Manual Tcnico

Biologa reproductiva y citogentica de la papa

Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale

Abril 2009

Red LatinPapa

Centro Internacional de la Papa (CIP)

Biologa reproductiva y citogentica de la papa Manual Tcnico Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale Centro Internacional de la Papa (CIP) 2009

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Tabla de Contenidos
Prlogo Agradecimientos Introduccin iv v vi

Biologa reproductiva de la papa 1.1 El ciclo de vida en papa 1.1.1 1.1.2 Ciclo de vida asexual Ciclo de vida sexual

1 1 1 1

Mitosis (Divisin nuclear somtica) 2.1 Determinacin de ploida en clulas somticas 2.1.1 Mtodo de preparacin de cromosomas en races de papa 2.1.2 Conteo del nmero de cloroplastos en las clulas guarda 2.1.3 Determinacin de ploida por Citometra de flujo

3 4 4 6 7

Meiosis 3.1 Meiosis I 3.2 Meiosis II 3.3 Observacin de meiosis en clulas sexuales 3.4 Gametos 2n

9 9 11 12 13

Observacin de polen y determinacin de su fertilidad 4.1 Cultivo de polen in Vitro 4.2 Crecimiento del tubo polnico in vivo (en el pistilo)

14 14 17

Cultivo in vitro de embriones inmaduros

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Literatura consultada

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Prlogo
La citogentica surge de la necesidad de relacionar los hechos descritos por la gentica con los fenmenos que ocurren dentro de la clula u rganos especializados. Ella ha permitido conocer la estructura y funcin de cada uno de los componentes de la clula, y de estructuras ms especializadas, en relacin con funciones como la reproduccin sexual. La citogentica clsica y molecular ha hecho posible el anlisis, interpretacin y trascendencia de ciertas caractersticas, desde las ms simples a las ms complejas (cromosomas y genes, cromosomas condensados y linearizados), contribuyendo en gran medida a la resolucin de problemas en aspectos taxonmicos, evolutivos y aplicativos. Asimismo, los estudios citogenticos permiten realizar valiosos aportes al conocimiento de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiacin en las plantas. Tambin permite la observacin de los caracteres citolgicos de clulas especializadas, su funcin y comportamiento ante cambios del entorno, o la serie de procesos que se suceden durante la fertilizacin, aportan conocimiento a la ciencia bsica. En los programas de mejoramiento la citogentica ayuda dilucidar ciertos fenmenos genticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homlogos, la relacin entre el polen y pistilo (fertilizacin-fecundacin) e identificacin de incompatibilidades, irregularidades meiticas en hbridos, produccin de gametos 2n y su relacin con la formacin de poliploides, etc. El presente manual servir como gua de capacitacin de investigadores, profesores, estudiantes y tcnicos. El documento busca llevar a la prctica diversas tcnicas clsicas y bsicas, que faciliten la observacin e interpretacin de parmetros y resultados genticos, ayudando a proyectar convenientemente un plan de mejoramiento, as como tambin en determinados estudios a nivel molecular. Los ejemplos y las ilustraciones han sido tomados de la papa, la cual, a pesar de contar con cromosomas pequeos, hace posible evidenciar ciertos fenmenos al nivel citolgico y estos a su vez relacionarlos con la constitucin y el comportamiento gentico. Adems, se da los conceptos tericos en cada uno de los temas tratados, pudiendo estas tcnicas ser aplicadas en otros cultivos.

Los autores

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Agradecimientos
La publicacin del presente Manual es gracias al soporte financiero de: Red Iberoamericana de Innovacin en Mejoramiento y Diseminacin de la Papa Red LatinPapa INIA Espaa FONTAGRO Federal Ministry for Economic Cooperation and Development (BMZ) Centro Internacional de la Papa (CIP)

Introduccin

El nmero bsico de cromosomas en el gnero Solanum es doce ( =12). En las papas silvestres y cultivadas existen diferentes nmeros de ploida, pueden ser 2n=2=24, 2n=3=36, 2n=4=48, 2n=5=60, 2n=6=72. El ms importante y de gran significacin en la evolucin de las especies de la papa es el nivel tetraploide, que cubre un amplio rango de distribucin desde la parte meridional de EE.UU. a la regin austral y sur de Chile. El nivel de ploida se determina contando el nmero de cromosomas en las clulas somticas y/o clulas sexuales. Otro mtodo rpido y directo es por citometra de flujo que cuantifica la cantidad de de ADN nuclear, sin embargo necesita de un aparato llamado citmetro de flujo. El anlisis citogentico ha sido ampliamente usado en estudios de gentica, comportamiento de los cromosomas, compatibilidad cromosmica, evolucin, filogenia, origen y taxonoma, as como tambin para determinar la viabilidad del polen evaluando su fertilidad tanto in vitro como in vivo (germinacin in situ); determinar la presencia de gametos no reducidos, el mecanismo por los cuales se producen etc., estudios que nos permitirn estimar el potencial de las especies o hbridos para propsitos de mejoramiento permitindonos desarrollar las estrategias a seguir en la transferencia de resistencias a enfermedades, plagas, etc., a travs de la manipulacin de ploida. Y es a travs de la biologa reproductiva ya sea asexual o sexual por la cual las plantas producen nuevos individuos, as: Microsporognesis, megasporognesis, barreras de pre y post fertilizacin, mutantes meiticos, polinizacin, embriognesis, desarrollo del endospermo, etc., estn involucrados en todo el proceso de vida, y su entendimiento nos provee de una gua para la seleccin de las hibridizaciones que seran exitosas tanto artificialmente como en la naturaleza, proporcionando las llaves para una eficiente y efectiva manipulacin del material del germoplasma silvestre, cultivado y avanzado de papa. Alguno de los ms importantes tipos de informacin necesitada por un mejorador incluye los principios de gentica y citogentica. Nuevas tcnicas citolgicas moleculares como FISH, GISH, DNA fibers, abren actualmente un abanico de oportunidades, sirviendo como intermediario entre mapas fsicos y mapas genticos, mostrando posiciones aproximadas de genes y marcadores moleculares, en sus distancias relativas a marcadores estructurales como centrmeros, telmeros, bandas de heterocromatina y constricciones secundarias.

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Captulo 1. Biologa reproductiva de la papa

1.1 El ciclo de vida en papa
Hay una generacin diploide, que consiste en una serie de divisiones mitticas, seguido por meiosis. Contina con una serie de divisiones haploides, seguido de la fusin de dos ncleos haploides (gametos), para dar un diploide. Es convencional llamar a la fase haploide gametofito y la diploide esporofito.

1.1.1 Ciclo de vida asexual

Reproduccin vegetativa de la papa: Asegura la conservacin clonal del genotipo, una nueva planta se forma a partir de tubrculos, brotes o yemas dando lugar a clones genticamente idnticos a la planta original, reproduccin que se realiza por mitosis. La propagacin asexual ha sido una gran ventaja para los mejoradores de papa puesto que se puede fcilmente obtener un genotipo seleccionado y multiplicarlo. Otro uso prctico de la propagacin asexual es el cultivo de tejidos y el cultivo de meristemas para la erradicacin de algunos patgenos.

1.1.2 Ciclo de vida sexual

Reproduccin sexual de la papa: Permite que el material gentico de dos individuos se combinen y se formen nuevas combinaciones allicas, requiere de la participacin de rganos reproductivos femeninos (pistilos) y masculinos (anteras) y por el proceso de polinizacin se formen bayas con semillas y cada una de estas constituye un nuevo individuo. Morfologa floral: las flores se encuentran reunidas en agregados llamados inflorescencias, sosteniendo a la inflorescencia se encuentra el pednculo, y lo que sostiene a cada flor es el pedicelo, que est dividido en pedicelo inferior y superior. Una flor contiene 2 juegos de envolturas florales: el cliz y la corola los que forman el receptculo floral ubicado debajo de las partes frtiles de la flor y compuesto por los estambres y el pistilo. El estambre consiste de un corto filamento que sostiene a la antera con dos lbulos que contiene el polen, los cinco estambres se encuentran separados de la corola. El pistilo est diferenciado en ovario, en la parte baja lleva los vulos, el estigma es el que recibe el polen y el estilo es el que conecta a ambos. Cada vulo contiene una clula madre llamada megaspora, la cual est rodeada de un tejido llamado nucela y de un integumento, cuando es fertilizado y maduro el vulo desarrolla en una semilla. Esta fase comprende dos aspectos: Meiosis y fertilizacin. El ms importante acontecimiento de la reproduccin sexual es la creacin de variacin gentica, nuevos genotipos con atributos genticos de ambos padres pueden estar combinados en las semillas formadas. De dos eventos en la meiosis como es el crossing over en la Profase I y la separacin al azar de bivalentes en Metafase I, podemos decir que cada producto es un nico genotipo. El uso prctico de la reproduccin sexual es lo que constituye una de las formas para la conservacin de germoplasma, especialmente silvestre, otro uso es para la produccin de semilla verdadera de papa.

Megasporognesis. Este proceso tiene lugar en el tejido del ovario (contiene de 300 a 600 vulos) y en las clulas madre de las megasporas, dando lugar a clulas reproductoras llamadas sacos embrionarios, que contienen al gameto femenino u ovoclula. Una clula materna, megaspora, mediante la I y II divisin meitica forma 4 megasporas, las 3 superiores degeneran y la inferior se convierte en megaspora funcional, esta dar origen al saco embrionario, que se agranda por megagametogenesis ocurriendo tres divisiones mitticas, sin citocinesis que darn origen a 8 ncleos que al orientarse forman el saco embrionario. Uno de los 3 ncleos del extremo micropilar del saco embrionario se trasforma en huevo funcional. Hay varias alternativas en la formacin del saco embrionario, la descrita ocurre en la mayora de las Angiospermas. Microsporognesis. Este proceso tiene lugar en el tejido esporgeno de las anteras, los ncleos de clulas madres del polen son muy largas justo antes de la meiosis y en la formacin de las ttradas de las microsporas la pared de callosa alrededor de cada clula madre del polen puede ser detectada durante la iniciacin de la meiosis y en cada nueva microspora joven de la ttrada, la que es tambin separada por una capa de callosa despus de la II divisin meitica, tan pronto como la formacin de la pared externa del polen empiece a formarse, la callosa empieza a desaparecer. Las capas meristemticas que dan origen a las diferentes estructuras u rganos en las plantas, son denominadas L1 que dan lugar a la epidermis (cloroplasto), L2 que forman las hojas, tallos y flor (rganos sexuales) y la L3 que generan los tejidos internos del tallo.

Captulo 2. Mitosis (Divisin nuclear somtica)

Este proceso ocurre en las clulas conocidas como meristemas (races, hojas, flores) y meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el ciclo de vida del organismo. Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente ordenada los complejos preparativos para la divisin, por la cual se hace un reparto equitativo del material gentico ya duplicado entre las dos clulas resultantes, manteniendo as la ploida original de la clula. Implica que cada cromtida pueda migrar a un diferente polo, separacin que es posible mediante el huso mittico o acromtico, estas fibras estn formadas de microtbulos y sus protenas asociadas por un proceso de polimerizacin, que se asocian a las cromtides permitiendo que cada una migren hacia los polos una vez que ambas se separan a nivel centromrico. Esta polimerizacin puede ser inhibida experimentalmente y muchos tratamientos con sustancias como la colchicina, 8-hidroxiquinolena, Tjio y Levan (1950), paradiclorobenceno, piretroides (Klein, 1990, Watanabe y Orrillo 1993, Chen, 2005) y tratamiento por fro pueden efectivamente acumular clulas en metafase y cromosomas condensados durante la mitosis. La mitosis comprende una divisin nuclear y somtica (citocinesis) lo que permite que los organelos pasen ms o menos al azar a una u otra de las dos clulas. El ms importante carcter de la mitosis es que el nmero cromosmico permanece constante a travs de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribucin de cromosomas en las nuevas clulas formadas, genticamente idnticas entre s, mantenindose la ploida original de la clula. Convencionalmente la mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y telofase. Interfase. Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son prcticamente invisibles an con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes que la clula se divida tiene lugar la replicacin, que es la sntesis del ADN y formacin de las fibras que conforman el uso mittico o spindle bipolar. Este periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo una vez en cada ciclo. Profase. En esta etapa se aprecia la aparicin ntida de los cromosomas en el ncleo, ya estn suficientemente condensados y son visibles bajo el microscopio ptico. Se ve, que cada cromosoma consiste en dos copias longitudinales, llamadas las cromtidas hermanas, se observan claramente unidas por los centrmeros, el nuclolo pierde visibilidad, la membrana nuclear desaparece, el huso acromtico va tomando cuerpo y muchas fibras cortas lo forman, las fibras polares, que llegan desde cada polo del huso a la regin central hasta la mitad y las fibras cinetocricas que se insertan en los cromosomas duplicados. Como vemos, estos dos grupos de fibras posibilitan la separacin de las cromtidas hermanas durante la mitosis, los cromosomas inician un proceso de acortamiento y engrosamiento. Al final de la profase, los cromosomas estn completamente condensados y con la desaparicin de la envoltura nuclear, quedan en contacto con el citoplasma.

Metafase. En esta etapa, los pares de cromtidas, se acortan y se alinean en un solo plano alrededor del centro de la clula, se observan ms gruesas. Anafase. En esta etapa se duplican y separan los centrmeros y las cromtidas hermanas se liberan, se repelen y son engarzadas por las fibras del huso que hacen traccin sobre ellas, dirigindose a los polos, convirtindose cada cromtida en un nuevo cromosoma. A medida que contina la anafase, los dos conjuntos idnticos de cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso. Telofase. Al iniciarse esta etapa se nota la futura regin nuclear y aparece la membrana nuclear, los cromosomas pierden su estado de condensacin y se alargan. Comienza la formacin del nuclolo. Se produce simultneamente la citocinesis, o sea la segmentacin y separacin del citoplasma, se termina de formar la placa celular, la nueva pared celular entre las clulas recin formadas.

2.1 Determinacin de ploida en clulas somticas

Ploida es un trmino referido al nmero de grupos o juegos de cromosomas que una clula posee.

2.1.1 Mtodo de preparacin de cromosomas en races de papa

Para una correcta determinacin del nmero de cromosomas es necesario contar con tcnicas citolgicas que den buenos resultados, con un nmero aceptable de metafases contables, con cromosomas bien separados y coloreados, por lo que las muestras debern ser colectadas en estado de metafase. Para la acumulacin de cromosomas metafsicos varios pre-tratamientos qumicos son usados y el mejor protocolo usado en nuestro laboratorio es descrito (Watanabe y Orrillo, 1993). No hay una tcnica universal, cada laboratorio toma una o varias tcnicas de acuerdo a las exigencias de cada cultivo. El conocer la ploida de una especie es de gran ayuda en la determinacin taxonmica y de gran importancia en los programas de mejoramiento. La papa no es una especie ideal para estudios citogenticos. Los cromosomas somticos de S. tuberosum miden de 1.0 a 3.5 m (Dong et al., 2000), nuevas tcnicas (FISH; GISH, Fiber FISH), estudios de cromosomas en estado de Paquiteno, permiten hoy la identificacin de los cromosomas y la caracterizacin del genoma de la papa. Figs. 1, 2 y 3. 1. Materiales Sembrar en macetas pequeas, con musgo bien fino, o vermiculita tubrculos bien brotados (tambin se pueden usar esquejes de plantas bien enraizadas, semillas germinadas, plantas de in vitro). La coleccin de races se realiza en plantas bien pequeas de unos 5 -10 cm de altura. Unas horas antes de colectar es conveniente regar bien las plantas. La coleccin de las races se hace generalmente temprano, en la maana alrededor de las 11 am. 2. Pre-tratamiento Usando una pinza de punta bien fina se colecta puntas de races, aproximadamente de 10 mm y se coloca en frasquitos o vials conteniendo agua destilada a temperatura ambiente, despus de 1 h pasar a una solucin de (Permetrina: La composicion quimica que figura en el envase es la siguiente: (3-Fenoxifenil)metil

Mtodo de preparacin de cromosomas en races de papa

Coleccin de races en: (H2O destilada + 15uL Permetrina, pH 5-5.8) 24 horas Eliminar la solucin de pre-fijacin

Hidrlisis con HCl 1 N previamente precalentado

Colocar las races en Placa Petri

Eliminar la solucin & Adicionar H2O destilada 8-10 min a 600C

Fig. 1: Toma de la muestra de races de papa, prefijacin e hidrlisis con HCl.

Tincin con Lacto-Propinico Orcena (15min aprox.)

Cortar 1-2mm de la punta de las races

Aplastado (Squash) Lmina lista

Presionar para extender el tejido

Fig. 2: Coloracin con lacto propinico orcena, aplastado (squash).

Observar al microscopio 4X

2X

4X

Fig. 3: Observacin de clulas en metafase de races de papa, ploidas 2 y 4.

() cis-trans 3-(2,2-dicloroetenil) 2,2-dimetil carboxilato de cicloropropano (Permetrina),15 l en agua helada a pH 5 a pH 5.8, por 24 horas a 4 C. Caso de no tener disponible la Permetrina, utilizar agua helada por 48 horas a 4 C, colocando las botellitas conteniendo las races en un termo con hielo.

3. Fijacin Es optativo, se puede obviar este paso si es que se desea ver las muestras inmediatamente, caso de querer guardar las muestras por ms tiempo se fijaran en alcohol 96 % 3p: cido actico 1p; y se deja a medio ambiente por 24 horas. Si se quiere guardar en fijador hacerlo en alcohol de 70% y en refrigeracin a 4 C, prepare suficiente cantidad de solucin fijadora, de tal manera de cubrir bien las races. Los fijadores se preparan al momento de ser usados. 4. Hidrlisis Se colocan las muestras en HCl 1N a 60 C de temperatura, por 8 -10 minutos; el cido se calentara previamente, transcurrido el tiempo de hidrlisis se proceder a quitar el cido y a lavar con agua destilada. 5. Coloracin Con lacto-propinico orcena u orcena-actica, se procede a colocar las races en pequeos contenedores o Petris conteniendo el colorante. 6. Aplastado o squash Se colocan las races en un porta-objeto, usamos solamente 1-2 mm de la punta, con una gota del mismo colorante (tambin podemos usar cido actico al 45 %), se coloca un cubre-objeto y asegurando uno de los extremos procedemos con una varilla de goma, o un borrador de un lpiz o la punta de l a presionar suavemente, o dando golpecitos repetidos, pero firmes, permitiendo la disociacin del tejido. Colocar el porta-objeto entre papel de filtro y presionar fuerte con el dedo pulgar squash, pero tratando de evitar cualquier movimiento lateral del porta-objeto. 7. Observacin La muestra se coloca bajo microscopio ptico, inicialmente a 10 X, 20 X con el objetivo de seleccionar las mejores metafases y luego pasar a objetivos de 40 X y 100X para el conteo de cromosomas, las clulas deben estar intactas, no superpuestas ni con artefactos que puedan distorsionar el conteo exacto de cromosomas.

Preparacin de Lacto-propinico orcena: Disolver 1 g de orcena en una mezcla de 23 ml de cido lctico y 23 ml de cido propinico a temperatura ambiente, completar a 100 ml con agua destilada, agitar bien y filtrar (Haskell y Wills, 1968) NOTA: Para obtener buenos resultados es necesario tener muy buenas races, finas, no muy gruesas; las plantas deben estar en perfecto estado de desarrollo.

Pre - tratamiento
Propsito: Separacin de los cromosomas, acortarlos, y la clarificacin de los centrmeros a fin de hacerlos visibles para chequear el nmero bsico.

Otro pre-tratamiento que da buenos resultados es con agua helada, en lugar del uso de Permetrina, se utiliza agua destilada helada por 48 horas a 4 C y colocando los frascos (vials) que contienen las raicillas en un termo en el cual se ha colocado cubitos de hielo con agua, el resto del procedimiento es igual.

Otras tcnicas utilizan:

8-Hidroxiquinolea, es insoluble en agua y ter. Soluble en alcohol, acetona, cloroformo y benceno. Preparacin: 0.002M, solucin en agua destilada. Pesar 0.29 g de 8Hidroxiquinolena y disolver en 25 ml del solvente escogido (generalmente alcohol) y se agrega el agua destilada poco a poco, hacindola deslizar muy lentamente por una bagueta o vara de vidrio, evitando la precipitacin de solucin, hasta completar 1 l. Usar un frasco oscuro y guardar a medio ambiente. Tratamiento por un mnimo de 3 horas, lo ptimo sera 5 horas a 15 C. Colchicina, 0.05-0.5% W/V en agua destilada por 4-6 horas a 10-15 C en refrigeracin. Es una tcnica popular desafortunadamente bastante cara y con posibilidad de ser este producto carcinognico. Para obtener races en mitosis se puede usar bajas concentraciones de colchicina en semillas en estado de germinacin. Paradiclorobenceno, alpha-bromonaftaleno, son otros de los qumicos usados.

2.1.2 Conteo del nmero de cloroplastos en las clulas guarda

Aunque no es una tcnica para determinar la exacta ploida de un genotipo, cuancdo manejamos una gran cantidad de material nos permite discriminar el grupo diploide de los otros grupos. Por ejemplo cuando queremos seleccionar haploides (2n=2=24). 1. Toma de la muestra Colectar hojas o los fololos terminales de una misma planta y colocarlos en una placa Petri con papel toalla o filtro humedecido con agua. 2. Procedimiento Obtener con la ayuda de una pinza fina el tejido epidrmico del envs de la hoja, de la zona prxima a las nervaduras, e inmediatamente colocarlo sobre un portaobjetos donde previamente se ha colocado una a dos gotas de solucin de KI - I y luego volver a colocar muy suavemente encima de la muestra otras dos gotas de KI - I y cubrir suavemente con un cubre-objeto. 3. Observacin Examinar la preparacin bajo el microscopio ptico, a un aumento de 10 X, 20 X 40 X. El contaje de cloroplastos se realiza solo en una de las clulas guarda de los estomas. El nmero promedio de cloroplastos nos dar una indicacin de nivel de ploida, as para una ploida 2x en papa, el promedio es de 5 - 8 cloroplastos por clula guarda, contajes mayores a 9 nos indica un nivel ms alto de ploida. Es aconsejable por lo menos obtener el promedio en 10 clulas guarda. Figs. 4 y 5.

Conteo del nmero de cloroplastos en las clulas guarda

Colecta de hojas, foliolos

Obtencin del tejido epidrmico del envs usando una pinza fina

Muestra lista para su cbservacin

Fig. 4: Procedimiento para la obtencin de muestras para el contaje de cloroplastos en clulas guarda de estomas.

Promedio del N de cloroplastos por clula guarda 7-8 9 - 11 12 -14 15 -16 Huamn, 1995

Posible ploida 2X 3X 4X 5X Cloroplasto

ncleo

Clula guarda

Contar los cloroplastos en 10 clulas guarda, de tamao similar y solo una clula por estoma

Genotipo Diploide

Posiblemente Genotipo Tetraploide

Fig. 5: Criterios de evaluacin para el contaje del nmero de cloroplastos.

Determinacin de ploida por Citometra de flujo

Fig. 6: Citmetro de Flujo (Ploidy Analyser) PARTEC I.

Fig. 7: Materiales requeridos.

Es recomendable utilizarlo en la seleccin de diploides y no para ploidas ms altas. Huaman (1995) asocia niveles de ploida al nmero de cloroplastos por clula guarda en determinaciones hechas en papas cultivadas.

Preparacin de KI-I
1. 1 g de KI 2. 1 g de I 3. Ambos reactivos disolver en 100 ml de Etanol al 70%, guardar en frasco oscuro.

2.1.3 Determinacin de ploida por Citometra de flujo

La tcnica de la citometra de flujo es, bsicamente un mtodo analtico que permite la medida de emisin de fluorescencia y dispersin de luz de muestras marcadas (ncleos) con sondas fluorescentes, que a medida que desfilan, de una en una y son arrastradas por un flujo portador del analizador de ploida (Partec PA-II Ploidy Analyser), que fluye del punto de inyeccin al detector y finalmente a la botella de desecho, frente a un sistema de deteccin (lmpara de mercurio que emite luz ultravioleta de 488 nm de longitud de onda). La corriente de ncleos en suspensin pasa por una cmara de cuarzo (conducto de 10 m que no permite el paso simultneo de dos unidades), mientras es iluminada por la luz ultravioleta; producindose dos fenmenos simultneos: Dispersin de luz y el fluorocromo DAPI fijado al ADN emite una fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN en el ncleo, emisin de luz fluorescente que es reconocida y captada por un fotorreceptor. De esta forma, la citometra de flujo permite medir la cantidad de ADN existente en los ncleos de las clulas, es un mtodo rpido y directo de establecer la ploida de una planta. El citmetro de flujo debe ser previamente calibrado antes de iniciar el proceso de evaluacin de ploida. Fig. 6.

Calibracin del aparato

El sistema se calibra previamente situando el pico correspondiente a un contenido de ADN igual a 2C (diploide) sobre el valor 100 de la escala de abscisas, o en su defecto sobre el valor 50. El patrn se determina segn el rea relativa en porcentaje de los picos correspondientes a las distintas poblaciones celulares (2C, 4C, 5C, etc.). El GAIN, se utiliza para mejorar la ampliacin y el alto voltaje del foto multiplicador, entre 0 y 1000 V, segn el aumento o reduccin del Gain la relacin eje de abscisas (eje x) y ploida puede tener con valor = 50, 2C diploide, 75 igual a 3C (triploide) y 100 igual a 4C (tetraploide), mientras si se aumenta dicho GAIN, este puede tener la siguiente relacin: 100= 2C (diploide), 150=3C (triploide) y 200= 4C (tetraploide). Es importante tambin el uso de controles de conocida ploida en cada cultivo a evaluar.

Procedimiento
1. Materiales Colectar fololos jvenes de la parte apical y colocarlos en placas Petri, y luego tomar aprximadamente unos 40-50 mg. Fig. 7.

2. Preparacin La muestra a analizar se coloca en una placa Petri y se adiciona 0.5 ml del buffer de extraccin (CyStain UV Ploidy) y se cortan los fololos con una hoja de afeitar, seccionando muy finamente en pequeos cuadraditos. Una vez est disgregado el tejido, se le adiciona nuevamente 1.5 ml del buffer de extraccin y se incuba por 5 minutos a temperatura ambiente. Este buffer de extraccin de ncleos, contiene el fluorocromo DAPI (4, 6 diamino-2-phenilindole), que tie el ADN. Una vez resuspendida la mezcla se pasa a travs de un filtro de nylon de 30 m (Partec 50 m, Cell TricsTM), lo cual permite separar los ncleos, que caen a un tubo receptor, el cual se coloca en el analizador. Figs. 8 y 9. 3. Observacin Los resultados de la muestra son cuantificados por el sistema electrnico, que se encarga de la cuantificacin de los destellos de la fluorescencia y de la luz dispersada, bajo el control del ordenador, el cual almacena los datos de miles de clulas por cada muestra, y representa los resultados grficamente. El sistema informtico que lleva incorporado el citmetro convierte cada seal fluorescente en un resultado que es presentado en un histograma en una escala logartmica. El grfico resultante ordena los datos segn el contenido nuclear de ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el nmero de ncleos de cada tipo en el eje de ordenadas. Figs. 9 y 10. Todas las clulas que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN medido, y este pico representa un nivel de ploida. El ruido consiste en una pequea seal indeseada y aparece en los canales bajos. Una razn para este ruido son los fragmentos resultantes de las clulas al momento de su preparacin. La cuantificacin del ADN nos permite conocer tambin la existencia de aneuploidas, donde los histogramas se desplazan levemente hacia uno u otro lado de la ploida esperada.

Interpretacin del histograma

El histograma resultante muestra el nmero de clulas por ml, que han sido contabilizadas (eje y), mientras que en el eje horizontal (eje x) indica el contenido nuclear de ADN, as todas las clulas que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN y un pico representa un nivel de ploida. Fig. 11.

Colectar aprox. 50mg hojas jvenes apicales

Cortar solo los foliolos

Colocarlos en 0.5 ml el buffer de extraccin (Cystain UV ploidy)

Adicionar 1.5ml de CyStain UV ploidy e incubar por 5 minutos

Picar muy suavemente y de arriba hacia abajo

Fig. 8: Procedimiento utilizado en la preparacin de muestras para su anlisis en el Analizador de ploida (Citmetro de Flujo).

Filtrar la muestra en filtros de 30m (Partec Cell Trics 30)

Colocar la muestra en el Clitmetro de Flujo

Citmetro de Flujo Ploidy Analyzer (PA) Partec I

Fig. 9: Filtracin de la muestra y su colocacin en el Citmetro de flujo para su lectura.

K.Soto

Se establece los parmetros para la lectura de la muestra

Histograma de la muestra

Fig. 10: Medicin, procesamiento de los datos y representacin de los resultados.

2x

4x

< 4X

Fig. 11: Histogramas con los resultados para plodas 2, 4 y <4, encontradas en GON, ADG y en un hbrido somtico respectivamente.

Captulo 3. Meiosis

Este trmino se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un nmero de cromosomas caracterstico de su especie. Este proceso ocurre antes de la formacin de las clulas reproductivas o esporas, en el cual el nmero diploide normal se reduce a un juego nico o haploide (n) en cada gameto, el nmero haploide se designa como n y el nmero diploide como 2n. La meiosis es tambin precedida por una fase S, durante la cual ocurre la sntesis de ADN (algo de sntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la meiosis el material gentico en el ncleo diploide ha sido replicado slo una vez, cada cromosoma consiste de dos cromtidas hermanas idnticas. Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y meiosis II. La comprensin del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y funcin de la recombinacin gentica en la evolucin cromosmica. Todo este proceso es dinmico, abarca atraccin, apareamiento, intercambio y ulterior separacin de los cromosomas homlogos paternos y maternos. Durante este proceso cada gameto lleva slo un miembro de cada par de homlogos. En toda clula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como pares homlogos, los que se asemejan en tamao, forma y en el tipo de informacin hereditaria que contienen. Adems de mantener un nmero constante de cromosomas de generacin en generacin, es una fuente de nuevas combinaciones de material gentico dentro de los mismos cromosomas. Cada divisin meitica es formalmente dividida en profase, metafase, anafase y telofase. De esos el ms complejo y largo es la profase I la cual est subdividida en: leptoteno, zygoteno, paquiteno y diacinesis.

3.1 Meiosis I
3.1.1 Profase I
La cromatina se condensa y los cromosomas se hacen visibles con el microscopio ptico. Durante este proceso cada gameto lleva slo un miembro de cada par de homlogos. Leptoteno: Los cromosomas aparecen como largos filamentos, y repartidos a lo largo se pueden observar los crommeros como las cuentas de un rosario. No se pueden individualizar los cromosomas y la membrana nuclear est presente. Zygoteno: Comienza el apareamiento de los cromosomas homlogos, a este proceso se le llama sinapsis, aqu se hace evidente la pareja de cromosomas homlogos, atrados uno con otro. El apareamiento es muy preciso, punto por punto

a manera de un cierre de cremallera. Cada homlogo consta de dos cromtidas hermanas y el par de homlogos consta de cuatro cromtidas (ttrada) y a los pares asociados se les llama bivalentes. Es el complejo sinaptonmico de naturaleza proteica el que mantiene los cromosomas homlogos estrechamente unidos formando un bivalente, se cree que su existencia es necesaria para que se produzca el entrecruzamiento, la formacin de quiasmas (del griego, Chiasma: punto de cruzamiento) y el evento de recombinacin. Paquiteno: Este estado evidencia la unin longitudinal de los homlogos y desdoblados cada uno en dos cromtidas. Las cromtidas de cada homlogo se llaman cromtidas hermanas. Dos cromtidas homlogas se rompen al mismo nivel y de inmediato se intercambian en este punto ambos segmentos, las otras dos quedan intactas. Esto es lo que se conoce como entrecruzamiento, la evidencia citolgica visible son las llamados quiasmas. Una serie de intercambios de material gentico ocurre entre cromtidas no hermanas u homologas. Diploteno: Los cromosomas homlogos comienzan a repelerse entre s, excepto en los puntos de intercambio o quiasmas. El nuclolo y la membrana nuclear desaparecen y el crossing-over se hace visible. La consecuencia es la formacin de nuevas combinaciones de genes, con alteracin de la informacin gentica localizada en los cromosomas afectados. Diacinesis: Las bivalentes se hallan ms condensadas. Paulatinamente el proceso de terminacin continua a medida que el nmero de quiasmas disminuye y empieza a aparecer el huso acromtico, los bivalentes quedan unidos por sus centrmeros al huso, y la membrana nuclear desaparece y comienza a formarse el spindle.

3.1.2 Metafase I
Los bivalentes se sitan a cada lado del plano ecuatorial. El huso (spindle) se ha formado completamente y cada homlogo tiene su centrmero. Por ello el cromosoma completo se dirige a uno de los polos. Los cromosomas aparecen ms condensados.

3.1.3 Anafase I
Los cromosomas homlogos se han separado y migran hacia los polos respectivos u opuestos de la clula por accin de los microtbulos del huso acromtico, sin embargo debido a los entrecruzamientos ocurridos, las cromtidas no son idnticas como lo fueron al comienzo de la meiosis. Nuevas combinaciones han surgido en cromtidas no hermanas, en tanto que las otras dos quedan intactas. Los centrmeros no se dividen, las cromtidas hermanas continan unidas, pero los homlogos se separan. Como resultado para cualquiera de los pares homlogos, un polo recibe un cromosoma de origen paterno y el polo contrario un cromosoma de origen materno. Y no todos los cromosomas paternos se dirigen hacia el mismo polo. De hecho cualquier combinacin de cromosomas maternos y paternos puede desplazarse hacia un polo determinado.

3.1.4 Telofase I
Los cromosomas propenden a alargarse, algunas veces el nuclolo y la membrana nuclear reaparece. Las clulas formadas contienen la mitad del nmero de cromosomas presentes en la clula madre. Set haploide de cromosomas. Los cromosomas se encuentran reagrupados en cada polo.

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Ha concluido la fase reduccional en la cual el par de cromosomas homlogos son separados en dos clulas hijas.

3.2 Meiosis II
Se parece a la mitosis, excepto en que no est precedida por la duplicacin del material cromosmico

3.2.1 Profase II
Cada clula es haploide, la membrana nuclear empieza a desintegrarse y el nuclolo desaparece al final de la profase II, sta es corta y le sigue una reorganizacin del huso acromtico.

3.2.2 Metafase II
En esta etapa los cromosomas que han quedado en los polos se colocan en el plano ecuatorial y se adhieren a las fibras del huso.

3.2.3 Anafase II
En esta fase los centrmeros se dividen y las cromtidas hermanas, que ahora son cromosomas, se separan y se van hacia los polos opuestos.

3.2.4 Telofase II
En esta fase se forma una ttrada de microsporas, se han formado nuevas paredes celulares, cada ncleo lleva un nmero haploide de cromosomas, cada cromosoma est representado una vez, Y cada ncleo de un segmento puede recibir cualquier combinacin factible de cromtidas de origen materno y paterno.

La divisin meitica tiene tres importantes eventos

1. Transformacin de los cromosomas por la ocurrencia del entrecruzamiento (crossing-over) en combinaciones completamente nuevas. 2. Re-arreglo del genoma por una distribucin al azar de los cromosomas homlogos. 3. Reduccin del nmero de cromosomas de diploide (2n) a haploide (n). De estos eventos, el ms decisivo es la recombinacin, siendo probablemente la ms importante contribucin a la evolucin y a la diversidad gentica.

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3.3 Observacin de meiosis en clulas sexuales de papa

El proceso de microsporognesis generalmente termina entre los 7 y 14 das anteriores a la floracin, muestras apropiadas de botones florales dependen de varios factores: como el medio ambiente, la hora y los factores genticos. Figs. 12, 13, 14 y 15.

Procedimiento
1. Fijacin Usar Carnoy modificado fresco (3:1 alcohol absoluto: solucin saturada de acetato frrico en cido propinico), el cual es dispensado en frascos con tapa rosca, sumergir la muestra de botones de diferentes estados de desarrollo, previamente haciendo un corte con un bistur en la punta de los botones para permitir que el fijador penetre. Aqu deben permanecer de 24 a 48 horas a temperatura ambiental. Para largos periodos de almacenamiento en refrigeracin, se recomienda guardar las muestras en etanol al 70 % a 4 C. 2. Preparacin Tomar varios tamaos de botones en una placa Petri o en un vidrio de reloj con 70 % de etanol y chequear cada botn si est en estado ptimo para la observacin de meiosis. Diseccionar la antera, sobre una lmina porta objeto, cortando los extremos aplastar presionndola con una aguja de diseccin para luego remover los restos de la antera y colocando rpidamente una gota de carmn propinico o de lacto propinico orcena, cubrir con un cubre objeto. Las agujas, pinzas de diseccin deben limpiarse frecuentemente para evitar su corrosin. 3. Observacin Examinar la preparacin bajo el microscopio ptico, a un aumento de 40 X o 100 X, si estuviera en un estado ptimo, calentar levemente la muestra pasando por la llama de un mechero y retirar el exceso de tinte colocando la lmina entre 2 papeles de filtro. Se puede golpear suavemente el cubre objeto para expandir los cromosomas.

Preparacin de la solucin saturada de acetato frrico: Se aaden 10 g de acetato frrico a 100 ml de cido propinico puro, mezclar bien, dejar sedimentar y decantar cuidadosamente la solucin, evitando que parte del precipitado pase a la solucin a usarse. Preparacin de carmn propinico: Preparar una solucin al 45% de cido propinico, calentar hasta que hierva, luego aadir 1 g de carmn, dejar hervir y filtrar. A esta solucin agregar 5 gotas de solucin saturada de acetato frrico en 45% de cido propinico.

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Observacin de meiosis en clulas sexuales

Botones florales recolectados en Fijador Carnoy Modificado

Anteras en alcohol de 70% colocadas en placa Petri listas para su diseccin

Antera diseccionada

Fig. 12: Fijacin y preparacin de muestras de botones florales.

Microsporognesis
Clulas madre del polen Clulas madre del polen Clulas nutritivas

Arquesporio

Clulas del Tapetum Meiosis

Polen

Fig. 13: Microsporognesis -Tejido esporgeno - Formacin del polen.

Profase I

Paquiteno

Diacinesis

AI

MI

Metafase I

Anafase I

Fig. 14: Meiosis I, mostrando Paquiteno - Diacinesis (Profase I), Metafase I y Anafase I.

Telofase I

M II

AII

Metafase II, ejes de los spindles (flecha) son paralelos Anafase II, ps y telofase temprana II (flecha)

TI

Telofase I, Anafase II Anafase II, husos normales y paralelos

AII

Fig. 15: Meiosis I, Telofase I y Meiosis II, Metafase II, Anafase II, Telofase II, husos normales y paralelos.

3.4. Gametos 2n
Gametos con el nmero somtico de cromosomas (gametos 2n) son el resultado de mecanismos que afectan formacin normal de los gametos, durante la fase premeiotica, meitica y post meitica. La incidencia de gametos 2n es frecuente en el reino vegetal, y su ocurrencia ha sido reportada en muchas especies de familias, incluyendo Crucferae, Leguminosae, Rosaceae, Solanaceae y Vitaceae (Veilleaux, 1985). Los gametos no reducidos son de gran utilidad, ya que facilitan la poliploidizacin sexual y a la vez proporcionan un mtodo muy efectivo para transmitir la heterocigosidad y la epistasis del nivel 2X al 4X. Pueden ser detectados: Por la ocurrencia de progenie tetraploide en cruzamientos 2x 4x, 4x 2x; distribucin bimodal del dimetro del polen: grande (2n) & normal (n). La presencia de ttradas, diadas y/o triadas en el estado de formacin de microsporas. Fig. 16. La poliploida es una caracterstica distintiva del reino vegetal y ha tenido un papel muy importante en la evolucin de las plantas superiores especialmente la Angiospermas, incluyendo las especies cultivadas de mayor importancia mundial tales como el trigo, papa, avena, caa de azcar y algodn que son poliploides. Camadro (1986). Los poliploides pueden originarse por duplicacin espontnea del complemento cromosmico somtico (poliploidizacin asexual) o por el funcionamiento de gametos 2n (poliploidizacin sexual).

Formacin de ttradas y diadas Formacin de polen normal y polen 2n

2n

Formacin de triadas (orientacin tripolar) y ttradas

Fig.16: Formacin de dadas por husos paralelos-polen 2n y formacin de triadas en Telofase II, los husos adoptan una configuracin tripolar.

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Captulo 4. Observacin de polen y determinacin de su fertilidad

El trmino viabilidad o frtil se refiere a la capacidad de los granos de polen de germinar en el estigma, este conocimiento es uno de los ms importantes aspectos para una eficiente reproduccin sexual. Granos de polen funcional (viables o frtiles) se observan claramente redondos con el citoplasma teido uniformemente de rojo, con morfologa normal, son considerados potencialmente funcionales, mientras los granos abortivos, no viables o estriles, no se tien, o son poco coloreados, con el citoplasma granular y permanecen encogidos, con citoplasma retrado (eclipse de esterilidad), deformes. Figs. 17, 18, 19, 20 y 21. 1. Colectar las flores prximas a la dehiscencia. 2. Colocar una o dos gotas de colorante gelatina aceto-carmn glicerol, en el centro de un porta-objeto, y sobre ella colocar una pequea cantidad de polen que puede ser obtenido de una o ms anteras con la ayuda de un vibrador o dando golpecitos a las anteras con una aguja de diseccin para hacer caer directamente el polen sobre la lmina porta-objeto. Si el polen ha sido colectado en cpsulas de gelatina, una cantidad suficiente es colocada de la misma manera con la punta de una aguja o con mondadientes. 3. Mover ligeramente con una aguja de diseccin o con el mismo mondadientes para asegurar una distribucin uniforme y luego cubrir con un cubre-objeto, dejar por lo menos 24 horas para que los granos de polen se tian. Colocar las muestran en una mesa o tablero, evitando colocarlas verticalmente hasta despus de unos das en que hayan sellado y luego colocar en cajas porta-objetos para guardarlas en refrigeracin a 4 C. Otro test de viabilidad es el X-Gal test, donde el polen es incubado por 30 minutos en la oscuridad a 37 C en un medio (Singh et al., 1985) de 1 mg X-Gal (5-bromo-4-cloro-3indoyle--galactoside) disuelto en 50 l de N, N dimethyl formamide y 1 ml del buffer acetato (50 mmol, pH 4.8). Este test es recomendado por Trognitz, 1991 por su alta reproducibilidad. El grano de polen es considerado viable si se torna azul y si se muestra con un citoplasma teido uniformemente. Figs. 22 y 23.

Preparacin de gelatina aceto-carmn glicerol

Preparar una solucin de 45% de cido actico con agua destilada y calentar hasta llegar a ebullicin, luego agregar 2 g de carmn hasta que el carmn est completamente disuelto y quede aproximadamente 60 ml. Dejar enfriar y filtrar, finalmente agregar igual volumen de glicerina. Todo el proceso se realiza bajo campana extractora y constante agitacin. (Marks, 1954).

4.1 Cultivo de polen in vitro

La observacin del desarrollo del tubo polnico al cultivar el polen en un medio adecuado, nos permite distinguir el polen no viable de las incompatibilidades que pueden ocurrir a nivel del estilo. Varios investigadores han reportado el uso de medios de cultivo para la germinacin y crecimiento del tubo polnico. Mortenson y col (1964) reportaron que una solucin de 20 % de sucrosa + 50 ppm de cido brico fue el medio ms adecuado para la

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Observacin de polen y determinacin de su fertilidad

Coleccin de polen

Polen colectado en cpsula de gelatina

La muestra es colocada en 2 - 3 gotas de colorante

Materiales

Fig. 17: Procedimiento para la toma de muestra, coloracin del polen.

Fig. 18: Muestras fijadas de polen para su observacin.

COLORANTE: Gelatina Aceto-carmn Glicerol

COLORACIN + polen bien formado= VIABILIDAD

Polen normal (n) + polen estril no coloreado

Polen estril (n) coloreado y no coloreado

Polen doble, coloreado y no coloreado

Fig. 19: Diferentes calidades de polen, normal (n), estril, polen 2n, polen doble.

Eclipse de esterilidad

Polen anmalo

Ttradas estriles

Fig. 20: Polen anmalo: Con eclipse de esterilidad, malformado y ttradas estriles.

Polen n y 2n coloreados

Polen n y 2n estriles

Fig. 21: Polen (n), polen 2n coloreados (viables) y estriles.

Fig. 22: A. Polen normal (n), B. Polen n y 2n, C. Polen normal y estril, D. Polen estril. Coloracin X-Gal.

Fig. 23: A. Polen con 3 poros germinativos, B. Polen doble, C. Polen con 2 poros germinativos, D. Polen estril. Coloracin X-Gal.

Cultivo de polen in vitro

Materiales y medio de sucrosa al 20% + cido brico 200 ppm + Tween 20 (0.2%)

Siembra del polen en el medio de cultivo

Polen ya sembrado bajo cmara hmeda

Fig. 24: Procedimiento para el cultivo de polen in vitro en medio de sucrosa, cido brico y Tween 20 bajo condiciones de cmara hmeda.

Fig. 25: A y B. Polen germinado y con buen crecimiento en el medio de cultivo. C. Polen con mediana germinacin D. Polen con escasa germinacin.

Fig. 26: A. Polen no germinado, B. Slo uno de los granos del polen doble germinando, C. Escaso polen germinado, D. Polen soltando su contenido.

germinacin in vitro de polen de Solanum, mientras que Bamberg y Hanneman (1991) encuentran que el medio de 20% de lactosa + 50 ppm de cido brico fue superior al medio con sucrosa, as Trognitz (1991) encuentra una respuesta altamente variable para este mismo medio. Gonzles y col (2002) usando un medio compuesto por sacarosa 12%, Nitrato de Calcio (CaNO3) 300 ppm, Sulfato de Magnesio (MgSO4) 200 ppm, Nitrato de Potasio (KNO3) 100ppm, Acido Brico (H3BO4) 100 ppm en solucin acuosa pH=6, refieren que les report resultados confiables.

4.1.1 Preparacin del medio

1. Reactivos Sucrosa (sacarosa), concentracin en la solucin al 20% Acido Brico (H3BO4) 100 ppm (Solucin madre 200 mg en 100 ml) Tween 20, 0.2 % 2. Preparacin del Medio de cultivo Se prepara con 5 ml de la solucin madre de cido brico a 200 ppm y se agrega 20 g de sucrosa y Tween 20, 0.2% en un cilindro graduado (Vaso de 100 cc) y se completa el volumen a 100 cc, agitar bien. 3. Procedimiento para la Germinacin Colocar 4 gotas (aproximadamente 15 l de medio/gota), en una placa Petri con la ayuda de una aguja, o con palillo de dientes colocar pequesimas cantidades de polen sobre cada gota, la tapa de la placa Petri a la cual se ha colocado un papel filtro humedecido va a contribuir a formar una pequea cmara hmeda. Las placas Petri se colocan a 20-24 C. Despus de 24 horas se coloca una gota de lugol, o de colorantes como orcena actica, carmin propinico, lacto propinico orceina y se cubre con un cubre-objeto de 22 x 40 mm y se procede a la observacin bajo el microscpio ptico. Se cuenta como granos germinados aquellos que por lo menos el tubo del polen ha crecido de igual tamao o mayor al dimetro del grano de polen. Para registrar los datos se cuentan en unos 10 sitios el nmero de granos de polen que muestran el tubo de germinacin. Figs. 24, 25 y 26.

Polinizacin y fertilizacin
Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al estigma(s) por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma, los granos de polen germinan formando el tubo polnico. En cada una de las microsporas haploides formadas durante la meiosis, el ncleo se divide por mitosis y desarrolla un grano de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las clulas se divide posteriormente otra vez habitualmente despus del desarrollo del tubo polnico, dando como resultado tres clulas haploides por grano de polen: dos gametos masculinos masculinos (ncleo germinativo y ncleo espermtico).y la clula generadora del tubo polnico. El tubo contina creciendo y entra al vulo a travs del micrpilo. Los dos gametos son entonces liberados dentro de la sinrgida. El saco embrionario contiene 8 ncleos y cada uno con una dotacin haploide de cromosomas. Los dos ncleos cerca al centro del saco embrionario son referidos como ncleos polares; la clula huevo u oosfera est situada cerca al micrpilo. Finalmente un ncleo espermtico entra en la clula huevo y el otro se une a los dos ncleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilizacin, entonces se forma un cigoto diploide, que luego desarrolla en embrin y la unin del otro ncleo espermtico con

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dos ncleos polares, llamado fusin triple resulta en la formacin del tejido nutritivo llamado endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilizacin, este es un proceso complejo, el embrin pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el ovario mismo madura y se transforma en fruto. Las polinizaciones o fertilizaciones, deben realizarse usualmente en la maana antes de las 10 a m, si los das son calurosos es posible hacerlos al final de la tarde. El probable xito del cruzamiento es apreciado por un pedicelo sostenido y ligeramente curvado, unos 2-4 das despus de la polinizacin con un posterior desarrollo de frutos (bayas), los cuales sern cosechados cerca de 30-45 das dependiendo de las especies. Normalmente los frutos son protegidos durante su desarrollo con una malla de fina gasa. Despus de la cosecha, (25-40 das), se colocarn en bolsas de papel hasta su maduracin a temperatura ambiente, esperando hasta que se tornen suaves lo cual permite que el proceso de extraccin sea ms fcil, la extraccin que se hace en un recipiente con agua donde son separadas las semillas de las otras partes del fruto. Las semillas viables tienden a irse hacia el fondo, mientras las semillas llamadas vanas flotan. Las semillas obtenidas as debern ser secadas, colocadas en papel de platina especial y selladas para guardar en cmara de refrigeracin a 4 C. Fig. 27.

Polinizacin y fertilizacin

Colecta de polen

Emasculacin de las anteras

Identificacin del Polinizacin cruzamiento Guardar el polen en cpsulas de gelatina

Fig. 27: Procedimiento para efectuar las polinizaciones en un bloque de cruzamientos.

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4.2 Crecimiento del tubo polnico in vivo (en el pistilo)

Un mtodo til para monitorear la fertilidad del polen es teirlo y visualizarlo para observar como crecen a lo largo del pistilo. Durante la polinizacin, el grano de polen hace contacto con las clulas receptivas del pistilo lo que favorece el crecimiento del polen de algunos genotipos, mientras que se opone o rechaza otros. Esta interaccin polenpistilo establece lmites de endogamia o de exogamia. El anlisis del crecimiento del tubo polnico nos permite hallar las diferencias existentes en cruzamientos compatibles, parcialmente o completamente incompatibles. Dos tipos de incompatibilidad pueden ser distinguidos en Solanum, auto-incompatibilidad o incompatibilidad interespecfica. Para monitorear el crecimiento del tubo polnico in situ: 1. Fijacin Sumergir los carpelos (pistilos) en la solucin de Schreiter (Schreiter and Tiemann, 1977), los que sern colectados 48 horas despus de realizada la polinizacin, 2-6 pistilos por muestra, los que sern retirados intactos de las flores, cortados desde la base con un escapelo. Se debe guardar las muestran en refrigeracin a 4 C hasta una semana antes de la preparacin. La solucin es re-usable cerca de 10 ciclos. Si se torna turbia o grumosa debe nuevamente filtrarse. La solucin debe manejarse con mucho cuidado y con guantes ya que el azul de anilina es cancergeno. 2. Preparacin Hervir las muestras fijadas en un bao de mara, hasta que el tejido se aclare y suavice suficientemente, pero no ms que 30 minutos. El tiempo de preparacin depender de la consistencia del tejido, variando entre genotipos. El tejido en esta etapa se torna extremadamente frgil, hay que tener mucho cuidado en su manipulacin. 3. Montaje Los pistilos sern extendidos y montados en lminas porta-objetos, en una gota de solucin acuosa de 50% de glicerol/agua, cubiertos con un cubre-objeto y aplastados suavemente. Los pistilos preparados de esta manera donde los tubos polnicos que contienen callosa pueden ser coloreados por azul de anilina y detectados con luz UV (Dionne y Spicer, 1958).

Preparacin de la solucin
Para una cantidad total de 1.2 litros de solucin: 100 ml (1 parte) (w/v) de la solucin acuosa de azul de anilina (2%), hervir y filtrar. 700 ml (7 partes) solucin acuosa de 0.2 N K3PO4 * 3 H20 (49.53 g completar a 700 ml con agua destilada) 200 ml (2 partes) 1.0 N Na OH (8.0 g completar a 200 ml con agua destilada) 200 ml (2 partes) (v/v) 10% solucin acuosa de Tween 20 (180 ml de agua destilada + 20 ml de Tween 20).

Al azul de anilina preparada, se agrega las dems soluciones y luego se procede a guardar en frasco oscuro en refrigeracin a 4 C, la solucin toma un color amarillo claro.

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La evaluacin del crecimiento del tubo del polnico se realizar en microscopio de fluorescencia, en una magnificacin x 100 con una lmpara HBO 200 UV- como fuente de luz, BG 12 filtro de excitacin y UG 1 filtro de barrera y un filtro de proteccin Y-455. Se coloca el carpelo cocinado en una lmina porta-objeto con una gota del glicerol/ agua al 50%. La concentracin demasiado alta del glicerol afecta el material. Pero es posible sustituir el agua en la solucin del montaje posteriormente agregando el glicerol puro. De esta manera, las preparaciones son durables si se mantienen en la oscuridad. El tiempo de la preparacin depende de la consistencia del tejido y vara entre los genotipos. El crecimiento del tubo polnico ser evaluado usando una escala o matriz combinada de 18 niveles cualitativos (nivel al que llegan los tubos polnicos) y cuantitativa (cantidad de tubos polnicos, Trognitz, 1991). Figs. 28 y 29.

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Crecimiento del tubo polnico in vivo (en el pistilo)

Cantidad (nmero total de tubos polnicos en el estilo-ovario)

Niveles*

> 30

10-30

<10

Valor combinado del nivel y cantidad de polen

16 No germinado Estigma Estilo-estigma Estilo Estilo (final) Placenta 7 4 1 8 5 2 9 6 3 13 10 14 11 15 12 17 18

Fig. 28: Matriz de valores combinados para evaluacin cualitativa (nivel de crecimiento al cual llegan los tubos polnicos en el pistilo) y cuantitativa (nmero de tubos polnicos llegando a los diferentes niveles a lo largo del pistilo). * Niveles de longitud del tubo del polen llegan: 6 - Polen no germinado; 5 - estigma; 4 - estilo - estigma; 3 - estilo; 2 - final del estilo; 1 - placenta. (Trognitz,1991).

Fig. 29: Diferentes vistas del crecimiento del tubo polnico en el pistilo y ovario despus de ser coloreado con el colorante fluorescente azul de anilina que reacciona con la callosa.

Captulo 5. Cultivo in vitro de embriones inmaduros

La utilizacin de las tcnicas de rescate de embriones ha sido muy importante para la obtencin de hbridos nter especficos e nter genricos. La reproduccin de plantas se realiza mediante hibridacin y seleccin. El cruzamiento de plantas permite al mejorador recombinar caractersticas deseables en nuevos genotipos y a travs de la seleccin obtener mejores productos. Este proceso depende totalmente de la produccin de descendencia; en otras palabras, de la formacin de semillas viables. El cultivo in vitro de embriones permite que embriones que se pierden o no progresan normalmente debido a su condicin de inmaduros, lleguen a progresar y desarrollar una plantula si son colocados en un medio adecuado superando con xito la falta de viabilidad de las semillas procedentes de cruzamientos especialmente difciles, adems de reducir el tiempo que dura el mejoramiento en muchas plantas (Brown & Torpe, 1995; RodriguesOtubo et al, 2000). El xito del cultivo in vitro de embriones inmaduros est influenciado por la composicin qumica del medio de crecimiento, el cual debe ser capaz de inducir el desarrollo exitoso de embriones hbridos, tambin debe establecerse de acuerdo a los principales requerimientos nutricionales de la especie (Pellegrineschi et al., 1997).

Procedimiento
Despus de realizados los cruzamientos las bayas se colectan dentro del lapso de 19-27 D.D.P, se efecta una desinfeccin previa usando una solucin que contiene los acaricidas Azociclotin (Peropal 50 SC): Imidacloprid (Confidor 35 SC) al 1 , adicionndole 6 gotas de Tween 20, colocando las bayas en esta solucin por aproximadamente 10 minutos, seguido de una desinfeccin con alcohol 70% por 30 segundos, y finalmente se lavan 2 veces con agua destilada, proceso que se realiza en un rea destinada para este propsito; por ltimo se esteriliza superficialmente con una solucin de Hipoclorito de Calcio al 2.5% por 10 minutos y finalmente se enjuaga con agua destilada estril, proceso que se realiza en la cmara de flujo laminar. En este punto las bayas estn listas para ser cortadas.

Siembra de embriones inmaduros

Medio modificado de Singsit y Hanneman (1991). Todo ste proceso se realiza dentro de la cmara de flujo laminar en las mayores condiciones de asepsia. Se cortan las bayas para obtener las semillas inmaduras, stas se abren a lo largo de su eje longitudinal, usando un escalpelo y una hoja para escalpelo No 11, todo este proceso se realiza con la ayuda de un estereoscpico. Los embriones son separados cuidadosamente de la cubierta de la semilla y sembrados directamente en las placas Petri de 60 x 15 mm. conteniendo el medio de cultivo, que consiste de 4.6 g/L del medio basal Murashige y Skoog (Sigma), fortificado con 4 % de sucrosa, 100 mg/L de mioinositol, 0.001 mg/L de adenina, 2.0 mg/L de glicina, 1 g/L de casena hidrolizada, 0.1mg/L tiamina-HCl, 1mg/L de cido nicotnico, 0.5 mg/L de piridoxina-HCl, 100 mg/L de cido mlico; 0.7 % de agar, adicionado con 1g/L de carbn activado. El pH del medio se ajusta a pH 5.6 antes de autoclavarlo a 120 C por 20 minutos y se agrega 0.1 mg/L IAA (cido 3indol-actico) y se agrega 0.001 mg/L de kinetina al medio de cultivo por filtracin antes de

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dispensarlo a las placas Petri. Finalmente las placas Petri se colocaran en la cmara de crecimiento en un rango de temperatura de 18 a 22 C, 16 horas de fotoperodo y 3000 lux de intensidad lumnica hasta su germinacin. Una vez ha desarrollada la plantita se procede al transplante a tubos con el medio de propagacin MSA que consiste de 4.6 g/L del medio basal Murashige y Skoog (Sigma), fortificado con 25 g/L de sucrosa, 2.9 g/L de Phytagel y 5 mL del Stock de Vitaminas (0.025 g de GA3 (cido giberlico), 0.5 g de glicina y 0.125 g de cido nicotnico) y a pH 5.6. Fig. 30.

Cultivo in vitro de embriones inmaduros

Torpedo

Apertura de bayas Polinizacin Bayas listas para ser cosechadas (19-27 DDP)
Globular Corazn

in vitro

Descarte de embriones con marcador

Rescate de pro embriones en diferentes estados

Plantas de in vitro creciendo en invernadero

Pro-embriones creciendo en medio de cultivo in vitro

Propagacin in vitro

Hbrido rescatado

Fig. 30: Procedimiento para el cultivo in vitro de embriones inmaduros.

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Literatura consultada

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