Column Diameter, Linear Velocity and Column Efficiency

Feb 1, 2010 By: John W. Dolan LCGC Europe Hace poco tuve una pregunta acerca de algunos cambios que tuvieron lugar en la edicin 2009 de la Farmacopea de EE.UU.. En la USP 32, Captulo General 621,1 los ajustes permitidos para cumplir con la idoneidad del sistema de cromatografa lquida (LC) incluyen un cambio en el dimetro de la columna interna de 25%. Se hizo un cambio en la USP 32 Suplemento 2.2 Este declar que el dimetro interno de la columna "puede ser ajustado, siempre que la velocidad lineal se mantiene constante." La persona no estaba segura de cmo este ajuste de la velocidad lineal debe hacerse, y se pregunt sobre el efecto que tendra en la eficiencia de la columna. Ajuste del caudal Gran parte de la banda de ampliacin que tiene lugar dentro de una columna de LC es un resultado de la difusin lenta del analito dentro y fuera de los poros en el relleno de la columna. Esto significa que el caudal de la fase mvil puede tener un efecto sobre la anchura volumtrica de un pico. Por el ancho de aforado, me refiero a la anchura del pico en unidades de volumen (por ejemplo, mililitros o microlitros), no el tiempo. En los das cuando las partculas 10 MICROm de dimetro fueron utilizados como relleno de la columna, una notable reduccin en la eficiencia de la columna se pudo observar cuando el caudal se aument. Cuanto menor sea el dimetro de partcula, menor es la dependencia de eficiencia de la columna sobre el caudal. Aunque es fcil de demostrar una prdida de eficacia con un aumento de la tasa de flujo para analitos muy buen comportamiento con 3 y 5 MICROm de dimetro de partculas, un cambio dos veces en la velocidad de flujo es raramente observado con aplicaciones reales. Con las partculas sub-micras 3, el caudal tiene poca influencia sobre la eficiencia de la columna, incluso con los compuestos de buen comportamiento. En esta discusin, me he referido a la velocidad de flujo, pero la variable importante no es el caudal, pero la velocidad lineal. La velocidad lineal es la velocidad a la que la fase mvil viaja a travs de la columna, por ejemplo, en milmetros por segundo. Para la comparacin de las condiciones equivalentes entre columnas de diferentes dimetros internos, la velocidad lineal debe mantenerse constante. Para mantener la velocidad lineal constante, la velocidad de flujo debe ser ajustada en proporcin a la columna de rea de seccin transversal, que es directamente proporcional al cuadrado de la relacin de los dimetros de las columnas. Para la discusin actual, vamos a considerar dos casos. El primero es un cambio desde una de 4,6 mm i.d. columna a una de 2,1 mm i.d. columna: (4.6/2.1) 2 = 4,8 5 y el cambio de 4,6 mm a 1,0 mm: (4.6/1.0) 2 = 21,2 20

En ambos casos, vamos a considerar las aproximaciones como lo suficientemente cerca como para el trabajo prctico y ms fcil sin duda para recordar y utilizar para los clculos mentales. Esto significa que para velocidades lineales equivalentes, un cambio desde un 4,6 mm di columna opera a 1 ml / min a una de 2,1 mm i.d. columna requerira un ajuste de la tasa de flujo de cinco veces, o de 1,0 / 5 = 0,2 ml / min. Un cambio a un i.d. 1,0 mm la columna que significara un nuevo caudal de 1.0/20 = 50 l / min. El subsidio Antiguo USP 32 permite un cambio en el dimetro de la columna 25% .1 Esto significaba que un 4,6 mm di columna podra ser cambiado por cualquier columna en el 3,45-5,75 mm de dimetro rango. Sospecho que esta especificacin fue originalmente escrito para permitir que las viejas aguas Bondapak 300 mm x 3,9 mm de columna que se utilizar en lugar de la Identificacin de 4,6 mm versiones. USP 32 tambin permite un cambio de 50% en la tasa de flujo. El 3,9 mm i.d. columna requerira una reduccin de caudal de 30% de la velocidad lineal constante, por lo que el caudal necesario cambio estaba cubierto. Nota, sin embargo, que el cambio de caudal no fue requerido por la USP, por lo que un cambio significativo en la velocidad lineal se permita. Actualmente, sin embargo, los dimetros de las columnas ms populares internas son de 4,6 mm, 2,1 y 1,0, por lo que el 25% del dimetro de cambio de asignacin eliminado la opcin de utilizar de menor dimetro interno-columnas. Es evidente que un cambio en la USP se necesitaba. El nuevo subsidio El cambio en la USP 32, Suplemento 2 a primera vista parece ms complicado por la introduccin de la velocidad lineal, pero en realidad, da ms flexibilidad y asegura un resultado ms que el equivalente a la asignacin de edad. Ahora cualquier dimetro de la columna se puede utilizar, por lo que el 2,1 y 1,0 mm di columnas se pueden utilizar adems del 3,9 mm di seres. Adems, el ajuste de la velocidad lineal significa que las columnas se opera bajo condiciones cromatogrficas ms similares que antes. Por apropiadamente ajustando la velocidad lineal, la presin en la columna y los tiempos de retencin de analitos debe ser el mismo dimetro de la columna cuando se cambia columna de la eficiencia Lo que no se trata en la pregunta original era por eso que uno desea utilizar una columna de diferente dimetro. Hay dos ventajas principales, disminucin de fase mvil y el consumo de una reduccin en el volumen mximo. Si el caudal se ajusta para una velocidad lineal constante, como se discuti anteriormente, los tiempos de retencin debe ser el mismo cuando se cambia dimetro de la columna, por lo que el tiempo de ejecucin de la muestra no se modificar. Si el tiempo de ejecucin es el mismo y la velocidad de flujo se reduce, la fase menos mvil ser utilizado. Esto es atractivo, sobre todo en estos tiempos de precios altos de acetonitrilo.

El volumen mximo (anchura del pico en trminos volumtricos) cae con la reduccin del rea en seccin transversal de la columna, o cuadrado del cambio de dimetro. Esto se traduce en picos proporcionalmente ms altas, suponiendo que la misma masa de la muestra pueden ser cargados en la columna, que puede o no ser verdad. As, al pasar de un 4,6 mm i.d. columna a una columna de 2,1 mm de anchura del pico debe reducir por cinco veces y aumentar la altura del pico en la misma cantidad (suponiendo la misma masa de la muestra se inyecta). Esto conduce a la segunda parte de la pregunta original, con respecto a cmo un cambio en el dimetro de columna afecta a la eficiencia de la columna. En teora, no debera haber ninguna dependencia de la eficiencia en dimetro de la columna, pero a partir de un punto de vista prctico, estrechas columnas son generalmente menos eficaces que los de mayor dimetro. El factor principal para determinar la eficiencia de la columna es el nmero de dimetros de partculas en la longitud de la columna. En condiciones ideales, una columna bien lleno debe tener una altura H placa equivale aproximadamente a dos dimetros de partculas DP. La eficiencia de la columna, o columna nmero de placa N se calcula como N=L/H donde L es la longitud de la columna. Para una partcula 5 micras (DP), dos dimetros de partcula dara H = 10 micras = 0,01 mm. Embalado en un 150 mm de longitud de columna, esto dara N = 150/0.01 = 15000 Es posible que pueda conseguir 15000 placas para una de 150 mm x 4,6 mm de columna montada en un lquido de alto rendimiento cromatografa (HPLC) sistema optimizado para la prueba de la columna y utilizando un compuesto de ensayo de buen comportamiento, tal como tolueno o benzoato de metilo. Sin embargo, para muestras reales en el sistema de un laboratorio tpico de HPLC, la mayora de nosotros se sentira muy bueno para obtener 10.000 placas para esta columna. Incluso si se utiliza tolueno o benzoato de metilo, se podra obtener slo 12000 placas en el sistema en el laboratorio. Efectos Extracolumn Cul es la razn de la reduccin del nmero de la placa en un verdadero sistema de HPLC? Parte de ello tiene que ver con extracolumn ensanchamiento de los picos. As es como funciona. La anchura de un pico en el cromatograma se puede expresar como .

donde WT es la anchura del pico observado en la lnea base, trazada entre tangentes a los lados del pico, Wc es el pico de ampliacin que tiene lugar como el analito viaja a travs de la columna y WEC es el pico ampliacin fuera de la columna, a menudo referido como extracolumn efectos.

Tenemos toda la ampliacin de pico observado dentro de la columna WC. Por ejemplo, con una separacin isocrtica, los picos eluidos temprana son ms estrechos que ms tarde-eluidas seres. Esto es porque cuanto mayor sea el compuesto permanece en la columna, el ms amplio que es. Algunos otros factores relacionados con pico en columna ampliacin incluyen el dimetro de partcula, temperatura de la columna, la viscosidad de la fase mvil y coeficiente de difusin del analito. Extracolumn efectos incluyen todas las fuentes de ensanchamiento de los picos excluyendo la propia columna. Estos incluyen cosas tales como el volumen de inyeccin y el disolvente, la longitud y el dimetro de la conexin de tubos entre el inyector automtico y la columna y entre la columna y el detector, el detector de volumen celular y la constante de tiempo y la velocidad de datos del sistema de datos. Para la presente discusin, vamos a considerar esto como una influencia compuesto. Para un sistema convencional de LC, tales como los que utilizan la mayora de nosotros, configurada para el anlisis de rutina con 150 mm x 4,6 mm di columnas rellenas con partculas de 5 micras de dimetro, Wec 15 l es un valor tpico. Impact of Wec on N and Rs Es un ejercicio interesante para evaluar la degradacin del nmero de columna N placa y la resolucin, R, para las columnas de diferente Table 1: Extracolumn dimetro. En la Tabla 1 que han resumido los effects for k = 1 datos para un pico con el factor de retencin, k = 1. Los supuestos en ambas tablas son una longitud L = 150 mm de columna; columna de dimetro interior, dc = 4,6 mm (o como se ha indicado), el volumen de la columna de vaco 60% del volumen de la columna, tasa de flujo F = 2,0 ml / min para el 4,6 mm de columna, partculas de 5 micras para un nmero de placa de columna, N = 15000, en ausencia de extracolumn efectos, y un volumen de 15 l extracolumn. Los datos se muestran de 4,6 mm, 2,1 y 1,0 i.d. columnas. Me han redondeado los valores que se muestran para mayor claridad, as que si usted est tratando de repetir mis clculos en una hoja de clculo, mantenga el nmero mximo de cifras significativas para todos los clculos. En las columnas segunda y tercera de la Tabla 1, se puede ver la VM volumen de la columna calculada para cada dimetro de la columna y los ajustes de caudal necesarios para mantener una velocidad lineal constante. Para un pico temprano-eluido con k = 1 y un 4,6 mm de dimetro columna, hay un aumento muy pequeo en anchura del pico resultante del volumen extracolumn. Sin embargo, el 15 l de volumen extracolumn aumenta la anchura de pico por ms de tres veces para la Identificacin de 1,0 mm columna (2,9 frente a 10 s). Esto reduce el nmero de placa por ms de un orden de magnitud, y porque la resolucin es proporcional a la raz cuadrada del nmero de placas, la resolucin disminuye en un 71%! La mayora de nosotros considerar una cada en la resolucin de 5% o menos para ser de poca importancia, pero es obvio a partir de los datos de la Tabla 1 que el uso de un ID de 2,1 mm o 1,0 columna con un pico temprano-eluida no producir resultados satisfactorios con este sistema LC.

La Tabla 2 resume el impacto de 15 l de volumen en extracolumn picos con grandes valores de k. Se puede observar que los picos ms retenidas estn influenciados por extracolumn menos volumen para todos los dimetros de las columnas. Se espera que esto, porque el ancho de pico en la columna Wc aumenta con la retencin, por lo que con WEC constante, el WT anchura de pico observado se vern menos afectados. Sin embargo, para las condiciones cromatogrficas elegidas, el 2,1 mm di columna es aceptable (R-prdida de < 5%) slo para los picos bien conservados. El 1,0 mm i.d. columna no produce resultados satisfactorios en cualquier tiempo de retencin. Un descargo de responsabilidad debe ser incluido aqu, como en los anuncios de coches nuevos: su kilometraje puede variar. Las Tablas 1 y 2 se calcula en base a la suposicin de que la partcula 5 micras de dimetro columna generada N = 15000. Como Table 2: Extracolumn effects se mencion anteriormente, esto representa la for k = 2, 5, and 10 realizacin de una operacin de columna bien envuelta bajo condiciones ideales. Es probable que este tipo de columna generar nmeros de placa en el intervalo de 10000 para los compuestos reales en condiciones reales de analticos. Esto significa que los picos ser ms amplio, incluso bajo las mejores circunstancias, por lo que el impacto de extracolumn volumen ser menor que la que se muestra en las tablas. Sin embargo, la conclusin general es el mismo: usted tendr que reducir al mnimo los efectos extracolumn si desea obtener resultados aceptables con el ID de 2,1 mm columnas en un sistema convencional de LC. Por otra parte, es poco probable que usted conseguir un rendimiento satisfactorio de 1,0 mm de dimetro columnas a menos que tener mucho cuidado. Esto significar que limita el volumen de inyeccin, en sustitucin del detector con una celda de flujo con un menor volumen y hacer otros cambios para reducir extracolumn efectos. Conclusiones Es bastante simple de hacer los cambios necesarios en el caudal para mantener la velocidad lineal constante, cuando los cambios de dimetro de la columna se hizo. Una reduccin en dimetro de la columna puede ser til para conservar disolvente y para mejorar los lmites de deteccin. Sin embargo, una cada en el rendimiento del sistema, segn se mide por la resolucin, podra ser observado para las columnas de menor dimetro a menos que se tiene especial cuidado para reducir extracolumn efectos. Desde un punto de vista de la resolucin de problemas, es tentador culpar a mal funcionamiento del sistema en la misma columna, cuando el verdadero culpable puede ser el volumen extracolumn del sistema LC. Una falta de sensibilidad con respecto a los efectos extracolumn es una razn por la que 150 mm x 4,6 mm de columna repleta de partculas de 5 micras de dimetro es probable que se mantenga la columna de caballo de batalla para la rutina de trabajo LC durante muchos. aos por venir. problemas" editor John W. Dolan es el vicepresidente de Recursos LC, Walnut Creek, California, EE.UU., y un miembro del Consejo Editorial Consultivo de la LCGC Europa. Correspondencia directa sobre esta columna a "LC Solucin de problemas", Europa LCGC, West Park, camino de Sealand, Chester CH1 4RN, Reino Unido.

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