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sabido que o DNA contm as informaes necessrias para o funcionamento dos organismos. Esse manual de instrues, porm, precisa ser interpretado pelas clulas, atravs de um mecanismo que envolve diversas e complexas etapas. Um papel fundamental nesse mecanismo cabe a um processo denominado splicing, sem o qual as instrues no poderiam ser lidas. O splicing no s organiza tais instrues, eliminando partes que no interessam, mas ainda permite selecion-las, de modo que o mesmo gene fornea diferentes instrues para as clulas.

Luiz O . F. Penalva Medical Center, Duke University (Estados Unidos) Diego A . R. Zorio Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UCHSC, University of Colorado (Estados Unidos)

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A leitura do DNA
Como processada a informao dos genes
Se um bilogo molecular tivesse que explicar a uma pessoa da rea de cincias exatas como funciona nosso material gentico, certamente faria uma analogia com um software. Da mesma forma que um computador, os seres vivos funcionam graas a um programa sensacional, escrito em uma linguagem simples, que utiliza apenas quatro letras ou variantes. Tal programa est dividido em uma srie de instrues os genes. As clulas, como o computador, interpretam e processam essas instrues, gerando produtos e/ou executando comandos. Curiosamente, dentro das instrues genticas existem partes que podem ou no conter informao til, o que exige um processamento prvio para que nossos computadores consigam interpret-las e, assim, cumprir as tarefas determinadas. Este artigo descreve como os seres vivos processam a informao gentica, as implicaes desse processamento e sua relao com doenas hereditrias.

Como tornar funcional o cdigo gentico

Nos chamados seres eucariontes, cujas clulas tm ncleo, o material gentico concentra-se nesse compartimento. Toda a informao para o funcionamento do ser est contida em uma longa molcula composta por duas cadeias (ou fitas) complementares e antiparalelas, o cido desoxirribonuclico (DNA). Examinando mais de perto, pode-se ver que o DNA contm uma sucesso de quatro tipos 4
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Figura 1. Do DNA protena: no ncleo, o DNA transcrito para RNA pr-mensageiro. Este, com o processamento (em vrias etapas), torna-se um RNA mensageiro maduro, molcula transportada para o citoplasma da clula e traduzida para protenas

diferentes de bases aminadas adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) e que cada gene formado por uma determinada seqncia dessas bases. Em uma regra quase geral, essas seqncias (ou seja, os genes) incluem alguns segmentos chamados exons, com informao que as clulas usaro na produo de protenas, e segmentos intercalados, os introns, cuja informao ser descartada, no sendo usada nesse processo celular. Para que a informao contida no DNA seja transferida para as diversas funes celulares, essa molcula precisa primeiro ser copiada, em um processo denominado transcrio, que gera uma molcula-irm, o cido ribonuclico (RNA) (figura 1). O RNA contm a mesma informao gentica presente no DNA, mas difere deste por ter uma s cadeia e por apresentar, no lugar da base timina (T), a uridina (U). No entanto, o RNA s se torna funcional depois que os introns so retirados, em um processo conhecido como splicing (esse o termo usado internacionalmente,

que pode ser traduzido, em portugus, por cortar e ligar). O splicing, um dos fenmenos biolgicos mais conservados ao longo da evoluo, est presente em praticamente todos os seres vivos com ncleo (eucariontes). um mecanismo altamente complexo e estruturado, que envolve a ligao, ao RNA, de uma srie de componentes celulares. Em uma explicao simplificada, pode-se dividir o splicing em duas etapas: a retirada dos introns e a ligao dos exons (figura 2). Ainda se sabe pouco sobre a verdadeira funo dos introns, mas j se conhece bastante sobre como essas seqncias so retiradas da molcula de RNA. Uma das etapas-chave no processo o reconhecimento preciso das junes entre os introns e os exons (os stios de splicing 5 e 3). Isso possvel porque, perto dessas junes, existem seqncias altamente conservadas (seqncias consenso) que servem como stios de unio para componentes celulares responsveis pelo processo de splicing. Existem ainda, nas proximidades das junes, regies ricas em pirimidinas (as bases citosina e uridina), que atuam como stio de unio para o fator de splicing U2AF, essencial para o reconhecimento do extremo 3 do intron, e uma regio batizada de branch site, onde o extremo 5 livre do intron, uma vez cortado, ir se unir (figura 3), formando uma estrutura circular. Foi demonstrado j h alguns anos que um complexo de protena-RNA denominado U1 reconhece o extremo 5 do intron, e promove o corte (junto com outros fatores celulares), mas s em 1999 os bilogos moleculares Diego Zorio e Tom Blumenthal desvendaram como o extremo 3 reconhecido. Em artigo publicado na revista Nature, eles demonstraram que uma protena celular, a

Figura 2. No processo de splicing, fatores especficos (representados por tesouras) reconhecem os stios de corte do DNA, eliminando os introns (partes sem informao gnica em laranja) e colando os exons (partes com informao gnica em roxo) adjacentes, formando a fita de RNA mensageiro

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Mamferos Consenso do stio de splicing 5 Consenso do stio de splicing 3 AG/GURAGU YAG/G YNYURAC Presente

Levedura AG/GUAUGU CAG/G UACUAAC Presente

Branch site
Regio rica em pirimidina

Figura 3. Nas junes exon-intron (barras entre as bases), existem seqncias mais conservadas, chamadas de consenso (bases sublinhadas), que servem de stios de unio para componentes celulares que atuam no processo de splicing. As bases so adenina (A), guanina (G), citosina (C ) e uradina (U). Nas seqncias, a letra R indica uma purina (A ou G), a letra Y indica uma pirimidina (C ou U) e a letra N indica qualquer uma das quatro bases (variaes possveis no DNA)

U2AF, reconhece a seqncia situada no stio 3' do intron e d incio ao processo de retirada desse intron. Retirados os segmentos extras, os exons so ligados uns aos outros e o RNA, agora chamado de RNA mensageiro (mRNA), torna-se funcional, ou seja, pode ser traduzido por organelas celulares denominadas ribossomos. No processo de traduo, a ordem dos exons no mRNA serve como modelo para a montagem, nos ribossomos, das molculas essenciais para nossa existncia: as protenas. Vital para a sobrevivncia da maior parte dos organismos existentes na Terra, o processo de splicing apresenta muitas variaes (mecanismos alternativos), tanto nas formas de reconhecimento dos stios de corte, para a retirada dos introns, quanto na escolha dos exons que sero ligados.

um RNA mensageiro funcional, capaz de ser traduzido em uma protena. medida que mais e mais genes foram seqenciados e analisados, percebeu-se que um nmero substancial deles originava mais de um tipo de mRNA. Mesmo produzidos a partir do mesmo gene, esses mRNAs podem conter diferenas na seqncia de bases que ser traduzida pelos ribossomos, possibilitando a montagem de protenas distintas, com funes tambm distintas e algumas vezes at antagnicas. Como um mesmo gene pode originar diferentes mRNAs? A resposta est em um processo denominado splicing alternativo. Como em um jogo de palavras, onde cada exon seria uma letra, o processo permite realizar variadas combinaes de exons para formar diferentes palavras (figura 4). Isso possvel porque cada exon contm a informao necessria para produzir uma parte da protena. Alm das combinaes de exons, o corte dos exons em diferentes stios tambm pode gerar diferenas 4

Quebra-cabeas de exons
Por muitos anos o processamento do RNA foi visto apenas como um mecanismo inventado pela clula para se livrar dos introns, unir os exons e produzir assim

Figura 4. O splicing alternativo gera distintos RNA mensageiros a partir de um mesmo gene. A informao contida na palavra NAMORAR (que representa um gene) permite gerar outras palavras com diferentes sentidos, dependendo da escolha das letras (ou dos exons, no caso dos genes): NORA (escolha em azul), AMOR (em preto), MAR (em vermelho) e ORAR (em verde)

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nos mRNAs (figura 5). Cada exon, ou grupo de exons, de um gene pode ainda ser o alvo, ao mesmo tempo, de diferentes estratgias de splicing alternativo, gerando nmeros de mRNAs que podem chegar a dezenas ou centenas. Padres complexos de splicing so comuns, por exemplo, no sistema nervoso, principalmente em processos eletrofisiolgicos. Verdadeiros quebracabeas de exons so usados para gerar grande nmero de protenas, chegando, em certos casos, at a algumas centenas. Isso permite criar uma espcie de sintonia fina, o que necessrio em mecanismos como o da audio, no qual necessrio captar e interpretar todo tipo de sons, com diferentes freqncias de onda.

Um gene-chave nesse mecanismo chamado de Slo. Esse gene, conservado ao longo da evoluo, pode ser expresso em distintas clulas do sistema nervoso, como as clulas capilares do ouvido interno. Tais clulas contm distintas formas da protena Slo, organizadas em uma espcie de escala. Cada forma assumida pela protena pode ser comparada a uma tecla ou corda de um instrumento musical, capaz de produzir um som nico, distinto dos produzidos pelas demais. Nas clulas capilares, cada grupo de clulas tem a funo no de produzir, mas de captar um determinado som (uma certa freqncia de onda). As variaes celulares que permitem ao ouvido captar sons de diferentes tipos so produzidas graas s inmeras formas da protena Slo geradas por splicing alternativo um total de 576 possveis combinaes! O controle do processo de splicing alternativo complexo. Inibir ou ativar um stio de splicing, saltar ou introduzir um ou mais exons e decidir a eliminao ou no de um intron so tarefas para os reguladores de splicing. Tais reguladores so protenas que se unem ao RNA em posieschave e atuam de maneira positiva (escolhendo um stio de splice e no outro, por exemplo) ou negativa (bloqueando um stio de splice para evitar que um exon faa parte do mRNA).

Ligando e desligando genes

Cada clula reflete o padro de expresso de seus genes. Assim, esse padro diferente, por exemplo, em uma clula do fgado e em uma clula muscular. Certos genes ativos (ou seja, produzindo protenas) em uma clula heptica podem estar desligados em uma clula muscular e viceversa. Entre os vrios processos celulares existentes que permitem ligar e desligar genes est o splicing alternativo. Durante o splicing do RNA, um exon que contm a informao para a montagem de uma regio importante de uma protena pode ser excludo, ou um exon que contm um sinal de parada de traduo pode ser introduzido. Nos dois casos, gerada uma protena no-fun-

Figura 5. No splicing alternativo, os exons (retngulos) podem ser unidos de maneiras diferentes, e essa ampla diversidade de escolhas pode originar produtos distintos, que por sua vez daro origem a protenas distintas

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cional ou um produto truncado. Em outras palavras, o gene desligado. Esse processo pode ser exemplificado com o gene Sex-lethal (Sxl) de Drosophila melanogaster, a popular mosca-das-frutas (figura 6). Esse gene controla, no inseto, processos como o comportamento e a determinao sexuais. ele que decide se uma mosca ser macho ou fmea, regulando, por exemplo, a expresso de genes vinculados diferenciao de estruturas sexuais. Indivduos que produzem a protena Sex-lethal se tornaro fmeas, e os que no o fazem se tornaro machos. A expresso dessa protena controlada atravs de splicing. Assim, durante o processamento, includo no RNA dos machos um exon contendo um sinal de parada de traduo. Isso leva produo de uma protena Sex-lethal menor e no-funcional. J nas fmeas, a presena de reguladores de splicing especficos far com que esse exon seja excludo do mRNA final, eliminando o sinal de parada de traduo e permitindo a produo da protena Sexlethal funcional.

Figura 6. Regulao do gene Sex-lethal (Sxl) em Drosophila melanogaster por splicing alternativo: se reguladores de splicing eliminarem um exon (em laranja) que contm um sinal de parada prematura na traduo, a protena Sxl produzida e a mosca ser uma fmea; se esse exon no excludo, a mosca ser um macho

Splicing, doenas genticas e cncer

Como o splicing um processo complexo, com regulao fina, a mutao de um simples nucleotdeo (uma das letras do DNA) situado em um stio de reconhecimento da juno exon-intron ou em um elemento regulador pode causar um erro no processo e gerar um produto aberrante. Muitas vezes, isso significa a inativao do gene. As conseqncias da inativao de fatores de splicing por mutaes ou delees podem ser graves. Estima-se hoje que erros no processo de splicing causem 10% das doenas genticas. Entre elas podem ser citadas a doena de Menkes, a tirosinemia hereditria, a porfiria intermitente, a doena de Sandhoff e a atrofia muscular espinal. A ltima a

principal causa de mortalidade infantil em pases do Primeiro Mundo. Essa atrofia ocorre quando h mutao em um gene chamado survival of motor neurons (SMN), indispensvel para a montagem de alguns dos componentes (fatores) envolvidos no processo de splicing. Produtos aberrantes tambm podem ser gerados quando fatores que participam do processo de splicing so ativados ou desativados por modificaes qumicas, ou quando h mudanas na concentrao celular dos mesmos. o caso, por exemplo, do gene CD-44, relacionado com adeso celular. A expresso incorreta (ou seja, splicing incorreto) desse gene est relacionada com o surgimento de certos tumores. A biologia molecular do novo milnio vai criar ferramentas capazes de corrigir seqncias que afetam padres de splicing. Tambm ser possvel expressar, inativar ou mudar a concentrao de reguladores, permitindo reparar genes afetados por delees, como no caso da distrofia muscular progressiva. Nessa direo, vrios testes tm sido feitos com clulas em cultura e modelos experimentais. Resultados promissores tm sido alcanados com RNA anti-sentido, uma pequena molcula cuja seqncia de bases complementar do RNA. Essa molcula capaz de se unir ao RNA e interferir com a escolha dos stios de splicing. No entanto, ainda estamos longe de prever quando essa tecnologia estar pronta para ser utilizada no ser humano. n

Sugestes para leitura

ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K. e WATSON, J. D. Biologia molecular da clula, Porto Alegre, ed. ArtMed, 1997. ZAHA, A. Biologia molecular bsica, Porto Alegre, ed. Mercado Aberto, 1996. ZORIO, D. A. R. & BLUMENTHAL, T. Both subunits of U2AF recognize the 3 splice site in Caenorhabditis elegans, in Nature, v. 402, p. 835, 1999.

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