Relatrio de um trabalho prtico da disciplina de Biologia Celular 2011/12 Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

Influncia da Variao da Concentrao de Etanol na Fermentao Alcolica em Leveduras

Ana Martins1, Ana ALmeida2, Brbara Adem3, Fbio Ferreira4, Pedro Ruas5, Sara Moniz6
1 3

raquel-fmartins@hotmail.com, 2 ana.isabel.11@live.com.pt,
6

barbara_filipa_ribeiro@hotmail.com, 4fabio_mtf@hotmail.com, 5p_s_ruas@hotmail.com,

sara.moniz1@gmail.com

Introduo
A fermentao um mtodo anaerbio de produo de ATP. Nos organismos que recorrem a estes processos, a gliclise a principal fonte de ATP e, por isso, apesar do oxignio no estar envolvido, necessrio providenciar um acar como substrato, como a sacarose, para que se possa realizar a gliclise. Esta ocorre geralmente no citosol das clulas, e baseia-se na produo de duas molculas de piruvato a partir de uma de glucose, originada a partir da quebra de macromolculas de acares. Este convertido noutros produtos energticos, dependendo do tipo de clula. Esta reao oxida o NADH em NAD+, que liberta os eletres necessrios para a continuao da gliclise. Este conjunto de fenmenos a fermentao, que pode ser de dois tipos: a fermentao lctica ocorre, por exemplo, em clulas musculares quando no h presena suficiente de oxignio para a atividade realizada. Na fermentao alcolica, utilizada por leveduras, o piruvato convertido em etanol e CO2, e o processo semelhante. Esta capacidade das leveduras aproveitada para a confeo do po e da cerveja. As leveduras so organismos unicelulares eucariticos muito simples, pertencentes ao reino Fungi so muitas vezes utilizadas em estudos sobre as propriedades de clulas eucariticas. A Sacharomyces cerevisiae um exemplo comum de leveduras, pois utilizado na produo de cerveja e confeo de po. Tm mitocndrias, que so fundamentais para a produo de ATP, mas no possuem cloroplastos e consegue dividir-se rapidamente em meios propcios. Quanto reproduo, tm a capacidade de a efetuar sexuada e assexuadamente. A escolha de cada processo pode ser manipulada em laboratrio conforme o meio em que esto inseridas, tornando-o um organismo muito til para investigao gentica. Neste trabalho

Influncia da variao da concentrao de etanol na fermentao alcolica

vamos utiliz-lo para proporcionar e estudar a fermentao alcolica. Como j foi referido em cima, a fermentao alcolica necessita de um substrato, a glucose, e os seus produtos finais so o etanol e o dixido de carbono, no estado gasoso. Assim podemos traduzir a fermentao alcolica pela seguinte equao: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2

Deste modo, observando a equao podemos prever que, pela Lei de Le Chatlier, ao aumentarmos a concentrao de etanol pelas diferentes preparaes de leveduras, a fermentao alcolica, ser desfavorecida, visto que a reo tender a ocorrer no sentido de formao do acar. Assim, o etanol tem um efeito inibidor[1] na fermentao alcolica, efeito esse que se deve sua interao com a regio hidrofbica da membrana plasmtica. Ao interagir com esta, o etanol aumenta a polaridade desta barreira, enfraquecendo-a e permitindo a interao de molculas polares, o que ir afetar o posicionamento das protenas na membrana, afetando a integridade da membrana, levando ao seu rompimento, e a um desequilbrio homeosttico[2]. O efeito inibidor do etanol atinge o seu pico, por volta dos 20%, em que a fermentao terminada completamente[3]. Por norma, esta concentrao utilizada para terminar a fermentao da cerveja durante a sua produo. Este trabalho teve como objetivo testar a influncia de diferentes concentraes de etanol na fermentao alcolica em leveduras.

Material e Mtodos
Material biolgico Leveduras desidratadas param panificao (Sacharomyces cerevisae) Maizena; Material - etanol 60%; - gua; - sacarose 20%.

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Preparao das solues de leveduras Pesar e colocar em cada tubo de ensaio, 0,12g de leveduras com um pouco de gua, de modo a ressuspender as leveduras e evitar que elas fiquem presas no fundo deste. Acrescentar o volume de 1,7 ml de Sacarose 20% em cada um dos tubos, bem como o volume de etanol 60% especfico para cada um. Perfazer o volume de 17ml com gua, colocar parafilme e inverter. Composio dos tubos utilizados para testar a influncia da concentrao de etanol na fermentao alcolica em leveduras. Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Mleveduras /g 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 Vsacarose 20% /mL 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 Vetanol 60%/mL ----1,42 2,27 3,40 4,25 Vgua/mL At 17 At 17 At 17 At 17 At 17 Cetanol /% ----5,0 8,0 12,0 15,0

Tabela 1: Tabela discriminatria da composio de cada tubo.

A determinao da atividade de fermentao alcolica foi feita atravs de uma montagem especfica. Colocou-se sobre o tubo de ensaio graduado um outro, de maiores dimenses (com cerca de 25 mL) at tocar no fundo. Com um movimento rpido e preciso inverteu-se o tubo, de forma a evitar sada da soluo. Podendo-se, desta forma, fazer a leitura correta do volume inicial, que corresponde ao volume do espao vazio no cimo do tubo invertido. De seguida, os tubos foram colocados na estufa, temperatura de 37C, durante 45 minutos. A realizao da fermentao por parte das leveduras levou libertao e, consequentemente, acumulao de CO2 no cimo do tubo, formando uma bolha de gs. Pelo mesmo processo, acima referido, medimos o volume final e procedemos subtrao do volume inicial, de modo a obter o volume de CO2 libertado.

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Resultados
Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 % etanol (v/v) 0 5 8 12 15 Vinicial/mL 1,5 1,6 1,6 1,4 1,6 VFinal/mL 6,9 4,5 3,5 2,1 1,9 CO2 libertado/mL 5,4 2,9 1,9 0,7 0,3

Tabela 2: Tabela representativa do volume de CO2 libertado, de acordo com o volume de etanol que contem.

Variao do volume de CO2 libertado em funo das diferentes concentraes de Etanol

16 14 volume de CO2 (mL) 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 concentrao de etanol (% V/V) Grfico 1: Variao do volume de CO2 libertado em funo das diferentes concentraes de Etanol

Atravs da observao do grfico, obtido com os dados da tabela, possvel inferir que conforme a concentrao de etanol aumenta, o volume de CO2 libertado, na fermentao alcolica diminui consideravelmente.

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Discusso
Uma vez que as restantes condies so mantidas ideais, para a atividade fermentativa, os resultados permitem avaliar a variao de atividade enzimtica das leveduras dependendo apenas da concentrao de etanol. Pelos resultados obtidos visvel que o volume de CO2 libertado diminui com o aumento de concentrao de etanol presente, diminuindo tambm o volume final da soluo. Desta forma o etanol atua como inibidor da atividade enzimtica e este efeito intensifica-se com o aumento da concentrao de etanol. Para alm do etanol fornecido inicialmente vai-se somar o etanol produzido na reao de fermentao, que amplia os efeitos inibidores. O tubo controlo manifesta [etanol]i = 0, mas no final verificou-se aumento do volume, de onde se depreende que houve produo de etanol, o que poderia ter evitado uma maior produo de CO2. Tubos que apresentam maior taxa fermentativa, certamente, manifestam uma maior concentrao de etanol produzido. Contudo, na experincia realizada, o tempo reduzido no permitiu que se atingisse um efeito inibidor significativo. Para a concentrao de etanol mais elevada testada, o volume de CO2 ainda no totalmente nulo, embora muito aproximado, o que sugere que uma concentrao ainda maior de etanol limitaria por completo a atividade enzimtica. de salientar a dificuldade em visualizar o volume final no tubo controlo, devido grande acumulao de bolhas, fruto da intensidade atividade fermentativa. A acumulao de leveduras no fundo do tubo foi um aspeto que persistiu aps uma ineficiente agitao da soluo. Contudo, nenhuma destas limitaes comprometeu os resultados da experincia sendo que estes vo de encontro ao referido na literatura. Portanto, a concentrao etanol apresenta um efeito inibidor da atividade enzimtica, diminuindo assim, a quantidade dos produtos finais. Um trabalho futuro poder passar pela anlise do efeito da [CO2] no processo biolgico descrito.

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Bibliografia
[1] Damore, T., 1992. Improving Yeast Fermentation Performance, J. Inst. Brew. SeptemberOctober, Vol. 98, pp 375-382 [2] Salgueiro S & S Correira I & Novais J, 1988, Ethanol-Induced Leakage in Sccharomyces cerevisiae: Kinetics and Relationship to Yeast Ethanol Tolerance and Alcohol Fermentation Productivity, Applied and Environmental Microbiology, April 1988, Vol.54, N4, pp.903-909 [3] Nagodawithana T. & Steinkraus K, 1976, Influence of the Rate of Ethanol Production and Accumulation on the Viability of Saccharomyces cerevisiae in Rapid Fermentation, Applied and Environmental Microbiology, February 1976, pp.158-162 [4] Alberts B et al., 2008, Molecular Biology of the Cell 5th ed, New York: Garland Science,

2008

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