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EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE ADN DE BOVINOS DE DOBLE PROPSITO ESCOGIDOS MEDIANTE NDICES DE SELECCIN EN EARTH
J.A. Saldaa, A.C. Tamayo1, W.A. Rojas
Universidad EARTH Las Mercedes de Gucimo, Limn, Costa Rica Recibido 18 de enero 2007. Aceptado 25 de junio 2007.

RESUMEN Los sistemas de produccin de ganado de doble propsito de Amrica Latina, se caracterizan por presentar niveles productivos o reproductivos bajos si se comparan con sistemas de produccin de carne o leche en Norteamrica o Europa. La seleccin animal y la biologa molecular pueden ser herramientas tiles para encontrar, tanto en campo como en laboratorio, las mejores caractersticas productivas o reproductivas de importancia econmica que garanticen la sostenibilidad de los sistemas de produccin en las regiones tropicales. El objetivo de este trabajo fue el validar protocolos de extraccin y cuantificacin de ADN de bovinos [Brahman (Bos indicus L.) y Holstein (Bos taurus L.)] seleccionados de doble propsito en la Finca Pecuaria Integrada de EARTH (FPI). Para cumplir con este objetivo se evaluaron 731 datos de 117 animales, con el fin de escoger los mejores de ellos a travs de ndices de seleccin para las caractersticas de produccin de leche, peso al destete e ndice de ganancia diaria de peso. Adems se evaluaron tres diferentes metodologas de extraccin de ADN a partir de sangre mediante electroforesis y espectrofotometra. A travs de este trabajo se lograron seleccionar los mejores animales del hato y se valid un protocolo de extraccin de ADN. Palabras clave: ADN, ganado doble propsito, ndices de seleccin, protocolos. ABSTRACT The production systems of dual purpose cattle in Latin America are known for having low productive and reproductive rates compared with similar systems in North America or Europe. Animal selection and molecular biology can be helpful tools to find, both in the field and in the laboratory, better productive and reproductive traits that guarantee the economic sustainability of these systems in tropical regions. The main objective of this study was to propose valid protocols of DNA extraction and quantification from selected dual purpose cattle [Brahman (Bos indicus L.) y Holstein (Bos taurus L.)] at EARTHs Integrated Livestock Farm. To accomplish this objective, 731 data from 117 cows were analyzed, in order to choose through selection indexes, the best cattle from the herd based on milk production, weaning weight of the calves and daily weight gain index. Three different methods to isolate DNA were evaluated through electrophoresis and spectrophotometry. The best cattle from the herd were selected and the DNA extraction protocol was validated.

Contacto: Ana Cristina Tamayo (atamayo@earth.ac.cr)

ISSN: 1659-2751

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Key words: DNA, dual purpose cattle, selection indexes, protocols. INTRODUCCIN La produccin bovina mundial ha tenido intensos cambios en las ltimas dcadas gracias a la implementacin de nuevas tecnologas en el mejoramiento gentico y en la seleccin de caracteres deseados en poblaciones de individuos, las cuales tienen el objetivo de incrementar la eficiencia en la produccin en razas animales. Verde (2000) menciona que evaluar la capacidad gentica de los animales dentro de una poblacin, permitir detectar cules de ellos son portadores de mejores composiciones genticas para una determinada caracterstica productiva o reproductiva; por lo tanto, se facilitara el establecimiento de un programa cientfico de seleccin de reproductores o reproductoras que garanticen el mejoramiento progresivo de la produccin dentro del rebao donde se aplique el programa. Jurado y Serrano (1995) sealan que los animales son valiosos por su fenotipo, pues es la produccin la que proporciona el beneficio econmico, pero ste no se transmite de generacin en generacin. El fenotipo es el resultado de las interacciones del genotipo del animal y el ambiente, por lo que determinados animales deben ser seleccionados por su capacidad de transmitir a su descendencia, la gentica necesaria para ser tomados en cuenta dentro de un programa de mejoramiento. El genotipo de un animal es el que expresa la combinacin de genes que posee y que lo hace diferente del resto del grupo. Es por esta razn que es importante extraer el material gentico de cada animal, porque mediante su caracterizacin, se puede obtener la informacin necesaria para asociar las evaluaciones hechas en laboratorio con la informacin gentica evaluada en campo. Las pruebas de caracterizacin de material gentico en animales a travs de marcadores moleculares requieren de mtodos de extraccin y cuantificacin de ADN de clulas del animal, donde se debe aislar ADN puro y en cantidad adecuada para la prueba en estudio. Mediante este proyecto de graduacin se quiso validar un protocolo de extraccin de ADN estndar como base para estudios de tcnicas de biologa molecular de especies bovinas en el laboratorio de Ciencias Naturales de la Universidad EARTH. Para ello, los bovinos a los cuales se les realiz la toma de muestras fueron seleccionados mediante un estudio de registros productivos, incluyendo al menos 115 animales para las caractersticas de produccin de leche por lactancia, calidad de la leche, peso al destete de las cras y ganancia diaria de las cras, para lo cual se cont con la informacin de los animales que mostraron estadsticamente los mejores valores genticos dados por los modelos de seleccin. De esta manera, la evaluacin de fenotipos en campo y el uso de metodologas de laboratorio como apoyo podran beneficiar la productividad de la finca, el aprendizaje de los estudiantes y a la universidad al contar con nuevas herramientas de investigacin en biologa molecular y modelos de seleccin gentica para especies animales. MATERIALES Y MTODOS El proyecto se llev a cabo en la Universidad EARTH, localizada en el trpico hmedo de las Mercedes de Gucimo, provincia de Limn, Costa Rica y tuvo una duracin de ocho meses. Para realizar las evaluaciones de los mejores animales, se determinaron las caractersticas de

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produccin de leche ajustada a 305 das, peso al destete de las cras ajustado a 205 das e ndice de ganancia diaria de peso ajustado a 205 das, debido al impacto econmico que tienen estas caractersticas en los sistemas de produccin de doble propsito. Se evaluaron los cruces raciales 50 % Brahman (Bos indicus) x 50 % Holstein (Bos taurus), 75 % Brahman (B. indicus) x 25 % Holstein (B. taurus) y 50 % Brahman (B. indicus) x 50 % Jersey (B. taurus). Para la seleccin de los animales se escogieron aqullos que estuvieron por arriba de una desviacin estndar segn el modelo propuesto por Vlez (1997), el cual destaca el mrito de produccin individual de cada animal. El modelo de seleccin utilizado fue el siguiente: I= h21V1F1 + h22V2F2 + h2nVnFn ; Donde, I= ndice h2 = heredabilidad de cada carcter V= fraccin de la importancia econmica del carcter F= valor fenotpico de cada carcter expresado como diferencia del promedio de la poblacin. Para la determinacin del ndice de cada animal, se tomaron valores de heredabilidad (h2) publicados por Madalena (2001), Vlez (1997), Eler et al. (1995) y Cardellino y Rovira (1985), los cuales son presentados en el Cuadro 1. Cuadro 1. Valores de heredabilidad (h2) para las caractersticas de produccin de leche, peso de las cras al destete y ganancia diaria de peso de las cras. Caracterstica Produccin de leche Peso al destete Ganancia diaria de peso
Fuente: Cardellino y Rovira (1985).

Heredabilidad (h2) 0.25 0.05 0.20 0.05 0.30 0.05

Rango Media - Alta Media Alta

Las estimaciones econmicas para los criterios de seleccin fueron establecidas con base a los criterios y conocimientos del autor. El valor establecido para los criterios de seleccin de produccin de leche a 305 das, peso al destete de las cras a 205 das e ndice de ganancia diaria de peso a 205 das fue de 0.50, 0.25 y 0.25, respectivamente Para determinar el valor fenotpico de cada criterio (F), se obtuvo la diferencia del valor del carcter en el animal del promedio de la poblacin, y se dividi sta por la desviacin estndar de la caracterstica. En cuanto a la validacin de los protocolos de aislamiento de ADN, se evaluaron dos metodologas para la extraccin de ADN con solventes orgnicos (fenol,

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cloroformo y alcohol isoamlico) y uno con una resina quelante (Chelex 100) mediante electroforesis y espectrofotometra. RESULTADOS Y DISCUSIN Los resultados del anlisis estadstico de los registros productivos del hato de doble propsito para las variables de produccin de leche ajustado a 305 das (PL305), peso al destete de las cras ajustado a 205 das (PD205) e ndice de ganancia diaria de peso ajustado a los 205 das (IGP205) fueron de 1321,58 kg 402.84 kg; 116.48 kg 17.45 kg y 0.410 kg 0.086 kg, respectivamente. El coeficiente de variacin de la poblacin expresado como porcentaje correspondi al 30 %, 21 % y 15 % para las variables de produccin de leche ajustado a 305 das (PL305), peso al destete ajustado a 205 das (PD205) e ndice de ganancia de peso diario ajustado a 205 das (IGP205), respectivamente. Se evaluaron los registros de 117 animales para la variable de produccin de leche ajustado a 305 das. Aproximadamente el 25 % de esta poblacin se ubic en el promedio de produccin de leche (1322 kg), 20 % de los animales se agruparon ligeramente superior a la media del hato y 19 % de los animales del hato se agruparon ligeramente por debajo del valor de la media. Los valores extremos de produccin, mximos y mnimos, correspondieron al 2 % y 1 % de los animales del hato respectivamente. Los valores mximos de produccin alcanzaron registros de 2450 kg de leche y los valores mnimos para la variable PL305 fueron de 82 kg. La media general de las cras del hato en produccin para la variable de PD205 fue de 116.48 kg, cuya distribucin en porcentaje dentro de la poblacin fue del 22 %. El promedio obtenido para la variable IGP205 fue de 0.410 kg por da. Esta variable se relaciona con la variable de PD205 porque durante la fase de amamantamiento, la vaca ejerce una influencia entre su capacidad de cra y el crecimiento del ternero. Si se obtienen valores relativamente bajos al destete, es de esperar que la ganancia de peso diaria al destete sea tambin baja, razn por la cual se obtienen bajos pesos al destete en sistemas doble propsito. El ndice de seleccin para cada animal se obtuvo mediante la aplicacin de la metodologa propuesta por Vlez (1997), en la que se tom en cuenta la heredabilidad de los rasgos a mejorar, el valor de la fraccin econmica de cada rasgo y el valor fenotpico para cada uno de los rasgos. Mediante este ndice, valores de cero (0.0) indican que los animales estn en el promedio del hato para todos los rasgos en estudio, o bien, un valor de cero (0.0) tambin puede representar el valor promedio de ese animal contra el valor del hato para una caracterstica en especial. Valores positivos indican que los animales tienen mritos de produccin individual mejor o ms alto que el promedio del hato y valores negativos indican que los animales estn por debajo de la calificacin general del hato. Animales con valores negativos son aquellos animales que han tenido valores fenotpicos ms bajos que el promedio del hato para cada caracterstica algunas de ellas. Para la estimacin del ndice de seleccin, los resultados de las evaluaciones de los animales con valores arriba del promedio del hato, indicaron que al combinar los rasgos heredables de cada caracterstica y los rasgos fenotpicos de los mismos, se pueden haber seleccionado animales que presenten rasgos hereditarios positivos de produccin. Es decir, mediante este ndice se destac

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el mrito individual en produccin de cada animal, ya que los valores de heredabilidad y fraccin de la importancia econmica de cada caracterstica, fueron igualmente aplicados para todos los animales del hato, lo que quiere decir que sus frecuencias genticas son mejores que las del promedio del hato y que al agruparlos, puede hacerse un ncleo de animales de mejor valor gentico que el resto del hato. En la Figura 1 se presentan los datos de dispersin en porcentaje del ndice de seleccin en el hato doble propsito evaluado. Se observa que el 25 % de los animales evaluados se ubicaron en el promedio del hato, mientras que el 29 % de ellos, se ubicaron arriba del promedio del ndice (0.00). Para efectos del proyecto, se estableci que se elegiran los animales que se encontraran en el promedio del hato ms una (1.0) desviacin estndar, por lo que los animales cuyo ndice sea mayor a 0.1563 sern los animales elegidos para colectar muestras de sangre y extraer su ADN.
Histograma de dispersin del ndice de Seleccin
30 25 20 Porcentaje 15 10 5 0
Mean 0,000006047 StDev 0,1563 N 117

-0,4

-0,2 0,0 0,2 0,4 Valores del ndice de seleccin

0,6

Figura 1. Histograma de dispersin del ndice de seleccin para el hato de doble propsito de la FPI. Los animales evaluados ubicados por encima de ese valor forman parte del 11 % de la poblacin de animales evaluados, con rangos mximos de 0.607 y mnimos de 0.1605 dentro de ese segmento de la poblacin. En el Cuadro 2 se muestran los animales seleccionados segn el ndice.

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Cuadro 2. Animales del hato de FPI seleccionados segn mejor ndice. ID del Animal O 668 O 4700 2458 82106 5102 21604 32402 6224 5212 47/4 O 5400 36 5666 Componentes del ndice de Seleccin PL305 0.014 0.102 0.282 0.233 0.206 0.242 0.239 0.157 0.153 0.025 0.079 0.050 0.056 PD205 0.243 0.121 0.000 0.007 0.018 0.000 0.000 0.027 0.012 0.065 0.029 0.045 0.047 IGP205 0.350 0.186 0.000 0.015 0.019 0.000 0.000 0.039 0.022 0.084 0.060 0.071 0.059 ndice total 0.607 0.409 0.282 0.255 0.243 0.242 0.239 0.222 0.186 0.175 0.168 0.167 0.162

La evaluacin de los protocolos de extraccin de ADN mediante electroforesis para cada mtodo, se hizo preparando geles de agarosa al 1.0 % para cuantificar la calidad de los cidos nucleicos a travs de su observacin bajo luz ultravioleta y comparndolos contra un patrn de banda con concentracin de ADN conocida. En la Figura 2 se presentan los resultados de la electroforesis del Mtodo 1 para la cuantificacin de ADN bovino, obtenido mediante la metodologa de extraccin usando fenol, cloroformo y alcohol isoamlico en proporcin 25:24:1, SDS 20 % y Proteinasa K 10 mg/mL y buffers de extraccin Lysys Buffer pH 7.4 y SE buffer pH 8.0 (mtodo propuesto por NIH (2005) con modificaciones hechas por los autores). Se observan las muestras de ADN bovino tomado de animales de la FPI. Se puede observar la luminosidad del ADN extrado usando bromuro de etidio y bajo la accin de la luz ultravioleta. La luminosidad en cada banda representa la presencia de ADN en la muestra. Mediante este protocolo se pueden llegar a extraer cantidades relativamente altas de ADN, pero se tiene poca pureza en la muestra, lo que se verifica por las coloraciones inconsistentes en los bordes de las bandas y en los pozos del gel.

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Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % para la cuantificacin de ADN a partir de muestras de sangre usando el Mtodo 1. En la Figura 3 se presentan los resultados de la electroforesis para la cuantificacin de ADN bovino, obtenido mediante la metodologa 2 de extraccin usando buffer de extraccin RCLB pH 8.0, WCLB pH 8.0, fenol equilibrado y cloroformo - alcohol isoamlico en proporcin 24:1, SDS 10 % y Proteinasa K 10 mg/mL (metodologa utilizada en el laboratorio de biologa molecular de la Universidad de Wisconsin-Madison con modificaciones hechas por los autores). Los resultados obtenidos de la electroforesis de ADN extrado a partir de muestras de sangre utilizando el Mtodo 2, resaltan que mediante este protocolo se obtuvieron muestras con similar concentracin. En todas las bandas se observa la misma consistencia en luminosidad y avance en el gel, por lo que podemos llegar a afirmar que mediante este protocolo se obtiene ADN en excelentes cantidades y concentracin.

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % para la cuantificacin de ADN a partir de muestras de sangre usando el Mtodo 2.

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El tercer mtodo de extraccin se caracteriz por emplear el reactivo Chelex en el aislamiento de ADN, el cual es una resina quelante que acta sobre los cidos nucleicos, atrapando las cadenas de ADN al momento que es desnaturalizado y evita su dao directo cuando es expuesto a altas temperaturas2, sin embargo no fue posible observar bandas de ADN. En la Figura 4 se presentan los resultados de la electroforesis realizada utilizando el Mtodo 3.

Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % para la cuantificacin de ADN a partir de muestras de sangre usando el Mtodo 3. Los resultados obtenidos de las evaluaciones hechas mediante espectrofotometra para los tres protocolos se presentan en el Cuadro 3. Mientras mayores son las proporciones de absorbancia A260/A280, mayor es la pureza de las muestras y mayor ser la concentracin obtenidas en las mismas. Cuadro 3. Valores de la proporcin de absorbancia (A260/A280) para diferentes muestras medido por espectrofotometra, segn cada mtodo de aislamiento de ADN. Nmero de muestra 1 2 3 4 5 6 Proporciones de absorbancia (A260/A280) Mtodo 1 1.550 1.450 1.375 1.300 1.388 1.368 Mtodo 2 1.485 1.500 1.700 1.743 1.650 1.500 Mtodo 3 1.667 1.400 1.750 1.500 1.500 1.600

Arce, V. 2006. Caractersticas del reactivo Chelex 100 para la extraccin de ADN. (Comunicacin personal) Complejo de Medicina Legal, Poder Judicial. Heredia, CR.

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Los resultados de las proporciones de absorbancia en las muestras de ADN nos pueden ser tiles para conocer la pureza segn cada caso y diferenciar as la calidad del mtodo de aislamiento. En el Cuadro 4 se presentan los resultados de los clculos de la concentracin de ADN en nanogramos por microlitro (ng/L) de cada muestra evaluada segn cada mtodo de extraccin. Cuadro 4. Valores de la concentracin de ADN cuantificado por espectrofotometra expresada en ng/L segn cada mtodo de aislamiento. Nmero de muestra 1 2 3 4 5 6 Cuantificacin de ADN (ng/L) por espectrofotometra Mtodo 1 68.0 56.0 68.0 48.0 92.0 80.0 Mtodo 2 224.0 208.0 144.0 152.0 104.0 128.0 Mtodo 3 76.0 96.0 104.0 116.0 80.0 56.0

Si observamos los valores obtenidos en los Cuadros 3 y 4, el mtodo de extraccin con el cual se obtuvo una mejor proporcin de absorbancia y un mejor rendimiento de cidos nucleicos, fue el mtodo 2, el cual se puede verificar por su calidad dada por la electroforesis (Figura 3). Por lo tanto, a travs de este mtodo se puede conseguir una mejor calidad y cantidad de ADN a partir de muestras de sangre que con los otros mtodos evaluados. CONCLUSIONES Se escogieron los mejores animales doble propsito de la Finca Pecuaria Integrada de EARTH mediante el uso de la metodologa de ndices de seleccin, logrando separar el 11 % de los mejores animales del hato para las caractersticas de produccin de leche, peso al destete de las cras e ndice de ganancia de peso de las cras. Los mejores animales seleccionados mediante la metodologa propuesta para las variables estudiadas, tuvieron ndices entre 0.156 y 0.607. Se evaluaron dos mtodos de extraccin de ADN a partir de sangre de bovinos basados en la extraccin convencional con solventes orgnicos, y un mtodo de extraccin utilizando una resina quelante. Se emplearon las metodologas de electroforesis y espectrofotometra para la evaluacin de la calidad y cantidad de ADN extrado, logrando determinar el mejor mtodo de extraccin de ADN. Mediante las dos metodologas empleadas para la cuantificacin de ADN, se determin que el Mtodo 2, el cual se bas en la extraccin de ADN con fenol, cloroformo y alcohol isoamlico, fue el mejor mtodo de extraccin de ADN, logrando obtener buenos rendimientos y calidad.

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LITERATURA CITADA Cardellino, R.; Rovira, J. 1985. Mejoramiento gentico animal. Montevideo, UY. 253 p. Eler, J.P.; Van Vleck, L.D.; Ferraz, J.B.S.; Lbo, R.B. 1995. Estimation of variants due to direct and maternal effects for growth traits of Nelore cattle. Journal of Animal Science 73(11): 3253-3258. Jurado, J.J.; Serrano, M. 1995. Gentica cuantitativa: particin del fenotipo. In Gentica, Patologa, Higiene y Residuos Animales. Zootecnia: Bases de la Produccin Animal, V.4. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid, ES. p. 93-107. Madalena, F.E. 2001. Programas prcticos aplicados en el mejoramiento gentico de hatos ceb y de ncleos de raza. In Produccin de Leche y Carne en el Trpico Clido: Una Realidad Eficiente en el Ao 2001. Restrepo, A.; Senz, M.C. (Eds.). Comunicaciones y Ediciones. Bogot, CO. p. 52-63. NIH (National Institute of Health, US), 2005. DNA preparation from blood (en lnea). Maryland, US. Consultado el 3 de febrero del 2006. Disponible en http://www.riedlab.nci.nih.gov/publications/DNA%20Prep_Blood%20.pdf Vlez, M. 1997. Produccin de Ganado Lechero en el Trpico. 2 ed. Zamorano Academic Press. Tegucigalpa, HN. 189 p. Verde, O. 2000. Caracteres reproductivos a considerar en un programa de evaluacin gentica para bovinos de carne (en lnea). Universidad Central de Venezuela. Maracay, VE. Consultado el 28 de junio del 2006. Disponible en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/CaracteresReproductivos.pdf