UNIVERSIDAD MAYOR ENFERMEDADES PARASITARIAS GUA DE LABORATORIO

Dr. Rafael Rodrguez 2012

Introduccin a los Mtodos de Diagnstico de Enfermedades Parasitarias

Consideraciones Generales La deteccin de los agentes involucrados en un proceso patolgico es una condicin elemental para el establecimiento de medidas tendientes a su eliminacin, es decir, tratamientos teraputicos o medidas de control. El proceso diagnstico a que son sometidas las muestras obtenidas de individuos pueden arrojar diferentes grados de positividad o negatividad, por ello se reconoce que ningn mtodo es 100 % efectivo, hacindose necesario un control peridico de los animales para poder actuar tempranamente en una Parasitosis Los mtodos de diagnstico son herramientas que se utilizan en la prctica de la profesin, ya sea clnica o productiva, los cuales deben interpretarse en forma conjunta con otras prcticas cientficas de la Medicina. Tipos de Mtodos de Diagnsticos Mtodos Directos O tambin llamados de Certeza, cuyo fundamento es el hallazgo de estructuras parasitarias o el propio parsito, por ejemplo, porciones del parsito (progltidas), parsitos enteros, ooquistes, larvas, huevos, etc. Para la deteccin de stos parsitos es necesario conocer la ubicacin de ellos para poder encontrarlos, por lo que va depender la tcnica parasitolgica que utilicemos y cual sera nuestra muestra a obtener.

En la prctica laboratorial usada en medicina humana se aplican tcnicas diagnsticas que se fundamentan en tecnologa imagenolgica avanzada como por ejemplo, Ecosonografa, Tomografa axial computarizada (TAC), y Resonancia magntica nuclear (RMN). En medicina veterinaria su uso es parcial y escaso debido al costo y a la preparacin previa del paciente. Se mencionarn a continuacin los mtodos directos ms utilizados en la parasitologa chilena. Frotis sanguneo: (mtodo de capa delgada) para detectar hemoparsitos, principalmente protozoos y nematodos. Ectoparasitolgico: Mtodo empleado en la deteccin de ectoparsitos principalmente caros tales como garrapatas, otros caros productores de sarnas, insectos productores de miasis, pediculosis y pulicosis. Exmenes Parasitolgicos de Abejas: Diagnstico de Nosemosis y Amebiasis, permite observar esporas de Nosema apis o los quistes de Malphigamoeba mellificae, a partir de abdmenes de abejas. Deteccin de caros traqueales, permite la deteccin de Acarapis woodi en los segmentos traqueales en el mesotrax. Deteccin del caro Varroa detructor, basado en la inspeccin visual de las cras o de los adultos de Apis melliphera para la deteccin del caro. Coproparasitolgicos: Se pueden clasificar segn los resultados que se puedan obtener. As si es un mtodo diseado para entregar resultados segn cantidad de parsitos encontrados ellos sern del tipo cuantitativo o bien si solo evidencian la variedad o tipo de parsitos posible de encontrar en una muestra, ellos sern del tipo cualitativo. Los mtodos cuantitativos necesitan de una implementacin especial para medir los volmenes de soluciones y el peso de las heces utilizadas. Cualquiera sea la tcnica empleada tienen como fundamento el principio fsico del peso especfico de los huevos de los parsitos, de tal forma que ellos pueden sedimentar o caer con cierta velocidad cuando son sometidos a soluciones de menor peso que ellos, o bien, flotan cuando son sometidos a soluciones sobresaturadas. Ambos principios permiten la recuperacin de estructuras parasitarias para su observacin, diagnstico, pudiendo ser mejoradas mediante el uso de tinciones, en algunos casos. Los resultados se expresan en negativos, o de positividad en diversos grados. As los huevos de tricostrongilideos sedimentan a razn de 20 a 40 mm. por minuto, los huevos de Cestodos lo hacen a 50 mm./ min y los de Fasciola hepatica a 100 mm. /min. Siendo este principio de peso especfico de los huevos el utilizado en la mayor de los exmenes coproparasitolgicos. A continuacin se muestra un diagrama con los mtodos coproparasitolgicos ms utilizados:

A continuacin se mencionan los mtodos coproparasitolgicos ms utilizados en relacin a su utilidad. Coproparasitolgico de Teuscher (sedimentacin flotacin Sulfato de Zinc 70%) permite detectar ooquistes y quistes de protozoos, huevos y larvas de Nemtodos y huevos de Cestodos y Tremados. Flotacin sal comn es menos sensible que el anterior y su rango de deteccin es el mismo. Coproparasitolgico Cuantitativo de Mc Master, permite la deteccin de ooquistes de protozoos, huevos y larvas de Nematodos y huevos de Cestodos. Coproparasitologico de Telemann modificado, se aplica para detectar principalmente protozoos entricos en exmenes seriados de humanos y tambin las especies animales. Mtodo de Sedimentacin con detergente, utilizado especficamente para la deteccin de huevos de Fasciola hepatica. Tincin de Ziehl - Neelsen para deteccin de Cryptosporidium sp. , se tien rosadas estas estructuras por ser cido-alcohol resistentes. Frotis de vsceras, para detectar parsitos entricos, principalmente Protozoos. Los mtodos ms utilizados en el diagnstico Mdico coproparasitologicos, ectoparasitolgicos y frotis sanguneos. Veterinario son

Mtodos Indirectos Son denominados de presuncin, inmunolgicos o serolgicos. Donde se utiliza como muestra principalmente suero sanguneo u otros fluidos corporales inclusive deposiciones. Estos mtodos permiten detectar la experiencia presente o pasada del hospedero, con algn agente. Se basan en la deteccin de anticuerpos que desarrolla el hospedero como reaccin a un antgeno o agente. Se pueden utilizar fracciones antignicas especficas, desechos metablicos, secreciones, etc. Poseen la ventaja de ser rpidos y econmicos y en algunos casos bastantes exactos, sin embargo no son 100% sensibles ni 100% especficos. Deben desarrollarse usando antgenos puros que no siempre es posible obtener y cuando no se logra, pueden

presentar reacciones cruzadas, es decir resultan positivos frente a otros parsitos que no son los pesquisados. Los parsitos presentan mosaicos antignicos complejos los que pueden variar segn etapa del ciclo de desarrollo en que se encuentra el parsito, o bien, simplemente eluden la respuesta del hospedero. Lo anteriormente expuesto determina que stas tcnicas presenten algunas limitaciones para su uso masivo en la deteccin de enfermedades parasitarias, no obstante existen tcnicas probadamente buenas en el uso de estudios seroepidemiolgicos o diagnstico de masa. A continuacin se muestra una tabla donde se clasifican algunas tcnicas de diagnstico serolgico.

Actualmente se han incorporado tcnicas basadas en la biologa molecular de los agentes, entre las cuales se encuentra la Reaccin Cadena de la polimerasa conocida como PCR. A continuacin se detallan los mtodos ms utilizados en la prctica nacional: Inmunofluorescencia Indirecta IFI, mtodo utilizado para la deteccin de anticuerpos contra Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzi en muestras de suero sanguneo de especies animales. Es necesario contar con un microscopio con equipo de epifluorescencia, siendo importante que el operador sepa reconocer la positividad. Inmunofluorescencia Directa IFD, se utiliza para la pesquisa de ooquistes de Cryptosporidium sp. Y quistes de Giardia sp. En muestras de fecas de animales domsticos (bovinos, ovinos, caprinos, porcinos, caninos, felinos, etc.) pudiendo ser usada para la deteccin de los protozoos citados en humanos. Las fecas deben ser mantenidas en un preservador en base a formol sal. Ensayo Inmuno Enzimtico ELISA para la deteccin de antgenos de Echinococcus granulosus en fecas de caninos. Se detectan sustancias producto del metabolismo de del parsito, los que se detectan mediante anticuerpos elaborados para tal efecto. Es una metodologa ELISA-SANDWICH. Existe ELISA indirecta para la deteccin de Neospora caninum en sueros de bovinos, de Trichinella spiralis en cerdos entre otros.

Fijacin del Complemento FC. Se detectan anticuerpos contra diversos antgenos en suero de animales, a travs de la accin que ejerce el complemento destruyendo el antgeno en una unin antgeno-anticuerpo. Se utiliza para detectar anticuerpos contra Babesia equi, Theileria equi, y Trypanosoma equiperdum en suero de Equinos.

Tabla: Mtodos diagnsticos serolgicos ms usados en algunas enfermedades parasitarias.

++++: Recomendada por alta sensibilidad y especificidad. +++: Confiables por su sensibilidad. + y ++: De utilidad limitada. ( ): No se realizan en Chile actualmente. 1: En fase experimental.

Introduccin Protozoos
Los protozoos son organismos unicelulares pertenecientes al reino de los Protistas, segn clasificacin de los reinos Monera, Protista, Plantae, Fungi y Animalia. En el reino Protista se encuentra el sub reino Protozoa, al que pertenecen organismos unicelulares que son eucarintes, es decir que poseen un material cromosmico agrupado en uno o ms ncleos separados del citoplasma por la membrana nuclear, a diferencia de los procarintes que carecen de membrana nuclear, quedando el material cromosmico en contacto directo con el citoplasma, como es el caso de las bacterias. Los protozoos tienen su hbitat en cualquier ambiente del globo terrestre agrupando unas 64.000 especies de las cuales unas 7.000 son parsitas de otras especies animales. Los protozoos presentan diferentes esquemas reproductivos siendo agrupados en dos tipos de reproduccin la asexuada y la sexuada. Algunos protozoos pueden alternar estas dos formas. El ncleo juega un rol importante en las divisiones celulares, pudiendo existir ms de un ncleo por clula, sta caracterstica muchas veces permite diferenciar especies de protozoos segn nmero y disposicin de stos. Los tipos de reproduccin asexuada ms conocidos son: Fisin binaria: a partir de un individuo se producen dos nuevos individuos, siendo la divisin longitudinal en los flagelados y transversal en los ciliados. Fisin mltiple o Esquizogona: El ncleo se divide varias veces y de un mismo individuo resultan 4, 6, 8 o ms individuos hijos. Endodiogenia: a partir de una clula madre se forman dos clulas hijas en su interior, semejentes a la clula de origen, la cual se rompe y libera el producto. Endopoligenia: es similar a la anterior, sin embargo se forman ms de dos clulas hijas. Todos los productos de Esquizogona, endodiogenia, endopoligenia reciben el nombre de Merozoitos y las clulas que las forman se llaman esquizontes o merontes. Los tipos de reproduccin sexuada ms conocida son: Conjugacin: se produce un intercambio de material nuclear entre las clulas progenitoras. Singamia o Gamogona: se juntan dos clulas reproductoras llamadas gametos y forman un cigoto. Si los gametos son de igual tamao se llaman isogametos y si son de diferente tamao uno de ellos es el macrogameto (usualmente hembra) y el microgameto (usualmente macho). Los gametos son producidos por clulas llamadas gamontes. La alimentacin de los protozoos puede ser pasiva o activa, desplazndose para obtener los nutrientes y generalmente proviene de materiales orgnicos (detritus celulares, clulas enteras, fluidos corporales, etc.), es decir, su nutricin es de tipo Hetertrofa a diferencia de la Auttrofa como la de organismos que utilizan la clorofila. La forma de alimentacin puede ser a travs del Citostoma que constituye una abertura oral permanente en algunos protozoos, o bien, pueden ingresar mediante una abertura oral temporal de la pared del organismo, proceso conocido como Pinocitosis, ya al interior y dentro de una vacuola digestiva es atacado por las enzimas propias del protozoo. Los deshechos son eliminados por el Citopigio (abertura permanente) o por una abertura temporal. La movilizacin o locomocin de los protozoos, puede ser mediante cilios, flagelos, pseudpos (como las bacterias) o por membranas ondulantes que es el sistema ms avanzado de locomocin que lo presentan los Trypanosomas sp.

A continuacin se expone una somera clasificacin del subreino de los protozoos, considerando las divisiones de importancia en parasitologa veterinaria.

Introduccin Cestodos y Trematodos

Cstodos
Son gusanos planos parecidos a una cinta, pertenecen al Sub Phylum Platyhelminthes. Es un grupo importante de parsitos internos que se localizan en el tubo digestivo de vertebrados. En la transmisin de su ciclo evolutivo participan huspedes intermediarios vertebrados o invertebrados. El estado adulto de estos parsitos denominados Tenias se encuentra en el husped definitivo vertebrado y los estados larvarios que reciben diferentes nombres se ubican en el husped intermediario que pueden ser vertebrados o invertebrados. Dentro de la clasificacin de estos Cstodos podemos distinguir dos grandes grupos Cyclophyllidea y Pseudopyillidea, Los primeros son las denominadas Tenias verdaderas con rganos de fijacin bien visibles como gancho que estan dispuestos en una corona o rostelo y ventosas, en cambio, los segundos slo poseen botrios o botridios que son surco presentes en el escolex o seudoventosas. Morfolgicamente los adultos se pueden dividir en: Cabeza o escolex, el que tiene la misin de anclarse o sujetarse a la pared intestinal del husped mediante ganchos, ventosas o botrios. Cuello, detrs del escolex que puede ser largo o corto con celulas germinales que dan origen a progltidas, este proceso se conoce como estrobilacin. Cuerpo o estrbila que est compuesto por progltidas, que varan en nmero segn la especie y que se van haciendo maduras asexualmente a medida que se alejan del cuello. Las estructuras internas de un Cestodo son la pared del cuerpo formado por varias capas, la ms externa la cutcula con proyecciones llamadas microtricos, los que absorben el alimento por difusin u osmosis, transporte activo o por pinocitosis. Bajo la cutcula existen otras capas, entre las destacan capas musculares. Luego existe un parnquima en el que estn insertos un sistema osmoregulador o excretor, un sistema nervioso, aparato reproductor hermafrodita el cual puede ser simple o doble. Cabe destacar la ausencia de tubo digestivo. En cada uno de los ciclos evolutivos de los dos grupos de Cestodos, los estados larvarios adquieren nombres y estados diferentes. Los Cyclophyllidea adultos eliminan huevos embrionados al medio ambiente, una vez que se liberan de las progltidas maduras y son ingeridos por el husped intermediario, dentro de este ltimo se desarrolla el estado larvario que puede adquirir los siguientes nombres, segn tipo de husped y segn el nmero de parsitos que se puedan originar de esta estructura larvaria, como se describe en el siguiente cuadro. Estructura larvaria Cisticercoide Cysticercus Coenurus Hidtide Husped intermediario Invertebrado (ocasionalmente vertebrado) Vertebrado Vertebrado Vertebrado Nmero de tenias originadas Una Tenia Una Tenia Cientos de Tenias Miles de Tenias

Los Pseudopyillidea dan lugar a dos estados larvarios en diferentes huspedes intermediarios dentro del mismo ciclo evolutivo, el Procercoide y el Plerocercoide. Los huevos son eliminados por una abertura que se denomina poro genital. No cabe duda que estas parasitosis son una de las ms importantes ya que causan grandes prdidas econmicas y tienen trascendencia en salud pblica, puesto que involucran al ser humano. Otras parasitosis son las causadas por los Tremtodos, de los cuales existe un solo representante en nuestro pas la Fasciola hepatica que sigue produciendo grandes prdidas econmicas en algunas regiones del pas y que tambin puede afectar al hombre. Trematodos Dentro de las caractersticas morfolgicas se distingue la forma de su cuerpo que es aplanada dorsoventralmente, de forma lanceolada, conoide, cilindroide o filiforme. Son hermafroditas y la mayora presenta un ciclo de vida indirecto. Poseen una cutcula que puede ser lisa o con espinas que le sirven para el transporte y como instrumento de alimentacin al raspar la superficie donde habitan. Sus rganos de fijacin son ventosas, una oral o anterior y otra ventral al parsito. Hacia el interior del parsito encontramos el sistema digestivo, el sistema reproductivo, un sistema excretor y un sistema nervioso. El sistema digestivo est compuesto por la ventosa oral, faringe, un esfago, intestino que se divide en dos grandes troncos y que se ramifican en ciegos, aunque algunas especies de tremtodo poseen ano. Su alimentacin puede ser quimfaga, histfaga o hematfaga y colagfaga dependiendo de la ubicacin y estado de desarrollo. El sistema reproductivo bsicamente contiene las mismas estructuras que otros parsitos (ver esquema), siendo la mayora hermafroditas a excepcin de los Schistosomas que presentan sexos separados. El sistema excretor est ramificado por el cuerpo y se van uniendo conductos que desembocan en un poro excretor ubicado en el extremo posterior del tremtodo. El sistema nervioso presenta un anillo periesofgico, del cual se originan fibrsa y ganglios que se distribuyen por todo el cuerpo. Existen pigmentos o placas fotosensebles en algunos estados de desarrollo del parsito como en el Miracidio y en Cercarias que responderan a estmulos lumnicos, y la presencia de placas sensoriales alrededor de la ventosa oral en las formas juveniles del parsito y que desaparecen en el estado adulto. En algunos tremtodos (del grupo Paramphistomum) existe un sistema circulatorio rudimentario. En el ciclo evolutivo de los tremtodos se pueden mencionar varios entados larvarios, el Miracidio, la Esporocisto, Redias, Cercarias, y Metacercarias. La ausencia de alguno de ellos depender de la especie parsita, generalmente el estado de metacercaia es el infectante para el husped definitivo, aunque hay excepciones, y en la mayora de los ciclos de los tremtodos podemos encontrar que necesitan de un husped intermediario en la mayora de los casos es un caracol que habita en un ambiente acutico. A continuacin hay un esquema del aparato reproductor hermafrodita de un tremtodo.

Esquema del aparato reproductor masculino y femenino de un trematodo. A. Poro genital comn; B. Cirro; C. Glndula prosttica; D. Saco del cirro; E. Vescula seminal; F. Vaso deferente; 0. Testculo; H. Vagina; I. Utero; J. Gotipo rodeado por las glndulas de Mehlis; K. Ovario; L. Conducto de Laurer; M. Receptculo seminal; N.Conducto vitelgeno; 0. Glndulas vitel6genas.

A continuacin se expone una breve clasificacin del Phylum platyhemintos al cual Pertenecen los Cstodos y Tremtodos. Se menciona el cuarto Phylum de los Helmintos, los Acantocfalos que en nuestro pas no representan parasitosis. Por mencionar algunas caractersticas de los acantocfalos son vermes de cuerpo largo, cilndrico y cuerpo anillado, carecen de tubo digestivo y provistos de trompa retractil armada de ganchos, mediante la cual se aferran a la mucosa del tubo digestivo de vertebrados. La nutricin es por osmosis al igual que los Cstodos. Presentan dimorfismo sexual. Su ciclo es indirecto con la participacin de insectos o crustceos como huspedes intermediarios. El acantocfalo ms conocido es el Macracanthorhynchus hirundinaceus que afecta al Cerdo.

Introduccin de Nematodos
El sub reino de los Helmintos presenta cuatro sub phylum, ellos son Cestoda (tenias), Trematoda (distomas), Acantocfalos y Nematoda (gusanos redondos). Los cestodos son hermafroditas al igual que los tremtodos, excepto los del gnero Schistosoma. Los Acantocfalos y Nematodos poseen sexos separados y dimorfismo sexual, en los cuales las hembras son de mayor tamao que el macho. Este captulo prctico trata de los nematodos o vermes redondos, los cuales en su estado parasitario se encuentran en diferentes rganos o sistemas del husped. Algunos de ellos son especficos para determinados grupos animales (estengenos), como lo son los Trichostrongildeos de los rumiantes; en los cuales causan parasitismo gastro intestinal, que produce prdidas cuantiosas ya sea en su forma "sub-clnica,, o bien "clnica,, y en algunas ocasiones la muerte de animales. Otros vermes parsitos son eurgenos (pueden parasitar a muchas especies diferentes) y adems constituyen zoonosis, como por ejemplo Trichinella spiralis, la cual presenta casos en forma clnica en personas, algunas de las cuales lamentablemente mueren. Nematodos parsitos como los Ascarldeos presentan un potencial bitico impresionante, as un Ascaris suum hembra puede eliminar 250.000 o ms huevos en un solo da, lo que equivale a por lo menos tres huevos por segundo. La morfologa de estos vermes sigue el tenor de aquellos redondos o cilndricos, donde se observan rganos con funciones bsicas de alimentacin y reproduccin. Tienen presencia de un tubo digestivo verdadero, con una boca que puede tener la presencia de labios o de lminas cortantes o en algunos casos presentar un mayor o menor grado de desarrollo de su cpsula bucal. A continuacin sigue un esfago que muchas veces tiene una forma caracterstica para una especie, tanto la boca o cpsula bucal como el esfago son elementos que se utilizan en la para la identificacin de ejemplares. Posterior al esfago sigue el intestino, formado por una monocapa de fibras musculares, terminando en el recto o cloaca que se abre en el ano que generalmente est en la cara ventral del extremo posterior del nematodo. En relacin a su sistema reproductivo vemos que existe dimorfismo sexual, en los machos se pueden encontrar a groso modo estructuras que tambin sirven como instrumentos de diagnstico en algunas especies de vermes. En algunas especies estn presentes una bolsa copuladora en su extremo terminal posterior cuya funcin es abrazar a la hembra en el momento de la cpula y con las espculas (otro elemento reproductivo de contextura quitinosa) dilatar la vulva y facilitar la penetracin de los espermatozoides. Los testculos generalmente uno se encuentran ramificados por su cuerpo como estructuras filiformes. Otros machos que no presentan estas estructuras reproductivas (espculas y bolsa copuladora) presentan un extremo posterior curvado que los permite diferenciar de las hembras. Las hembras pueden tener tambin uno o dos ovarios ramificados de igual manera, en algunas especies la abertura genital (vulva) presenta una estructura que la cubre y se denomina labio vulvar, el extremo posterior generalmente termina recto. Existen variaciones importantes de tamao, donde las hembras se presentan con un mayor desarrollo. Otros aspectos morfolgicos que se pueden mencionar es la presencia de un sistema nervioso formado por troncos nerviosos que ascienden desde el anillo esofgico hacia la boca y otros troncos nerviosos que descienden desde este anillo hacia su extremo posterior. Existe tambin un sistema excretor que tiene funcin osmoreguladora. Algunas caractersticas fisiolgicas es su tipo de alimentacin, por ejemplo, algunos se alimentan de material digerido o semidigerido que vara en composicin segn la

localizacin del parsito, es decir, si se encuentra en estmago, intestino delgado o intestino grueso. Otros pueden alimentarse de mucosa gastroentrica o de vas respiratorias y otros tratan de llegar vasos sanguneos para obtener sangre de la cual se alimentan. Los nemtodos presentan entonces una diversidad de formas, as como tambin una variada gama de estados infectantes, a travs de huevos, larvas infectantes, microfilarias, etc. Los que pueden transmitirse mediante un ciclo directo o indirecto con participacin de huspedes intermediarios o vectores en algunos casos. As este captulo de nematologa parasitaria, constituye uno de los puntos de mayor relevancia en los temas de salud animal y humana; basta sealar que existen sobre la tierra ms de 2.000 millones de personas afectadas por algn tipo de nemtodo parsito en estos precisos instantes. A continuacin se expone una clasificacin breve de los Helmintos de mayor relevancia veterinaria y humana, incluyendo en ellos al phylum Nematoda.

Introduccin de Artrpodos
Los artpodos son el grupo ms numeroso de las especies animales que habitan la tierra, abarcando un 85 % de ellas, con cifras cercanas al milln de especies. Dentro de las artrpodos los ms numerosos son los insectos con cerca de 800.000 especies. Son adems de abundantes, grandes colonizadores de diferentes ambientes, cumpliendo as con su rol biolgico. Son animales que se caracterizan por poseer sus apndices (patas) articulados y tanto el cuerpo como los apndices poseen una cubierta gruesa que contiene quitina la que forma el exoesqueleto. Esta cubierta tiene conexiones flexibles (membranas) que permiten el movimiento entre los segmentos. Poseen un corazn rudimentario en la parte dorsal del cuerpo ocupada por el homocele. Y poseen un sistema nervioso ganglionar ventral y uno eslabonado arriba del esfago que asemeja a un cerebro. Existen dentro de los artrpodos muchas especies benficas para la humanidad (polinizacin, productores de miel, cera, seda, etc.), pero tambin, existen aquellas que representan un peligro al inocular veneno en su picadura o mordedura (animales ponzoosos) o pueden producir daos a la agronoma constituyndose en verdaderas plagas. Y aquellos que pueden ejercer un parasitismo temporal o permanente. Algunas de estas especies parsitas producen prdidas econmicas importantes al daar la salud de los animales domsticos o los productos de especies de abasto. Las especies parsitas producen diferentes efectos sobre sus huspedes, destacndose el efecto patgeno que realizan al inocular en su husped virus, bacterias, protozoarios, helmintos u otros artrpodos. Otro efecto es el dao traumtico que se produce al penetrar por piel, por ejemplo caros de la sarna, larvas de moscas que producen miasis donde se destruye tejido y se produce tambin una accin irritativa.

En esta clasificacin resumida se pueden observar dos grandes grupos, aparte de los Pentastmidos, en los que se dividen los artrpodos, los Chelicerata que son los que poseen quilceros como aparato de alimentacin, con la clase Arachniderida que poseen cuatro pares de patas, no poseen antenas, ni alas, ni ojos compuestos. Los segmentos estn agrupados en caso de los Aracnorida en dos segmentos, un Cefalotrax y un abdomen, y en el caso de los Acarinorida agrupados en un segmento fusionado (cabeza, trax y abdomen). El otro grupo de los Mandibulata son aquellos que presentan mandbulas como aparato de alimentacin, que presenta la clase Insectasida donde encontramos los insectos que presentan tres segmentos, la cabeza que tiene un par de antenas, el trax que tiene tres pares de patas, a veces un par o dos pares de alas y el abdomen que no tiene apndices. La respiracin es por medio de traqueas que se comunican al exterior por los estigmas. Algunos presentan ojos compuestos. Dentro de esta clase se pueden encontrar los Exopterygota, donde encontramos los piojos, chinches y vinchucas que se caracterizan por que el estado ninfal es semejante con el de los ancestros (adultos), presentando una metamorfosis incompleta o hemimetabolos, es decir, huevo, ninfas o juveniles, adultos. Se pueden encontrar tambin los Endopteygota donde encontramos a las moscas, abejas y pulgas que se caracterizan por que en su evolucin las larvas son muy diferentes a los ancestros (adultos), presentando una metamorfosis completa(holometabolos), es decir, huevo, larva, pupa, adulto.

Practico N 1

Mtodos de Diagnstico utilizados en la deteccin de Protozoos.

Algunos de los mtodos aqu descritos como por ejemplo la tcnica de Teleman modificado se utiliza no slo para detectar protozoos, sino que tambien, para el diagnstico de otros parsitos como Nemtodos y Cestodos. Pero para efectos prcticos de una buena distribucin de los diferentes mtodos que se vern durante el sementre es que se decidio pasarla en este prctico Coproparasitolgico de Telemann Modificado Tincin de Ziehl-Neelsen Frotis sanguineo Diagnstico de Nosemosis

Coproparasitolgico de Telemann Modificado

Soluciones Fijador: Formaldehdo solucin al 40% Na Cl (cloruro de sodio) Agua destilada Colorante: Lugol :Yodo Yoduro de potasio Agua destilada Tincin MIF (Merthiolate, lodo y Formol) Lugol Formaldehdo solucin 40% Timerosal (Merthiolate) 1: 1000

50 mI 5 gr 950 ml 1 gr 2 gr 30 mI 0.10 MI 0.15% 0,75 mI.

Materiales : Mortero con pistilo, pipeta pasteur, vaso p.p de 250 nil, tamiz, tubo de 10 nil, porta objetos, cubre objetos, cmara hmeda. Procedimiento : 1. Vaciar la mitad de la muestra al mortero y agregar fijador si la emulsin es muy espesa. 2. Tomar con una pipeta pasteur una gota de la emulsin fecal y colocarla en un portaobjetos numerado cubrir, con un cubreobjeto y dejar en una cmara hmeda. Esta es la preparacin directa. 3. Tamizar la emulsin hacia un vaso p.p de 250 nil y observar el material retenido para ver si se encuentran parsitos macroscpicos. 4. Depositar aproximadamente 10 mI de la emulsin tamizada en el tubo de 10 mI ya numerado, agregar una columna de 1 mI de altura de ter sulfrico o etlico al tubo de centrfuga. 5. Ocluir el tubo con el pulgar y agitar enrgicamente, destapar lentamente para reducir la presin generada. 6. Colocar los tubos en la centrfuga. Centrifugar por 5 minutos a 1500 o 1800 r.p.m. 7. Vaciar el sobrenadante en forma brusca invirtiendo el tubo. 8. Con la pipeta pasteur colocar 2 gotas de tincin MIF separadas por 3 cms. entre si, con la pipeta pasteur tomar 2 gotas de sedimento obtenido en el tubo centrifugado y colocarlas al lado de cada gota de MIF. 9. Mezclar con un asa desechable las gotas de sedimento y MIF. Cubrir con el cubre objeto y repetir la operacin con el otro par de gotas. Esta es la preparacin concentrada. 10. Colocar en una cmara hmeda hasta el momento de su lectura.

11. La lectura se debe efectuar para ambas preparaciones con aumentos de 400 x y 100 x e inmersin cuando sea necesario. Consideraciones Generales : Esta metodologa diagnstica permite el hallazgo y reconocimiento de algunas estructuras protozoarias tales como quistes (Giardia sp., Entamoeba hystolitica y otros) y trofozotos, aunque presenta un rendimiento algo inferior al mtodo de Teuscher. Es una tcnica que puede ser aplicada en forma complementaria al Teuscher en muestras de animales mamferos (mascotas). Es la que se aplica para el examen seriado de deposiciones en las personas.

Tincin de Ziehl-Neelsen para deteccin de Cryptosporidium sp.

Materiales : Porta objetos desgrasados, cubre-objetos, varillas para suspender porta objetos, fuente de agua corriente, microscopio provisto de lentes de 400x e inmersin. Soluciones: Tinciones para deteccin de organismos cido-alcohol resistentes (fucsina fenicada, alcohol cido, azul de metileno). El alcohol-cido se prepara agregando 3 ml. de cido clorhdrico concentrado a 97 ml. de alcohol etlico de 95. Procedimiento: 1. Se obtiene una alcuota del sedimento de las muestras de fecas, debidamente tamizadas y decantadas. Con ella se confecciona un frotis delgado el que se deja secar al medio ambiente. 2. Este frotis se cubrir con carbol ? fucsina o fucsina fenicada y se calentar hasta emitir vapores, pero sin permitir que hierva. 3. Se permite reaccionar durante 20 a 30 minutos. 4. Los frotis se lavan con agua corriente. 5. Se decolora con alcohol cido durante 30 segundos a un minuto. 6. Se lava nuevamente con agua corriente. 7. Depositar azul de metileno para efectuar una contracoloracin, que tie de azul aquello que no posea las caractersticas de cido alcohol-resistente. 8. Lavar nuevamente con agua corriente. 9. Dejar secar a medio ambiente. 10. Recorrer la preparacin con 400x, usando inmersin cuando sea necesario confirmar la presencia de los ooquistes. 11. En las muestras positivas, los ooquistes se observan de forma esfrica, entre 4 a 6 urn. de dimetro, de color rojo o rosado intenso, mientras que el fondo se observa de color azul. Se debe tener cuidado ya que algunos hongos o levaduras, pueden

determinar una coloracin similar pero su forma y tamao son importantes para efectuar el diagnstico diferencial. Se recomienda montar en forma permanente, una preparacin positiva para que sirva de referencia. Consideraciones Generales : Esta tcnica utiliza las caractersticas cido alcohol resistente de los ooquistes de Cryptosporidium sp., siendo una tcnica de bajo costo y ligeramente menos sensible que IFD pero que necesita mayor tiempo de lectura que esta ltima, no siendo necesario contar con un microscopio dotado con equipo para inmunofluorescencia (halgena o de mercurio).

Frotis sanguineo (Mtodo Capa Delgada)

Tincin : Giemsa : La solucin colorante, puede adquirirse lista en el comercio. Este colorante se diluye un volumen de la solucin con 10 volmenes de agua destilada. Material : Portaobjeto desengrasado, cubreobjeto, capilar, bulbo, vaso copling, cubeta, cubeta de tincin, canastilla, porta canastilla, pocillos para enjuague. Procedimiento : 1. Depositar una gota de sangre en un extremo del portaobjeto con un capilar provisto de un bulbo. 2. Acercar el cubreobjeto a la gota de sangre formando un ngulo de 30' una vez extendida la gota en una de las caras de cubreobjeto, se arrastrar la sangre en el portaobjeto dejando una delgada lmina. La extensin de sangre se seca inmediatamente, posteriormente se rotula sobre la parte gruesa del frotis con un lpiz grafito. 3. Fijar la extensin en alcohol metilico durante 3 a 5 minutos. 4. Secar al aire. 5. Sumergir el frotis durante 20 a 30 minutos en el colorante diluido. La duracin de la tincin puede prolongarse 1 hora o ms. 6. Lavar con agua destilada neutra. 7. Poner vertical para secar. 8. Leer el frotis una vez seco, en un mnimo de 50 campos. Algunos exmenes requieres que se revise la mayor extensin posible. 9. La lectura debe ser realizada con aumento de 1 000x o superior (inmersin).

Diagnstico de Nosemosis (Nosema apis) y Amebiasis (Malphigamoeba mellificae)

Generalidades. Existe una variada gama de formas para detectar parsitos en las muestras de Apis mellifera, por ello los mtodos aqu expuestos son aquellos que se utilizan en forma rutinaria en la Unidad de Parasitologa y que han demostrado ser economicos y sensibles. En Chile, an varias patologas apcolas se mantienen como exticas, sin embargo, las presentes presentan un fuerte impacto en la condicin sanitaria de la colmena, como lo son nosemosis en abejas adultas y varroasis en larvas y abejas adultas. Otras son exticas como Acarapis woodi pero se pesquisan en cada muestra que ingresa al laboratorio para acumular antecedentes y demostrar la condicin aludida. Procedimiento : 1. Separar 20 abdmenes de abejas adultas y depositarlos en un mortero. 2. Agregar 5 cc. de agua destilada o corriente. 3. Homogenizar vigorozamente con el pistilo del mortero. 4. Obtener una alicuota de 0,0 15 m1 con un capilar graduado provisto de un bulbo de goma. 5. Depositar la gota entre porta y cubre objeto. 6. Dejar "descansar" la muestra con la finalidad que los elementos en solucin no se desplacen. 7. Observar a 400x. 8. Una muestra se considera positiva cuando se observan las estructuras caractersticas de las esporas de Nosema apis y/o los quistes de Ma1phgamoeba mellificae. 9. Contar las esporas observadas en varios campos y luego obtener un promedio para expresar el resultado en "cantidad (n) de esporas por campo de 400x". Recomendaciones. Es conveniente mantener siempre constante el nmero de abejas a procesar en cada muestra, as mismo el volumen de agua en la solucin, la alicuota obtenida y el instrumento ptico en cuanto al dimetro de su campo, ya que ello permitir la estandarizacin de la prueba y las comparaciones entre las mismas.

Practico N 2

Mtodos de Diagnstico utilizados en la deteccin de Nematodos

Algunos de los mtodos aqu descritos como por ejemplo la tcnica de Teuscher modificado se utiliza no slo para detectar Nematodos, sino que tambien, para el diagnstico de otros parsitos como Protozoos y Cestodos. Pero para efectos prcticos de una buena distribucin de los diferentes mtodos que se vern durante el sementre es que se decidio pasarla en este prctico. Lo mismo ocurre para la tcnica de flotacin en Sal comn. Es una tcnica sencilla, econmica y factible de usar en actividades en Terreno. Coproparasitolgico de Teuscher Flotacin en Sal comn

Coproparasitolgico de Teuscher (Sedimentacin y Flotacin en Sulfato de Zinc 70 %)

Solucin de Trabajo: 700 grs. de sulfato de zinc por cada 1000 cc de agua. Material y equipo necesario: Morteros con pistilos, vasos de precipitado de 250 m1, tamiz con malla n' 60, tubos de 22 m1, tubos de 10 m1 porta objetos, cubre objetos, microscopio y centrfuga de sobremesa. Procedimiento : 1.Separar las muestras fecales para posteriormente pesar 5 grs. de fecas en caso de bovinos y equinos. Para las especies ovina, caprina y otros se pesan 2 grs. 2.La muestra se coloca en un mortero, se disuelve con agua y se homogeneiza. 3.Verter la muestra, a travs de un colador fino (n' 60) a un vaso de precipitado de 250 ml, lavando con porciones pequeas de agua hasta completar un volumen de 200 ml 4.Decantar durante 20 minutos, luego de los cuales se elimina el sobrenadante y se vierte el sedimento en un tubo de ensayo de 22 ml, hasta completarlo, enjuagando cuidadosamente el vaso de precipitado. 5.Esperar 10 minutos y el sobrenadante resultante se elimina depositando el sedimento en un tubo de centrfuga de 15 ml de capacidad, cuidando de enjuagar el tubo de 22 ml con solucin de sulfato de zinc al 70%; vertiendo al tubo de centrfuga hasta 10 ml 6.Centrifugar durante 10 minutos a 1.500 r.p.m. 7.Centrifugado el tubo de 15 ml se saca y se coloca en gradillas, adicionndoles con un gotario solucin de sulfato de zinc al 70% hasta fonnar un menisco convexo, sobre el cual se deposita un cubre objeto de 18 x 18 20 x 20 mm. 8.Esperar 5 minutos para que las estructuras presentes (huevos, ooquistes, quistes y otras) se adhieran a la cara inferior del cubre objetos mediante flotacin. 9.Retirar el cubre objetos y montarlo sobre un porta objetos observando luego al microscopio. 10. Leer con aumentos de 1 00x y 400x.

Resultados : Los resultados se expresan de acuerdo a la siguiente pauta. Positivos : x xx xxx xxxx escasa cantidad regular cantidad abundante cantidad muy abundante cantidad (1-10) (11-50) (51-100) (> 100)

Consideraciones generales de la tcnica : Esta tcnica permite detectar la presencia de protozoos (ooquistes y algunos quistes), helmintos (huevos o larvas de diversos nematodos, huevos de cestodos) y el algunos casos es posible observar algunos artrpodos en las fecas. Si bien es cierto es una de la tcnicas de mayor uso en los laboratorios de la espcialidad, tambin presenta algunos inconvenientes en razn del peso especfico de la solucin, la cual deforma algunas estructuras (huevos de distomas) y destruye quistes de protozoos tales como Giardia sp., Cryptosporidium sp.y no permite la observacin de trofozotos.

Flotacin en Sal comn

Generalidades : Este mtodo es bastante sencillo y econmico, sin embargo presenta menor sensibilidad que el mtodo de Teuscher. Por ello se recomienda en aquellos laboratorios que no posean la implementacin para efectuar otras tcnicas. Materiales : Microscopio ptico, tamices, morteros, tubos de ensayo, porta objetos y cubre objetos. Solucin : Solucin de Cloruro de Sodio (Sal comn) al 30 % ( 300 grs. de sal comn en 1 litro de agua) Procedimiento: 1. Disolver en unos 50 cc. de solucin salina, dos gramos de fecas. 2. Tamizar la solucin. 3. Depositar la solucin en un tubo de ensayo u otro recipiente hasta formar un menisco convexo. 4. Depositar un cubre objeto sobre el menisco.

5. Esperar 10 minutos. 6. Retirar el cubro objetos y montar sobre un porta objetos. 7. Leer en microscopio ptico.

Practico N 3

Mtodos de Diagnstico utilizados en la deteccin de Trematodos

La Tcnica de Sedimentacin, permite pesquisar huevos de Fasciola hepatica, basandose en el principio fsico del peso especfico de los huevos, stos por ser muy pesados sedimentan a una velocidad mayor lo que permite que se observen esperando el tiempo recomendado para este mtodo. Sedimentan a una velocidad de 100 milmetrospor minuto. Para la deteccin de huevos de Cestodos se pueden utilizar otras tcnicas ya vistas o que se vern luego. Por ejemplo, la tcnica de Telemann permite detectarlos o el mtodo de Teuscher modificado tambin (se ver en Nematodos) Mtodo de Sedimentacin Observacin de progltidas

Mtodo de Sedimentacin
Material : Mortero con pistilo, tamiz (colador con malla n 60), vaso de precipitado de 250 mI, portaobjetos, cubreobjetos, pipetas pasteur. Tincin : Lugol:Yodo Yoduro de potasio Agua destilada Verde malaquita:Verde malaquita Agua destilada Procedimiento : 1.Tomar una fraccin de fecas del tamao de una nuez o pesar 5 gramos. 2.Homogenizarlo en un vaso precipitado en unos 200 cc. de solucin con detergente (cualquier detergente lquido comercial). 3.Tamizarlo y rellenar un vaso precipitado de 250 ml. con la misma solucin hasta completar los 200 cc. 4.Dejar sedimentar o decantar por 10 minutos. 5.Eliminar el sobrenadante, agregar ms solucin detergente hasta completar 200 cc. y dejar sedimentar por 10 minutos ms (este procedimiento es recomendable repetirlo cuantas veces sea necesario hasta obtener un sobrenadante de aspecto claro). 6.Transferir el sedimento a una placa Petri u otro recipiente adecuado. 7.Observar bajo lupa estereoscpica. Se puede agregar al sedimento final unas gotas de Lugol o Verde malaquita y se deja teir por un minuto. Consideraciones Generales : Este mtodo se aplica para la deteccin rpida de huevos de alto peso especfico (Fasciola heptica, cestodos y algunos nematodos). Presenta la ventaja de ser sencillo, rpido y econmico, sin embargo su capacidad para detectar las estructuras es ligeramente inferior al mtodo de Teuscher. Es una tcnica complementaria.

1 gr. 2 grs. 30 ml. 1 gr. 1.000 MI.

Identificacin de Progltidas
Material : portaobjetos, cubreobjetos, pinzas, placas de petri, disponer de alguna tincin como rojo carmin u otra. Para la identificacin de progltidas es necesario conocer la morfologa interna y externa de un Cestodo, es decir tener referncia de como es aparato reproductor, como elimina huevos al medio ambiente, si lo hace eliminando de a uno o salen envueltos en una cubierta (capsulas ovigeras), o si elimina proglotidas solas o trozos de su estrobila. Por cuantos orificios (poros genitales) salen estos huevos, entre otros puntos a considerar. Lo ideal para la correcta clasificacion es constar con el escolex de la Tenia, ya que nos pude aportar antecedentes importantes al momento del diagnostico, como pr ejemplo, la presencia de un rostelo, cuantas filas de ganchos posee este rostelo, como es la forma de su s ventosas, si presenta o no apendice retractil en su rostelo, forma de los ganchos, etc. La identificacion de los ejemplares depende muchas veces de la visualizacion de detalles que permitan clasificar un parsito dentro de un gnero o incluso a que especie pertenece.En la identificacion de proglotidas lo ideal sera la tincin de ellas , lo que permite una mejor visualizacin del sistema reproductor y de su disposicin interna.A continuacin se muestra la morfologa interna de una progltida tipo que nos permitir hacer ms facil nuestro diagnstico. Se muestran adems los diferentes tipos de estados larvarios de los Cetodos

c.= Cirro; c.s.= Saco del cirro; g.s.= Seno genital oot.= Ooteca; ov.= Ovario; r.s.= Receptaculo seminal; t.= Testculos; ut.= tero; vag.= Vagina; v.d.= Vaso deferente; vit.= Glndula vitelgena

A continuacin se muestran una serie de imagenes extraidas de E. J. L. Soulsby (6 Ed. 1968) que le servirn para la identificacin de las preparaciones que se le entregarn para su identificacin.

A.= Moniezia benedeni B.= Moniezia expansa

Thysanosoma actiniodes Progltidas maduras

Dipylidium caninum, escolex y progltida madura

Progltida madura de Taenia solium l.e.c.= Canal excretor longitudinal; l.n.= Nervio lateral; oot.= Ooteca y glndula de Mehlis; ov.= Ovario; r.s.= Receptculo seminal; t.= Testculos; ut.= tero; vag.= Vagina; vit.= Glndulas vitelgenas; v.d.= Vaso deferente

Progltidas de Taenia saginata = a y de Taenia solium = b. Observe las ramificaciones uterinas primarias o principales.

Escolex y progltida madura de Taenia pisiformis

Caractersticas Forma del esclex Tamao del esclex Corona de ganchos Tamao de las progltidas Ram. Uterinas primarias Tamao de los huevos

Taenia saginata Rectangular 1 - 2 ml. ausente 1,5 - 2,5 alto x 1 ancho > 12 30 - 40 micrones

Taenia solium Piriforme 0,5 - 1 ml. presente 0,6 - 0,8 alto x 0,5 ancho < 12 30 - 40 micrones

Aqui se muestra la morfologa interna de un Trematodo y sus estados evolutivos (Fasciola hepatica)

Prctico N4

Mtodos de diagnsticos utilizados para la deteccin de artrpodos

Para la deteccin de artrpodos, el profesional que tome la muestre, debe en primer lugar hacer una buena anamnesis, sobre la aparcin de las lesiones. En segundo lugar detectar si es que el agente est presente (en caso de que los artrpodos sean de gran tamao, pulgas, piojos, garrapatas, etc), o si no es visible, deber tomar una buena muestra. Una buena muestra, es aquella que nos permite pesquisar el agente parasitario del cual se sospecha. Para el caso de los artrpodos detectables por medio microscopio, se debe raspar con una hoja de bistur del centro y borde de las lesiones, hasta que sangre y extraer pelos de raiz. A continuacin se vern dos mtodos utilizados em la detecin de artrpodos:

Ectoparasitolgico Deteccin de Varroa sp.

Ectoparasitolgico
Solucin : Hidrxido de sodio al 3%, Lactofenol (1 volumen de cido lctico, 1 volumen de fenol o cido carblico, 1 volumen de glicerina, 1 volumen de agua destilada que puede usarse o no, dependiendo de cun consistente se desee la solucin). Materiales : Placas reloj, bistur, pinzas. Procedimiento : 1.Las escamas o pelos son depositados en la placa reloj, agregando gotas de lactofenol se deja reposar durante 10 minutos aproximadamente para luego observar las estructuras parasitarias en el microscopio estereoscpico. 2.En caso de no tener lactofenol es posible usar hidrxido de sodio al 3%, calentando la placa reloj en el mechero, para luego ser observada en el microscopio estereoscpico microscopio ptico. 3.La lectura debe ser efectuada a aumento adecuado para la observacin del ectoparsito buscado. 4.La identificacin se efecta en base a claves pictricas existentes o segn experiencia del observador.

Deteccin de Varroa sp
Consideraciones Generales : La presencia de Varroa destructor puede ser registrada tanto en la cra operculada como en abejas adultas. Generalmente el diagnstico es efectuado en las abejas adultas cuando ellas cumplen la fase de permanencia y diseminacin, en la superficie de las obreras y znganos y pocas veces se efecta dicho diagnstico en la fase reproductiva que ocurre en las larvas. En este documento se expondrn los dos metodologas. En cra operculada. Varroa destructor prefiere las larvas de zngano mas que las de obreras para efectuar su desarrollo reproductivo, en una proporcin de 9-10 veces znganos / 1 vez obreras, debido a una serie de mecanismos entre los cuales se cuenta la mayor produccin de hormona juvenil 3 por parte de las larvas de znganos, rugosidad del oprculo y duracin de la fase operculada. En algunos casos la infestacin es tan alta que los caros tambin atacan larvas de obreras. Procedimiento : 1. Abrir los oprculos bajo una fuente de luz directa, idealmente iluminador de fibra ptica de haz de luz fra y dirigible

2. Extraer cuidadosamente la larva. 3. Examinar su superficie, bordes y fondo de las celdillas. 4. El hallazgo de caros en el interior debe ser registrado, recuperar algunos ejemplares e identificarlos bajo microscopio, a fin de asegurar la presencia de Varroa destructor de acuerdo a sus estados de desarrollo. 5. En celdillas abiertas y sin cra es posible determinar la presencia anterior de Varroa destructor mediante el hallazgo de pequeas manchas de color blanco en los bordes internos de las celdillas. Ellas corresponden a las fecas que deposita la madre de los nuevos caros para marcar el lugar donde acudirn a alimentarse las cras. 6. El resultado se expresa en presencia y nmero de celdillas examinadas versus detectadas infectadas o ausencia.

En abejas adultas Procedimiento : 1. Las abejas obreras adultas, se someten a una inspeccin visual global inicial Para detectar alguna malformacin inducida por la presencia de varroas (falta de alas, patas, segmentos del abdomen, alas rugosas u otros). 2. Las abejas se depositan en la cmara de un doble tamiz, donde el primer tamiz retiene las abejas y es lo suficientemente amplio para permitir el paso de los caros; mientras que el segundo tamiz retiene los caros y es desmontable. 3. Todo el sistema se somete a la accin de un chorro de agua (de la llave) idealmente tibia a caliente. 4. Se agitan durante tres a cinco minutos. 5. Se desmonta el segundo tamiz y se observa la presencia de caros. 6. En caso de encontrar Varroa destructor, ellas corresponden a hembras adultas, las que deben contarse, al igual que las abejas sometidas a la accin de la corriente de agua. 7. El resultado se expresa en n de varroas encontrados versus n de abejas analizadas, siendo la expresin de porcentaje (%) inadecuada, por cuanto la distribucin de los caros no es homognea en las abej as, as encontrar 10 caros en 100 abej as no es un 10%, ya que ellos pueden haber estado en solo 2 o 3 abejas.