FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Relatrio Cientfico
Extrao de DNA genmico Amplificao de DNA por PCR e Anlise por Electroforese

Biologia Molecular e Celular I

Ana Gomes Ana Pinheiro Daniela Oliveira Maria Machado TURMA 15

Objetivo do trabalho
A primeira atividade laboratorial teve como principal objetivo efetuar a extrao do DNA genmico de fgado de ratinho, com vista a numa segunda aula amplificar esses fragmentos de DNA e por eletroforese determinar o gentipo dos ratinhos descendentes de um cruzamento entre progenitores heterozigticos (+/-) relativamente ao gene Drg11.

Resultados
Na primeira atividade laboratorial efetuou-se a extrao do DNA genmico de uma poro de fgado de ratinho. Na segunda aula, os fragmentos de DNA correspondentes ao gene Drg11 (300 pb) e LacZ (200 pb) foram amplificados atravs de polymerase chain reaction (PCR) . O DNA molde utilizado foi portanto o DNA genmico da primeira aula e cujo gentipo relativamente ao gene Drg11 era desconhecido. Sabe-se que estes ratinhos so descendentes do cruzamento entre progenitores heterozigticos (+/-) que tm um dos alelos com o gene Drg11 normal (alelo +) e outro alelo em que o gene Drg11 foi removido e substitudo por um gene LacZ (alelo -). Desta forma, em electroforese pretendeu-se estimar o tamanho das bandas, comparando com o padro de peso molecular e determinar o gentipo do ratinho. Na eletroforese poderia-se esperar uma de trs hipteses: presena de uma banda ao nvel das 300 pb (mix Drg 11) e outra ao nvel das 200 pb (mix LacZ) em que o ratinho seria heterozigtico; presena de duas bandas de 200 pb (mixLacZ) em que o ratinho seria homozigtico mutado; presena de duas bandas de 300 pb (mixDrg11) em que o ratinho seria homozigtico normal. O resultado esperado para o DNA genmico era ao nvel dos 1000 pb. Na imagem de eletroforese abaixo, o D+ corresponde ao controlo +Drg11, o L+ ao controlo +LacZ, o 1 ao DNA genmico, o 2 ao mix Drg11 e o 3 ao mix LacZ. Pela observao desta imagem de eletroforese (em G4- azul), verifica-se uma banda pesada de 1000 pb que corresponde ao DNA genmico (1). Esta banda apesar de ser de difcil visualizao devido ao facto de ser muito clara, encontra-se no local esperado (1000 pb). Em 1, ao nvel das 100 pb verifica-se ainda uma banda muito leve que parece uma nuvem esbatida

e que provavelmente corresponder a RNA. Em 2 e 3 deveria ser possvel observar bandas (tendo em conta as hipteses enunciadas anteriormente), mas apenas visvel uma mancha negra que no nos permite extrair os resultados. Devido ao facto do grupo (G4) no ter obtido resultados efetivos, iremos utilizar tambm os dados do grupo 1 (G1-vermelho) para podermos analisar resultados conclusivos, contribuindo para o nosso processo de aprendizagem. Em G1 verifica-se que, em 1, existe tambm uma banda mais pesada ao nvel das 1000 pb (DNA genmico) com um certo arrastamento e uma banda mais leve e esbatida, como se fosse uma nuvem (ao nvel das 100 pb correspondente ao RNA). (mixLac Z). Ambas as bandas Alm disso, verificam-se outras duas so muito claras, principalmente a bandas: uma ao nvel das 300 pb (mix Drg11) e outra ao nvel das 200 pb correspondente ao mixLacZ.

Figura 1 : Imagem da Electroforese obtida

(G4-azul corresponde aos resultados do grupo em questo e G1-vermelho corresponde aos resultados que o grupo optou por discutir)

Discusso
A concretizao do objetivo inicial s foi possvel graas s tcnicas de PCR (polymerase chain reaction) e de electroforese. Atravs da primeira conseguimos replicar os genes Drg11 e LacZ, dado que esta uma tcnica que visa amplificar uma sequncia precisa de DNA e que consiste em 3 passos: desnaturao do DNA molde, ligao dos primers (annealing) e

elongao atravs de uma DNA polimerase deste ratinho (2).

(1)

. A segunda tcnica revelou-se

extremamente til no mapeamento fsico do DNA e determinao do gentipo

Centrando-nos, nos resultados observados em G4, mais propriamente em 1, verificou-se uma banda que devido ao seu elevado peso pouco se moveu. Tal como previsto, esta banda corresponde ao DNA genmico do ratinho (1000 pb). Esta banda muito clara, o que se deve, muito provavelmente, a erros de pipetagem. Compreende-se ento que a quantidade de DNA genmico transferida para o respetivo eppendorf foi inferior ao estipulado no protocolo experimental. A nvem que se verifica ao nvel das 100 pb de G4 em 1 dever constituir uma mistura de RNA associada a primers (numa concentrao consideravelmente inferior), pois ao extrair DNA tambm recuperamos RNA. A mancha negra, que se observa na imagem, demonstra a adio de corante em excesso durante a realizao desta atividade experimental. No decorrer da aula, o grupo compreendeu, de imediato, pela constatao da existncia de um volume anmalo no eppendorf aps a adio do corante, que a pipetagem tinha sido efetuada erronicamente ( verificou-se que tinham sido adicionados 5 l de loading buffer, ao invs de 2 l, como constava no protocolo). Este erro foi significativo, acabando por condicionar de forma evidente todas as possveis concluses relativamente ao gentipo do ratinho. Desta forma, os resultados obtidos pelo grupo revelaram-se inconclusivos. Perante esta situao, vimo-nos obrigadas a recorrer aos resultados de um outro grupo, de forma a podermos retirar resultados conclusivos desta experincia laboratorial, (ainda que estes possam ou no coincidir com os resultados que supostamente iriamos obter). Assim sendo, debruamo-nos sobre os resultados do Grupo 1. Neste caso tambm se obteve uma banda mais pesada correspondente ao DNA genmico (1000 pb). Note-se que esta banda surge-nos com algum arrastamento que se deve danificao do DNA, quer devido agitao violenta do eppendorf, quer devido aco de alguma DNAase que tenha permanecido ativa (apesar do EDTA). No entanto, contrariamente ao nosso grupo (G4), as duas bandas restantes so evidentes e distintas, verificando-se que uma se encontra ao nvel das 300 pb (mix Drg11) e outra ao nvel das 200 pb (mixLac Z). Considerando que o ratinho

possui dois alelos distintos, concluimos que este possui um gentipo heterozigtico. A claridade verificada nas referidas bandas pode ser atribuida a um erro de pipetagem, nomeadamente, a uma quantidade inferior de DNA pipetada relativamente ao que era estipulado no protocolo experimental.

Referncias Bibliogrficas

1. Ou, C.-Y., & Jones, W. K. (1988). Polymerase Chain Reaction Gerald Schochetman. The Journal of Infectious Diseases, 158(6), 1154-1157 2. Roberts RJ. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005 April 26, 2005;102(17):5905-8