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MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de Vigilncia Epidemiolgica

Manual Nacional de VIGILNCIA LABORATORIAL da TUBERCULOSE e outras MICOBACTRIAS

Braslia, DF 2008

2008 Ministrio da Sade Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs Srie A. Normas e Manuais Tcnicos Tiragem: 1 edio 2008 2.550 exemplares Elaborao, distribuio e informaes: MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de Vigilncia Epidemiolgica Ncleo de Comunicao/GAB/SVS Esplanada dos Ministrios, Bloco G, Edifcio Sede, sobreloja, sala 134 CEP: 70058-900, Braslia DF E-mail: svs@saude.gov.br Home page: http://www.saude.gov.br/svs Produo editorial: Coordenao: Fabiano Camilo Projeto grfico, diagramao e reviso: All Type Assessoria Editorial Ltda Apoio Fundo Global - Projeto Tuberculose Brasil Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Ficha Catalogrfica Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Manual nacional de vigilncia laboratorial da tuberculose e outras micobactrias / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Braslia : Ministrio da Sade, 2008. 436 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos) ISBN 978-85-334-1447-1 1. Doena crnica. 2. Tuberculose. 3. Diagnstico. 4. Doenas infecciosas. I. Ttulo. II. Srie. NLM WT 500
Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2008/0111

Ttulos para indexao: Em ingls: National Manual for the Laboratory Surveillance of Tuberculosis and others Mycobacterias Em espanhol: Manual Nacional de la Vigilancia Laboratorial de la Tuberculosis y otras Micobacterias

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Sumrio
Prefcio 9

Apresentao

11

Equipe de elaborao

12

CAPTULO 1 13 ORGANIZAO E GERNCIA DA REDE DE LABORATRIOS DE TUBERCULOSE 1.1 1.2 1.3 Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Organizao da rede nacional de laboratrios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Hierarquia na rede nacional de laboratrios de tuberculose. . . . . . . . . 16 1.3.1 Rede hierarquizada de execuo de exames para o controle da tuberculose e outras micobactrias . . . . . . . . . . . 19 Funes e competncias do LRN, LRR, LRE/LACEN, LRM, LL e LF para o controle da tuberculose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Capacitao, visita tcnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Administrao laboratorial e manuteno de registros . . . . . . . . . . . . 31 1.6.1 Procedimentos Operacionais Padro (POP) . . . . . . . . . . . . . . . 32 1.6.2 Formulrios de laboratrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 1.6.3 Registros laboratoriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Monitoramento da sade dos profissionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.4 1.5 1.6

1.7 1.8 1.9

CAPTULO 2 SISTEMA DE GARANTIA DA QUALIDADE DA BACILOSCOPIA

47

Siglas e definies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2.1 Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 2.2 Controle de Qualidade Interno (CQI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 2.3 Melhoria da Qualidade (MQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.4 Avaliao Externa da Qualidade (AEQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

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2.5 2.6 2.7 2.8 2.9

2.4.1 Teste de Proficincia (TP). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2.4.2 Releitura de lminas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2.4.3 Visita tcnica aos laboratrios locais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Responsabilidade dos laboratrios em relao Avaliao Externa da Qualidade (AEQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Benefcios da AEQ para o Ministrio da Sade e para os laboratrios . 68 Indicadores para avaliao de desempenho do laboratrio . . . . . . . . . 68 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

CAPTULO 3 BIOSSEGURANA 3.1 3.2

105

3.3 3.4

3.5 3.6 3.7 3.8

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Barreiras de conteno primrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 3.2.1 Boas prticas microbiolgicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 3.2.2 Equipamentos de Proteo Individual (EPI). . . . . . . . . . . . . . 106 3.2.3 Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC) . . . . . . . . . . . . . . 107 Barreiras de conteno secundria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 3.3.1 Instalaes laboratoriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Transporte de amostras biolgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 3.4.1 Transporte intra e interlaboratorial de amostras clnicas. . . . 111 3.4.2 Transporte intra e interlaboratorial de lminas com esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 3.4.3 Transporte interlaboratorial de cepas de micobactrias . . . . 112 Procedimentos em casos de acidentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Uso adequado dos equipamentos de laboratrio . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

CAPTULO 4 121 MICOBACTRIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 4.1 4.2 Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

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CAPTULO 5 AMOSTRAS CLNICAS 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6

127

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Seleo e tipos de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Amostras de origem pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 Amostras de origem extrapulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 Solicitao de exames. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 Consideraes gerais para coleta e armazenamento de amostras clnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 5.7 Orientaes para coleta de escarro espontneo . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 5.8 Instrues para coleta de escarro induzido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 5.9 Recepo de amostras no laboratrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 5.10 Controle de qualidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 5.10.1 Recebimento de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 5.10.2 Aspectos fsicos do escarro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 5.10.3 Qualidade das amostras de escarro espontneo . . . . . . . . . . 138 5.11 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 5.12 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

CAPTULO 6 BACILOSCOPIA 6.1 6.2 6.3 6.4

145

6.5 6.6 6.7 6.8 6.9

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 Mtodos de execuo do esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 Fixao do esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 Mtodos de colorao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 6.4.1 Mtodo de Ziehl-Neelsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 6.4.2 Mtodo da fluorescncia com Auramina O . . . . . . . . . . . . . 161 Leitura e interpretao dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 Registro dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 Controle de qualidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

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CAPTULO 7 CULTURA PARA MICOBACTRIAS 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10

179

7.11 7.12 7.13 7.14 7.15

7.16 7.17

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 Critrios para realizao da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 Mtodos de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 Etapas da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 Pr-tratamento das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 Agentes fluidificantes-descontaminantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Incubao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Leitura, interpretao e registro dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Mtodos clssicos de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 7.10.1 Mtodo de Petroff modificado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 7.10.2 Mtodo de N-Acetil-L-Cistena-Hidroxido de Sdio (NALC-NaOH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 7.10.3 Mtodo de Ogawa-Kudoh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 7.10.4 Mtodo do cido oxlico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 Procedimentos para incubao nos mtodos clssicos . . . . . . . . . . . . 200 Procedimentos de leitura, interpretao e registro dos resultados nos mtodos clssicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 Subcultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Sistemas comerciais automatizados de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 Controle de qualidade da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 7.15.1 Controle de qualidade interno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 7.15.2 Controle de qualidade externo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229

CAPTULO 8 IDENTIFICAO DE MICOBACTRIAS 8.1 8.2

265

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 Material para os testes fenotpicos para separao das espcies do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) e diferenciao das espcies do Complexo M. tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

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8.3

Pr-requisitos para identificao de espcies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 8.3.1 Preparo da suspenso bacteriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 8.3.2 Isolamento de colnias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 8.4 Separao das espcies do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) . . . . . . . . . 270 8.4.1 Anlise microscpica da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270 8.4.2 Anlise macroscpica da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 8.4.3 Teste de inibio de crescimento em meio com cido p-nitrobenzico 500 g/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 8.4.4 Teste da Niacina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 8.5 Diferenciao dos membros do Complexo M. tuberculosis . . . . . . . . 275 8.5.1 Testes Fenotpicos para diferenciao das espcies do Complexo M. tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 8.6 Identificao fenotpica das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 8.7 Controle de qualidade interno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 8.8 Identificao molecular pelo Mtodo Molecular de PRA-hsp65 . . . . . 297 8.9 Testes fenotpicos e moleculares combinados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 8.10 Consideraes sobre critrios para diagnstico de doena causada por MNT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308 8.11 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 8.12 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312

CAPTULO 9 TESTE DE SENSIBILIDADE PARA MICOBACTRIAS 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11 9.12

323

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 Vigilncia da resistncia s drogas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 Mecanismo de resistncia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324 Critrios para realizao do Teste de Sensibilidade . . . . . . . . . . . . . . . 326 Mtodos de Teste de Sensibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326 Mtodo das propores em meio LJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327 Sistemas comerciais automatizados de TS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 Teste de Sensibilidade para drogas alternativas . . . . . . . . . . . . . . . . . 348 Controle de qualidade interno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Controle de qualidade externo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366

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CAPTULO 10 CONSERVAO DE MICOBACTRIAS 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5

393

Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393 Mtodos de congelamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393 Manuteno de Cepas Padro ou Controles de Referncia . . . . . . . . . 398 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402

CAPTULO 11 USO E MONITORAMENTO DE EQUIPAMENTOS

405

11.1 Descrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 11.2 Equipamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406 11.2.1 Agitador mecnico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406 11.2.2 Autoclave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407 11.2.3 Balanas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408 11.2.4 Banho-maria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410 11.2.5 Cabine de Segurana Biolgica (CSB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410 11.2.6 Capela de Exausto (CE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412 11.2.7 Centrfuga e microcentrfuga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413 11.2.8 Coagulador de meio de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416 11.2.9 Cuba e fonte de eletroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417 11.2.10 Destilador de gua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418 11.2.11 Estufas bacteriolgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 11.2.12 Freezer e refrigerador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 11.2.13 Medidor de pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421 11.2.14 Micropipetadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423 11.2.15 Microscpio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424 11.2.16 Termociclador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425 11.2.17 Termmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426 11.3 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429 11.4 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430

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Prefcio
Foi com grande satisfao que aceitei o convite e a incumbncia de escrever o prefcio para este manual, pois o considero tambm uma oportunidade para prestar homenagem aos milhares de profissionais de laboratrio da bacteriologia da tuberculose que, durante dcadas, vm dando sustentao tecnolgica aos programas de controle da tuberculose no Pas, tanto para o diagnstico da doena como para o controle do tratamento. Quando se fala em tempos pretritos, a bacteriologia da tuberculose passa a ser sinnimo de baciloscopia direta do escarro, pois foi e, certamente, continuar sendo o mtodo mais importante e simples para a descoberta das fontes de infeco na comunidade. Sinto-me vontade para discorrer sobre o assunto baciloscopia. Acompanhei de perto, no Rio Grande do Sul, a aplicao do conceito de rede de baciloscopia da tuberculose, com controle de qualidade, e que em apoio ao Programa de Controle da Tuberculose do Rio Grande do Sul (PCT/RS) atingiu, a partir da dcada de 70 do sculo passado, o mais alto grau de proficincia e confiabilidade de resultados no Pas. Nesse sentido, quero manifestar meus respeitos a todos os profissionais que se dedicaram, ao longo de suas vidas, implantao e qualificao do diagnostico laboratorial da tuberculose. Em especial, cumpre registrar e destacar o mestre dos mestres da bacteriologia da tuberculose brasileira, o saudoso professor e doutor Milton Fontes Magaro, com o qual tive o prazer de conviver na dcada de 70 em diversos momentos, tendo a oportunidade de conhecer suas qualidades profissionais e humanas, inclusive seu empenho, com corpo e alma, para a implantao da Rede de Laboratrios de Bacteriologia da Tuberculose no Brasil com seu prprio sistema de informao. Nos dias de hoje, tendo eu o privilgio de ainda estar militando na rea de tuberculose e de sade pblica, olho ao meu redor e vejo com muita alegria uma nova e entusiasmada gerao de profissionais de laboratrio na rea da tuberculose, dando continuidade aos trabalhos de rotina e ampliando sua rea de abrangncia, de acordo com a nova realidade poltico-administrativa, o novo momento epidemiolgico da tuberculose no Brasil e no mundo, bem como as novas tecnologias que o avano da cincia, especialmente a biologia molecular, vem proporcionando. H consenso de que a baciloscopia do escarro continua essencial na luta contra a tuberculose, mas que na atualidade insuficiente para fazer frente aos desafios postos pelo M. tuberculosis, especialmente pelo surgimento de cepas multirresistentes aos frmacos atualmente disponveis e a modificao das formas e caractersticas de apresentao da tuberculose no hospedeiro, induzidas pela presena concomitante do vrus HIV, que potencializa a agressividade e o poder destrutivo das micobactrias.

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O primeiro passo para a adoo de tecnologias mais avanadas a ampla utilizao do mtodo da cultura dos bacilos no PNCT, o que possibilitar posteriores desdobramentos tcnico-cientficos mais sofisticados, como a tipificao dos bacilos e outros, quando indicados. As chances de que estes dois novos e grandes desafios, resistncia bacilar e TB/AIDS, sejam vencidos so diretamente proporcionais competncia tcnica dos profissionais, e principalmente vontade poltica e capacidade de organizao e gerncia dos gestores municipais, responsveis diretos pelo controle da tuberculose em seu territrio desde a municipalizao da sade na dcada de 90. Este Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias, que abrangente e de altssimo padro, contempla tanto os aspectos organizacionais, como os procedimentos tcnicos com os respectivos materiais e equipamentos necessrios melhoria da qualidade dos servios laboratoriais. , portanto, uma ferramenta bem-vinda e imprescindvel para que todos os laboratrios, pblicos ou privados, possam atuar de forma uniforme e padronizada em todos os recantos desse imenso Brasil, para o xito do Programa Nacional de Controle da Tuberculose. Ao mesmo tempo em que o Manual reitera a padronizao do diagnstico laboratorial da tuberculose pela simples baciloscopia do escarro, o ttulo indica que o laboratrio da tuberculose transcende o papel de realizar somente o diagnstico clnico da doena para inserir-se no objetivo maior que exercer vigilncia epidemiolgica sobre as vrias formas da tuberculose, no sentido de monitorar o comportamento do bacilo e de seu aliado, o vrus da Aids, e sejam adotadas, em tempo oportuno, as medidas de interveno pertinentes nas comunidades.

Werner Paul Ott


Tisiologista/Especialista em Sade Pblica Membro do Comit Tcnico Assessor de Tuberculose da SVS/MS

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Apresentao
Esta publicao apresenta algumas diretrizes gerais para a estruturao e funcionamento das atividades, em uma lgica hierarquizada e regionalizada. O objetivo orientar os profissionais de laboratrio do Sistema nico de Sade (SUS) na organizao da rede de referncia para detectar casos de tuberculose pulmonar infecciosa, monitorar a evoluo do tratamento e documentar a cura por meio do exame microscpico do escarro baciloscopia. Alm disso, este manual contribuir para o diagnstico dos casos de tuberculose pulmonar, baciloscopia negativa e extrapulmonar e deteco de outras micobactrias que afetam a sade da populao. O estabelecimento de diretrizes para a organizao da rede laboratorial particularmente importante em termos de cuidado aos usurios, impacto na sade e custos para o sistema de sade. A organizao desses servios representa uma tarefa complexa, por exigir a combinao de tecnologias diversificadas e a sua adaptao s caractersticas locais, no que diz respeito aos aspectos sociodemogrficos, epidemiolgicos, sanitrios, econmicos, entre outros. Assim, na organizao da rede laboratorial fundamental considerar: especificidades regionais, necessidade do Programa de Controle da Tuberculose, infra-estrutura existente, disponibilidade de recursos humanos, relao custo-benefcio da incorporao tecnolgica, critrios para otimizao dos servios, parmetros de qualidade e legislao em vigor para instalao de laboratrios. A Secretaria de Vigilncia em Sade (SVS) do Ministrio da Sade se valeu da combinao dos conhecimentos terico-prticos de profissionais que atuam na rea de laboratrio, como pesquisadores, tcnicos de bancada e educadores, para elaborao desse manual, voltado para a melhoria da qualidade dos servios prestados, dentro de critrios que privilegiam o aperfeioamento e a padronizao dos mtodos utilizados, a adequao aos requisitos de biossegurana e a organizao da rede. Gerson Oliveira Penna
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Equipe de elaborao
Esta publicao foi elaborada por um grupo de profissionais pesquisadores, tcnicos de bancada e educadores dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica dos estados, Instituto Evandro Chagas, Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia e Universidade Federal do Esprito Santo que atuam na rea de laboratrio para o controle da tuberculose, em parceria com a Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade. Coordenao

Roslia Maia CGLAB/DEVEP/SVS/MS

Organizao da Publicao

Roslia Maia CGLAB/DEVEP/SVS/MS Susana Beatriz Vianna Jardim CGLAB/DEVEP/SVS/MS Marta Osrio Ribeiro IPB/LACEN/RS FEPPS Daisy Nakamura Sato IAL/Ribeiro Preto/SP Fabiano Camilo e Silva NUCOM/SVS/MS

Elaborao da publicao

Ana Lcia Viana Atta Sarmento LACEN/DF Creusa Lima Campelo LACEN/CE Daisy Nakamura Sato IAL/Ribeiro Preto/SP Julia Ignez Salem INPA/MCT Lucilaine Ferrazoli IAL/SP Maria Luiza Lopes IEC/SVS Maria Madileuza Carneiro Neves LACEN/PE Dr. Milton Bezerra Sobral Marta Osrio Ribeiro IPB/LACEN/RS FEPPS Mauricio Morishi Ogusku INPA/MCT Moiss Palaci Ncleo de Doenas Infecciosas NDI/UFES Rita Lecco Fioravanti LACEN/ES Roslia Maia CGLAB/DEVEP/SVS/MS Solange A. Vinhas Ncleo de Doenas Infecciosas NDI/UFES Susana Beatriz Vianna Jardim CGLAB/DEVEP/SVS/MS

Revisora tcnica

Lucia Barrera Servicio Micobacterias, INEI ANLIS Dr CG Malbran, Argentina. Laboratrio Supranacional OPS/OMS

Colaboradores

Angela Maria Werneck Barreto CRPHF Erica Chimara IAL/SP Eunice Atsuko Totumi Cunha LACEN/MS Francisco Duarte Vieira LACEN/DF Ludmila Baethgen IPB/LACEN/RS FEPPS Ricardo Gadelha de Abreu DEVEP/SVS/MS Rosa Maria Albuquerque Castro IPB/LACEN/RS FEPPS

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CAPTULO 1

ORGANIZAO E GERNCIA DA REDE DE LABORATRIOS DE TUBERCULOSE

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1 .1 Introduo
Na construo de um Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT), o objetivo principal dos servios laboratoriais de diagnstico de tuberculose deve ser o de detectar casos de tuberculose pulmonar, monitorar a evoluo do tratamento e documentar a cura no fim do tratamento por meio do exame microscpico do escarro-baciloscopia. A cultura pode complementar a baciloscopia permitindo colocar em evidncia bacilos viveis presentes em escassa quantidade. A cultura permite tambm a identificao das espcies e a realizao do teste de sensibilidade. A padronizao das tcnicas bsicas de bacteriologia da tuberculose possibilita a comparao de resultados no pas, facilita o treinamento de profissionais, a delegao de responsabilidades e a seleo de equipamentos, materiais e reagentes a serem adquiridos; facilita ainda a avaliao de desempenho da rede de laboratrios e o estabelecimento de uma superviso apropriada para aumentar a eficincia e reduzir o custo operacional da rede. A padronizao facilita tambm a instalao de novos laboratrios assim como a organizao dos j instalados. As tcnicas e os procedimentos padronizados devem ser simples (para obter grande cobertura) e aplicveis pelos auxiliares de laboratrio. Ao mesmo tempo, sua sensibilidade e especificidade devem garantir a confiabilidade dos resultados obtidos. A rede de laboratrios muitas vezes negligenciada, apesar de ser um componente essencial para a estratgia do tratamento supervisionado (DOTS). Alm disso, a epidemia de Aids e a emergncia da tuberculose multirresistente tm demonstrado uma necessidade de investimento em garantia da qualidade e de biossegurana nos laboratrios de tuberculose1. Este captulo tem o propsito de oferecer informaes em administrao e organizao da rede de laboratrios de tuberculose, a partir da legislao brasileira e da literatura disponvel, que orientem os gerentes e profissionais de laboratrios a: Desenvolver um sistema de rede de laboratrios, orientados pelos princpios e diretrizes do Sistema nico de Sade (SUS), que participem, em suas reas de abrangncia, do processo que se estende desde a deteco, o diagnstico e o tratamento at a cura dos pacientes de TB. Assumir responsabilidade conjunta, com a gerncia dos Programa de Controle da Tuberculose (PCT), ao programar, desenvolver e avaliar as atividades dos programas. Adotar as polticas dos PCT de maneira efetiva em suas reas de abrangncia, baseado em estratgias revisadas e recomendadas pela OMS e pela Unio Internacional Contra Tuberculose e Doenas Pulmonares (UICTDP) para o controle da TB2.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

1 .2 Organizao da rede nacional de laboratrios


O planejamento dos servios de laboratrios deve ser orientado pelos princpios e diretrizes do Sistema nico de Sade (SUS). Dessa forma, deve-se buscar garantir a universalidade e oportunidade de acesso dos cidados a todas as aes e servios necessrios integralidade da ateno3. A Lei Orgnica da Sade, LOS 8.080/90, que dispe sobre as condies para a promoo, proteo e recuperao da sade; a organizao e o funcionamento dos servios, diz em seu artigo 15 que a Unio, Estados, Distrito Federal e Municpios, em seu mbito administrativo, tm as atribuies de: organizao e coordenao do Sistema de Informao em Sade; elaborao de normas tcnicas e estabelecimento de padres de qualidade; participao na formulao da poltica de formao de recursos humanos para a sade; elaborao de normas para regular as atividades de servios privados em sade, tendo em vista a sua relevncia pblica; elaborao de normas tcnico-cientficas de promoo, proteo e recuperao da sade entre outras. Em seus artigos 16, 17 e 18, respectivamente, descreve as competncias da: Direo Nacional do SUS de: definir e coordenar o sistema de rede de laboratrios de sade pblica; identificar os servios estaduais e municipas de referncia nacional para o estabelecimento de padres tcnicos de assistncia a sade; prestar cooperao tcnica e financeira aos Estados, Distrito Federal e Municpios, para aperfeioamento de sua atuao institucional; elaborar normas para regular as relaes entre o SUS e os servios privados contratados de assistncia sade; acompanhar, controlar e avaliar as aes e os servios de sade, respeitadas as competncias Estaduais e Municipas; promover a descentralizao para as Unidades Federadas e para os Municpios dos servios e aes de sade entre outras competncias. Direo Estadual do SUS de: promover a descentralizao, para os municpios, dos servios e das aes em sade; acompanhar, controlar e avaliar as redes hierarquizadas do SUS; prestar apoio tcnico e financeiro aos Municpios e executar supletivamente aes e servios de sade; coordenar e, em carter complementar, executar aes e servios; identificar estabelecimentos hospitalares de referncia e gerir sistemas pblicos de alta complexidade, de referncia estadual e regional; coordenar a rede estadual de laboratrios de sade pblica e gerir as unidades que permaneam em sua organizao administrativa; estabelecer normas, em carter suplementar, para o controle e avaliao das aes e servios de sade, entre outras competncias. Direo Municipal do SUS de: planejar, organizar, controlar e avaliar as aes e os servios de sade e gerir e executar os servios pblicos de sade; participar do planejamento, programao e organizao da rede regionalizada e hierarquizada

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do SUS em articulao com sua Direo Estadual; gerir laboratrios pblicos de sade; controlar e fiscalizar os procedimentos dos servios privados de sade entre outras competncias4. De acordo com a Norma Operacional da Assistncia em Sade, NOAS 01/02, a implantao e o funcionamento articulado de estabelecimentos de sade podem se dar no mbito de um municpio, de uma microrregio ou regio, dependendo da populao de abrangncia, das especificidades locais e dos nveis de complexidade dos servios de laboratrio. Dessa forma, deve-se garantir o encaminhamento para exames de maior complexidade, a serem ofertados, em alguns casos, nos laboratrios de referncia estadual, regional ou at mesmo nacional5. De forma geral, prope-se, com o objetivo de evitar o deslocamento dos usurios, um modelo organizacional que compreenda a estruturao de postos de coleta de amostras clnicas articulados a laboratrios de maior complexidade para a realizao de exames6. O Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica (SNLSP) foi institudo pela Portaria Ministerial 280, de 1977, ratificada pela LOS 8.080, de 1990. O SNLSP foi reestruturado e ento constitudo o SISLAB, atravs da Portaria 15, em janeiro de 2002, ratificada pela Portaria 2.031 de setembro de 2004, como um conjunto de redes nacionais de laboratrios, organizadas em sub-redes, por agravo ou programas, de forma hierarquizada, por grau de complexidade das atividades relacionadas vigilncia em sade compreendendo a vigilncia epidemiolgica e vigilncia em sade ambiental, vigilncia sanitria e assistncia mdica. Em seu artigo 8, a Portaria 2.031/2004 classifica as unidades laboratoriais do seguinte modo: I. Centros Colaboradores CC. II. Laboratrios de Referncia Nacional LRN. III. Laboratrios de Referncia Regional LRR. IV. Laboratrios de Referncia Estadual LRE. V. Laboratrios de Referncia Municipal LRM. VI. Laboratrios Locais LL. VII. Laboratrios de Fronteira LF. Os CC so unidades laboratoriais especializadas e capacitadas em reas especficas, que apresentam os requisitos necessrios para desenvolver atividades de maior complexidade e de ensino e pesquisa. Os LRN so unidades laboratoriais de excelncia tcnica altamente especializada. Os LRR so unidades laboratoriais capacitadas a desenvolver atividades mais complexas, organizadas por agravo ou programas, que prestam apoio tcnico-operacional quelas unidades definidas para sua rea geogrfica de abrangncia.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Os LRE so os Laboratrios Centrais de Sade Pblica LACEN, vinculados s secretarias estaduais de sade e com rea geogrfica de abrangncia estadual. Os LRM so unidades laboratoriais vinculadas s secretarias municipas de sade e com rea geogrfica de abrangncia municipal. Os LL so unidades laboratoriais que integram a rede estadual ou municipal de laboratrios de sade pblica. Os LF so unidades laboratoriais localizadas em regies de fronteira para a viabilizao do diagnstico de agentes etiolgicos, vetores de doenas transmissveis e outros agravos sade pblica, bem como a promoo do controle analtico para a verificao da qualidade sanitria dos servios prestados e de produtos7. Em dezembro de 2004, a Portaria 70 da SVS, republicada em fevereiro de 2005 por incorreo da publicao de 2004, estabeleceu os critrios e a sistemtica para habilitao de Laboratrios de Referncia Nacional e Regional, para as Redes Nacionais de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica e Ambiental em Sade. Determinou, tambm, prazo para os Laboratrios de Referncia Nacional e Regional, pr-selecionados pelas Portarias 409 e 410, de setembro de 2003, da Fundao Nacional de Sade FUNASA, encaminharem documentao Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica CGLAB, formalizando interesse em permanecer como Referncia. Um dos requisitos para a habilitao participar de Programa Internacional de Avaliao Externa de Qualidade para o LRN ou em Programa Nacional de Avaliao Externa de Qualidade para o LRR. Os Laboratrios de Referncia Nacional e Regional habilitados, passaro por processo de auditoria externa a cada 02 (dois) anos8. Em dezembro de 2005, a Portaria Ministerial 2.606, classificou os LRE/LACEN por Nvel e Porte, definindo, a partir da, recursos a serem repassados mensalmente do Fundo Nacional de Sade para os Fundos Estaduais de Sade9. Para a rede de laboratrios de tuberculose, as Portarias 409 e 410 FUNASA indicaram o Laboratrio de Referncia Nacional do Centro de Referncia Professor Hlio Fraga como pr-selecionado, o mesmo no acontecendo com Laboratrios de Referncia Regional. O processo de habilitao dos laboratrios pr-selecionados est em andamento nesse momento.

1 .3 Hierarquia na rede nacional de laboratrios de tuberculose


A organizao dos servios de laboratrios deve ser orientada pela diretriz da hierarquizao, centralizando em laboratrios de referncia (LR) procedimentos tais como a cultura, a identificao e o teste de sensibilidade em funo da necessidade desses procedimentos exigirem recursos humanos, ambientais e materiais mais especializados. necessrio implementar um processo de descentralizao das atividades para laboratrios de referncia estadual e municipal bem como para laboratrios lo-

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cais, quando o territrio extenso como o caso do Brasil. Segundo a Organizao Mundial de Sade, em geral, um LL com microscopia pode realizar de 2 a 20 baciloscopias por dia e atender uma populao de 100.000 habitantes e, necessrio ao menos um laboratrio que realize cultura para uma rea com populao de 500.000 habitantes1. Para que todos os pacientes possam se beneficiar com a cultura para micobactrias e para que se possa garantir a qualidade da mesma necessria a participao de toda a rede de laboratrios. Os LL que realizam baciloscopia devem manter um fluxo de referncia e contra-referncia sistemtico com o LR mais prximo que realize cultura e teste de sensibilidade. Lembrando que as amostras clnicas devem ser enviadas o mais rpido possvel para serem cultivadas, conforme as orientaes descritas nos Captulos 3 e 5 deste manual. No item 1.9.1 do anexo deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolados bacterianos para o LR. possvel que seja necessrio coletar informaes complementares em casos especiais que no sejam freqentes na rotina de trabalho de LL ou LRM. Dessa forma, os estudos necessrios para cada caso podero ser realizados, utilizando-se da melhor forma possvel os recursos de diagnsticos disponveis no LR. No captulo 7 deste manual descrito o Mtodo de Ogawa-Kudoh como uma opo para o LRM ou LL que desejar realizar cultura para micobactrias e no possui todos os equipamentos recomendados para os outros mtodos. Esse mtodo econmico e suficientemente sensvel para assegurar que a cultura contribua para confirmar o diagnstico da tuberculose pulmonar, nos casos com baciloscopia negativa e til para recuperar os bacilos de escarros de pacientes bacilferos que requerem teste de sensibilidade. Gera risco biolgico similar ao da baciloscopia pois no requer centrifugao de suspenses com bacilos10. Em funo disso, vem sendo utilizado em alguns estados do Brasil e em outros pases da Amrica Latina. A utilizao do mtodo de Ogawa-Kudoh pelo LRM ou LL pode reduzir o tempo de espera do paciente pelo resultado do exame pois, se houver estufa bacteriolgica no local, a cultura s ser enviada ao LR se houver visualizao de colnias. Nesse caso, deve ser estabelecido um fluxo referncia e contra-referncia sistemtico com o LR mais prximo para o envio dos isolados bacterianos para identificao de espcie e/ou teste de sensibilidade. Para que seja implantada cultura com todas suas etapas em um laboratrio, existem alguns requisitos que devemos levar em considerao: Mais tempo gasto por amostra clnica pelo profissional. Treinamento em procedimentos de maior risco biolgico. Medidas adicionais de proteo dos profissionais.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Equipamentos especficos de maior custo, com garantia de manuteno. Laboratrio mais espaoso e com sistema de direcionamento e purificao de ar. A qualidade dos meios de cultura especficos a serem utilizados em um laboratrio um ponto crtico. Para elabor-los, necessria uma infra-estrutura para preparao e para o controle de qualidade interno dos mesmos. Por essa razo, muitas vezes necessrio e/ou conveniente que os LRM ou LRE/LACEN produzam esses meios para sua rede de abrangncia, assegurando seu transporte adequado e sua qualidade. Os gestores nacionais, estaduais e municipais em parceria com os LRN, LRR, LRE/LACEN e LRM devem assegurar a qualidade da baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade e garantir que a oferta e a utilizao dos insumos, equipamentos e documentos tcnicos sejam adequadas em todo pas, de acordo com o plano de trabalho e objetivos dos PCT. As trs esferas de governo, em parceria, de acordo com os princpios do SUS e respeitadas as competncias descritas no item 4 deste captulo, devem desenvolver as seguintes atividades: Publicar documentos tcnicos e operacionais para a implementao dos procedimentos. Implementar um programa de formao de recursos humanos. Implementar um programa de garantia da qualidade. Promover o desenvolvimento das condies de biossegurana adequadas. Os gestores devem verificar se a aplicao de recursos na implantao de novos mtodos em um laboratrio vai resultar na otimizao do manejo dos casos da tuberculose. importante, tambm, no momento de selecionar um mtodo para utilizao na rede de laboratrio, conhecer quais so aceitos pelas normas da OMS10. conveniente priorizar a implantao de mtodos mais sofisticados, como os sistemas automatizados de cultura e teste de sensibilidade e mtodos moleculares, em laboratrios com comprovada qualidade e que concentrem o diagnstico de casos crticos de tuberculose (infantil, extrapulmonar, associada a infeco por HIV, multirresistente). Nesses laboratrios, algumas vezes, possvel processar os mtodos mais caros somente nas amostras clnicas de pacientes que requerem prioritariamente rapidez na obteno do resultado, e manter os procedimentos clssicos para as demais amostras clnicas. O aumento de custo por amostra clnica analisada, originado pelo uso dos sistemas comerciais, em relao aos mtodos clssicos, varivel mas sempre significativo. maior para os laboratrios habituados a preparar seus prprios meios de cultura a base de ovos, para os que processam um baixo nmero de amostras clnicas e compram poucos tubos com meios semi-sintticos e para os que esto longe dos centros urbanos. Os laboratrios que no tm cabine de segurana biolgica no devem processar mtodos com centrifugao de amostras clnicas com baciloscopia positiva para

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minimizar o risco biolgico. Essas amostras so geralmente investigadas para identificar espcie e/ou conhecer sua sensibilidade a drogas antituberculose. Nesse caso, conveniente enviar a amostra clnica, conforme descrito no Captulo 5 deste manual, diretamente para o LR para a realizao desses estudos. A identificao das espcies de micobactrias feita atravs das provas bioqumicas, mas pode ser tambm realizada por tcnicas moleculares. Neste manual, no Captulo 8, alm das provas bioqumicas ser descrito tambm um mtodo molecular j utilizado em alguns LR no Brasil, o Mtodo de PRA hsp65 (do ingls Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65). No se recomenda a incorporao de mtodos que amplifiquem cidos nucleicos em laboratrios que no apresentem os requisitos necessrios para realiz-los (disponibilidade de trs laboratrios separados, material descartvel em cada laboratrio, pessoal capacitado, roupa de uso exclusivo em distintas reas, etc.)10. 1 .3 .1 Rede hierarquizada de execuo de exames para o controle da tuberculose e outras micobactrias Uma rede hierarquizada de execuo dos exames para o controle da tuberculose e outras micobactrias deve ser orientada pela centralizao, em laboratrios de referncia (LR), de procedimentos tais como cultura, identificao e teste de sensibilidade em funo da exigncia de recursos humanos, ambientais e materiais mais especializados, conforme descrito detalhadamente no item 1.3 deste captulo. No Quadro 1, apresentamos um resumo dos locais para execuo de exames na rede hierarquizada de laboratrios do SUS para o diagnstico e controle da tuberculose e outras micobactrias.

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Quadro 1
Identificao do Complexo M. tuberculosis Identificao de Micobactrias No Causadoras de Tuberculose Identificao Fenotpica x x x x Identificacao Molecular Identificao Fenotpica x x x x x x x Identificacao Molecular

Rede hierarquizada de execuo de exames para o diagnstico e controle da tuberculose e outras micobactrias
Teste de Sensibilidade Drogas de 1 Linha Mtodo das Propores x x x Outras Drogas Concentrao Inibitria Mnima x x

Laboratrios

Baciloscopia

Cultura (isolamento bacteriano)

LRN x x x x

LRR

LRE/LACEN

LRM

LF

LL

Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS

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1 .4 Funes e competncias do LRN, LRR, LRE/LACEN, LRM, LL e LF para o controle da tuberculose


O LRN a unidade laboratorial de excelncia tcnica especializada e tem as seguintes competncias: Assessorar a Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica (CGLAB), no acompanhamento, normalizao, padronizao de tcnicas e avaliao das atividades dos laboratrios de tuberculose. Assessorar a CGLAB na coordenao tcnica da rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Realizar procedimentos laboratoriais de maior complexidade. Assessorar a CGLAB na aquisio e distribuio de equipamentos e insumos estratgicos para a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Coordenar o fornecimento e a produo de insumos (drogas antituberculose para o TS, fitas para a prova de niacina, meios de cultura, etc.) para a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Promover, em parceria com a CGLAB e a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose, o desenvolvimento e avaliao de mtodos, pesquisas operacionais e de vigilncia epidemiolgica de forma articulada com as sociedades tcnicocientficas sem fins lucrativos e com centros de pesquisa e desenvolvimento, que renam competncias e capacitaes tcnicas em reas de interesse dos PCT. Assessorar a CGLAB na elaborao e promoo de um programa de educao continuada de recursos humanos para o desenvolvimento da credibilidade e confiabilidade laboratorial, estimulando parcerias com os laboratrios integrantes do SUS e com centros formadores de recursos, visando a melhoria da qualidade do diagnstico laboratorial da tuberculose. Realizar assessoria e visitas tcnicas aos LRR. Participar dos encontros, seminrios e oficinas para elaborao de oramentos, avaliao e programao das atividades da rede de vigilncia laboratorial de interesse dos PCT. Participar da elaborao de protocolos do sistema de avaliao externa da qualidade para os testes de baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade. Participar da realizao das Avaliaes Externas da Qualidade realizando os painis de lminas amostras e isolados bacterianos e, retestando amostras ou isolados bacterianos investigados nos laboratrios da rede, participar do comit de anlise dos resultados. Participar na elaborao e reviso de documentos tcnicos relacionados vigilncia laboratorial da tuberculose.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Disponibilizar, periodicamente, relatrios para a CGLAB das visitas tcnicas realizadas. Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto CGLAB com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose, obedecendo cronograma definido. Participar de intercmbio e acordos nacionais e internacionais, visando, juntamente com a CGLAB, promover a melhoria do SUS.

Os LRR so unidades laboratoriais que prestam apoio tcnico-operacional quelas unidades definidas para sua rea geogrfica de abrangncia com as seguintes competncias: Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades laboratoriais executadas nas unidades. Desenvolver e realizar tcnicas de maior complexidade, bem como dar suporte tcnico aos LRE/LACEN, promovendo as condies tcnicas e operacionais na execuo das aes. Assessorar o LRN no fornecimento e na produo de insumos (drogas antituberculose para o TS, fitas para a prova de niacina, meios de cultura, etc.) para a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Desenvolver, em parceria com a CGLAB, o LRN e a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose, estudos, diagnsticos e pesquisas, de forma articulada com as sociedades tcnico-cientficas sem fins lucrativos e com centros de pesquisa e desenvolvimento, que renam competncias e capacitaes tcnicas em reas de interesse dos PCT. Assessorar a CGLAB na elaborao e promoo de um programa de educao continuada de recursos humanos para o desenvolvimento da credibilidade e confiabilidade laboratorial, estimulando parcerias com os laboratrios integrantes do SUS e com centro formadores de recursos, visando a melhoria da qualidade do diagnstico laboratorial da tuberculose. Realizar visitas tcnicas aos LRE/LACEN. Participar dos encontros, seminrios e oficinas para avaliao e programao das atividades da rede de vigilncia laboratorial de interesse dos PCT. Participar da elaborao de protocolos do sistema de avaliao externa da qualidade para os testes de baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade. Participar da realizao das Avaliaes Externas da Qualidade. Participar na elaborao e reviso de documentos tcnicos relacionados vigilncia laboratorial da tuberculose. Executar supletivamente exames laboratoriais de menor complexidade.

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Encaminhar ao LRN, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que necessitam de identificao de espcie, bem como aqueles isolados que se destinam ao controle de qualidade. ATENO: No item 1 .9 .1 dos anexos deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado bacteriano para o LR .

Disponibilizar, periodicamente, relatrios para a CGLAB da visitas tcnicas realizadas, Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto para a CGLAB com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose, obedecendo cronograma definido.

Os LRE/LACEN so os laboratrios com rea geogrfica de abrangncia estadual com as seguintes competncias: Coordenar a rede estadual de laboratrios pblicos e privados que realizam a vigilncia laboratorial de interesse dos PCT. Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades laboratoriais executadas na rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Desenvolver e realizar tcnicas de maior complexidade, bem como dar suporte tcnico aos LRM, LL e LF, promovendo as condies tcnicas e operacionais na execuo das aes. Coordenar o fornecimento e a produo de insumos (fitas para a prova de niacina, meios de cultura, etc.) para a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Assessorar a CGLAB na elaborao e promoo de um programa de educao continuada de recursos humanos para o desenvolvimento da credibilidade e confiabilidade laboratorial, estimulando parcerias com os laboratrios integrantes do SUS e com centros formadores de recursos, visando a melhoria da qualidade do diagnstico laboratorial da tuberculose. Realizar visitas tcnicas aos LRM, LL e LF. Participar dos encontros, seminrios e oficinas para avaliao e programao das atividades da rede de vigilncia laboratorial de interesse dos PCT. Participar da elaborao de protocolos do sistema de avaliao externa da qualidade para os testes de baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade. Participar da realizao das Avaliaes Externas da Qualidade. Participar na elaborao e reviso de documentos tcnicos relacionados vigilncia laboratorial da tuberculose.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Executar supletiva e complementarmente exames de menor complexidade. Realizar procedimentos laboratoriais de maior complexidade. Encaminhar ao LRR, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que necessitam identificao de espcie, bem como aqueles isolados que se destinam ao controle de qualidade. ATENO: No item 1 .9 .1 do anexo deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado bacteriano para o LR .

Realizar controle de qualidade da rede estadual. Habilitar, observada a legislao especfica a ser definida pelos gestores nacionais da rede, os laboratrios que sero integrados rede estadual, informando a CGLAB. Disponibilizar, periodicamente, relatrios ao LRN, LRR e a CGLAB da visitas tcnicas realizadas. Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao PCT e CGLAB com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose, obedecendo cronograma definido.

Os LRM so unidades laboratoriais, com rea geogrfica de abrangncia municipal, com as seguintes competncias: Coordenar a rede municipal de laboratrios pblicos e privados que realizam a vigilncia laboratorial de interesse dos PCT. Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades laboratoriais executadas na rede de vigilncia laboratorial da tuberculose. Participar dos encontros, seminrios e oficinas para avaliao e programao das atividades da rede de vigilncia laboratorial de interesse dos PCT. Realizar visitas tcnicas aos LL. Participar das Avaliaes Externas da Qualidade. Realizar baciloscopia. Obs.: No caso de municpios com de 500.000 habitantes ou mais, realizar alm da baciloscopia, a cultura, buscando as condies descritas nos Captulos 3 e 7, com o apoio tcnico-operacional do LRE/LACEN. Encaminhar ao LRE/LACEN, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que necessitam identificao de espcie e teste de sensibilidade, bem como as baciloscopias e os isolados que se destinam ao controle de qualidade.

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ATENO: No item 1 .9 .1 do anexo deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado bacteriano para o LR . Habilitar, observada a legislao especfica a ser definida pelos gestores nacionais da rede, os laboratrios que sero integrados rede municipal, informando ao LRE/LACEN. Disponibilizar, periodicamente, relatrios ao LRE/LACEN da visitas tcnicas realizadas. Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao PCT e ao LRE/ LACEN com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose, obedecendo cronograma definido.

Os LL so unidades laboratoriais que integram a rede estadual ou municipal de laboratrios que realizam exames de interesse dos PCT, com as seguintes competncias: Coletar amostra para o diagnstico, cultura e teste de sensibilidade para tuberculose, respeitando sua capacidade tcnica instalada. Realizar baciloscopia. Participar das Avaliaes Externas da Qualidade. Encaminhar ao respectivo LRM ou ao LRE/LACEN, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para complementao do diagnstico, cultura e teste de sensibilidade e as baciloscopias que se destinam ao controle de qualidade. ATENO: No item 1 .9 .1 do anexo deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado bacteriano para o LR . Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao LRM com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose, obedecendo cronograma definido.

Os LF so unidades laboratoriais com as seguintes competncias: Participar das Avaliaes Externas da Qualidade. Realizar baciloscopia e cultura. Encaminhar ao LRE/LACEN as amostras, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, para complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que necessitam de identificao de espcie e teste de sensibilidade, bem como as baciloscopias e os isolados que se destinam ao controle de qualidade.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

ATENO: No item 1 .9 .1 do anexo deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado bacteriano para o LR . Auxiliar nas atividades desenvolvidas pelos LRE/LACEN. Colaborar no cumprimento dos Acordos Internacionais, na rea de preveno e controle da tuberculose. Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao LRE/LACEN com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose, obedecendo cronograma definido1, 7, 10.

1 .5 Capacitao, visita tcnica


Uma das metas do PNCT aumentar o nmero dos sintomticos respiratrios (SR) examinados atravs da baciloscopia ou cultura. Sabe-se que para o cumprimento dessa meta necessrio investimento constante na qualificao dos servios laboratoriais e na capacitao de recursos humanos (RH), de modo a ampliar a capacidade de diagnstico e intensificar a busca de SR.
1 .5 .1 Capacitao Profissionais capacitados e motivados so fundamentais para o adequado desempenho do laboratrio. crucial tambm que eles estejam conscientes do papel que desempenham para que possam ser parceiros no controle da tuberculose. No Brasil, a CGLAB, em conjunto com o PNCT, tem realizado cursos e oficinas, com o objetivo de capacitar e sensibilizar os profissionais de laboratrio para a utilizao de indicadores na anlise dos dados laboratoriais gerados. A avaliao um processo crtico-reflexivo, contnuo e sistemtico e esse processo, se desenvolvido integrado s prticas do cotidiano dos servios, fortalece a integrao otimizando o uso dos recursos pblicos. A avaliao pode ser usada, tambm, como ferramenta para a tomada de deciso no mbito da gesto. 1 .5 .1 .1 Capacitao para os LL As capacitaes tcnicas voltadas para os LL devem abordar a relevncia da baciloscopia para o diagnstico e o controle de tratamento da tuberculose, noes de sistema mtrico para que possam utilizar adequadamente os equipamentos, noes de biossegurana e de qualidade; alm dos conceitos de assepsia e esterilizao. Os profissionais devem receber ainda orientao para: Forma de transmisso da doena. Coleta, armazenamento e transporte das amostras clnicas.

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Baciloscopia direta: preparao do esfregao, inclusive numerao da lmina e escolha da partcula purulenta do escarro; fixao; colorao, descolorao e colorao de fundo pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Procedimentos para o Controle de Qualidade Interno da Baciloscopia. Uso do microscpio para a leitura microscpica. Emisso do resultado no formulrio de Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia e registro dos dados no Registro de Baciloscopia. Modelos destes formulrios so apresentados, respectivamente, nos itens 1.9.2 e 1.9.3 dos anexos desse captulo. ATENO: O resultado da baciloscopia deve ser emitido no mximo em 24 horas .

Manuteno de microscpio. Limpeza e conservao das lminas para o Controle de Qualidade Externo. Procedimentos de envio ao LRE/LACEN das amostras para complementao do diagnstico, cultura e teste de sensibilidade, bem como as baciloscopias que se destinam ao controle de qualidade. Procedimento de desinfeco e esterilizao de material contaminado. Medidas de segurana para a manipulao de escarro. Identificao de problemas que possam ocorrer durante a realizao e leitura da baciloscopia. Planejamento e controle de estoque dos insumos e reagentes do laboratrio. Os cursos para os LL devem ser organizados e conduzidos pelo LRE/LACEN, em parceria com o LRM (quando houver), para no mximo 10 profissionais por curso1. O suporte financeiro e tcnico deve ser dos gestores estaduais e nacionais e dos LRR e LRN. O nmero de treinandos deve ser calculado com base no espao do laboratrio, nos insumos a serem utilizados e nos microscpios disponveis. Em mdia, necessrio um microscpio para cada dois treinandos1. O contedo terico deve ser ministrado pelo LRE/LACEN em parceria com o PCT e com o LRM, quando houver.
1 .5 .1 .2 Capacitao para os LF As capacitaes tcnicas voltadas para os LF devem abordar a relevncia da baciloscopia para o diagnstico e o controle de tratamento da tuberculose, noes de sistema mtrico para que possam utilizar adequadamente os equipamentos, noes de biossegurana e de qualidade; alm dos conceitos de assepsia e esterilizao. Os profissionais devem receber ainda orientao para: Forma de transmisso da doena.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Coleta, armazenamento e transporte das amostras clnicas. Baciloscopia direta: preparao do esfregao, inclusive numerao da lmina e escolha da partcula purulenta do escarro; fixao; colorao, descolorao e colorao de fundo pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Baciloscopia aps concentrao da amostra clnica. Cultura e identificao do Complexo M. tuberculosis Procedimentos de controle de qualidade interno. Uso e manuteno dos equipamentos. Uso do microscpio para a leitura microscpica. Emisso do resultado no formulrio de Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia e registro dos dados no Registro de Baciloscopia. Modelos desses formulrios so apresentados, respectivamente, nos itens 1.9.2 e 1.9.3 dos anexos desse captulo. Emisso do resultado no formulrio de Solicitao e Resultado de Exame Cultura de Teste de sensibilidade e registro dos dados no Registro de Cultura e Teste de Sensibilidade. Modelos destes formulrios so apresentados, respectivamente, nos itens 1.9.4 e 1.9.5 dos anexos desse captulo. Manuteno de microscpio. Limpeza e conservao das lminas para o Controle de Qualidade Externo. Procedimentos de envio ao LRE/LACEN das amostras para complementao do diagnstico, isolados bacteriolgicos inconclusivos ou que necessitam de identificao de espcie, bem como as baciloscopias e os isolados que se destinam ao controle de qualidade. Procedimento de desinfeco e esterilizao de material contaminado. Medidas de segurana para a manipulao de escarro. Identificao de problemas que possam ocorrer durante a realizao e leitura da baciloscopia. Planejamento e controle de estoque dos insumos e reagentes do laboratrio. Preparao dos reagentes para o mtodo de Ziehl-Neelsen. Preparao dos reagentes para todas etapas da cultura. Preparao de meios de cultura. Biossegurana. Os cursos para os LF devem ser organizados e conduzidos pelo LRE/LACEN em parceria com o LRM (quando houver), para no mximo 10 profissionais por curso1. O suporte financeiro e tcnico deve ser dos gestores estaduais e nacionais, e dos LRR e LRN. O nmero de treinandos deve ser calculado com base no espao do laboratrio, nos insumos a serem utilizados e nos microscpios disponveis. Em mdia, necessrio um microscpio para cada dois treinandos1. O contedo terico deve ser ministrado pelo LRE/LACEN em parceria com o PCT e com o LRM, quando houver.

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1 .5 .1 .3 Capacitao para os LRE/LACEN e LRM As capacitaes voltadas para o LRE/LACEN e LRM devem atender as necessidades tcnicas e dar suporte para o execuo das funes de coordenadores de rede. O contedo do curso deve cobrir: Informao sobre normas e princpios do SUS, PCT, estratgia do tratamento supervisionado. Funes da rede de laboratrios de tuberculose: emisso de relatrios, protocolo de visita tcnica, protocolo de Controle de Qualidade Interno e Externo. Metodologia tcnica: 1) Mtodos de Execuo do Esfregao para Baciloscopia Direta e Baciloscopia aps Concentrao da Amostra Clnica. 2) Baciloscopia corada pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O, como mtodo alternativo e se o laboratrio j possui microscpio de fluorescncia. 3) Cultura para micobactrias. 4) Identificao do Complexo M. tuberculosis. 5) Preparao de reagentes, corantes e meios de cultura. 6) Procedimento para o Controle de Qualidade Interno. 7) Uso e Manuteno de Equipamentos. 8) Biossegurana. 9) Avaliao Externa da Qualidade. Metodologia tcnica especfica para LRE/LACEN: 1) Teste de sensibilidade. 2) Preparao de reagentes e meios de cultura para o teste de sensibilidade pelo mtodo das propores. Contedo de gerncia: 1) Organizao do treinamento em Baciloscopia direta corada pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. 2) Roteiro da visita tcnica aos LL e LF; e ao LRM (quando for o caso). 3) Programa de Controle Externo da Qualidade da Baciloscopia. 4) Organizao do fluxo de lminas para o controle de qualidade, amostras clnicas e isolados bacterianos. 5) Planejamento, aquisio e controle de insumos, reagentes e equipamentos. A CGLAB em parceria com o PNCT, LRN e LRR devem organizar e ministrar os cursos para os LRE/LACEN e LRM. Esses cursos devem ter a durao de trs ou mais semanas1.

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1 .5 .1 .4 Capacitao para os LRN e LRR Os LRN e LRR devem receber contedo sobre assessoria tcnica, planejamento e gerncia de rede de laboratrios, alm de contedo terico-prtico em mtodos para execuo de testes de sensibilidade, vigilncia laboratorial, identificao de micobactrias, avaliao de atividades laboratoriais e metodologia para pesquisa operacional. Eles podem ser capacitados dentro do pas ou em cursos internacionais promovidos pela Organizao Mundial de Sade (OMS) ou pela Unio Internacional Contra Tuberculose e Doenas Pulmonares (UICTDP). 1 .5 .2 Visita tcnica A visita tcnica consiste no processo mais adequado para observar as condies de um laboratrio e as atividades tcnicas nele desenvolvidas. Por ter um contato direto, mais efetivo e permite propor aes corretivas de acordo com os recursos e possibilidades locais. imprescindvel que as visitas tcnicas sejam realizadas de forma programada, regular, peridica e que disponham de apoio e de recursos financeiros dos gestores. Durante a visita, o avaliador dever observar detalhadamente documentos, condies tcnicas, operacionais e de biossegurana. Essa atividade deve ser realizada durante o perodo de trabalho especialmente quando h mudanas de recursos humanos, de procedimentos, de local ou de equipamento. A visita tcnica permite a coleta de dados para o Programa de Controle Externo da Qualidade da Baciloscopia da Tuberculose e melhora o fluxo de informao entre os laboratrios. Recomenda-se como rotina uma visita anual e, se necessrio, uma freqncia maior. O avaliador deve preparar e manter uma lista de verificao de requisitos operacionais, tcnicos e de indicadores fundamentais durante a visita tcnica. Lista de verificao operacional Avaliar condies de infra-estrutura. Verificar se a norma de prazo para emisso dos resultados (especialmente os casos positivos) est sendo seguida. Verificar se as lminas esto guardadas apropriadamente para o controle externo de qualidade. Verificar se a equipe tcnica foi capacitada para as tcnicas especficas. Avaliar a carga de trabalho em relao disponibilidade de profissionais. Verificar e avaliar a quantidade de baciloscopias realizadas e a proporo de lminas positivas. Verificar e avaliar a quantidade de culturas, pacientes investigados, quantidade de cultura para diagnstico.

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Verificar e avaliar isolados bacterianos enviados para teste de sensibilidade. Verificar se os casos positivos notificados pelo laboratrio constam dos registros da unidade de tratamento.
Verificar tambm os seguintes requisitos:

- - - - - - - - - -

Possuir POP das tcnicas e manuais de laboratrio. Possuir insumos em quantidade e qualidade adequadas. Possuir um planejamento para compra de insumos necessrios. Possuir equipamentos (microscpio) em funcionamento apropriado. Possuir um sistema de controle de qualidade interno. Possuir normas de biossegurana. Possuir controle de sade peridico dos profissionais. Possuir registro de acidentes de trabalho. Possuir e manter registros dos exames padronizados. Possuir requisio de exame padronizada.

Lista de verificao tcnica Observar e avaliar os processos de preparao de esfregao, colorao e leitura. Assegurar que sejam feitos os controles de qualidade dos corantes. Fazer releitura de algumas lminas com o profissional do local, para avaliar a qualidade do esfregao, da colorao e da leitura. Revisar os resultados anteriores do CEQ por releitura, discutir sugestes e recomendaes para a melhoria da qualidade. Lista de verificao de indicadores fundamentais Quantas amostras foram realizadas por sintomtico respiratrio. Qual a positividade da baciloscopia diagnstica. Qual o percentual de sintomticos respiratrios com baciloscopia positiva. Qual a positividade da baciloscopia total. Qual o percentual de amostras com aspecto de saliva.

1 .6 Administrao laboratorial e manuteno de registros


Um sistema de registro laboratorial fornece informaes que podem ser utilizadas para melhorar a gerncia dos PCT em todas as esferas de governo. A manuteno de registros dos materiais recebidos (amostras clnicas, isolados bacterianos ou lminas de baciloscopia), dos procedimentos laboratoriais, dos resultados de exames e dos materiais enviados (amostras clnicas, isolados bacterianos ou lminas de baciloscopia) para os LR para realizao de cultura, identificao de espcie, teste de sensibilidade e controle de qualidade, essencial para o planejamento das estratgias a serem utilizadas para o controle da doena. A padronizao desses registros deve ser

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

simples, prtica e limitada s informaes essenciais para facilitar a coleta, a compilao e avaliao das informaes. O laboratrio deve possuir programa de manuteno preventiva para os equipamentos necessrios realizao dos exames, que atenda as recomendaes dos fabricantes e deve, tambm, possuir programa aprovado e implantado de calibrao/validao dos equipamentos e instrumentos de medio. Esses programas devem estar documentados e disponveis. 1 .6 .1 Procedimentos Operacionais Padro (POP) Todos os protocolos dos procedimentos de laboratrio usados rotineiramente devem ter sido publicados anteriormente em livro, manual ou peridico confivel e, todos, devem ser mantidos na bancada para serem consultados facilmente. Os procedimentos devem ser escritos exatamente como realizados no laboratrio e qualquer mudana deve ser conhecida e utilizada primeiramente pelo LR1. ATENO: Os mtodos apresentados neste manual devem ser utilizados pelos laboratrios da rede, de acordo com o Quadro 1 desse captulo e sua capacidade tcnica instalada . Os mtodos a serem utilizados pelos laboratrios devem ser pactuados com os coordenadores da rede estadual e/ou nacional para um planejamento adequado do suporte tcnico-financeiro . O laboratrio deve ter instrues documentadas e disponveis: Para coleta, acondicionamento, conservao e transporte de amostras clnicas e isolados bacterianos. Com critrios para aceitao e rejeio de amostras clnicas e de isolados bacterianos encaminhados. Para o uso e manuteno de todos os equipamentos. Essas instrues devem estar aos lado do equipamento e devem ser claras para que todo profissional possa oper-los. De biossegurana relacionados com os processos de limpeza e desinfeco de superfcies e gerenciamento de resduos. Para o caso de acidente com risco biolgico. 1 .6 .2 Formulrios de laboratrio O formulrio de solicitao e resultado de exame deve ser legvel e com informaes suficientes para a identificao do laboratrio, do solicitante, do paciente, da amostra e dos mtodos utilizados. Deve conter tambm datas (coleta, entrada no

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laboratrio, da realizao dos ensaios e da emisso do laudo), nome e assinatura dos responsveis por sua emisso. Os formulrios de solicitao e resultado de baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade; do controle de qualidade interno e externo; ou qualquer outro formulrio utilizado na rede de laboratrios deve ser padronizado; os modelos esto disponveis nos anexos dos captulos deste manual. 1 .6 .3 Registros laboratoriais Alguns registros merecem ateno especial do responsvel pelo laboratrio, especialmente os registros nos: Sistema de informao com cadastramento unvoco das amostras clnicas e isolados bacteriano que garanta sua identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio. A CGLAB, em parceria com o DATASUS, vem desenvolvendo o sistema informatizado Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL, especialmente para as doenas de interesse da sade coletiva como a tuberculose, com o objetivo de agilizar o fluxo de informaes. No item 1.9.7 deste captulo apresentamos a Requisio de Exames do Sistema Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL. Registro das manutenes corretivas e preventivas realizadas em todos os equipamentos do laboratrio. Livro de acidentes laboratoriais. Este ltimo deve ser mantido pelo responsvel do laboratrio e deve conter detalhes sobre os acidentes e as medidas necessrias tomadas. Cada acidente de laboratrio deve ser relatado ao responsvel do laboratrio e todos os detalhes registrados, anotando os seguintes dados: Data do acidente. Nome da pessoa acidentada e de todas as pessoas presentes no laboratrio no momento do acidente. Descrio do acidente. Nmero do registro da amostra clnica/isolado bacteriano envolvido. Extenso do ferimento. Acompanhamento das medidas tomadas aps a realizao dos exames na pessoa acidentada. O responsvel do laboratrio e a pessoa acidentada devem assinar o registro no 1 livro .

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

1 .7 Monitoramento da sade dos profissionais


A transmisso da tuberculose um risco reconhecido para os profissionais de laboratrio e a infeco pelo vrus do HIV facilita essa transmisso. A maioria das pessoas no desenvolve a doena depois da infeco, desde que elas sejam imunocompetentes. Para o estabelecimento de uma infeco suficiente para produzir doena, a exposio deve ser prxima e prolongada. Alguns fatores como: higienizao deficiente e negligncia com as medidas de segurana, quando presentes no laboratrio, aumentam a probabilidade da transmisso da infeco, enquanto fatores que afetam a imunidade do indivduo (por exemplo: HIV, diabetes, cncer, uso abusivo de lcool) aumentam a probabilidade o desenvolvimento da doena. Os profissionais do laboratrio de tuberculose devem ser selecionados cuidadosamente. Eles devem ser mental e psiquicamente capaz1. Devem aderir as medidas de segurana e ser acompanhados por um programa de vigilncia pelo qual seu status de sade monitorado regularmente.
1 .7 .1 Programa de monitoramento de doenas para profissionais de laboratrio

Cada profissional deve ter um arquivo confidencial de monitoramento de doena no qual os procedimentos de triagem para tuberculose, tanto quanto de outras doenas, devem ser registrados. Os elementos de um programa de monitoramento de doena incluem o seguinte:
1 .7 .1 .1 Perfil pr-admisso e linha de base na admisso dos profissionais de laboratrio

Um questionrio padro de sade deve ser preenchido para cada profissional. Esse questionrio deve relatar infeco ou doena prvia de tuberculose, status da vacinao pela BCG, fatores de sade que podem comprometer a susceptibilidade tuberculose e contato prvio com caso confirmado de tuberculose. Um modelo de questionrio apresentado no item 1.9.6 dos anexos deste captulo. Para a linha de base deve ser realizado um raio X de trax e uma Reao de Mantoux - RM tambm conhecida como Teste Tuberculnico ou PPD. Se o resultado da RM for: forte reator, com endurao > 15 mm e, o profissional apresentar sintomas sugestivos de tuberculose, ele deve ser avaliado clnica e microbiologicamente. Devem ser coletadas duas amostras de escarro em dias sucessivos e investigados por baciloscopia e/ou cultura para tuberculose. O teste para HIV confidencial com aconselhamento (pr e ps-teste) deve ser oferecido para todos os profissionais do laboratrio. No recomendada a revacinao com BCG como preveno para tuberculose nos profissionais de laboratrio1.

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1 .7 .1 .2 Monitoramento trimestral de sade Os profissionais de laboratrio devem declarar, trimestralmente, as informao de seu status de sade em um formulrio que contenha perguntas especficas relacionadas aos sinais e sintomas de tuberculose. Isso inclui tosse por mais de trs semanas, perda de peso, anorexia, suores noturnos e outros episdios de infeco respiratria nas ltimas semanas. O peso dos profissionais tambm deve ser registrado trimestralmente e, se houver uma perda maior do que 10% sem motivo conhecido, com relao ao trimestre anterior, dever ser realizada uma investigao clnica e microbiolgica para tuberculose. Um modelo Monitoramento Trimestral de Sade apresentado no item 1.9.6 dos Anexos deste captulo e poder ser utilizado como monitoramento trimestral do estado de sade dos profissionais de laboratrio. 1 .7 .1 .3 Monitoramento de ps-exposio Aps um acidente no laboratrio, o monitoramento trimestral deve ser alterado. O profissional deve ser monitorado clinicamente. Oito semanas depois da exposio, um raio X de trax deve se realizado. Junto deve ser realizada uma RM nos casos onde a RM realizada na linha de base tenha apresentado uma endurao com dimetro < 10 mm.

1 .8 Referncias
1. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part I. Organization and Management. WHO/TB/98.258. Geneva, Switzerland. 1998. 2. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Gerncia de Rede de Laboratrios de TB. Braslia. 2004 3. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria da Assistncia Sade. Departamento de Descentralizao da Gesto da Assistncia. Manual de Apoio aos Gestores do SUS Organizao da Rede de Laboratrios Clnicos. Braslia. 2002. 4. BRASIL. Lei Orgnica da Sade, LOS 8080. Braslia. 1990 5. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria da Assistncia Sade. Norma Operacional de Assistncia a Sade NOAS. Braslia. 2002. 6. BRASIL. Ministrio da Sade, Secretaria da Assistncia Sade, Departamento de Descentralizao da Gesto da Assistncia. Posto de Coleta. Braslia. 2002. 7. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria 2031 Gabinete Ministerial. Braslia 2004. 8. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Portaria 70. Braslia. 2004. 9. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria 2606 Gabinete Ministerial. Braslia. 2005. 10. OPAS/Organizacion Panamericana de la Salud. Draft de Normas Para el Diagnostico Bacteriolgico de la Tuberculosis Parte II. Cultivo. Argentina. 2007.

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

1 .9 Anexos do captulo
1 .9 .1 Formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado bacteriano para o LR
Formulrio para o Envio de Amostras Clnicas ou Isolados Bacterianos para o LR
A informao solicitada neste formulrio a mnima necessria para o LR manter contato com o laboratrio que enviou a amostra clnica ou cultura e ter condies de escolher a metodologia mais adequada a ser utilizada no isolamento ou na identificao da espcie ou no teste de sensibilidade. A falta de informao pode levar a no utilizao da metodologia adequada para o caso em questo e com isso aumentar o tempo de emisso do resultado.

PROCEDNCIA
Instituio: Nmero do CNES:

Endereo:

Telefone/Fax:

Nome do Paciente:

Gnero:

Masculino
Profisso:

Feminino

Data de Nascimento: __________/__________/__________

Idade atual: __________

Procedncia do Paciente:

Ambulatrio

Hospital

Consultrio

DADOS CLNICOS DO PACIENTE


Teste ID com PPD (Mantoux):

Reator Forte No Reator Paciente com Tratamento Prvio para TB

Reator Fraco No Realizado Paciente sem Tratamento Prvio para TB

TRATAMENTO PRVIO PARA TB


Esquema Ano Desfecho

Cura Cura Cura

Abandono Abandono Abandono

Recidiva Recidiva Recidiva

Falncia Falncia Falncia

FATORES PR-DISPONENTES PARA MICOBACTERIOSES


Doena pulmonar obstrutiva e/ou destrutiva:

micose curada pneumoconiose bronquiectasia


Estado de imunodeficincia:

tuberculose curada doena maligna fibrose cstica

bronquite crnica silicose

doena maligna
HIV/Aids:

diabetes

uso de drogas imunossupressoras

positivo
Doena esofageana com regurgitao:

negativo

sem informao

sim
Utilizao de procedimentos invasivos:

no

prtese/implante transplante

dilise injees e/ou punes repetidas

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Resumo da doena:

MATERIAL ENVIADO
Amostra clnica. Qual:
O resultado da baciloscopia da amostra clnica foi:

Cultura. A partir de qual amostra clnica:

Nmero de culturas realizadas:

Nmero de cultura positivas:

1 cultura foi realizada em meio de cultura: ___________________________ . Houve desenvolvimento de ________ colnias em _____ dias de incubao, com desenvolvimento de pigmento sim no. 2 cultura foi realizada em meio de cultura: ___________________________ . Houve desenvolvimento de ________ colnias em _____ dias de incubao, com desenvolvimento de pigmento sim no. 3 cultura foi realizada em meio de cultura: __________________________ . Houve desenvolvimento de ________ colnias em _____ dias de incubao, com desenvolvimento de pigmento sim
Data:

no.
Assinatura do Responsvel pelo envio:

__________/__________/__________

_________________________________________________________________

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Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

1 .9 .2 Formulrio de solicitao e resultado de exame baciloscopia


Formulrio de Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia
Data de Entrada no Laboratrio: __________/__________/__________ Unidade de Sade: Telefone: ( ) Nmero do CNES: N Geral:

Nome do Paciente:

Gnero:

Masculino
Data de Nascimento: __________/__________/__________ Nmero do Carto SUS: Idade atual: __________ Nome da me:

Feminino

Endereo completo:

Bairro:

Municpio:

CEP:

Telefone: (

Procedncia do Paciente:

N Pronturio:

Ambulatrio
Data da Coleta: Amostra:

Hospital Escarro espontneo Escarro induzido

Consultrio Outras Qual?

SOLICITAO BACILOSCOPIA
Diagnstico Controle de Tratamento

1 Amostra

2 Amostra

1 ms 5 ms

2 ms 6 ms
Assinatura do solicitante

3 ms _____ ms

4 ms

Data de solicitao:

Nome do solicitante

RESULTADO BACILOSCOPIA
Laboratrio Executor: N do Exame:

Data de Entrada no Laboratrio: __________/__________/__________ Metodo de Ziehl Neelsen

Data da realizao do Exames: __________/__________/__________

Negativa Positiva (+++)


Aspecto do Escarro:

de 1 a 9 bacilos No realizada Mucopurulento

Positiva (+)

Positiva (++)

Saliva
Observaes:

Sanguinolento

Liquefeito

Nome do responsvel pelo exame:

Data: ____/____/____

Assinatura do Responsvel pelo Exame:

38 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

1 .9 .3 Registro de baciloscopia
Registro de Baciloscopia
Data Entrada: Data da Coleta da Amostra:

Nmero:

Nome: Data nascimento: Gnero:

Endereo:

Masculino
Diagnostico: Solicitante:

Feminino

Material:

Escarro
Aspecto do escarro:

Outro: 3 ms 4 ms
Corantes: Fucsina- Lote:

1 Amostra ____ ms Saliva Mucopurulento

2 Amostra

____ Amostra Sanguinolento


Azul de metileno-Lote:

Controle de tratamento:

1 ms Outro: Qual:

2 ms

Liquefeito
lcool-cido Lote:

Baciloscopia pelo Mtodo de:

Ziehl-Neelsen

BACILOSCOPIA RESULTADO
de 1 a 9 bacilos
Assinatura

Negativa

Positiva (+)

Positiva (++)

Positiva (+++)

No realizada

Observaes:

Data:

Nome do responsvel pelo exame:

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Nmero:

Data Entrada:

Data da Coleta da Amostra:

Nome: Data nascimento: Gnero:

Endereo:

Masculino
Diagnostico: Solicitante:

Feminino ____ Amostra


Aspecto do escarro:

Material:

Escarro 3 ms 4 ms ____ ms

Outro:

1 Amostra

2 Amostra

Controle de tratamento:

1 ms Outro: Qual:

2 ms

Saliva

Mucopurulento
Corantes: Fucsina- Lote:

Sanguinolento
Azul de metileno-Lote:

Liquefeito
lcool-cido Lote:

Baciloscopia pelo Mtodo de:

Ziehl-Neelsen de 1 a 9 bacilos Positiva (+)

BACILOSCOPIA RESULTADO
Positiva (++) Positiva (+++)
Assinatura

Negativa

No realizada

Observaes:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 39

Data:

Nome do responsvel pelo exame:

Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

1 .9 .4 Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias


Formulrio de Solicitao e Resultado de Exame Cultura para Micobactrias
Data de Entrada no Laboratrio: __________/__________/__________ Unidade de Sade: Nome do Paciente: Telefone: Gnero: N CNES N Geral:

Masculino
Data de Nascimento: __________/__________/__________ Nmero do Carto SUS: Idade atual:_____ Nome da me:

Feminino

Endereo completo:

Bairro: Procedncia do Paciente:

Municpio: N Pronturio

CEP:

Telefone:

Ambulatrio

Hospital Paciente sem Tratamento Prvio para TB

Paciente com Tratamento Prvio para TB

GRUPO DE VULNERABILIDADE
Dependente de lcool Diabtico Presidirio Usurio de Drogas IV Portador de Fibrose Cstica Portador de SIDA/Aids

Portador de outra Imunudeficincia Qual:

AMOSTRA CLNICA
Escarro espontneo
Aspecto do Escarro:

Escarro induzido

Outra ________________________

Via de Obteno:_____________________________

Saliva
Data da Coleta:

Mucopurulento

Sanguinolento
N de amostras:

Liquefeito

__________/__________/__________

SOLICITAO CULTURA
Investigao Diagnstica 1 Amostra Controle de Tratamento 2 Amostra Identificao da Espcie 1 ms 5 ms
Critrio para Teste de Sensibilidade:

Teste de Sensibilidade 3 ms _____ ms Co-infeco 4 ms

2 ms 6ms Recidiva

Falncia Contato com TB Resistente


Responsvel:

Abandono

Instituio:

Telefone: (

40 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

RESULTADO CULTURA
Laboratrio Executor: Data da Realizao do Exame:: __________/__________/__________ Cultura pelo mtodo:

Convencional em LJ
Cultura:

Convencional OgawaKudoh Contaminada

Automatizado

Semi-automatizado

Negativa

No Realizada

Positiva

Identificao da Espcie pelo mtodo:


Fenotpico
Resultado Preliminar da Identificao pelo Mtodo Fenotpico

Molecular

Houve crescimento de colnias sugestivas do Complexo M. tuberculosis Houve crescimento de colnias sugestivas de Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) Teste de sensibilidade em andamento Identificao conclusiva em andamento

Resultado da Identificao da Espcie: Mycobacterium __________________


Teste de Sensibilidade s Drogas pelo mtodo:

Propores

Por outro mtodo. Qual:

Drogas
RESULTADO

Isoniazida

Rifampicina

Etambutol

Estreptomicina

Legenda drogas: Isoniazida=I=INH; Rifampicina=R=RMP; Etambutol=E=EMB; Estreptomicina=S=SM Legenda Resultado: Sensvel=S; Resistente=R Teste de Sensibilidade No Realizado:

Cultura Invivel

Cultura Contaminada

Exame Solicitado fora dos critrios

Teste Realizado com outra Cepa num Perodo Inferior a 3 meses

Observaes:

Data: ____/____/____

Nome do Responsvel pelo Exame:

Assinatura:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 41

1 .9 .5 Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade


Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade
Data Entrada LACEN: Data nascimento: Sexo: Data da Coleta da Amostra:

Nmero LACEN:

42 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Nome:

Feminino

Masculino

End: Amostra: Solicitante:

Material:

Controle

VT

No VT
Obs.:

Aspecto do Escarro:

Saliva

Mucopurulento

Sanguinolento

Liquefeito

HIV +

HIV -

Baciloscopia:

Cultura: Lote dos meios: data: data: data: data: 8 semana 7 semana 6 semana 5 semana

OK / LJ

OK / LJ

Observaes

Cultura: Lote dos reagentes: data: data: data: data: Andamento cultura:

OK / LJ

OK / LJ

Observaes

1 semana

2 semana

3 semana

4 semana

Cultura pelo Mtodo:

Convencional - LJ
Data da Realizao:

Convencional OK Molecular
data semeadura: N de colnias:

Automatizado

Semi Automatizado
Identificao: Niacina: PNB:

Identificao:

Fenotpica

Teste Sensibilidade: lote dos meios:

data leitura: N de colnias:

Obs:

Isoniazida (INH)

sensvel
No. de colnias:

resistente resistente

Rifampicina (RMP)

sensvel
No. de colnias: Estreptomicina (SM)

resistente sensvel resistente

Etambutol (EMB)

sensvel

Obs.:

Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Data da Emisso do Resultado:

Nome do responsvel pelo exame:

Assinatura:

1 .9 .6 Questionrio de sade dos profissionais do laboratrio de tuberculose


Questionrio de Sade dos Profissionais do Laboratrio de Tuberculose
N do CNES:

Nome do Laboratrio:

Nome:

Idade:

anos

Data da Entrevista: / /

Dados da primeira entrevista (Linha de Base)


Tratamento Prvio para Tuberculose

Vacinao Prvia de BCG

No se a resposta sim, qual o resultado do tratamento: Tratamento interrompido Tratamento completo

Sim

No

Sim Falncia de Tratamento

se a resposta sim qual a idade:_________________anos.

Cura

Sinais e sintomas de Tuberculose na primeira entrevista (Linha de Base)


Perda de peso Dor no peito Anorexia

Tosse h mais de 3 semanas

No No
Suores noturno Outras doenas:

Sim Sim Sim


Raio X de Trax Resultado Positivo (em mm) Data Resultado Data

No

Sim

No

Sim

Letargia

No
Reao de Mantoux Data Resultado Negativo

Sim

No

Exame de Escarro Resultado da Baciloscopia Resultado da Cultura Resultado do Teste de Sensibilidade Peso

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Monitoramento

Teste para HIV oferecido

Aceito

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 43

No

Sim

No

Sim

Monitoramento Trimestral de Sade Primeiro Trimestre


Dor no Peito Letargia Outras doenas

Tosse por mais de 3 semana

No
Anorexia Suores Noturno Data Peso

Sim

No

Sim

No

Sim

Perda de peso

44 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

No

Sim

No

Sim

No

Sim

Kg

Segundo Trimestre
Dor no Peito Letargia

Tosse por mais de 3 semana

No
Anorexia Suores Noturno

Sim

No

Sim

No

Sim

Outras doenas Peso

Perda de peso

No

Sim

No

Sim

No

Sim

Data

Kg

Terceiro Trimestre
Dor no Peito Letargia Outras doenas

Tosse por mais de 3 semana

No
Anorexia Suores Noturno

Sim

No

Sim

No

Sim
Data Peso

Perda de peso

No

Sim

No

Sim

No

Sim

Kg

Quarto Trimestre
Dor no Peito Letargia Outras doenas

Tosse por mais de 3 semana

No
Anorexia

Sim

No

Sim

No
Suores Noturno

Sim
Data Peso

Perda de peso

Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

No

Sim

No

Sim

No

Sim

Kg

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

1 .9 .7 Requisio de exames do sistema gerenciador de ambiente laboratorial GAL

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 45

Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose

Gerenciador de Ambiente Laboratorial - GAL INSTRUES PARA PREENCHIMENTO FICHA DE REQUISIO DE EXAME
Campo 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Descrio Nome completo e sem abreviaes da Unidade de Sade ou outra fonte que solicita exame (s) a rede de laboratrios ou nmero do Cadastro Nacional dos Estabelecimentos de Sade CNES . CAMPO OBRIGATRIO Sigla da Unidade de Federao da Unidade de Sade ou outra fonte responsvel pela solicitao de exame (s). CAMPO OBRIGATRIO Nome do municpio de atendimento da Unidade de Sade ou outra fonte responsvel pela solicitao de exame (s) ou o cdigo do IBGE correspondente. CAMPO OBRIGATRIO Nome completo do profissional de sade responsvel pela solicitao de exame (s) e nmero do registro profissional ou matrcula. CAMPO OBRIGATRIO Assinatura do profissional de sade responsvel pela solicitao de exame (s). Nome completo e sem abreviao do paciente. CAMPO OBRIGATRIO Data de nascimento do paciente. CAMPO OBRIGATRIO Idade do paciente. Este campo deve ser preenchido somente se a data de nascimento for desconhecida (Ex. 10 dias = 10 D; 3 meses = 3 M; 26 anos = 26 A). Se o paciente no souber informar sua idade, anotar a idade aparente. Sexo do paciente. CAMPO OBRIGATRIO Situao gestacional. Sendo o paciente do sexo feminino, informar o perodo gestacional em que a paciente se encontra no momento da ocorrncia do agravo/doena. Sendo o paciente do sexo masculino, informar a opo 6 no se aplica. Nmero do Carto Nacional de Sade. Caso o paciente possua, informar o nmero do Carto SUS. Nome completo e sem abreviaes da me do paciente. Logradouro (Rua, Avenida) de residncia do paciente. Dados complementares, por exemplo, apartamento, casa, da residncia do paciente. Nmero (apartamento, casa) da residncia do paciente. Ponto de Referncia para auxiliar na localizao da residncia do paciente. Bairro de residncia do paciente. Unidade de Federao de residncia do paciente. CAMPO OBRIGATRIO Municpio de residncia do paciente ou cdigo do IBGE correspondente. CAMPO OBRIGATRIO CEP - Cdigo de endereamento postal do logradouro (avenida, rua, travessa, etc) - da residncia do paciente. Telefone para contato com o paciente, com DDD. Classificao da zona de residncia do paciente. Pas de residncia do paciente. Se residente fora do Brasil preenchimento do CAMPO OBRIGATRIO Data da solicitao do exame (s). CAMPO OBRIGATRIO Data dos primeiros sintomas data que surgiram os primeiros sintomas no paciente. CAMPO OBRIGATRIO Classificao da definio de caso. Suspeito - Diagnstico; Comunicante; Acompanhamento Controle ou Ignorado. CAMPO OBRIGATRIO Tratamento tempo de tratamento que o paciente encontra-se na data da solicitao do exame (s). Preenchimento em nmero + orientao de Dia, Semana, Ms, Ano, por exemplo: 12 D corresponde a 12 dias, 3 M que corresponde em 3 ms. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASO DE ACOMPANHAMENTO. Etapa de Tratamento corresponde etapa em que o paciente encontra-se na data da solicitao do exame (s) podendo ser: Pr - sem tratamento; Tratamento sob medicao; Re-tratamento iniciado novamente o tratamento ou troca de esquema de tratamento; Avaliao de resistncia paciente com resultados laboratoriais sugestivo de resistncia. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASO DE ACOMPANHAMENTO Aps verificar documentao/caderneta, se o paciente j foi vacinado contra o agravo/doena suspeito ou confirmado conforme solicitao de exame (s). Informar a data da ltima dose da vacina contra agravo/doena suspeita ou confirmado que o paciente tomou. ex: 20/10/2007. Informar o (s) exame (s) laboratorial (is) solicitado (s) para paciente. CAMPO OBRIGATRIO Informar o (s) tipo (s) de material (is) enviado (s) para o (s) exame (s) solicitado (s) para o paciente. CAMPO OBRIGATRIO Informar o nmero da (s) amostra (s) coletada (s) para o paciente. CAMPO OBRIGATRIO Informar a data em que a (s) amostra (s) foi (ram) coletada (s). CAMPO OBRIGATRIO Informar se o paciente na data de coleta usou antibitico ou medicao. Informar o nome do agravo/doena ou cdigo correspondente estabelecido pelo SINAN (CID 10) que foi notificado. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS Preencher o nmero da notificao atribudo pela unidade de sade ou outra fonte para identificao do caso no SINAN. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS Informar no campo de data da notificao a data de preenchimento da ficha de notificao SINAN. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS Nome completo da Unidade de Sade, ou outra fonte que realizou a notificao e o cdigo correspondente ao Cadastro Nacional dos Estabelecimentos de Sade CNES. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS Sigla da Unidade de Federao da Unidade de Sade ou outra fonte que realizou a notificao no SINAN. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS Nome completo do municpio onde est localizada a unidade de sade ou outra fonte notificadora que realizou a notificao ou cdigo do IBGE. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS Dados complementares informar dados clnicos/ laboratoriais adicionais que auxiliaram no diagnstico laboratorial.

28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

46 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

CAPTULO 2

SISTEMA DE GARANTIA DA QUALIDADE DA BACILOSCOPIA

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Siglas e definies
BAAR Bacilo lcool-cido Resistente FN Falso Negativo (s) FP Falso Positivo (s) AL Amostragem de Lote PCEQB Programa de Controle Externo da Qualidade da Baciloscopia LR Laboratrio de Referncia LRN Laboratrio de Referncia Nacional LRR Laboratrio de Referncia Regional LRE/LACEN - Laboratrio de Referncia Estadual/Laboratrio Central de Sade Pblica LRRE Laboratrio de Referncia Regional dos Estados LL Laboratrio Local LF Laboratrio de Fronteira Laboratrio Local: Laboratrios que realizam a baciloscopia e atendem a uma rea geogrfica definida Laboratrio Avaliador (LA): Laboratrio que realizar a releitura das lminas dos laboratrios locais de sua rea de abrangncia Sistema de Controle de Qualidade por Amostragem de Lote: sistema de controle de qualidade por amostragem das lminas de baciloscopia baseado na produo total trimestral de lminas por um laboratrio em particular e na prevalncia estimada de lminas positivas Teste de Proficincia (TP) Historicamente cada organizao tem definido TP diferentemente - Unio Internacional Contra Tuberculose e Doenas Pulmonares (UICTDP) TP a avaliao do desempenho do laboratrio pela comparao de resultados a partir de diferentes laboratrios. A UICTDP define que a AEQ uma expanso do teste de proficincia - Organizao Mundial de Sade (OMS) TP o processo de envio de lminas a partir do LR para o LL - International Organization for Standartization (ISO) TP a determinao do desempenho do laboratrio por meio de comparaes de testes inter-laboratoriais Releitura de Lminas a anlise, por parte do LA, das lminas dos laboratrios locais encaminhadas como parte do PCEQB. Este manual recomenda que a releitura seja sempre cega Taxa de Positividade Proporo de lminas positivas encontradas em um laboratrio entre todas as lminas examinadas (diagnstico e controle), em um perodo de tempo definido

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 47

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Erro Maior Este tipo de erro considerado o mais crtico e tem um potencial alto de impacto no manejo do paciente e pode resultar no diagnstico incorreto ou no manejo imprprio do paciente. Um erro maior pode indicar deficincia tcnica grosseira1 Um erro maior pode ser por FP e FN: - Erro Maior FP quando uma lmina negativa confundida com uma lmina positiva +, ++ e +++1 - Erro Maior FN quando uma lmina positiva +, ++ ou +++ confundida com uma lmina negativa1 Erro Menor Na prtica clnica este erro pode ter algum impacto no manejo do paciente. Entretanto para a proposta de avaliao do desempenho do laboratrio, este tipo de erro considerado irrelevante, por causa das limitaes inerentes na deteco de bacilos em materiais paucibacilares que podem no estar distribudos igualmente na lmina. Entretanto, freqentes erros menores podem indicar deficincias1

48 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .1 Descrio
O Sistema de Garantia da Qualidade (SGQ), segundo recomendaes do Consenso Global publicado pela Association of Public Health Laboratories (APHL), Center for Disease Control and Prevention (CDC), International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Royal Netherlands Tuberculosis (KNCV), Research Institute of Tuberculosis, Japan (RIT) and World Health Organization (WHO) em 2002, projetado para melhorar continuamente a confiabilidade e a eficcia dos servios de laboratrio. Em relao bacteriologia da TB, deve ser um sistema com o objetivo de alcanar a qualidade tcnica necessria ao diagnstico laboratorial, fortalecendo conhecimentos, desenvolvendo capacidade tcnica e estimulando uma atitude responsvel frente ao trabalho, no devendo de maneira nenhuma ser confundido com inspeo ou fiscalizao. Para alcanar esse objetivo, importante a organizao de uma rede de laboratrios com capacidade de planejar e implementar tais atividades de SGQ. No Brasil, a rede de laboratrios para o diagnstico da tuberculose composta do LRN, LRR, LRE/LACEN, LRRE, LL e LF, conforme descrito no Captulo 1. O estabelecimento do SGQ requer uma seqncia de atividades, tais como planejamento, avaliao da situao, identificao das falhas que devem ser corrigidas de forma prioritria, estabelecimento de um programa de treinamento e suporte tcnico desenhado para corrigir estas falhas medindo o impacto do sistema. Os resultados de cada seqncia de atividade orientaro o desenho de um novo ciclo, sendo, portanto, um processo interativo. Uma avaliao pontual, em geral, pouco esclarecedora e limitada, podendo ser somente o reflexo de um acerto ou erro fortuito, de um momento de organizao ou desorganizao do laboratrio, do bom ou mau funcionamento do equipamento. O SGQ deve produzir resultados peridicos que permitam avaliar a tendncia ao longo do tempo dos parmetros que qualificam a qualidade de trabalho. Os processos e anlises do SGQ requerem aplicao de um mtodo cientfico e cada novo mtodo deve ser validado antes de ser adotado. Diferentes estratgias tm sido propostas para o controle dos mtodos, podendo ser utilizadas combinadas ou separadas em distintos momentos ou diferentes regies segundo as possibilidades que existam e as informaes que se deseja obter. O SGQ basicamente um processo educativo e motivador cujo xito se baseia na aceitao pelos integrantes da equipe de sade de sua responsabilidade frente comunidade, e est destinado a manter e aperfeioar a qualidade tcnica e operativa. Um Programa de Garantia da Qualidade de Baciloscopia leva a identificar os erros mais freqentes, descrever os procedimentos e controles que minimizam a probabilidade de produzir falsos resultados ou baixos rendimentos dos mtodos bacteriolgicos e a elevar a qualidade do diagnstico2.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 49

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

O SGQ composto por trs mtodos: Controle de Qualidade Interno (CQI) Tambm chamado Superviso Interna (SI), abrange todos os meios pelos quais o laboratrio de baciloscopia da TB controla a operao, incluindo verificao de instrumentos e de reagentes/solues de colorao em estoque. Melhoria de Qualidade (MQ) Processo pelo qual os componentes dos servios de diagnstico de baciloscopia so analisados com o objetivo de procurar alternativas para remover possveis obstculos e causas de erro. Coleta de dados, anlise de dados e soluo criativa de problemas so os componentes-chave desse processo. Envolve monitoramento contnuo e identificao de defeitos, seguidos por ao de reforo, incluindo treinamento quando necessrio, para evitar a recorrncia de problemas. MQ freqentemente depende de visitas efetivas de avaliao. Avaliao Externa da Qualidade (AEQ) Trata-se de um processo que permite que os laboratrios participantes avaliem suas capacidades pela comparao dos seus resultados aos de outros laboratrios da rede (laboratrio central e intermedirio). Esse processo pode abranger os seguintes mtodos: (i) Teste de Proficincia executado atravs de exame de painis contendo esfregaos baciloscpicos; (ii) releitura cega dos esfregaos baciloscpicos por um LR; (iii) visita tcnica executada pelo LR para revisar a qualidade de desempenho dos laboratrios sob jurisdio.

2 .2 Controle de Qualidade Interno (CQI)


Essa estratgia de controle interna porque feita dentro do prprio laboratrio que deve estabelecer, na sua rotina de trabalho, um sistema de controle regular e registrar os resultados decorrentes desses controles. O responsvel tcnico deve realizar uma reviso peridica dos pontos crticos e monitorar os resultados com objetivo de evitar ou minimizar erros tcnicos. O CQI do laboratrio de diagnstico da tuberculose envolve dois aspectos: Preventivos: comuns a todos os laboratrios, tambm conhecidos como Boas Prticas de Laboratrio (BPL) englobam medidas a serem adotadas desde a recepo das amostras, realizao dos esfregaos, colorao, leitura microscpica at a emisso do laudo final. Operacional: inclui o controle de insumos, equipamentos, procedimentos tcnicos, monitoramento dos resultados de exames, registro tcnico dos procedimentos de CQI e aplicao de aes corretivas quando estas se fizerem necessrias3.

50 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .2 .1 CQI dos insumos A qualidade da baciloscopia est tambm relacionada ao controle de estoque. Esse controle deve garantir a disponibilidade de todo o material de consumo necessrio execuo dos exames e monitorar o aspecto fsico e prazo de validade dos reagentes, corantes e outros materiais, para evitar desperdcios. 2 .2 .1 .1 gua Em alguns locais, a gua corrente, mesmo deionizada, pode estar contaminada com micobactrias ambientais, que podem gerar resultados falsos positivos. Se a gua da torneira ou a gua purificada aparecer turva ou suja, deve ser feita uma investigao microbiolgica buscando a presena de micobactrias ambientais. Nos anexos deste captulo, item 2.9.1, apresentado um modelo de registro para o CQI da gua utilizada no laboratrio. A) Procedimentos para deteco de microorganismos lcool-cido resistentes na gua. 1. Centrifugar 200 250 ml da gua em mltiplos tubos. 2. Fazer um esfregao com uma mistura dos sedimentos. 3. Fixar, corar pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen e realizar a leitura do esfregao conforme descrito no Captulo 6 deste manual. ATENO: As frmulas e o modo de preparo dos corantes e reagentes utilizados no Mtodo de Ziehl-Neelsen esto descritos nos anexos do Captulo 6; e os formulrios para o controle da preparao dos corantes e reagentes esto descritos nos anexos deste captulo . Resultado Presena de microorganismos lcool-cido resistentes. Ao corretiva: Investigar a causa da contaminao. Esterilizar todo o contedo da gua e descartar conforme descrito no Captulo 3 deste manual. Ausncia de microorganismos lcool-cido resistentes. Ao: Esterilizar todo o contedo da gua e descartar conforme descrito no Captulo 3 deste manual. B) Procedimento para isolamento de micobactrias na gua. 1. Filtrar 1000 ml da gua atravs de um filtro membrana estril com poros de 0,22 m. 2. Cortar o filtro em tiras com bisturi estril.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 51

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

3. 4.

Colocar a tira num meio de cultura LJ4. Registrar, incubar e realizar a leitura da cultura conforme descrito no Captulo 7. ATENO: As frmulas e o modo de preparo dos meios de cultura e reagentes para a cultura das tiras do filtro, assim como os formulrios para o controle da preparao desses meios de cultura e reagentes esto descritos nos Anexos do Captulo 7 .

Resultado Cultura negativa. Ao: Esterilizar todo o contedo da gua e descartar conforme descrito no Captulo 3 deste manual. Cultura positiva. Ao corretiva: Investigar a causa da contaminao. Esterilizar todo o contedo da gua e descartar conforme descrito no Captulo 3 deste manual. 2 .2 .1 .2 Corantes Verificar a qualidade dos corantes toda vez que produzir um lote e, quando estiver em uso, verificar pelo menos uma vez por semana. O CQI do lote dos corantes consiste em corar um esfregao preparado e fixado com uma amostra de resultado conhecido positivo e outro com uma amostra negativa. Esses esfregaos podem ser preparados no laboratrio a partir de amostras tratadas com 10 gotas de fenol a 5% durante uma hora. Os esfregaos devem ser conservados ao abrigo do calor e da umidade, em caixas plsticas conforme descrito no item 2.4.2 deste Captulo. Os procedimentos para a verificao da qualidade dos corantes esto descritos no item 2.2.2 deste captulo. A validade dos corantes de 6 meses. 2 .2 .1 .3 Lminas Devem ser sem uso, limpas e desengorduradas, conforme descrito no Captulo 6. 2 .2 .1 .4 Equipamentos Os equipamentos devem ser utilizados de acordo com as recomendaes do fabricante, a fim de ampliar a sua vida til. Devem, tambm, ser monitorados pelo usurio para assegurar a preciso requerida para a anlise, conforme descrito no Captulo 11. 2 .2 .2 CQI dos procedimentos tcnicos da baciloscopia Recomenda-se a realizao do controle dirio dos procedimentos tcnicos, levando-se em conta os detalhes que mais freqentemente podem ser as causas de erros

52 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

na execuo tcnica. No Quadro 1 so apresentadas as causas mais comuns de erros, as provveis conseqncias e medidas preventivas a serem tomadas. Quadro 1 Causas mais comuns de erros na baciloscopia, provveis conseqncias e medidas preventivas/corretivas
CAUSAS DE ERROS PROVVEIS CONSEQNCIAS MEDIDAS PREVENTIVAS Fornecer gratuitamente pote descartvel. Jamais reutilizar os potes de coleta Orientar adequadamente o paciente para coletar a amostra Seguir rigorosamente as orientaes e os tempos para armazenar, conservar e enviar a amostra Escrever com letra legvel o nome completo do paciente e o n da amostra no corpo do pote Utilizar lminas sem uso, desengorduradas e sem arranhes. Jamais reutilizar lminas Manter a rea bem iluminada e preparar no mximo 12 esfregaos de cada vez; conferir o n da lmina e da amostra Utilizar a poro mais purulenta do escarro; colocar quantidade adequada de amostra para preparar o esfregao Seguir rigorosamente os tempos indicados nos procedimentos; fazer controle de qualidade Filtrar os corantes na hora do uso; seguir rigorosamente os procedimentos Seguir rigorosamente os procedimentos

Reutilizao de potes de amostra (resduo de Resultado falso positivo escarro positivo) Coleta inadequada da amostra para diagnstico: quantidade muito pequena ou saliva Resultado falso negativo

Amostras em temperatura ambiente por Resultado falso negativo mais de 24h; mantidas refrigeradas por mais de 7 dias; exposta luz solar Identificao da amostra: nome incompleto ou ilegvel ou nome e n na tampa do pote Lminas com arranhes e/ou resduos Preparo de esfregaos com: pouca iluminao; muitas amostras ao mesmo tempo; lmina colocada longe da amostra Utilizao da poro no purulenta do escarro; esfregao com pouca amostra Aquecimento excessivo na fixao; tempo menor de aquecimento da fucsina; descolorao excessiva; corantes imprprios para uso Fucsina sem filtrar; aquecimento demasiado do esfregao na colorao Descolorao insuficiente do esfregao Troca de amostra e de resultados dos pacientes Resultado falso positivo Troca de amostra e de resultados dos pacientes Resultado falso negativo

Resultado falso negativo

Resultado falso positivo (cristais de fucsina confundidos com BAAR Resultado falso positivo (bacilos saprfitos corados de vermelho confundidos com BAAR). Resultado falso positivo (visualizao de bacilos de outros esfregaos) Resultado falso negativo Resultado falso negativo

Lente de imerso ou frasco conta-gotas do leo com resduos de esfregao positivo Sobreposio e diminuio do nmero de campos lidos Microscpio sem condies adequadas de uso/manuteno; presena de fungos nas lentes (embaamento)
Fonte:

Limpar a lente de imerso aps a leitura de cada esfregao positivo. Cuidar para que o frasco conta-gotas no toque no esfregao Ler de forma padronizada, seguindo rigorosamente os procedimentos Providenciar manuteno preventiva semestral. Limpar o microscpio diariamente

Ministrio da Sade. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. 2001

Os aspectos operacionais do CQI dos procedimentos tcnicos de colorao da baciloscopia consistem na incluso diria de esfregaos de amostras clnicas com resultado conhecido para verificar se a colorao est de acordo com o esperado.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Selecionar amostras de escarro da sua rotina com resultados conhecidos de acordo com os seguintes critrios: CQI positivo: amostras com resultado positivo ++ ou +++ para BAAR. CQI negativo: amostras negativas para BAAR. Os esfregaos para o CQI da baciloscopia devem ser realizados de acordo com os seguintes procedimentos: 1. Identificar vrias lminas como CQI positivo e vrias como CQI negativo. 2. Preparar e fixar os esfregaos. Colocar e conservar os esfregaos para CQI em uma caixa porta-lminas, identificar a caixa com uma etiqueta com os dados: CQI positivos e negativos, data de preparao, prazo de validade (3 meses) e smbolo de risco biolgico. Conservar em lugar fresco e ao abrigo da luz. Aps a produo de um lote de corantes, realizar uma colorao, conforme descrito no Captulo 6 deste manual, com um CQI positivo e um CQI negativo para verificar o desempenho dos corantes frente a esfregaos com resultado conhecido. Procedimentos de leitura dos esfregaos do CQI na verificao da qualidade do lote: 1. Ler o CQI positivo e o negativo, conforme descrito no Captulo 6 deste manual. 2. Interpretar os resultados dos CQI, de acordo com as seguintes possibilidades: CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de vermelho e o CQI negativo no apresentou presena de BAAR, como o esperado. Nesse caso, o lote de corantes est validado. CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado. Nesse caso, todo o lote est invalidado e deve ser descartado. Realizar uma vez por semana a colorao de uma lmina com esfregao CQI positivo e uma com CQI negativo, juntamente com os esfregaos das amostras da rotina, conforme descrito no Captulo 6 deste manual. Procedimentos de leitura dos esfregaos no dia da realizao do CQI da colorao: 1. Ler o CQI positivo e o negativo, conforme descrito no Captulo 6, antes de ler as lminas dos pacientes. 2. Interpretar os resultados dos CQI, de acordo com as seguintes possibilidades: CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de vermelho e o CQI negativo no apresentou presena de BAAR, como o esperado. Nesse caso, a rotina est validada e pode-se realizar a leitura das lminas dos pacientes e liberar os resultados. CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado. Nesse caso, toda a rotina est invalidada e ser preciso fazer novamente a bacilos-

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copia de todas as amostras e analisar quais as possveis causas de erro (ver quadro 1). Recomenda-se que, nos laboratrios que possuam mais de um tcnico, todas as lminas positivas no dia de sua execuo sejam revisadas pelo outro tcnico, a fim de minimizar os erros oriundos do processo de leitura ou registro de resultado do exame.

2 .3 Melhoria da Qualidade (MQ)


A Melhoria da Qualidade uma atividade permanente e depende da conscientizao e atitude dos profissionais envolvidos em cada etapa do trabalho, entre os quais pode se destacar: Organizao do local de trabalho Capacitao peridica dos profissionais Uso de procedimentos operacionais padro (POP) Cuidados quanto a inspeo, identificao, conservao e transporte de amostras Manuteno de equipamentos Padronizao da leitura, anlise, registro, emisso e entrega de resultados Registro dos problemas e dificuldades observadas durante a realizao das atividades laboratoriais e das medidas corretivas adotadas. Esse registro deve estar disponvel para todos os profissionais envolvidos com o trabalho

2 .4 Avaliao Externa da Qualidade (AEQ)


Trata-se de um processo que permite que os laboratrios participantes avaliem suas capacidades tcnicas, atravs da comparao dos resultados dos seus exames aos de outros, dentro de uma rede hierarquizada de laboratrios. Esse processo pode ser constitudo de trs mecanismos: 1. Teste de Proficincia executado atravs de exame de painis contendo esfregaos baciloscpicos. 2. Releitura dos esfregaos baciloscpicos realizados nos LL pelo LR. 3. Visita tcnica aos laboratrios participantes. Para execuo desses processos, o profissional de laboratrio deve ser habilitado e reunir as seguintes caractersticas: 1. Conhecimento atualizado das tcnicas e princpios dos Programas de Controle da Tuberculose, das realidades regionais, das caractersticas da populao e de prticas administrativas. 2. Experincia de campo.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Interesse no trabalho a ser feito. Bom relacionamento interpessoal. Flexibilidade e experincia para analisar problemas e sugerir prticas adequadas e medidas corretivas simples. 6. Sensibilidade para as necessidades de cada situao. 7. Experincia suficiente para antever problemas tcnicos e solucionar eventuais imprevistos. Uma das exigncias previstas pelas normas de qualidade a participao dos laboratrios em programas de controle externo da qualidade5, tambm entendidos como programas de ensaios de proficincia6. Com objetivo de atender essas normas, a CGLAB est propondo, entre outros, um Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose (AEQ TB). Entre os benefcios da participao dos laboratrios na (AEQ-TB), destacam-se: Avaliao externa e regular. Meios objetivos de demonstrar a confiabilidade dos dados que so produzidos. Comparao do seu desempenho com o de outros laboratrios semelhantes. Identificao dos problemas no detectveis internamente. Subsdio implantao de aes preventivas e corretivas para melhoria dos procedimentos do laboratrio. Disponibilidade de informaes sobre as caractersticas de desempenho de mtodos analticos. Entre os objetivos do programa, destacamos os seguintes: Avaliar o desempenho dos laboratrios em anlises especficas. Identificar problemas tcnicos pontuais e diferenas interlaboratoriais. Complementar a superviso in loco de laboratrios. Indicar aes preventivas e/ou corretivas, quando necessrias. As principais caractersticas da AEQ-TB so: O carter educativo. A participao voluntria, incentivada pela CGLAB. O sigilo em relao s recomendaes de aes preventivas e ou corretivas e identidade dos participantes.

3. 4. 5.

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As principais atribuies do coordenador do programa, designado pela CGLAB so: Coordenao do planejamento e implementao do programa. Participao na seleo dos profissionais do comit assessor. Definio das responsabilidades dos membros do comit assessor. Definio do acesso aos dados e resultados do programa. 2 .4 .1 Teste de Proficincia (TP) Um dos componentes do Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose da CGLAB o teste de proficincia. O TP proporciona aos laboratrios participantes meios objetivos de demonstrar a confiabilidade de seus dados atravs da comparao de resultados com outros laboratrios semelhantes. O Teste de Proficincia coordenado pela CGLAB consiste: No envio, pela CGLAB, de um painel contendo 10 lminas com esfregao de escarro, corados pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen para os laboratrios participantes. Na anlise e encaminhamento dos resultados das lminas pelo laboratrio participante para a CGLAB. Na comparao e anlise dos resultados do laboratrio participante com os resultados previamente conhecidos. Na comunicao, pela CGLAB, ao laboratrio participante do seu desempenho na anlise das lminas. A participao dos laboratrios dever ser formalizada e o processo formalizao dever ser constitudo de: Ofcio convite elaborado pela CGLAB dirigido aos responsveis dos laboratrios alvo do programa, modelo de ofcio apresentado nos anexos deste captulo. Formulrio de participao do laboratrio na AEQ, modelo de formulrio apresentado nos anexos deste captulo. Ofcio informativo do envio do painel com as caractersticas ticas e tcnicas da AEQ, modelo de ofcio apresentado nos anexos deste captulo. Formulrio de Recebimento do Material e Identificao do Profissional Participante do AEQ, modelo de formulrio apresentado nos anexos deste captulo. Formulrio para Envio dos Resultados, modelo de formulrio apresentado nos anexos deste captulo. 2 .4 .2 Releitura de lminas uma atividade orientadora e educacional, exercida por profissionais, com reconhecida experincia, com o objetivo de melhorar a qualidade do trabalho e promover o desenvolvimento profissional.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Em 2007, a CGLAB, em conjunto com um grupo de tcnicos representantes de LACEN sob a coordenao de uma consultoria internacional da OMS, elaborou o Protocolo de Controle Externo de Qualidade da Baciloscopia (PCEQB) segundo recomendaes do Consenso Global1. Ressaltamos que o foco desse controle de qualidade a identificao de problemas dos laboratrios e no a identificao de erros individuais ou de correo de diagnstico de pacientes. O objetivo do PCEQB definir procedimentos e estabelecer critrios para a execuo da releitura de lminas ou controle externo de qualidade da rede de laboratrios de baciloscopia. O PCEQB se aplica a todos os laboratrios que realizam baciloscopia para o diagnstico e controle da Tuberculose no mbito do Sistema nico de Sade. O controle externo de qualidade (CEQ) consiste no envio de lminas j lidas nos LL para os LR ou LA para releitura e subseqente anlise estatstica, buscando determinar variaes e discordncias. A releitura feita sem que o profissional avaliador conhea o resultado da baciloscopia fornecido pelo laboratrio participante. O PCEQB recomenda tambm a avaliao da qualidade do esfregao, da colorao e da numerao das lminas, procedimentos que influenciam na qualidade do resultado. 2 .4 .2 .1 Fundamentos do CEQ da baciloscopia O CEQ da baciloscopia consiste na avaliao do desempenho de laboratrios que realizam baciloscopia atravs da releitura, por parte de um LA, de uma amostra representativa, selecionada atravs de amostragem aleatria, das lminas examinadas na rotina do LL e a qualificao do grau de concordncia/discordncia entre ambas leituras. O PCEQB utiliza o sistema de controle de qualidade por amostragem de lote, recomendado pelo Consenso Global1 para determinar o tamanho da amostra para que ela seja representativa. O sistema de controle de qualidade por amostragem de lote um sistema baseado na prevalncia estimada de lminas positivas e na produo total trimestral de lminas de um laboratrio em particular. 2 .4 .2 .2 Determinao da amostra No PCEQB, o tamanho da amostra foi desenhado para uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 100%, em um nvel de confiana de 95% descrito no Quadro 2, e adequado ao ndice de positividade da baciloscopia dos laboratrios analisados, para obter-se uma amostragem de lminas positivas e negativas. O grupo determinou que o tamanho da amostra de 80 lminas por laboratrio a ser avaliado, em funo do nmero mdio de exames realizados pelos LL e a capacidade do LA de realizar a releitura.

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Fundamentos do tamanho da amostra A sensibilidade a capacidade de descobrir os resultados positivos no LL comparados com o LA. Em funo da dificuldade de se obter uma sensibilidade de 100%, em razo dos resultados das lminas com poucos bacilos (de 1 a 9 BAAR em 100 campos observados), recomenda-se utilizar um intervalo de sensibilidade entre 75 e 85%, neste protocolo fixamos o valor de 80% de sensibilidade, valor apresentado no Quadro 2. A especificidade a capacidade de detectar os resultados negativos. Por razes operacionais se adotou, neste protocolo, a especificidade de 100%. Quadro 2 Tamanho da amostra recomendado para releitura de lminas (anual ou trimestral)
POSITIVIDADE 5% 107 129 143 154 167 180 10% 72 80 86 89 92 96 13% 61 67 70 71 75 76 15% 54 59 61 62 65 66 18% 46 50 51 52 54 55

LMINAS EXAMINADAS ANUALMENTE 200 300 400 500 700 1000

WHO, APHl, CDC, IUATLD, KNCV e RIT. External Quality Assessment for AFB Smear Microscopy, Cooperative Agreement. U60/CCU303019, Washington DC. 2002.

Preparo da Amostra a) Definio do quociente proporcional: O quociente proporcional obtido atravs da diviso do nmero total de lminas recebidas por 80 (tamanho da amostra). No caso do resultado ser um nmero decimal, arredondar para o nmero inteiro mais prximo, com a condio que sejam no mnimo 80 lminas. Caso o sorteio no atinja as 80 lminas, sortear aleatoriamente outras lminas para completar o tamanho da amostra. Exemplo: Se o laboratrio analisou durante o trimestre um total de 1.420 lminas, o quociente proporcional obtido da diviso de 1.420 por 80 = 17,7 ou seja, 18. b) Escolha do nmero de partida: Atravs de uma tabela de nmeros aleatrios ou procedimento equivalente, dever ser sorteado um nmero qualquer entre 1 e 18. Exemplo: foi sorteado o nmero 15. c) Seleo das lminas: A primeira lmina a ser selecionada corresponde ao nmero de partida. No exemplo, a dcima quinta lmina seqencial a partir do primei-

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

ro nmero de ordem recebido. A partir dessa primeira lmina selecionada uma lmina a cada 18, na ordem do livro de registro. Exemplo: Se o LL encaminhou cpia do registro das lminas com nmeros de ordem que comeam em 215 e acabam em 1.635, as lminas selecionadas so 230 248 266 284, e assim sucessivamente at completar 80 lminas. ATENO: Se no perodo avaliado o laboratrio no atingir o tamanho da amostra (80 lminas) dever ser realizada a releitura de todas as lminas . 2 .4 .2 .3 Fluxo de lminas O LA dever solicitar a cada LL o envio de cpia das folhas do Registro de Baciloscopia, que contm o nmero de ordem e os resultados das lminas examinadas durante o perodo a ser avaliado (trimestral ou semestral) atravs de um documento conforme descrito no item 2.9.3.1 dos anexos deste captulo. Deve ser solicitado tambm, todas as lminas relativas ao perodo a ser avaliado. Para o laboratrio cuja produo de baciloscopia no atinja o total de lmina necessrio para a amostragem representativa no perodo de 3 meses, dever ser solicitado as lminas de um perodo maior 4 a 6 meses. O LL dever encaminhar ao LA as lminas e a cpia dos registros solicitados no prazo mximo de dez dias seqenciais aps a solicitao. 2 .4 .2 .4 Responsabilidades no PCEQB Laboratrio Avaliador Coordenar e avaliar as atividades do PCEQB. Solicitar atravs de formulrio padronizado, item 2.9.3.1 dos anexos deste captulo, as baciloscopias que foram realizadas pelos LL de sua abrangncia. Verificar se as lminas enviadas para releitura correspondem aos nmeros de registro descritos na relao. Preparar a amostra conforme descrito acima. Realizar uma reviso macroscpica dos esfregaos das lminas e classific-los conforme item 2.4.2.5 deste captulo. Realizar a releitura microscpica dos esfregaos, conforme descrito no item 6.5.1 do Captulo 6 deste manual. Registrar os resultados no formulrio de Registro de Resultados, item 2.9.3.4 dos anexos deste captulo. Avaliar o desempenho dos LL com base na comparao dos resultados obtidos, conforme descrito no item 2.4.2.5 deste captulo.

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Elaborar relatrio conforme decrito no item 2.9.3.6 dos anexos deste captulo. Enviar o relatrio aos responsveis pelo LL e coordenadores dos PCT Municipal e Estadual.

Laboratrio Local Conservar em condies adequadas as lminas examinadas. No item 2.9.3.2 dos anexos deste captulo apresentamos as orientaes de conservao das lminas para o CEQ para os LL. Encaminhar ao LA, quando solicitado, as lminas e cpia das pginas do Registro de Baciloscopia do mesmo perodo. No item 2.8.3.2 dos anexos deste captulo apresentamos as orientaes de conservao das lminas para o CEQ para os LL. 2 .4 .2 .5 Avaliao das lminas Critrios para as releituras das lminas O tcnico avaliador no dever conhecer os resultados das lminas recebidas antes de realizar as releituras. A releitura das lminas dever ser realizada utilizando os critrios de leitura para diagnstico, conforme descrito no item 6.5.1 do Captulo 6 deste manual. Freqncia da avaliao dos LL Elaborar um cronograma anual de avaliaes dos laboratrios, conforme descrito nos anexos deste captulo no item 2.9.3.3. Dependendo da possibilidade do LA sero realizadas uma ou duas avaliaes anual de cada LL. Avaliao das caractersticas tcnicas das lminas Avaliao macroscpica do esfregao O profissional avaliador dever analisar o esfregao de cada uma das lminas, classificando-os como: a) Satisfatrio: Homogneo b) No satisfatrio: No homogneo Caso o esfregao seja classificado como no homogneo fazer uma segunda classificao: No homogneo: Espesso Delgado

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Avaliao Microscpica do Esfregao Na avaliao microscpica devem ser avaliados dois aspectos: I) Colorao II) Concordncia de resultados I) Colorao

O profissional avaliador dever analisar a colorao de cada uma das lminas, classificando-as como: a) Satisfatria b) No satisfatria: Descolorao inadequada Caso a colorao seja classificada como descolorao inadequada deve ser realizada uma segunda classificao: Presena de cristais de fucsina Excesso de aquecimento O critrio para qualificar as caractersticas tcnicas relacionadas acima baseado na avaliao das deficincias que eventualmente ocorram, podendo induzir a erros de interpretao e, portanto, a resultados falso-positivos ou falso-negativos. Aps classificar os esfregaos quanto a qualidade do esfregao e da colorao de um laboratrio realizar o clculo do percentual de adequao do esfregao. Exemplo: Nmero de esfregaos adequados dividido pelo total de esfregaos classificados X 100 = A Nmero de esfregaos com colorao adequada dividida pelo total de esfregaos classificados X 100 = B Para classificao final do esfregao realizar o seguinte clculo: Classificao final da qualidade do esfregao= A + B dividido por 2 i) Se o resultado encontrado for > 80% a qualidade do esfregao Adequada. ii) Se o resultado encontrado for < 80% a qualidade do esfregao Inadequada. Um resultado abaixo de 80% indica uma necessidade de capacitao em coleta de escarro e em confeco e colorao de esfregao. II) Avaliao das concordncias/discordncias dos resultados As diferenas dos resultados no nmero de cruzes em lminas positivas, no so consideradas discordncias significativas para o diagnstico do paciente.

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So classificadas como discordantes: a) Falso Negativa (FN): lminas com resultado negativo no LL e positivo na releitura. b) Falso Positiva (FP): lminas com resultado positivo no LL e negativo na releitura. O clculo da concordncia feito de acordo com a seguinte tabela: Anlise de Concordncia
LABORATRIO AVALIADOR POSITIVO Laboratrio Local Positivo Negativo Total
N Lminas FN _________ N Lminas FP________ % Relativo de FN_______________ % Relativo de FP________________

NEGATIVO

TOTAL

Clculo de Concordncia, FP e FN
LABORATRIO AVALIADOR POSITIVO Laboratrio Local Positivo Negativo Total (a) (c) (a+c) NEGATIVO (b) (d) (b+d) TOTAL (a+b) (c+d) (a+b+c+d)

% concordncia: (a+d)/ (a+b+c+d) Resultados FN: (c) Resultados FP: (b) % relativo de resultados FN: [c/ (c+d)] x 100 (N FN/ Total resultados negativos do Laboratrio Local x 100) % relativo de resultados FP: [b/ (a+b)] x 100 (N FP/ Total resultados positivos do Laboratrio Local x 100)

Toda vez que uma releitura caracteriza uma discordncia, dever ser realizada uma segunda releitura confirmatria, por um outro tcnico. As lminas com discordncias confirmadas devero ser revistas junto com o tcnico do LL, para verificao da discordncia, na visita tcnica. Diferenas de resultados em lminas com 1 a 9 BAAR em 100 campos observados no so classificadas como discordncias importantes. Nesses casos, porm, a diferena anotada no formulrio Relatrio do Controle de Qualidade da Baciloscopia, no campo das observaes.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

ATENO: O ndice de concordncia (C) esperada de 100% e expresso de acordo com a seguinte frmula:
C% = N lminas concordantes total de lminas relidas x 100

Registro de resultados e aes corretivas Registros Os resultados das releituras devem ser registrados no formulrio apresentado no item 2.9.3.4 Formulrio de Registro de Resultados nos Anexos deste captulo, e devem ser arquivados em pastas correspondentes ao LL e/ou arquivo informatizado. Relatrio do Resultado do Controle de Qualidade O resultado do CEQ deve ser encaminhado ao LL no prazo mximo de 30 dias aps o recebimento das lminas. O resultado do CEQ deve ser encaminhado atravs ofcio acompanhado do Relatrio do Controle de Qualidade da Baciloscopia. Modelo de ofcio e de relatrio so apresentados nos itens 2.9.3.5 e 2.9.3.6 dos Anexos deste Captulo. Relatrio da avaliao tcnica Quando as lminas encaminhadas pelo LL forem classificadas como inadequadas, de acordo com os critrios estabelecidos anteriormente, o relatrio de avaliao deve informar as principais deficincias tcnicas observadas, orientar o laboratorista sobre as possveis causas e recomendar as aes pertinentes para corrigi-las. IMPORTANTE: Caso a amostragem no contemple lminas positivas, selecionar algumas para avaliar a colorao . Essas lminas no entraro no clculo da amostragem . Relatrio da anlise de concordncia Concluso: a avaliao final dos resultados da releitura de lminas. Exemplo de concluso Concordncia total = 100%: Parabenizar o laboratrio como forma de incentivo. Concordncia total < 99%: No aprovado.

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Recomendaes Investigar as possveis causas de erro como microscpio, corantes, tcnicas de esfregao, colorao e leitura, erros de numerao e transcrio dos resultados. Consideraes sobre as condutas a seguir em caso de discordncia Medidas corretivas devem ser tomadas em caso de concordncia total < 99%. Essas medidas devem ser capacitao, visita tcnica, substituio de reagentes ou uma segunda avaliao, devendo ser programadas em conjunto com o LL. A deteco de um FP considerada erro grave, exigindo uma investigao imediata das causas. A deteco de um FN indica que o laboratrio apresenta um erro significativo e, portanto, no estar aprovado no controle de qualidade. importante considerar todas as causas potenciais de erros, incluindo a qualidade dos corantes, a tcnica de colorao e preparo de esfregao, a qualidade e manuteno do microscpio, e procedimentos administrativos incorretos como registros e emisso de laudos. Relatrio geral No item 2.9.3.7 dos anexos deste captulo, apresentamos modelo de registro geral onde devero ser compilados os resultados de todos os laboratrios avaliados durante o ano. Esse relatrio deve ser encaminhado aos responsveis pelos laboratrios e coordenadores municipais e estadual dos PCT. 2 .4 .3 Visita tcnica aos laboratrios locais A visita tcnica o processo mais adequado para observar as condies de um laboratrio e as atividades tcnicas nele desenvolvidas. Por ter um contato direto, mais efetivo e permite propor aes corretivas de acordo com os recursos e possibilidades locais. imprescindvel que as visitas tcnicas sejam realizadas de forma programada, sistemtica, peridica, e que o LA disponha de apoio e de recursos financeiros da instituio a que est vinculado. As vantagens da visita tcnica sobre os outros componentes do CEQ so: Permitir contato direto com a equipe tcnica do LL. Motivar a equipe tcnica. Observar diretamente a prtica laboratorial. Identificar causas de erro. Verificar a qualidade e funcionamento dos equipamentos.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

As desvantagens so: Ser um processo seletivo, e difcil de extrapolar os dados para o resto da rede de laboratrios. Exigir muito tempo de trabalho. Ter um custo relativamente elevado. uma atividade que precisa ser realizada durante o perodo de trabalho, especialmente quando h mudanas de recursos humanos, de procedimentos, de local ou de equipamento. Permite a coleta de dados para o PCEQB e melhora o fluxo de informao entre os diversos nveis laboratoriais. Recomenda-se como rotina uma visita anual e, se necessrio, uma freqncia maior. A seguir, apresentamos o roteiro de verificaes da visita tcnica Roteiro operacional Avaliar condies de infra-estruturas. Verificar se a norma de prazo para emisso dos resultados (especialmente os casos positivos) est sendo seguida. Verificar se as lminas esto guardadas apropriadamente para o controle externo de qualidade. Verificar se a equipe tcnica tenha sido capacitada para as tcnicas especficas. Avaliar a carga de trabalho em relao a disponibilidade de profissionais. Verificar e avaliar a quantidade de baciloscopias realizadas e a proporo de lminas positivas. Verificar se os casos positivos notificados pelo laboratrio constam dos registros da unidade de tratamento. Verificar tambm os seguintes requisitos: Possuir POP das tcnicas e manuais de laboratrio. Possuir insumos em quantidade e qualidade adequadas. Possuir um planejamento para compra de insumos necessrios. Possuir equipamentos (microscpio) em funcionamento apropriado. Possuir um sistema de controle de qualidade interno. Possuir normas de biosseguranca. Possuir controle de sade dos profissionais peridicos. Possuir registro de acidentes de trabalho. Possuir e manter registros dos exames padronizados. Possuir requisio de exame padronizada.

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Roteiro tcnico Observar e avaliar a classificao de qualidade da amostra, os processos de preparao de esfregao, colorao e leitura. Assegurar que sejam feitos os controles de qualidade dos corantes. Fazer releitura de algumas lminas com o profissional do local, para avaliar a qualidade do esfregao, da colorao e da leitura. Revisar os resultados anteriores do controle externo de qualidade por releitura, discutir sugestes e recomendaes para o melhoramento. Roteiro de verificao de indicadores fundamentais Quantas amostras foram realizadas por sintomtico respiratrio. Qual a positividade da baciloscopia diagnstica. Qual o percentual de sintomticos respiratrios positivos a baciloscopia. Qual a positividade da baciloscopia total. Qual o percentual de amostras com aspecto de saliva. Qual o percentual de positividade da baciloscopia de amostras com aspecto de saliva. No item 2.9.4 nos anexos deste captulo apresentamos um protocolo para visita tcnica.

2 .5 Responsabilidade dos laboratrios em relao Avaliao Externa da Qualidade (AEQ)


Para que a AEQ seja efetiva e produza bom nvel de informao, os laboratrios devem ter a responsabilidade de cumprir os seguintes requisitos: Laboratrio Local Enviar as lminas em boas condies ao LR. Fornecer todas as informaes solicitadas dentro do tempo determinado. Utilizar os mtodos recomendados pelo Ministrio da Sade para realizao dos exames. Discutir os resultados obtidos com toda a equipe. Corrigir falhas detectadas e seguir as orientaes recebidas. Laboratrios de Referncia Elaborar e enviar o relatrio padro confidencial aos laboratrios participantes em um prazo de 30 dias. Estar disponvel para discutir os resultados discrepantes e propor solues.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .6 Benefcios da AEQ para o Ministrio da Sade e para os laboratrios


Quadro 3 Benefcios da AEQ para o Ministrio da Sade e para os Laboratrios Participantes
MINISTRIO DA SADE Fornece informaes sobre os padres de desempenho e das metodologias utilizadas em nvel nacional Indica se os recursos financeiros esto sendo bem empregados Ajuda a identificar reas com problemas, planejar e oramentar as atividades do PCT Ajuda a manter e a aumentar os padres nacionais de desempenho Contribui para estabelecer credibilidade internacional
Fonte:

LABORATRIOS PARTICIPANTES Revela reas de dificuldade

Melhora o padro de desempenho da equipe Permite que os resultados sejam utilizados como uma ferramenta de gerncia educativo Contribui para estabelecer credibilidade local

Ministrio da Sade. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. 2001

2 .7 Indicadores para avaliao de desempenho do laboratrio


Indicador I Percentual de resultados de baciloscopias liberados at 24 horas aps a recepo da amostra no perodo da avaliao. Interpretao Um percentual maior do que 15% de resultados liberados mais de 24 horas depois da recepo das amostras significa que o laboratrio no est contribuindo, de maneira satisfatria, para busca rpida das fontes de infeco na comunidade. Uso Avaliar a capacidade de resposta do laboratrio em relao a realizao da baciloscopia e liberao dos resultados em tempo ideal (mximo de 24 horas). Perodo de Avaliao Trimestral Mtodo de clculo
N de resultados liberados 24 horas aps recepo no laboratrio em determinado perodo X 100 Total de baciloscopias liberadas no mesmo perodo

Fonte de dados: Registro de baciloscopia.

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Indicador II Percentual de amostras de escarro para diagnstico, com aspecto de saliva, no perodo de avaliao. Interpretao Um percentual maior do que 15% pode indicar que no esto sendo dadas as orientaes adequadas para a coleta de escarro ou que os pacientes s conseguem produzir amostras com aspecto de saliva. Uso Avaliar a qualidade das amostras recebidas, para diagnstico e a necessidade ou no de capacitao do profissional que orienta o paciente para coleta. Perodo de Avaliao Trimestral Mtodo de clculo
N de amostras de escarro recebidas com aspecto de saliva em determinado perodo X 100 Total de amostras de escarro recebidas no laboratrio em mesmo perodo

Fonte de dados: Registro de baciloscopia.

Indicador III Percentual de lminas com os esfregaos preparados inadequadamente no perodo de avaliao Interpretao Um percentual maior do que 10% de esfregaos inadequados indica a probabilidade de um aumento de resultados falso e uma conseqente diminuio na deteco de fontes de infeco. Uso Avaliar a necessidade de capacitao do profissional que prepara os esfregaos. Perodo de Avaliao Determinado pela AEQ Mtodo de clculo
N de esfregaos considerados inadequados pela AEQ em determinado perodo X 100 Total de esfregaos submetidos AEQ no mesmo perodo

Fonte de dados: Relatrio da AEQ emitido pelo LR

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Indicador IV Percentual de lminas que apresentam esfregaos com colorao inadequada no perodo de avaliao. Interpretao Um percentual acima de 10% de esfregaos com colorao inadequada alerta para um possvel aumento dos resultados falsos positivos ou negativos. Uso Avaliar a necessidade de capacitao do profissional que realiza a colorao dos esfregaos e controle de qualidade dos reagentes. Perodo de avaliao: Determinado pela AEQ Mtodo de clculo
N de lminas com esfregaos inadequados submetidos a AEQ. em determinado perodo X 100 Total de lminas submetidas a AEQ no mesmo perodo

Fonte de dados: Relatrio da AEQ emitido pelo LR

Indicador V Positividade da baciloscopia de diagnstico de tuberculose, entre escarros de SR adultos, no perodo em avaliao. Uso: Avaliar o rendimento da baciloscopia no diagnstico da TB, a capacidade do tcnico para leitura de lminas e qualidade da amostra. Perodo de avaliao: Trimestral para municpios e semestral para estados. Mtodo de Clculo:
N de lminas para diagnstico positivas em determinado perodo X100 N de lminas para diagnstico realizadas no mesmo perodo

Fonte de dados: Registro de baciloscopia Parmetro de avaliao e interpretao esperado um percentual entre 5 e 10%, um percentual maior pode indicar que a busca de SR no est adequada. Um percentual menor indica que a amostra no adequada.

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Exemplo: 400 = nmero de baciloscopia para diagnstico com resultado positivo em um perodo de 1 ano. 1.600 = nmero total de baciloscopia para diagnstico no perodo de 1 ano.
400X100 1.600

= 25% das baciloscopias so positivas

Possveis causas Estgio tardio da doena. Orientao inadequada ao paciente para coleta de escarro e/ou amostras coletadas por induo. Possveis correes Capacitar o profissional responsvel pela busca de SR para fazer diagnstico precoce da doena.

Indicador VI Nmero de baciloscopias realizadas por sintomtico respiratrio (SR) no perodo de avaliao. Uso: Avaliar o nmero de baciloscopias realizadas por SR e indiretamente avaliar o aporte de segunda amostra no diagnstico de TB. Perodo de avaliao: Trimestral para municpios e semestral para estados. Mtodo de clculo:
N total de baciloscopias para diagnstico realizadas no perodo N de baciloscopias primeira amostra realizadas no perodo

Fonte de dados: Registro de baciloscopia Parmetro de avaliao e interpretao: A norma tcnica recomenda pelo menos duas baciloscopias por SR, um nmero menor pode indicar que a busca de SR est inadequada, a orientao ao paciente inadequada e isso pode diminuir a possibilidade de fazer o diagnstico oportuno da doena. Exemplo: 3.000= n de baciloscopia para diagnstico realizadas no perodo de 1 ano.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2.000= n de SR investigado pelo laboratrio (primeira amostra) para diagnstico no perodo de 1 ano.
3.000 = 1,5 baciloscopia por SR 2.000

Possveis causas: Recursos humanos no capacitados ou o no cumprimento pelo profissional de sade da norma. Orientao inadequada ao paciente para coleta de escarro. Possveis correes: Capacitar o profissional responsvel pela busca de SR para fazer diagnstico precoce da doena e sensibilizar o profissional da importncia da segunda amostra.

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2 .8 Referncias
1. AZIZ et al. External Quality Assessment for AFB Smear Microscopy, Cooperative Agreement. U60/CCU303019, Washington DC. 2002. 2. SEQUEIRA, M.D. Garantia de Calidad de Baciloscopas Evaluacin Externa de Laboratorios de Referncia Nacional. Argentina. Draft Verso de agosto de 2006. 3. BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. 2001. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001. 4. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part III Culture. Geneva. Switzerland. WHO/TB/98.258. 1998. 5. NORMA NIT-DICLA-083:2001. Critrios gerais para competncia de laboratrios clnicos. 6. NBR ISO/IEC 17025:2001 Requisitos gerais para competncia de laboratrios de ensaio e calibrao. 7. WHO/World Health Organization. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Part 1: Organization and Management. WHO, Geneva, 1998. 8. ABNT ISO/IEC GUIA 43-1:1999 Ensaios de proficincia por comparaes interlaboratoriais. 9. NORMA NIT-DICLA-026:2003 Requisitos sobre a participao dos laboratrios de ensaios em atividade de ensaio de proficincia. 10. BRASIL. Ministrio da Sade. Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria. Gerncia Geral de Laboratrios de Sade Pblica. Critrios para Habilitao de Provedores de Ensaios de Proficincia Segundo os Princpios da ISO GUIA 43 Procedimento GGLAS 02/43, 2001.

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 Anexos do captulo
2 .9 .1 Formulrios do CQI dos Reagentes 2 .9 .1 .1 Formulrio Controle de qualidade interno da gua utilizada no laboratrio .
Formulrio Controle de Qualidade Interno da gua Utilizada no Laboratrio
Procedncia
gua da Torneira

N do Lote

Validade

gua destilada estril

Data da Coleta
gua da torneira

gua destilada

Responsvel:

Data de Emisso:

gua Destilada Esterilizao Autoclave - Equipamento Marca:


Temperatura Tempo Presso

Aprovado Reprovado

Responsvel:

Data de Emisso:

Controle Micobacteriolgico da gua da Torneira Exame Direto do Sedimento/Colorao pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen:
Aprovado. Ausncia de BAAR Reprovado. Presena de BAAR

Semeadura em LJ
Aprovado. No houve crescimento
Responsvel:

Incubao a 36 1C por 8 semanas


Reprovado. Houve crescimento de BAAR
Data de Emisso:

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2 .9 .1 .2 Formulrio Controle de preparao da Fucsina fenicada a 0,3% .


Formulrio Controle da Preparao da Fucsina Fenicada a 0,3%
Data da Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido

Substncia
lcool etlico 95% PA

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

Fucsina bsica

Cristal de fenol

gua Destilada

Pesagem (g) / volume (ml)


Substnci lcool etlico 95% PA uantidade

Fucsina bsica

Cristal de Fenol

gua Destilada

Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Data de Execuo:

Controle do Desempenho da Fucsina Fenicada a 0,3%


CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de vermelho e o CQI negativo no apresentou presena de BAAR, como o esperado. Lote do corante est validado
Responsvel:

CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado.

Lote do corante invalidado


Data de Execuo:

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .1 .3 Formulrio Controle de preparao da Soluo Descorante de lcool-cido a 3%


Formulrio Controle de Preparao da Soluo Descorante de lcool-cido a 3%
Data da Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido

Substncia
lcool etlico comercial

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

cido Clordrico concentrado

Pesagem (g) / volume (ml)


Substnci lcool etlico comercial uantidade

cido Clordrico concentrado

Responsvel:

Data de Execuo:

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2 .9 .1 .4 Formulrio Controle de preparao de Azul de Metileno 0,3%


Formulrio Controle de Preparao de Azul de Metileno 0,3%
Data da Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido

Substncia
Azul de Metileno

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

gua destilada

Pesagem (g) / volume (ml)


Substnci Azul de Metileno uantidade

gua destilada

Pesagem Balana - Marca: Responsvel: Data de Execuo:

Controle do Desempenho do Azul de Metileno a 0,3%


CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de vermelho, com fundo azul e o CQI negativo no apresentou presena de BAAR, mas apresentou fundo azul, como o esperado Lote do corante est validado
Responsvel:

CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado.

Lote do corante invalidado


Data de Execuo:

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .1 .5 Formulrio Controle de preparao de Auramina fenicada


Formulrio Controle de Preparao de Auramina Fenicada
Data da Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido

Substncia
lcool etlico 95% PA

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

Auramina O

Fenol lquido

gua Destilada

Pesagem (g) / volume (ml)


Substnci lcool etlico 95% PA uantidade

Auramina O

Fenol Lquido

gua Destilada Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Data de Execuo:

Controle do Desempenho da Auramina Fenicada


CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de amarelo e o CQI negativo no apresentou presena de BAAR, como o esperado. Lote do corante est validado
Responsvel:

CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado.

Lote do corante invalidado


Data de Execuo:

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .9 .1 .6 Formulrio - Controle da preparao da Soluo Descorante de lcool-cido a 1% para o mtodo da fluorescncia

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .1 .7 Formulrio Controle de preparao da Soluo de Permanganato de Potssio


Formulrio Controle de Preparao da Soluo de Permanganato de Potssio
Data da Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido

Substncia
Permanganato de Potssio

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

gua destilada

Pesagem (g) / volume (ml)


Substnci Permanganato de potssio uantidade

gua destilada

Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Data de Execuo:

Controle do Desempenho do Permanganato de Potssio


CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de amarelo, com fundo preto e o CQI negativo no apresentou presena de BAAR, mas apresentou fundo preto, como o esperado. Lote do corante est validado
Responsvel:

CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado.

Lote do corante invalidado


Data de Execuo:

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2 .9 .1 .8 Formulrio Controle de preparao da Soluo de Tinta Nanquim Azul

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Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .2 Formulrios da AEQ 2 .9 .2 .1 Modelo de ofcio convite aos laboratrios

MINISTRIO DA SADE SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE DEPARTAMENTO DE VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA Esplanada dos Ministrios, Edifcio Sede, 1 andar CEP. 70.058-900 - Braslia-DF Ofcio Circular n CGLAB/DEVEP/SVS/MS Braslia, data. A Sua Senhoria o(a) Senhor(a) Diretor(a) do Laboratrio Assunto: Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose. Senhor(a) Diretor(a) 1. Com o objetivo de promover, coordenar, apoiar e fomentar aes dos servios prestados pela rede de laboratrios de sade pblica visando sade da populao atendida, a Coordenao Geral de Laboratrios CGLAB tem como uma de suas estratgias incentivar os laboratrios na implantao de um sistema de garantia da qualidade. 2. Uma das exigncias previstas pelas normas de qualidade a participao dos laboratrios em programas de controle externo da qualidade (NIT-DICLA-083/NBR ISO/IEC 17025:2001). 3. Neste caso a CGLAB entende que fundamental a implantao de um Programa de Avaliao Externa da Qualidade AEQ das anlises laboratoriais realizadas pelas redes por ela coordenada. 4. Diante do exposto, a Secretaria de Vigilncia em Sade, representada pela CGLAB, convida esse laboratrio para participar do Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose. 5. O laboratrio dever confirmar sua participao, por meio do Formulrio de Participao, anexo, que dever ser enviado a CGLAB, por correio e e-mail para o coordenador do programa at 15 dias aps o recebimento do mesmo. 6. Colocamo-nos disposio para maiores esclarecimentos. Atenciosamente,

Coordenador Geral CGLAB/DEVEP/SVS

Diretor DEVEP/SVS/MS

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .9 .2 .2 Formulrio de participao
Formulrio de Participao
Primeiro Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose
Instituio: UF:

Nome do Diretor/ Coordenador:

E-mail para contato:

Telefone:

O laboratrio concorda em participar do Primeiro Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose organizado pela CGLAB. O laboratrio no gostaria de participar da avaliao externa nesse momento pelo motivo abaixo assinalado:

no se considera suficientemente capacitado no presente momento

no tem interesse Qual ?:

outro motivo

Identificao do Laboratrio Participante


Nome do contato no laboratrio para o envio do painel:

Endereo do local de entrega do painel (com cdigo postal):

Telefone:

E-mail:

Assinatura do responsvel pela instituio

Data:

Solicitamos que este formulrio seja enviado CGLAB, pelo correio, at 15 dias aps o recebimento do mesmo, mesmo que o laboratrio no concorde em participar da avaliao.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 83

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .2 .3 Modelo de ofcio de envio do painel aos laboratrios

MINISTRIO DA SADE SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE DEPARTAMENTO DE VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA COORDENAO GERAL DE LABORATRIOS DE SADE PBLICA

Ofcio Circular n CGLAB/DEVEP/SVS/MS Braslia, data. A Sua Senhoria o(a) Senhor(a) Responsvel pelo Laboratrio de Tuberculose Assunto: Programa de Avaliao Externa da Qualidade da Baciloscopia para Tuberculose Prezado(a) Senhor(a): 1. A Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica, diante da aceitao desse laboratrio em participar do Programa de Avaliao Externa de Qualidade da Baciloscopia para Tuberculose, est enviando um painel contendo 10 lminas com esfregaos de escarro corados por Ziehl-Neelsen. 2. O laboratrio dever, aps a anlise, enviar o painel de lminas, o Formulrio de Recebimento do Material e Identificao do Profissional Participante do AEQ e o Formulrio para Envio dos Resultados (anexos) preenchidos para a CGLAB por correio. 3. Os painis devero ser devolvidos seguindo os procedimentos para conservao e limpeza das lminas descritas no captulo 2 do Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias. Esclarecemos que faz parte do processo de avaliao do laboratrio as condies de devoluo dos painis. 4. A metodologia de leitura do painel dever ser realizada de acordo com a descrita no capitulo 6 do manual citado. O profissional indicado para a anlise do painel dever realizar a leitura de 15 lminas por dia levando no mnimo 5 e no mximo 10 minutos por lmina. As lminas devero ser lidas sem recorrer ajuda de terceiros. 5. A CGLAB enviar para o laboratrio participante o relatrio dos resultados da AEQ lembrando que neste relatrio a identificao dos laboratrios ser mantida em sigilo. 9. Outras informaes e esclarecimentos podero ser feitos por meio de telefone ou e-mail. Atenciosamente,

Coordenador Geral CGLAB/DEVEP/SVS

Diretor DEVEP/SVS/MS

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .9 .2 .4 Formulrio de recebimento do material e identificao do profissional participante do AEQ


Formulrio de Recebimento do Material e Identificao do Profissional Participante do AEQ
1. Identificao do Laboratrio
Nome:

Endereo:

UF:

Municpio: Regional de Sade:

CEP.: Qual?:

Telefone:

Sim
E-mail para contato:

No

2. Informao sobre o Material Recebido


2.1 - Data de recebimento do painel: 2.2 - A embalagem de transporte chegou:

fechada
2.3 - Acondicionamento das lminas:

aberta

condies adequadas
Descrever:

condies inadequadas

2.4 - Responsvel pelas informaes dos itens 2.1, 2.2 e 2.3: Nome: Assinatura:

3. Informaes do Participante Responsvel pela Leitura das Lminas e pelas Informaes do Equipamento Utilizado:
Nome:

Grau de Escolaridade:

Ensino Fundamental

Ensino Mdio

Formao Universitria

Dedicao exclusiva ao laboratrio de tuberculose?

Sim

No

Se a resposta for sim, quantas lminas l por ms:

Participou de treinamento para coleta de amostra clnica, preparao e leitura da baciloscopia, aplicado por rgo oficial:

Se a resposta for SIM, quando:

Sim
Qual rgo responsvel pelo treinamento:

No
H quanto tempo realiza leitura de baciloscopia: _________(anos)

4. Informaes do Equipamento Utilizado:


Fabricante/Modelo: Tempo de uso do microscpio: Possui objetiva de 100x planacromtica:

mais que 5 anos


realizada manuteno no microscpio:

menos que 5 anos. Anual No

Sim S quando estraga

No

Semestral Sim

O microscpio de uso exclusivo do laboratrio de tuberculose:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 85

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .2 .5 Formulrio para envio dos resultados CGLAB


Formulrio para Envio dos Resultados CGLAB
1. Registre o nmero da lmina a ser lida na primeira coluna; 2. Marque com um X, na coluna correspondente o resultado obtido pela leitura da Lmina; 3. Marque com um X na coluna correspondente as condies de recebimento da lmina. Painel n

Resultado Obtido na Leitura da Lmina No da Lmina Neg Inconclusivo Pos + Pos ++ Pos +++

Condies de Recebimento da Lmina ntegra Quebrada

Obs.

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .9 .3 Formulrios do programa de controle externo da qualidade da baciloscopia 2 .9 .3 .1 Modelo de ofcio de solicitao de lminas

Logotipo do Laboratrio Avaliador


Of. no........../........ Data:

Ilmo Sr. Chefe do Laboratrio (Local)

Em cumprimento ao Programa de Controle Externo de Qualidade da Baciloscopia da Tuberculose, solicitamos o envio do material listado abaixo, para realizao da releitura das Baciloscopias. Todas as lminas do perodo __________________________ ; Uma cpia das pginas do Registro de Baciloscopia, com o registro dos exames do perodo correspondente. Ateno: As lminas devem ser enviadas em ordem numrica, sem separar as positivas das negativas. Enviar para o endereo:
Laboratrio (Avaliador)

Rua

CEP:

Cidade

Fone

ax:

Atenciosamente,

Responsvel pelo Laboratrio Avaliador

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 87

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .3 .2 Orientaes para conservao das lminas


Orientaes para Conservao das Lminas

Os Laboratrios Locais devem: Aps a leitura, retirar levemente o excesso de leo de imerso com papel absorvente macio, sem prejudicar o esfregao. Conservar a numerao original. Guardar em ordem numrica todas as lminas examinadas, independentemente do resultado, por um perodo mnimo de seis meses. Guardar as lminas em caixa especfica para conservao. Caso no disponha, recomenda-se envolver cada lmina separadamente em papel suave sem nenhuma anotao e, aps esse procedimento fazer pacotes com 50 lminas, no mximo, em papel de embrulho comum. Armazenar as caixas ou pacotes em local fresco e ao abrigo da luz.

88 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

2 .9 .3 .3 Formulrio Cronograma da Releitura das Lminas


Formulrio - Cronograma da Releitura das Lminas
Ano:

Laboratrio:

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Laboratrios a serem avaliados JAN. FEV. MAR. ABR. MAI. JUN. JUL. AGO. SET. OUT.

MESES NOV. DEZ.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 89

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .3 .4 Formulrio de registro de resultados do CEQ


Formulrio de Registro de Resultado do CEQ
Laboratrio Local: Perodo: de (ms) a (ms) de (ano)

N da Lmina

Releitura1

Esfregao2

Colorao3

Resultado do L. Local4

Assinatura do Tcnico

(1) (2) (3) (4)

Resultado da releitura no LA. Satisfatrio, no satisfatrio (no homogneo, espesso e delgado). Satisfatria, no satisfatria (descolorao inadequada, cristais de fucsina, aquecimento excessivo. Resultado: Negativa ou Positiva (em cruzes) do Laboratrio Local.

90 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

2 .9 .3 .5 Modelo de ofcio de encaminhamento de relatrio de resultados

MINISTRIO DA SADE SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE DEPARTAMENTO DE VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA COORDENAO GERAL DE LABORATRIOS DE SADE PBLICA

Ofcio Circular n CGLAB/DEVEP/SVS/MS Braslia, data.

Ao Sr. Responsvel Tcnico do Laboratrio:

Estamos enviando, anexo, o Relatrio de Resultados do Controle Externo da Qualidade da Baciloscopia da Tuberculose, referente ao perodo de ____/____/____ a ____/____/____. Solicitamos dar conhecimento deste resultado ao(s) profissionais que realizam baciloscopia em sua Instituio. Ficamos sua inteira disposio para quaisquer informaes complementares.

Atenciosamente,

_______________________________
Responsvel

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 91

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

2 .9 .3 .6 Formulrio para relatrio do controle externo da qualidade da baciloscopia

92 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

2 .9 .3 .7 Formulrio - Relatrio Anual dos LL Supervisionados


Programa de Controle Externo de Qualidade da Baciloscopia
Relatrio Anual dos Laboratrios Locais Supervisionados
Municpio: UF: Ano:

Laboratrio:

Laboratrio Local FP FN C A I

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

No de lminas revisadas Positividade %

Discordncia N Avaliao Final

Esfregao (E) Adequado %

Colorao (C) Adequada %

Superviso Direta *

Treinamento *

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 93

FP FN A I C

quantidade de lminas classificadas como falso-positivo; quantidade de lminas classificadas como falso-negativo; adequado; inadequado; discordncia em cruzes. Indicar se foi feita alguma superviso direta, ou se foi realizado treinamento (curso ou estgio) no perodo.

2 .9 .4 Formulrio Protocolo para visita tcnica


Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia
Roteiro para Visita Tcnica - Laboratrio de Tuberculose

94 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Orientaes: Esse instrumento deve ser preenchido pelo avaliador acompanhado pelos profissionais do LAB responsveis pela Qualidade e Biossegurana e pelo Diagnstico Laboratorial da Tuberculose. Esse instrumento dever ser assinado no final pelo avaliador e pelos profissionais do LAB que acompanharam o processo.

SIGLAS: A Atende, AR Atende com restries (o requisito atendido parcialmente, ou nos documentos apresentados faltam informaes ou no esto totalmente corretos), EL Em elaborao ( necessrio evidenciar minuta), N No atende, NAP No se aplica

I - DADOS DO LABORATRIO
Data

Laboratrio:

Municpio:

Rua/Av.

Bairro:

CEP

Fone:

FAX

e-mail:

Chefe do Laboratrio de Tuberculose:

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Funcionrios:

II - INFRA-ESTRUTURA
Requisito APossui ambientes suficientes e com construo adequada para a realizao da baciloscopia AR - Possui espaos (b) e (c) juntos N - Os ambientes no so suficientes e/ou inadequados para a realizao da baciloscopia A AR EL N NAP O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada

1. Possuir dimenses e construo adequadas para realizao da baciloscopia: (a) recepo de amostras; (b) registro de dados, liberao de resultados; (c) microscopia (d) realizao de esfregao e colorao (e) rea para autoclave

Outras situaes encontradas:

III - RECURSOS HUMANOS


Requisito ANO que verificar e as possveis situaes H profissionais para preparao de todos os procedimentos da baciloscopia: recepo, registro, confeco do esfregao e leitura (mximo 20 baciloscopias em 4 horas de trabalho/dia). O nmero de profissionais insuficiente para atender a demanda do laboratrio A Condio encontrada AR EL N NAP

2. Possuir nmero suficiente de pessoal para realizao da baciloscopia

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Outras situaes encontradas:

IV - TREINAMENTO
Requisito ANO que verificar e as possveis situaes Os tcnicos que realizam baciloscopia receberam treinamento pelo Laboratrio Referncia ou no prprio laboratrio nos ltimos 2 anos Os tcnicos que realizam baciloscopia nunca foram treinados A Condio encontrada AR EL N NAP

3. Possuir pessoal treinado para a realizao da baciloscopia

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 95

Outras situaes encontradas:

V - ORGANIZAO INTERNA E DOCUMENTAO


Requisito A - Possui instrues documentadas e disponveis de instrues para a coleta de amostras AR - Possui instrues documentadas, mas necessitam ser mais bem divulgadas ou faltam informaes. EL - Instrues em elaborao N - No existem instrues A AR EL O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada N NAP

96 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS


Requisito AAR EL NExistem POP, inlusive com critrios para aceitao e rejeio de amostras clnicas Existem POP, mas incompletos Os POP esto em elaborao No existem POP O que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Requisito ANO que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Possui mecanismos de cadastramento unvoco de amostras que garantam sua identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio No possui mecanismos de cadastramento unvoco de amostras que garanta sua identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio. Requisito O que verificar e as possveis situaes A - Possui e utiliza o SILTB ou outro sistema informatizado N - No utiliza A Condio encontrada AR EL N NAP

4. Possuir instrues documentadas e disponveis para a coleta, acondicionamento, conservao e transporte de amostras.

Outras situaes encontradas:

5. Possuir procedimento documentado e aprovado (POP) com critrios para aceitao e rejeio de amostras clnicas.

Outras situaes encontradas:

6. Possuir mecanismos de cadastramento unvoco das amostras clnicas que garantam sua identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio.

(Registro de Baciloscopia ou similar)

Outras situaes encontradas:

7. Possuir e utilizar o sistema SILTB ou outro sistema informatizado.

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Outras situaes encontradas:

Requisito A - Informa mensalmente AR - Informa esporadicamente N - No informa A AR EL N NAP

O que verificar e as possveis situaes

Condio encontrada

8. Informar mensalmente a Vigilncia Epidemiolgica (informe mensal de resultados de baciloscopia)

Outras situaes encontradas:

Requisito ANSim, utiliza e esto disponveis No A

O que verificar e as possveis situaes

Condio encontrada AR EL N NAP

9. Utilizar e estar disponvel no laboratrio os manuais recomendados em nvel nacional

Outras situaes encontradas:

Requisito AAR EL NExistem POP das tcnicas com todas as informaes Existem POP das tcnicas, mas so incompletos Os POP esto em elaborao No existem POP

O que verificar e as possveis situaes A

Condio encontrada AR EL N NAP

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

10. Possuir documento (POP) das tcnicas de baciloscopia

Outras situaes encontradas:

Requisito AAR EL N-

O que verificar e as possveis situaes Possui laudos com as informaes necessrias e de forma legvel Possui laudo de forma legvel e com informaes incompletas O modelo de laudo est em elaborao Os laudos no possuem as informaes necessrias A

Condio encontrada AR EL N NAP

11. Apresentar laudo de forma legvel e com informaes suficientes para a identificao do laboratrio, do solicitante, do paciente, da amostra, datas (coleta, entrada no laboratrio, da realizao dos ensaios e da emisso do laudo) e dos mtodos utilizados e assinados pelos responsveis por sua emisso.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 97

Outras situaes encontradas:

VI - ASPECTOS TCNICOS
Requisito A - Numerao e linha divisria adequada AR - Linha divisria inadequada N - Numerao com caneta de retroprojetor/ lpis dermatogrfico ou ilegvel A AR EL O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada N NAP

98 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS


Requisito A - Realiza o esfregao de acordo com as recomendaes AR - No realiza a pr-lavagem das lminas com detergente N - No utiliza aplicadores de madeira O que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Requisito O que verificar e as possveis situaes A - Realiza a colorao de acordo com as recomendaes AR - No utiliza as concentraes dos corantes recomendados e/ou os tempos recomendados e/ou no filtra os corantes N - No utiliza o mtodo de Ziehl-Neelsen A Condio encontrada AR EL N NAP

12. Realizar numerao e diviso da lmina para confeco do esfregao

Outras situaes encontradas:

13. Realizar confeco do esfregao de escarro obedecendo as normas do Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias ou Manual TELELAB Baciloscopia

Outras situaes encontradas:

14. Realizar a colorao do esfregao segundo as normas do Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias ou Manual TELELAB Baciloscopia

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Outras situaes encontradas:

VII - EQUIPAMENTOS
Requisito A - Possui todos os equipamentos para a correta realizao da baciloscopia AR - Possui os equipamentos em condies inadequadas e/ou microscpio em quantidade insuficiente N - No possui os equipamentos necessrios A AR EL N NAP O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada

15. Possuir os equipamentos abaixo para a realizao da baciloscopia: microscpio, balana, geladeira, autoclave

Outras situaes encontradas:

Requisito AAR ELNAtende o requisito Atende o requisito, mas faltam informaes, ou no tem para todos os equipamentos Procedimento em elaborao No existe procedimento nem registro

O que verificar e as possveis situaes A

Condio encontrada AR EL N NAP

16. Possuir procedimento documentado ou POP aprovado para operao, verificao e limpeza dos equipamentos, mantendo os registros correspondentes.

Outras situaes encontradas:

Requisito A-

O que verificar e as possveis situaes O programa existe e est aprovado e implantado e so mantidos os registros das manutenes AR - O programa existe, mas no so mantidos os registros das manutenes EL - O programa est em elaborao N - O programa no existe A

Condio encontrada AR EL N NAP

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

17. Possuir programa de manuteno preventiva para os equipamentos, que atenda as recomendaes dos fabricantes, e manter registros das manutenes corretivas e preventivas realizadas.

Outras situaes encontradas:

Requisito AN-

O que verificar e as possveis situaes Atende o requisito No atende o requisito A

Condio encontrada AR EL N NAP

18. Possuir os insumos armazenados corretamente

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 99

Outras situaes encontradas:

Requisito ANAtende o requisito No atende o requisito A AR EL N

O que verificar e as possveis situaes

Condio encontrada NAP

19. Possuir reagentes/solues preparados no laboratrio e os adquiridos com rtulo de identificao de origem, grau de pureza e validade.

100 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS


Requisito ANAtende o requisito No atende o requisito O que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Requisito ANPossui registros do controle interno No possui registros do controle O que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Requisito ANO que verificar e as possveis situaes Possui registros do controle externo No possui registros do controle A Condio encontrada AR EL N NAP

Outras situaes encontradas:

20. Possuir procedimento para a identificao de trabalhos no conformes incluindo as aes corretivas.

Outras situaes encontradas:

21. Possuir um sistema de controle de qualidade interno devidamente registrado

Outras situaes encontradas:

22. Participar de programas de controles externo da qualidade, mantendo os registros dos resultados

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Outras situaes encontradas:

VIII - BIOSSEGURANA
Requisito ANSim No A AR EL N NAP O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada

23. Possuir as normas de biossegurana relacionados com a baciloscopia, limpeza e desinfeco de superfcies e tratamento de resduos

Outras situaes encontradas:

Requisito ANSim No

O que verificar e as possveis situaes A

Condio encontrada AR EL N NAP

24. Possuir Equipamentos de Proteo Individual (EPI) adequados e em nmero suficiente para baciloscopia

Outras situaes encontradas:

Requisito ANSim No

O que verificar e as possveis situaes A

Condio encontrada AR EL N NAP

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

25. Possuir controle mdico peridico da equipe de profissionais

Outras situaes encontradas:

Requisito ANSim No

O que verificar e as possveis situaes A

Condio encontrada AR EL N NAP

26. Possuir documentos de instrues em caso de acidente com material clnico e os registros correspondentes

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 101

Outras situaes encontradas:

IX - INDICADORES
Requisito ANPossui registros No realiza o clculo do indicador A AR EL O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada N NAP

102 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS


Requisito ANPossui registros No realiza o clculo do indicador O que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Requisito ANPossui registros No realiza o clculo do indicador O que verificar e as possveis situaes A Condio encontrada AR EL N NAP Requisito ANO que verificar e as possveis situaes Possui registros No realiza o clculo do indicador A Condio encontrada AR EL N NAP

27. Possuir registros peridicos do indicador: Nmero total de baciloscopias realizadas num perodo determinado. Percentual de baciloscopias para diagnstico.

Outras situaes encontradas:

28. Possuir registros peridicos do indicador: Percentual de positividade da baciloscopia para diagnstico.

Outras situaes encontradas:

29. Possuir registros peridicos do indicador: Percentual de baciloscopias liberadas no prazo de 24 horas.

Outras situaes encontradas:

30. Possuir registros peridicos do indicador: Percentual de amostras para diagnstico com aspecto de saliva. Percentual de resultados positivos em amostras: saliva.

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia

Outras situaes encontradas:

RELATRIO FINAL DA VISITA TCNICA


DATA:

Laboratrio:

Facilidades:

Limitaes:

Recomendaes:

Assinaturas:

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Nome e assinatura do avaliador

Nome e assinatura do profissional do laboratrio que acompanhou a avaliao dos requisitos de qualidade

Nome e assinatura do profissional que acompanhou a avaliao dos requisitos especficos do laboratrio de tuberculose

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Local:

Data:

CAPTULO 3

BIOSSEGURANA

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

3 .1 Descrio
Biossegurana a condio de segurana alcanada quando da utilizao conjunta de equipamentos de proteo, prticas e procedimentos laboratoriais, e estrutura fsica da instituio, destinados a minimizar a exposio dos funcionrios e do meio ambiente aos agentes infecciosos. Pela Classificao dos Agentes Etiolgicos Baseado no Grau de Risco1 a espcie Mycobacterium tuberculosis integra o grupo de risco III, juntamente com outros microrganismos capazes de infectar atravs de aerossis2, 3. Profissionais de laboratrios apresentam risco de infeco pelo M. tuberculosis de 3 a 5 vezes maior do que o risco de outras pessoas4, 5. A exposio dos profissionais de laboratrio aos aerossis infecciosos depende do nmero de amostras clnicas e culturas positivas para M. tuberculosis processadas diariamente por um nico profissional e da adeso rgida s normas de biossegurana. Para isso, torna-se necessrio que os laboratrios de sade pblica disponham ou implantem um programa de Biossegurana amplo com medidas administrativas e tcnicas. As medidas de biossegurana em laboratrios de bacteriologia da tuberculose variam de acordo com a complexidade dos exames realizados, podendo ser nvel de biossegurana II (para procedimentos que no geram aerossis) e/ou nvel de biossegurana III2, 6. Entre as medidas administrativas, pode se destacar o monitoramento dos tcnicos escolhidos para trabalhar no laboratrio de bacteriologia da tuberculose, atravs da realizao do teste tuberculnico (PPD) e o RX de trax, e seu treinamento nas tcnicas de segurana e nos procedimentos usualmente empregados no diagnstico da tuberculose, alm do fornecimento de equipamentos de proteo adequados para a realizao do trabalho4. Cabe aos profissionais dos laboratrios a responsabilidade pelo uso correto desses equipamentos de proteo e o correto seguimento das medidas administrativas adotadas pela instituio. A grande maioria das infeces que ocorre nos laboratrios de bacteriologia da tuberculose atribuda produo de aerossis potencialmente infecciosos; portanto, o objetivo dessas medidas reduzir a exposio desses profissionais, da comunidade e do meio ambiente aos agentes potencialmente perigosos. O termo conteno usado para descrever os mtodos de segurana utilizados na manipulao de materiais infecciosos em um meio laboratorial onde esto sendo manejados ou mantidos. O objetivo da conteno reduzir ou eliminar a exposio da equipe de um laboratrio, de outras pessoas e o meio ambiente em geral aos agentes potencialmente perigosos. Os trs elementos de conteno incluem a prtica e a tcnica laboratorial, o equipamento de segurana e o projeto da instalao7. Para reduzir a gerao de aerossis pelos procedimentos laboratoriais e sua disperso, preciso a utilizao de um conjunto de medidas tcnicas descritas a seguir.

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Captulo 3 Biossegurana

3 .2 Barreiras de conteno primrias


Constitui a primeira linha de proteo quando se trabalha com agentes infecciosos. As boas prticas microbiolgicas, cabines de segurana biolgica, centrfugas com caapa de segurana, luvas, mscaras e aventais so exemplos de barreiras primrias utilizadas nos laboratrios de bacteriologia da tuberculose, as referncias7, 8. 3 .2 .1 Boas prticas microbiolgicas9, 10 Compreendem as prticas e tcnicas microbiolgicas padronizadas, que devem ser seguidas para todos os procedimentos realizados no laboratrio, valendo a pena salientar que a adeso rgida a elas o principal componente de conteno4. A seguir so descritas algumas das Boas Prticas Microbiolgicas que devem ser adotadas nos laboratrio. Restringir ou limitar o acesso ao laboratrio apenas para os profissionais autorizados. No comer, beber, fumar ou aplicar maquiagem no laboratrio. No pipetar com a boca, fazer uso de dispositivos de pipetagem. Fazer higienizao das mos com gua e sabo apropriado ao entrar no laboratrio, aps manipulao de amostras, aps a realizao de qualquer procedimento bacteriolgico, aps tirar as luvas e o jaleco e antes de sair do laboratrio. Manipular material potencialmente infeccioso apenas em reas restritas, afastadas da circulao geral. Usar luvas durante a execuo de suas atividades. No manusear maanetas, telefones, puxadores de armrios ou outros objetos de uso comum enquanto estiver de luvas. Realizar cuidadosamente todos os procedimentos a fim de evitar a formao de aerossis. 3 .2 .2 Equipamentos de Proteo Individual (EPI) So equipamentos de proteo utilizados individualmente pelos profissionais como ferramenta de trabalho, destinados proteo do trabalhador, minimizando riscos suscetveis de ameaar a segurana e a sade no trabalho. Os EPI no evitam os acidentes em si, mas protegem o profissional quando o risco est ligado funo do mesmo e sua exposio ao agente. Deve-se considerar que o risco est associado ao tipo e quantidade de agente infeccioso, tempo de exposio e sensibilidade do organismo de cada profissional. Existem vrios tipos de EPI, cada qual com sua finalidade e modo de usar, com especificaes muito particulares dependendo da atividade a ser executada, sendo os mais utilizados as luvas, mscara, avental e calados fechados.

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

O uso de luvas, mscaras, aventais e calados fechados deve sempre fazer parte de toda as etapas do diagnstico laboratorial da tuberculose, desde a recepo das amostras at a execuo de tcnicas mais complexas. As luvas devem ser de material resistente, ter baixa permeabilidade e boa flexibilidade e ser descartveis. Nunca reutilize as luvas, descarte-as de forma segura. As mscaras utilizadas pelos profissionais de laboratrio devem ser aprovadas pelo CDC atravs do National Institute for Ocupacional Safety and Health (NIOSH). No Brasil, os EPI devem ter registro junto ao Ministrio do Trabalho. Para a proteo contra a tuberculose so utilizadas as do tipo N95, que apresentam porosidade de eficincia igual ou maior do que 95%, para reter partculas de 0, 3. Elas devem adaptarse perfeitamente ao formato do rosto do usurio e podem ser reutilizadas pelo mesmo profissional por perodos longos, desde que se mantenham ntegras (no amassadas, dobradas e rasgadas), secas e limpas. A manuteno das mscaras em sacos plsticos no recomendada por reter umidade. Para proteg-las e permitir o uso mais prolongado, deve-se envolv-las em papel-toalha e manter em local seguro11. Os aventais devem ser de mangas longas, com punhos sanfonados, de fechamento frontal, com botes, preferencialmente de presso, mantidos permanentemente fechados, de comprimento abaixo dos joelhos, em tecido de algodo ou de fibra sinttica no inflamvel9, 10. O uso do avental deve ser restrito rea de trabalho, e devem ser guardados em locais apropriados, nunca em armrios junto com objetos de uso pessoal. O avental deve ser descontaminado por autoclavao ou por descontaminao qumica antes de ser lavado8, 9. 3 .2 .3 Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC) So os dispositivos ou equipamentos utilizados para preveno de acidentes e proteo de profissionais em reas de trabalhos e arredores dos setores e unidades executoras de atividades de risco. A cabine de segurana biolgica (CSB) um dos principais dispositivos de conteno primria utilizados para possibilitar a conteno de derrames infecciosos ou aerossis gerados por muitos procedimentos microbiolgicos realizados em laboratrios que manipulam M. tuberculosis8. Existem trs tipos de cabine de segurana biolgica utilizadas em laboratrios de microbiologia. As cabines de segurana biolgica de classe I, II e III, sendo algumas classes subdivididas em tipos A, B1e B2 dependendo do uso a que se destinam. As cabines de classe II so cmaras abertas que oferecem nveis significativos de proteo ao pessoal de laboratrio e ao meio ambiente quando utilizadas em conjunto com boas prticas microbiolgicas. Esse tipo de cabine tambm protege contra a contaminao externa de materiais (e.g. culturas de clulas, culturas microbianas de estoque) que so manipulados dentro dela. As CSB de classe II quando mantidas

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Captulo 3 Biossegurana

adequadamente e utilizadas em conjunto com as boas prticas microbiolgicas proporcionam um nvel de conteno apropriado para os laboratrios de bacteriologia da tuberculose2, 3, 4. Todos os procedimentos geradores de aerossis nos laboratrios de bacteriologia da tuberculose2 devem ser realizados no interior dessas cabines. Os principais procedimentos geradores de aerossis so: agitao de amostras em alta velocidade, macerao de bipsias, agitao e pipetagem de culturas lquidas do bacilo da tuberculose. Apesar de se saber que o M. tuberculosis pertence ao grupo de risco III, alguns procedimentos para o diagnstico da tuberculose podem ser realizados em laboratrios de nvel de biossegurana II, podendo citar, como exemplo, a baciloscopia direta e processamento de amostras biolgicas por mtodos que no exijam agitao. Esses procedimentos podem ser realizados fora da CSB, na bancada com o auxlio de chama de um bico de Bunsen12. As CSB devem ser testadas e certificadas no laboratrio onde vo ser utilizadas, ao serem instaladas, sempre que forem removidas, e preventivamente, uma ou duas vezes ao ano, dependendo do uso12. Como para qualquer outro equipamento, os profissionais devem ser treinados para utilizao adequada das cabines de segurana biolgica, em particular, para evitar atitudes que rompam o fluxo de ar dentro desses equipamentos, comprometendo sua eficincia. No utilize a CSB para manipulao de substncias volteis, para isso utilize as capelas de exausto qumica. As capelas de exausto qumica so equipamentos que protegem os profissionais na manipulao de substncias que liberam vapores txicos ou irritantes. Esse equipamento necessrio na preparao de corantes e solues qumicas, jamais realizar estas atividades fora dela12. O fenol irritante para os olhos e cancergeno. Se o laboratrio no dispuser de capela de exausto, a soluo de fenol a 5% e os corantes devero ser preparados e distribudos pelo laboratrio de referncia. As centrfugas para trabalho em laboratrios de bacteriologia da tuberculose devem funcionar em velocidade suficiente para sedimentar os bacilos, isto , em 3000 x g. Preferencialmente, devem ser refrigeradas evitando o aquecimento acima de 37C. O rotor deve ser sem vibraes, angular e com tampa. imprescindvel que as caapas sejam seladas, evitando a disperso de aerossol caso haja a quebra de algum tubo durante a centrifugao. Para outras informaes consulte o Captulo 11 deste Manual. Rotores com tampa ou caapas de proteo so utilizados para evitar que aerossis sejam liberados durante a centrifugao.

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3 .3 Barreiras de conteno secundria


O desenho das instalaes laboratoriais pode constituir uma importante barreira de proteo pessoal, em geral, contra os agentes infecciosos que podem ser acidentalmente liberados do laboratrio. A adoo de barreiras secundrias depende do risco de transmisso dos agentes infecciosos, devendo as instalaes serem adequadas funo do laboratrio e ao nvel de segurana recomendado para os agentes infecciosos manipulados nesses locais. As barreiras secundrias recomendadas nestes laboratrios devem incluir a separao da rea de trabalho laboratorial do acesso pblico, existncia de uma rea para descontaminao e locais para lavagem de mos. medida que o risco de transmisso dos microrganismos por aerossis aumenta, tornam-se necessrios nveis mais elevados de conteno primria e mltiplas barreiras secundrias para impedir a sada de agentes infecciosos para o meio ambiente. As caractersticas do desenho das instalaes podem ento incluir: sistemas de ventilao especializados que assegurem fluxo de ar direcionado, sistemas de tratamento do ar laboratorial para descontaminar ou remover agentes do ar liberado (ar expelido), reas de acesso controlado, e possivelmente, o isolamento do laboratrio em edifcios ou mdulos separados8. 3 .3 .1 Instalaes laboratoriais12 Ao construir ou reformar um laboratrio necessrio consultar profissionais especializados que tenham conhecimento na rea de biossegurana. As instalaes do laboratrio que realiza diagnstico da tuberculose devem atender aos seguintes requisitos. 3 .3 .1 .1 Requisitos gerais Exigidos para qualquer laboratrio de diagnstico, ou seja, paredes, pisos e bancadas de superfcie lisa, lavveis contendo apenas os equipamentos e materiais necessrios aos procedimentos, para facilitar a limpeza e a descontaminao alm de evitar acidentes. 3 .3 .1 .2 Requisitos especficos Para o diagnstico laboratorial da tuberculose esses requisitos variam de acordo com o exame realizado, ou seja, baciloscopia e/ou cultura. As instalaes do laboratrio que realiza a baciloscopia devem atender, no mnimo, aos seguintes requisitos de biossegurana. Na rea onde os pacientes so atendidos para entregar amostras, recomenda-se tambm a instalao de um exaustor, com capacidade de 6 a 10 renovaes do volume de ar por hora, para facilitar a retirada do ar contaminado. Outra reco-

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Captulo 3 Biossegurana

mendao que seja organizado um fluxo de atendimento dos pacientes que permita que eles permaneam o menor tempo possvel de espera. A rea de recepo de amostras deve ser o mais prximo possvel da sala de procedimentos, isolada das reas comuns, e conter uma abertura pass-through que permita apenas a passagem das amostras acompanhadas da solicitao de exames. A rea de realizao dos procedimentos deve ser de forma a permitir um sistema de circulao de ar das reas limpas para as reas sujas. No caso de haver janelas estas devem estar localizadas de forma a no permitir correntes de ar na rea de preparao de esfregaos, evitando assim a contaminao dos profissionais. Nessas reas no deve haver ventiladores de teto. As janelas e portas dos laboratrios so teis para ventilar o ambiente quando no h sistema de extrao do ar e devem permanecer fechadas durante a realizao dos procedimentos, podendo ser abertas no final de cada rotina de trabalho. As bancadas devem ser instaladas em ambiente apropriado para a preparao do esfregao de maneira a ter boa iluminao. Recomenda-se tambm a instalao de um exaustor, com capacidade de 6 a 10 renovaes do volume de ar por hora, para facilitar a retirada do ar contaminado. O ideal que essa sala seja exclusiva para o preparo dos esfregaos. No entanto, se isso no for possvel, absolutamente necessrio que seja definida uma rea especfica para esse fim, onde devem circular apenas os profissionais envolvidos com a baciloscopia. fundamental tambm preparar os esfregaos no horrio de menor movimento na sala. Jamais faa a manipulao das amostras ao mesmo tempo em que outras atividades estiverem sendo realizadas na mesma sala. Uma outra opo ter uma sala de procedimentos equipada com CSB. Sempre que possvel, deve-se utilizar a CSB para preparao dos esfregaos e todas as atividades que envolvam a manipulao do microrganismo. A descontaminao do material reutilizvel e do lixo a ser descartado deve ser por autoclavao. Quando no houver autoclave no local, o lixo infeccioso deve ser recolhido juntamente com o lixo hospitalar. As atividades administrativas devem ser realizadas em reas destinadas exclusivamente a elas, no sendo permitida nessas reas a manipulao de amostras biolgicas. As reas para o preparo e armazenamento de corantes, desinfetantes e outras solues devem ser equipadas com capela de exausto qumica. Sala separada ou rea restrita para a realizao de cultura e/ou teste de sensibilidade com cabine de segurana biolgica Classe II Tipo B2 ou B3, estufa bacteriolgica e centrfuga

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3.4 Transporte de amostras biolgicas


Amostras clnicas precisam ser transportadas com segurana e dentro do tempo determinado, do local onde foram coletadas at o local onde vo ser analisadas para garantir a qualidade dos resultados. Os espcimes de origem humana devem ser acondicionados e transportados de maneira a proteger o pessoal responsvel pelo transporte, dos ricos de infeco. A regulamentao do transporte de amostras e agentes biolgicos definida para assegurar a proteo ao pblico a queles que fazem o transporte, contra qualquer agente infeccioso que possa estar presente na embalagem4. 3.4.1 Transporte intra e interlaboratorial de amostras clnicas As amostras clnicas devem ser transportadas, intralaboratorialmente, em caixas prprias com tampa, identificadas com o smbolo de risco biolgico. Devem ser de material no poroso, rgido, resistente descontaminao. Na Figura 1 so descritos o smbolo de risco biolgico e a caixa para transporte de amostras. Ao transportar amostras potencialmente patognicas deve-se escolher o caminho menor e com menos obstculos. O profissional responsvel pelo transporte das amostras deve estar usando avental e luvas. Figura 1 Smbolo de risco biolgico e caixa para transporte de amostras
tampa com fechamento hermtico grades internas para acondicionamento dos potes em p material no poroso, rgido, resistente descontaminao Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS smbolo de risco biolgico
ESPCIMES PARA DIAGNSTICO

Quando a coleta de material clnico estiver localizada em outro servio de sade, deve-se acondicionar os frascos contendo as amostras biolgicas em caixa apropriada, verificando se os mesmos encontram-se com as tampas bem fechadas e voltadas para cima. recomendvel colocar cada um dos frascos dentro de um saco plstico, pois, em caso de extravasamento, o risco biolgico fica limitado ao saco plstico e no se espalha por toda a caixa. Se o tempo de transporte for superior a 24 horas, coloque gelo reciclvel. Se o servio no tiver gelo reciclvel, acondicione cubos de gelo comum dentro de um saco plstico resistente e bem vedado. A quantidade de gelo utilizada deve corresponder a, no mnimo, 1/3 do volume (cubagem) da caixa trmica; que deve ser hermeticamente fechada.

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Captulo 3 Biossegurana

Coloque as solicitaes de exames dentro de um saco plstico e prenda-o firmemente com fita adesiva, sobre a tampa, do lado externo da caixa. Jamais, coloque as solicitaes dentro da caixa junto com as amostras. Coloque sobre a tampa ou na lateral da caixa uma etiqueta com o nome e endereo do laboratrio destinatrio, nome da unidade de sade remetente, endereo, telefone e fax. Notificar o laboratrio receptor, hora e data do envio do material, para que esse programe a recepo das amostras. 3 .4 .2 Transporte intra e interlaboratorial de lminas com esfregao O transporte dos esfregaos fixados de uma rea do laboratrio para outra, deve ser feito em caixas plsticas porta-lminas bem fechadas. As lminas com esfregao enviadas para a realizao do controle de qualidade devero ser acondicionadas em caixas plsticas porta-lminas bem fechadas e identificadas com os nomes e endereos dos laboratrios destinatrio e remetente. ATENO: mesmo aps a fixao ainda podem existir bacilos viveis no esfregao . Siga as normas de biossegurana para o transporte e identifique a caixa com o smbolo de risco biolgico14, 15, conforme descrito na Figura 1 . Preferencialmente, no transportar lminas sem corar ou amostra clnicas sem tratar previamente com Soluo de Fenol a 5% . 3 .4 .3 Transporte interlaboratorial de cepas de micobactrias O transporte de culturas positivas, por via area, deve seguir as normas internacionais da Associao Internacional de Transporte Areo (International Air Transport Association IATA http://www.iata.org). Culturas de micobactrias devem ser transportadas em meio slido em tubo de rosca ou em meio lquido. Se forem transportadas em meio lquido, devem ser em criotubos com miangas, com tampa de rosca, anel de vedao e, a soma dos volumes dos criotubos, no pode ultrapassar 50 ml. Culturas em placas de Petri no devem ser transportadas. As culturas devem ser embaladas em trs recipientes. O frasco contendo a cultura bacteriana dever ser prova de vazamento (recipiente primrio), bem vedado, e deve ser colocado em um segundo recipiente tambm prova de vazamento. Entre os dois recipientes deve haver quantidade suficiente de material absorvente. Por ltimo, deve haver uma embalagem externa adquirida comercialmente. Essa ltima embalagem destinada a proteger as outras embalagens e o material a ser transportado contra fatores externos, tais como impacto fsico e contato com a gua durante o transporte, como mostra a Figura 2.

112 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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A embalagem deve conter um rtulo que identifique o contedo como substncia infecciosa (risco biolgico)14, 15.
Figura 2. Embalagens apropriadas para envio de amostras ou culturas patognicas por via area

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

3.5 Procedimentos em casos de acidentes


Todo laboratrio deve ter os procedimentos definidos e escritos que devem ser realizados no caso de acidentes. Os profissionais devem ser treinados para a realizao desses procedimentos de forma correta. 3.5.1 Derramamento de material biolgico no laboratrio8, 10, 16 Quando houver acidentes onde haja derrame de material biolgico deve-se adotar os seguinte procedimentos. Solicitar as pessoas que estiverem na sala para sair imediatamente. Cobrir imediatamente o material biolgico derramado com material absorvente para limitar a rea afetada e minimizar a produo de aerossis. Utilizar qualquer material disponvel como, por exemplo, toalhas de papel. Derramar, sobre o material biolgico j coberto, Soluo de Fenol a 5%, deixar em repouso e sair imediatamente da sala. ATENO: No item 3.8.1.1 dos anexos deste captulo descrevemos a preparao da soluo de Soluo de Fenol a 5%. Esperar pelo menos 20 minutos para que o desinfetante possa agir. Recolher com um papel-toalha os materiais envolvidos no acidente (inclusive o material usado na limpeza); colocar tudo dentro de uma lata com tampa ou caixa de papelo resistente com tampa ou de um saco de lixo autoclavvel.

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Captulo 3 Biossegurana

Encaminhar para autoclavao e depois para descarte final. Descontaminar o local do acidente com gaze ou algodo embebido em Soluo de lcool a 70%. Ateno: No item 3 .8 .1 .2 dos anexos deste captulo descrevemos a preparao da Soluo de lcool a 70% .

Se houver quebra de tubos, o procedimento deve ser o mesmo descrito acima, observando as precaues para recolher o material quebrado, aps a ao do desinfetante.

3 .5 .2 Derramamento dentro da cabine de segurana biolgica10, 16 Quando houver quebra de tubos contendo contendo cultura lquida, respingo de amostras clnicas ou respingos de cultura lquida dentro da CSB deve-se adotar os seguintes procedimentos. Manter a CSB ligada, para conter os aerossis que possam ser formados. Iniciar a limpeza o mais rpido possvel utilizando o desinfetante apropriado (recomenda-se utilizar Soluo de Fenol a 5%). Caso o derramamento ocorra em um recipiente, o mesmo deve ser descartado como material infeccioso. Se o derramamento ocorrer na superfcie de trabalho, cobrir o material derramado com papel-toalha, e derramar sobre o material biolgico j coberto, Soluo de Fenol a 5%, deixar em repouso por no mnimo 20 minutos para remover o papel-toalha e descart-lo como material infeccioso. Os materiais que estiverem dentro da CSB no momento do derramamento s devero ser retirados aps 20 minutos do acidente, tendo sido desinfetados com Soluo de Fenol a 5%, antes de retirar da CSB. Dependendo do material dever ser autoclavado em seguida. Os EPI utilizados para a realizao da limpeza devero ser autoclavados. Aps a limpeza, a CSB dever ficar ligada por mais 10 minutos com a lmpada de ultravioleta ligada. 3 .5 .3 Derramamento de material biolgico por quebra de tubos no interior da centrfuga10, 15 No caso de quebra de tubos contendo suspenses de M. tuberculosis deve-se adotar os seguintes procedimentos. Interromper a operao, desligando a centrfuga. Manter a centrfuga fechada por pelo menos 30 minutos para que baixem os aerossis.

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Remover as caapas fechadas da centrfuga e levar para a CSB. Remover e descartar os fragmentos do tubo em condies seguras. Descontaminar a centrfuga, o rotor e as caapas com desinfetante adequado (de acordo com as instrues do fabricante contidas no manual da centrfuga). Utilizar caapa de segurana e tubos de polipropileno com tampa rosquevel.

3 .6 Uso adequado dos equipamentos de laboratrio


Os tcnicos dos laboratrios de bacteriologia da tuberculose devem ser treinados no uso correto dos equipamentos para evitar acidentes e liberao de aerossis infecciosos. 3 .6 .1 Uso de pipetas e de dispositivos auxiliares de pipetagem Usar sempre um dispositivo auxiliar de pipetagem (pipetador automtico ou manual). Usar somente pipetas contendo barreira de algodo na extremidade superior interna, com a finalidade de reduzir o risco de contaminao dos dispositivos de pipetagem. Eliminar os lquidos das pipetas de forma suave. Cobrir a superfcie da mesa de trabalho com um papel absorvente embebido em desinfetante, com o objetivo de evitar a disperso de material infeccioso, se este cair acidentalmente da pipeta. Nesse caso, o papel deve ser autoclavado aps o uso. Descartar as pipetas contaminadas, ainda dentro da CSB, mergulhando as pipetas por completo, horizontalmente, em recipiente inquebrvel contendo gua. Esterilizar o recipiente com as pipetas em autoclave. ATENO: Autoclavar recipientes com soluo de cloro poder gerar gs cloro que txico . Os compostos liberados de cloro provocam irritao da pele, dos olhos e do aparelho respiratrio . Quando ingeridos, produzem irritao das membranas mucosas . Utilizar Soluo de lcool a 70 % para desinfeo de superfcies. Os casos de acidentes esto descritos no item 3.5 deste captulo.

3 .6 .2 Uso de cabines de segurana biolgica10, 16 17 Proceder da seguinte forma ao utilizar a CSB. Fechar as portas do laboratrio e evitar a circulao de pessoas na frente da CSB durante sua utilizao. O local adequado para instalar uma CSB est descrito no Captulo 11 deste manual. Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes de seu uso18.

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Captulo 3 Biossegurana

ATENO: Lmpada ultravioleta (UV) germicida uma lmpada fluorescente, sem a deposio de p de vidro como cobertura interna, que responsvel por transformar a radiao ultravioleta gerada pela lmpada em luz visvel . Sem a cobertura, a lmpada emite apenas a radiao ultravioleta capaz de matar microrganismos a ela expostos . Esta emite raios no comprimento de onda de 253,7nm, que o comprimento com efeito bactericida . Os microrganismos atingidos pela radiao UV sofrem modificao no DNA ou RNA, pela formao de dmeros de pirimidina, que formados entre molculas adjacentes, podem interromper a replicao ou a transcrio levando morte da bactria . Desligar a luz UV e descontaminar a superfcie interior com gaze estril embebida em Soluo de lcool a 70%. Colocar dentro da CSB o mnimo indispensvel de aparelhos e materiais. Esses materiais devem ficar atrs da rea em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de circulao de ar da CSB. Organizar os materiais de modo que os itens limpos e contaminados no se misturem. No efetuar movimentos rpidos ou gestos bruscos na rea de trabalho. No permitir o uso da chama do bico de Bunsen, pois isto acarreta danos ao filtro HEPA e o aquecimento do ar pode gerar turbulncia interrompendo o fluxo laminar. Limpar a CSB, ao trmino do trabalho, com gaze estril embebida em Soluo de lcool a 70%. Deixar a CSB e a lmpada UV ligadas por 10 a 15 minutos, antes de deslig-la. A maioria das CSB, alm dos filtros HEPA e um sistema de direcionamento de ar, possuem uma lmpada ultravioleta (UV) germicida. A eficincia do uso da UV como um meio de descontaminao ainda motivo de controvrsia j que a UV alm de no penetrar em partculas, est limitada distncia entre a luz e o material exposto a ela, e ao tempo de exposio. A exposio UV carcinognica causando ceratoconjuntivite quando inadequadamente utilizada18. ATENO: Antes da verificao das CSB ou trocas dos seus filtros HEPA deve-se realizar descontaminao das mesmas . Esse procedimento deve ser realizado por pessoal treinado atravs do uso de paraformaldeido, levando-se em conta o tamanho da rea de trabalho da CSB, segundo recomendaes do fabricante ou equipe que realiza a certificao; seguindo a norma NSF 4919 de 1983 .

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3 .7 Referncias
1 CDC/Centers for Disease Control, Office of Biosafety. Classification of Ethiologic Agents on the Basis of Hazard. 4. ed. [S.l]: US Department of Health, Education and Welfare; Public Health Service, Washington, DC, 1974. ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD. Los servicios de laboratorio en el control de la tuberculosis. Suia, 1998. CDC/Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5. ed, U.S. Department of Health and Human Services. Washington, DC, 2007. BRASIL. Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Biossegurana em Laboratrios Biomdicos e de Microbiologia. 3 edio revista e atualizada, Serie a Normas e Manuais Tcnicos, 2004. KENT, P.T. & KUBICA, G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide For The Level III Laboratoy, US Department of Health and Human Services; Public Health Service, Centersfor Disease Control, 1985. CDC/Centers for Disease Control and Prevention. Department of Health and Human Services. Goals for working safely with Mycobacterium tuberculosis in clinical, public health and research laboratories.Atlanta, 1997. BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia, 72 p. Braslia. 2001. FLEMING, D.O.; RICHARDSON, J.H.; TULIS, J.J.; VESLEY, D. Laboratory Safety Principles and Practices, ASM Press 2nd ed. Washington, DC, 1995. HIRATA, H.H.; FILHO, J.M. Manual de Biossegurana. Rio de Janeiro: Manole, 2002. ODA, L. & VILA, S.M. (org). Biossegurana em Laboratrios de Sade Pblica. Rio de Janeiro, 2 ed., 2000. GONALVES, M.L.C. Transmisso nosocomial da tuberculose: diminuindo o risco. Boletim de Pneumologia Sanitria, Rio de Janeiro, p. 21-25, v. 9 n 2 jul/dez 2001. OPAS/Organizacin Panamericana de la Salud. Cabinas de Seguridad Biolgica:Uso, Desinfeccin y Manutenimento. Washington, 2004. WHO/World Health Organization. Guidance on regulations for the transport of infectious substances, 2007-2008. Applicable as from 1 January 2007.WHO/CDS/ EPR/2007.2. Geneva, Switzerland, 2007. BRASIL. Ministrio da Sade. ANVISA. Resoluo RDC 302, de 13 de outubro de 2005. Dispe sobre Regulamento Tcnico para Funcionamento de Laboratrios Clnicos. DOU, Braslia, 2005. SES-PR/Secretaria do Estado da Sade do Paran. Laboratrio Central do Estado do Paran. Manual de Biossegurana e Segurana Qumica em Laboratrio de Sade Pblica. Curitiba, 2000.

2 3

8 9 10 11 12 13

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Captulo 3 Biossegurana

16

KUEHNE, R.W.; et al., Primary Barriers and Personal Protective Equipment in Biomedical Laboratories, in: Laboratory Safety Principles and Practices, p 145. 2nd Edition. Eds Diane O. Fleming, John H. Richardson, Jerry J. Tulis and Donald Vesley, 1995. 17. CDC/Centers for Disease Control and Prevention. Primary Containment for Biohazard: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. 2nd Ed,: U.S. Department of Health and Human Services. Washington, DC, 2000. 18. UEKI S. Y. M.; GEREMIAS A. L.; MONIZ L. L.; LATRILHA F.O.; BRITO A.C.; GIAMPAGLIA, C.M.S.; SIMEO F.C.S.; TELLES M.A.S. Cabine de segurana biolgica: efeito da luz ultravioleta nas micobactrias. Rev Inst Adolfo Lutz, 65(3):222-224, 2006. 19. NSF/National Sanitation Foundation. Appendix E: Standard 49 for Class II (laminar flow) biohazard cabinetry. In Recommended Microbiological Decontamination Procedure. Ann Arbor, MI: 4-E:39; 5-B:50, 1983. 20 BRASIL. ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS ABNT. Norma Brasileira Registrada - NBR5992/80 - Determinao da massa especfica e do teor alcolico do lcool Etlico e suas mistura com gua, pg 31, Tabela 3: Teor alcolico. 1980.

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3 .8 Anexos do captulo
3 .8 .1 Preparao de reagentes 3 .8 .1 .1 Quadro 1 Preparao da Soluo de Fenol a 5%
PREPARAO DA SOLUO DE FENOL A 5% Cristal de fenol gua destilada qsp 1. Colocar o fenol em um balo de 1.000 ml. 2. Adicionar 700 ml da gua destilada aos poucos no balo sobre o fenol. 3. Colocar o balo para aquecer em banho maria at o fenol dissolver completamente. 4. Retirar do banho maria e acrescentar gua destilada at completar 1.000 ml. 5. Deixar esfriar em temperatura ambiente. 6. Colocar a Soluo de Fenol a 5% em um frasco mbar de 1.000 ml, hermeticamente fechado para impedir desprendimento de vapores enquanto no est em uso, rotulado com as seguintes informaes: nome da soluo, data da preparao, de validade e a expresso PRODUTO UTILIZADO APENAS PARA CONTENO DE DERRAMAMENTOS DE GRANDE VOLUME. 7. Armazenar essa soluo em temperatura ambiente. 50 g 1.000 ml

3 .8 .1 .2 Quadro 2 Preparao da Soluo de lcool a 70%


PREPARAO DA SOLUO DE LCOOL A 70% lcool etlico comercial 95% gua destilada qsp 1. Colocar o lcool etlico em um balo de 1.000 ml. 2. Adicionar gua destilada aos poucos no balo sobre o lcool etlico at completar 1000 ml. 3. Colocar a soluo da lcool etlico em um frasco bem vedado j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante, data da preparao e de validade. 4. Armazenar ao abrigo da luz e a temperatura ambiente. 700 ml 1.000 ml

OBS: O ttulo Soluo de lcool a 70% significa percentagem em Peso/Peso (P/P), expresso usual. Na preparao da soluo mais prtico trabalhar com volume ao invs de peso, portanto, faz-se necessrio uma converso para a correo do teor alcolico. Para isto considerar a relao: 770ml(volume) correspondem a 700g (peso) do lcool etlico comercial 95%.20

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Captulo 3 Biossegurana

3 .8 .2 Formulrios de controle da preparao

3 .8 .2 .1 Formulrio Controle da Preparao da Soluo de Fenol a 5%

3 .8 .2 .2 Formulrio Controle da Preparao da Soluo de lcool a 70%

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CAPTULO 4

MICOBACTRIAS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Descrio Aps a comprovao de que os agentes etiolgicos da tuberculose (TB) e da hansenase tinham caractersticas morfolgicas de bacilos e tintoriais de lcool-cido resistncia, Lehmann e Neumann, em 1896, agruparam os agentes como pertencentes ao gnero Mycobacterium, estabelecendo as espcies Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, respectivamente. A denominao do gnero originou-se do latim fungus bacterium, pelo fato do M. tuberculosis apresentar algumas caractersticas semelhantes aos fungos quando cultivado em meio lquido1. Posteriormente, foram visualizados e isolados, tanto do homem como do meio ambiente, vrios outros bacilos com as mesmas caractersticas tintoriais do M. tuberculosis, entretanto, com diversificaes no tempo de crescimento in vitro, produo de pigmentos e patogenicidade para aos seres humanos. A partir da dcada de 90, um nmero crescente de novas espcies tem sido descritas e at o momento dessa publicao 125 espcies e 11 subespcies so reconhecidas oficialmente2. Com exceo do M. leprae que no cresce in vitro, essas espcies so divididas em dois grupos, as espcies pertencentes ao Complexo M. tuberculosis e as Micobactrias No causadoras de Tubeculose (MNT)123.
Os bacilos (Unidades Formadoras de Colnias UFC) variam de tamanho conforme a espcie de micobactria (0,2 a 0,7 por 1 a 10 micrmetros) e so constitudos de: Parede celular responsvel pela morfologia bacilar, tem em sua constituio qumica diversos lipdeos, entre eles os cidos miclicos que so utilizados em testes de identificao das espcies de micobactrias. A ligao de alguns desses lipdios com o corante Fucsina gera complexos que so responsveis pela caracterstica tintorial de resistncia descolorao por solues lcool-cidas, apresentada pelas clulas bacterianas que so ento designadas como Bacilos lcool-cido Resistentes. Por esse motivo, na prtica clnica e laboratorial so conhecidas e transcritas como BAAR. Essa caracterstica tintorial e o aspecto morfolgico no permitem a definio da espcie micobacteriana, embora algumas se apresentem morfologicamente mais espessas e curtas. Assim, para a definio da espcie preciso que os bacilos sejam isolados em meio de cultivo e identificados por testes fenotpicos e/ou moleculares. tambm na parede que se encontra o composto (6-6 dimicolato de trealose) responsvel pela pelcula que o M. tuberculosis forma em meio de cultivo lquido e o aspecto de corda dos bacilos em esfregaos feitos a partir de cultivos. Membrana citoplasmtica estrutura que envolve o citoplasma e responsvel pelo transporte e seleo de substncias, nutrientes e gua, alm de participar do processo respiratrio e da produo de energia. Nessa membrana so sinte-

4 .1

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Captulo 4 Micobactrias

tizados pigmentos carotenides e niacina, utilizados nos testes de identificao fenotpica das espcies. Cromossomo constitudo de cido desoxiribonucleico (ADN) que codifica todas as caractersticas e informaes necessrias sobrevivncia e multiplicao da micobactria. Ribossomos corpsculos espalhados no citoplasma da micobactria contendo cido ribonucleico (ARN) e protenas. Possuem as enzimas necessrias biossntese celular, entre elas a responsvel pela reduo do nitrato a nitrito, uma das provas utilizadas na identificao do M. tuberculosis. Grnulos de polifosfato estruturas onde ficam armazenados polifosfatos para uso nas atividades energticas e de multiplicao bacilar. Na visualizao microscpica podem aparecer como pequeninos gros escuros localizados nas extremidades do bacilo. Vacolos lipdicos armazenam lipdeos para uso nas necessidades metablicas das clulas. Mesossomos encontram-se associados membrana celular e desempenham funo essencial no processo de diviso celular e nas atividades enzimticas. As micobactrias so, tambm, classificadas, conforme sua capacidade de causar doena no homem, em (i) patognicas, que obrigatoriamente causam doena; (ii) potencialmente patognicas, que podem causar doena; (iii) raramente patognicas, nunca ou com extrema raridade causam doena. Mediante essa classificao, as espcies oficialmente reconhecidas e mais comumente isoladas esto distribudas no Quadro 1.

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Quadro 1

Espcies de micobactrias classificadas conforme patogenicidade para seres humanos


PATOGNICAS M. tuberculosis M. bovis M. africanum M. microti M. caprae POTENCIALMENTE PATOGNICAS

M. leprae

M. avium M. avium subsp paratuberculosis M. abscessus M. asiaticum

M branderi M. celatum M. chelonae M. fortuitum

M. genavense M. haemophilum M. intracellulare M. kansasii RARAMENTE PATOGNICA

M. malmoense M. marinum M. peregrinum M. scrofulaceum

M. simiae M. szulgai M. ulcerans M. xenopi

M. agri M. aichiense M. alvei M. aurum M. brumae M. austroafricanum M. chitae M. chubuense M. confluentis


Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS/MS

M. cooki M. diernhoferi M. duvalii M. fallax M. farcinogenes M. flavescens M. gadium M. gastri M. gilvum

M. gordonae M. hassiacum M. komossense M. lepraemurium M. mucogenicum M. nonchromogenicm M. neoaurum M. obuense

M. phlei M. porcinum M. pulveris M. rhodesiae M. senegalense M. shimoidei M. smegmatis M. sphagni

M. terrae M. thermoresistible M. tokaiense M. triviale M. vaccae

Estudos taxonmicos demonstraram similaridades fenotpicas, relao de antgenos citoplasmticos e homologia do ADN, entre as vrias espcies oficialmente descritas induzindo, por razes operacionais de diagnstico, o agrupamento de algumas e suas definies como complexos ou grupos. Assim, oficialmente fazem parte do Complexo M. tuberculosis (CMTB) as espcies: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG; M. africanum, M. microti, M. caprae e M. pinnipedii. A espcie M. canetti, descrita inicialmente por George Canetti em 1969, ainda no foi oficialmente reconhecida como membro do CMTB2.

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Captulo 4 Micobactrias

Alm do CMTB, tem-se o Complexo M. avium (MAC) que agrupa as espcies M. avium, M. avium subespcie paratuberculosis, M. intracellulare e M. scrofulaceum e Complexo M. terrae as espcies M. terrae, M. nonchromogenicum e M. triviale. Recentemente, algumas espcies de crescimento rpido foram reunidas em trs grupos: (i) grupo M. fortuitum composto pelas espcies M. fortuitum, M. peregriunum, M. mucogenicum, M. senegalense, M. mageritense, M. septicum, M. houstonense M. bonickei; (ii) grupo M. chelonae pelas espcies M. chelonae, M. abcessus, M. immunogenum e (iii) grupo M. smegmatis, pelas espcies M. smegmatis, M. woliskyi, M. godii. 4 As espcies de MNT tm sido isoladas de diversas fontes ambientais (guas, solos, poeiras e materiais vegetais) e/ou de animais. Algumas espcies so encontradas na prpria microbiota epidrmica e dos tratos respiratrio e gstrico-intestinal dos seres humanos. Quando responsveis por processos patolgicos em humanos, as MNT podem acometer qualquer tecido dos sistemas ou disseminar-se por todo o organismo, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A doena que ocasionam denominada de micobacteriose, independentemente da espcie responsvel pela patologia. Por no serem transmissveis, no existe obrigatoriedade de notificao, o indicador de incidncia no Brasil desconhecido.

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4 .2 Referncias
1 2 3 COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M.; YATES, M.D. Tuberculosis Bacteriology: Organization and Practice. Butter Worth-Heinemann, Oxford, 2nd edition. 139 p, 1997. EUZBY, J.P. List of bacterial names with standing in nomenclature. Disponvel em: (http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.htm) Acesso em 09 mar 2007. GRIFFITH, D.E.; AKSAMIT, T, BROWN-ELLIOTT, B.A.; CATANZARO, A.; DALEY, C.; GORDIN, F.; HOLLAND, S.M.; HORSBURGH, R.; HUITT, G.; IADEMARCO, M.F.; ISEMAN, M.; OLIVIER, K.; RUOSS, S.; von REYN, C.F.; WALLACE, R.J. Jr, WINTHROP, K.; An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med, 175:367-416, 2007. BROWN-ELLIOTT, B.A.; WALLACE, R.J. Jr. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clin Microbiol Rev, 15:716-46, 2002.

4.

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CAPTULO 5

AMOSTRAS CLNICAS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

5 .1 Descrio
As amostras clnicas enviadas ao laboratrio para diagnstico de micobactrias devem cumprir uma srie de condies gerais das quais dependem a qualidade e eficincia dos resultados dos exames: indicao correta da pesquisa de micobactrias, seleo do tipo de amostra mais representativa, cuidado na coleta, transporte, acondicionamento e recepo dessas amostras. Assim, os profissionais envolvidos nas atividades descritas devem ter conhecimento da natureza crtica da manuteno da qualidade da amostra durante todo o processo, incluindo aspectos de biossegurana no seu manuseio1. Alguns fatores podem comprometer um exame microbiolgico, desde a hiptese diagnstica mal elaborada, informaes mal coletadas, incompletas ou no devidamente interpretadas, requisio inadequada da anlise laboratorial, coleta, conservao e transporte inadequados, falha tcnica na anlise, demora na liberao do resultado e m interpretao dos resultados2. Este captulo fornece informaes prticas para uma apropriada coleta e manuseio de amostras destinadas a anlises num laboratrio de microbiologia de micobactrias.

5 .2 Seleo e tipos de amostras


Antes da coleta de amostra para anlise no laboratrio, importante que o stio anatmico de onde ser coletada a amostra seja identificado como sendo representativo do processo de doena ativa1,2. O diagnstico laboratorial de micobactrias pode ser realizado a partir de amostras provenientes de vrios stios do corpo humano e, para o diagnstico da tuberculose, as amostras vo depender da forma de tuberculose que est sendo investigada, se tuberculose pulmonar ou extrapulmonar3. No Quadro 1 esto descritas as amostras encaminhadas com maior freqncia para realizao de baciloscopia e cultura para o diagnstico laboratorial da tuberculose e micobacterioses4. Quadro 1 Tipos de amostras utilizadas no diagnstico laboratorial da TB
Tuberculose Extrapulmonar urina lquidos: pleural, sinovial, peritoneal, pericrdico, asctico e LCR secrees ganglionares e de ndulos fragmentos de tecidos: bipsias cutneas, de ossos e de rgos secrees purulentas de pele, nariz, ouvido, olhos, garganta sangue e aspirado de medula aspirados de gnglios e de tumores
Fonte: Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001

Tuberculose Pulmonar escarro (espontneo ou induzido) lavado brnquico lavado bronco-alveolar fragmento de tecido pulmonar (bipsia pulmonar) aspirado transtraqueal lavado gstrico

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Captulo 5 Amostras Clnicas

A grande maioria das amostras de origem respiratria: escarro (espontneo ou induzido), lavado bronco-alveolar (LBA), escovado brnquico, fragmentos de tecido pulmonar, aspirado transtraqueal e lavado gstrico. Amostras de stios no respiratrios so: urina, leses, secrees, abscessos, lquidos cavitrios (lquido cfalo-raquidiano LCR, pleural, pericridico, sinovial, asctico) e outros. Especial ateno deve ser dada quando h suspeita de micobactrias disseminadas, pois nesse caso as amostras sero provenientes de stios estreis, como sangue, aspirado de medula ssea, bipsias de gnglios linfticos, bao e fgado. Nesses casos observar as condies de assepsia da coleta e o acondicionamento em frasco estril, pois a semeadura ser feita diretamente em meio de cultura, no passando pela etapa de descontaminao.

5 .3 Amostras de origem pulmonar


As amostras a seguir so as mais freqentemente solicitadas para o diagnstico de tuberculose pulmonar5,6,7: Escarro espontneo a amostra clnica mais utilizada para o isolamento de micobactrias, principalmente para o diagnstico da tuberculose pulmonar, por ser o material de maior riqueza bacilar e de fcil obteno. Uma boa amostra de escarro a que provm da rvore brnquica, obtida aps esforo de tosse (expectorao espontnea) e no a que se obtm da faringe ou por aspirao de secrees nasais e nem tampouco a que contm somente saliva. O volume ideal de 5 a 10 ml. O escarro contm fragmentos de necrose (caseum), secrees bronco-pulmonares e secrees orofarngeas, pois, embora a rvore brnquica seja estril, a expectorao contamina-se ao passar pela parte superior do trato respiratrio, assim o escarro um produto contaminado e viscoso por conter grande quantidade de muco. O escarro deve ser coletado em pote de plstico transparente, de boca larga e com tampa de rosca. As recomendaes para a coleta devem ser feitas pelo pessoal da Unidade de Sade. Por ser um material de maior riqueza bacilar, pode ser conservado em refrigerao (2C 8C), por 5 a 7 dias, sem perder sua viabilidade para a cultura e suas caractersticas para a baciloscopia. Transportar para o laboratrio, ao abrigo da luz solar e acondicionar de maneira adequada para que no haja risco de derramamento (tampa bem fechada). O pote para a coleta de escarro deve ser fornecido pela Unidade de Sade e ter as caractersticas de: ser descartvel, capacidade de 35 a 50 ml, altura mnima de 40 mm, boca larga e tampa de rosca, como mostra a Figura 1.

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Figura 1

Caractersticas do pote de coleta de escarro.

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS/MS.

Escarro induzido Esse procedimento recomendado e orientado pelo mdico quando o paciente tem pouca secreo ou no consegue coletar normalmente o escarro. A coleta de escarro por induo feita aps a realizao de nebulizao com soluo salina hipertnica (5 ml de NaCl 3%), durante no mnimo 5 e no mximo 20 minutos, preferencialmente com nebulizador ultra-snico. A nebulizao fluidifica a secreo do pulmo, provoca uma irritao que leva tosse e facilita a expulso do escarro. Esse procedimento deve ser acompanhado por profissional treinado e em Unidade de Sade equipada com sala especial e cuidados de biossegurana para prevenir a contaminao do ambiente pelos aerossis formados. No pote de coleta deve constar a informao de que a coleta foi por induo, pois o material menos viscoso e semelhante saliva. Esse procedimento til para pacientes em controle de tratamento e pacientes com Aids. Segue as mesmas recomendaes de transporte e conservao para o escarro espontneo. Lavado brnquico ou broncoalveolar (LBA) so coletados sob orientao de equipe mdica especializada, durante o momento da explorao broncoscpica (broncofibroscpio), em frasco estril, com um volume de mais de 5 ml e transportados, temperatura ambiente, com o cuidado de manter a tampa bem fechada para no derramar. O tempo de transporte deve ser no mximo de 4 horas. ATENO: O broncofibroscpio deve ser esterilizado conforme indicao do fabricante para evitar contaminao entre pacientes .

Aspirado transtraqueal deve ser coletado o maior volume possvel em recipiente estril, por equipe mdica especializada. Transportar temperatura ambiente com o cuidado de manter o frasco bem fechado, num tempo inferior a 2 horas. Lavado gstrico a obteno desse material requer hospitalizao, pois coletado logo que o paciente acorda, antes mesmo de se levantar e comer. Indicado para crianas, pois essas deglutem o escarro. Considerado material respiratrio,

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Captulo 5 Amostras Clnicas

pois se faz induo do escarro, com sonda nasogstrica fina, injetando 10 a 15 ml de soro fisiolgico e, aps 30 minutos, feita lavagem gstrica. Coletar pelo menos duas amostras em dias consecutivos. Pode ser coletado em frasco estril contendo soluo tampo de carbonato de sdio a 10% para neutralizar a ao do suco gstrico e transportado temperatura ambiente em at 1 hora, em frascos bem fechados. Recomenda-se agendamento entre a instituio que realizar a coleta e o laboratrio, para que o laboratrio possa organizar-se e processar imediatamente o material. No item 5.12.2 do anexo deste captulo, o Quadro 2 resume as recomendaes tcnicas para as amostras de origem pulmonar.

5 .4 Amostras de origem extrapulmonar


As amostras a seguir so as mais freqentemente solicitadas para o diagnstico de tuberculose extrapulmonar 5,6,7: Urina um material rico em microbiota associada e o processamento deve ser executado o mais rapidamente possvel. Deve-se coletar toda a urina da primeira mico da manh em frasco estril, de boca larga, aps higiene ntima com gua e sabo neutro, com volume mnimo de 40 ml. Utiliza-se um nmero mnimo de trs e mximo de seis amostras, coletadas em dias consecutivos. Transportar com o cuidado de manter a tampa bem fechada para no derramar, temperatura ambiente num perodo mximo de 2 horas. Recomenda-se a organizao de um fluxo para que o laboratrio processe imediatamente o material. Lquido corporal assptico: pleural, peritoneal, sinovial, asctico, pericrdico esses materiais so coletados assepticamente por pessoal mdico, no maior volume possvel e colocados em frascos estreis. Transportar com o cuidado de manter o frasco bem fechado, num tempo de 15 minutos, temperatura ambiente. Lquido Cefalorraquidiano (LCR) o material indicado para o diagnstico de meningite tuberculosa. Deve ser coletado pelo mdico, por puno lombar, assepticamente, em um volume mnimo de 5 ml (volumes menores comprometem o rendimento da baciloscopia e da cultura). Transportar temperatura ambiente, em frasco bem fechado. Fragmentos de tecidos (bipsias) os materiais obtidos por disseco, ou seja, os fragmentos de tecidos (bipsias cutneas, de rgos e de ossos), secrees ganglionares e ndulos so coletados assepticamente por pessoal mdico, em frascos com gua destilada (ou soluo salina) estril. No utilizar conservantes ou fixadores como formol. Na suspeita de tuberculose pleural o fragmento de pleura deve ser coletado sempre que possvel, pois apresenta positividade superior a cultura do lquido pleural. Devem ser transportados temperatura ambiente

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num perodo de 15 minutos, em frascos bem fechados. Os raspados de pele ou de leses superficiais secas tm pouco valor no diagnstico de micobactrias, com rendimento de isolamento no satisfatrio e devem ser considerados somente em ltima instncia. Para o diagnstico de TB cutnea utiliza-se a bipsia cutnea, pois as micobactrias esto localizadas na hipoderme, obtida apenas pela realizao de uma bipsia profunda. Sangue a pesquisa de micobactrias no sangue est particularmente indicada nos casos de bacteremia, em pacientes imunodeficientes, por exemplo em pacientes com Aids. Se houver a disponibilidade do frasco de meio de cultura no momento e local da coleta, o sangue dever ser coletado sem anticoagulante, pois os meios de cultura lquidos j contm o anticoagulante na sua formulao. De preferncia utilizar meios de cultura que so incubados em sistemas semi-automatizados ou automatizados. Na impossibilidade de existir os meios de cultura no momento da coleta, o sangue dever ser coletado com anticoagulante (com exceo do EDTA) e levado ao laboratrio imediatamente. O uso de Sodium polyanethol sulfonate (SPS) recomendado por ser o anticoagulante menos txico para micobactrias (1,5 ml de SPS a 0,35% para 8,5 ml de sangue). Transportar temperatura ambiente (nunca refrigerar), com o cuidado de manter o frasco bem fechado. O sangue menstrual no mais utilizado para o diagnstico de tuberculose uterina, sendo a bipsia de endomtrio o material mais indicado. Medula ssea alm da amostra de sangue, o aspirado de medula ssea tem bom rendimento no isolamento de micobactrias de casos disseminados. Deve ser coletado o maior volume possvel, em seringa ou frasco estril, preferencialmente com anticoagulante (evitando o EDTA). No caso de fragmento, deve ser coletado e guardado em frasco com soro fisiolgico ou gua destilada estril. Em ambos no se deve usar conservante ou fixador. Transportar temperatura ambiente (nunca refrigerar), com o cuidado de manter o frasco bem fechado. Assim como o sangue, recomenda-se a semeadura direta no meio de cultura. Pus e secrees purulentas, aspirado de gnglios e de tumores secrees purulentas de pele, nariz, ouvido, olhos, garganta tambm podem ser utilizados para isolamento de micobactrias. Esses materiais quando provenientes de cavidade fechada so coletados atravs de puno, por pessoal mdico e so semeados diretamente em meio de cultura. Quando o material de cavidade aberta, geralmente coletado atravs de um swab, com cuidados especiais de no tocar nas bordas. Nesse caso, o swab deve ser imerso em gua destilada ou soluo salina, estreis. Transportar temperatura ambiente num perodo inferior a 2 horas.

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Captulo 5 Amostras Clnicas

Fezes para o caso de diagnstico de tuberculose intestinal, indicada a bipsia. A conduta de escolha a laparotomia, atravs da colonoscopia. A pesquisa de micobactrias em fezes apenas indicada para pacientes com Aids e deve ser criteriosamente avaliada pelo mdico. Coletar em frasco estril, sem conservantes ou fixadores e transportar temperatura ambiente num perodo menor de 1 hora e com o cuidado de fechar bem o pote. No item 5.12.3 do anexo deste captulo, o Quadro 3 resume as recomendaes tcnicas para as amostras de origem extrapulmonar.

5 .5 Solicitao de exames
As amostras clnicas encaminhadas ao laboratrio devem estar acompanhadas da solicitao de exames, que um formulrio com informaes teis tanto para quem est solicitando o exame como para o laboratrio que ir processar a amostra. As requisies devem estar preenchidas completa e corretamente e devem conter, no mnimo, os seguintes dados, que podem ser valorizados em diferentes etapas do processamento do exame3. Identificao do paciente: nome e sobrenome completos sem abreviao; data de nascimento para evitar confuso com homnimos; idade atual; nome da me; gnero; nmero do carto do SUS, endereo completo e telefone para contato. Local da consulta e registro: nmero do Cadastro Nacional de Estabelecimento de Sade (CNES), ambulatrio, hospital ou consultrio e registro do paciente (pronturio), nome e assinatura do solicitante. Informaes sobre o paciente: hiptese diagnstica, descrio objetiva dos achados clnicos significativos do local e caractersticas da infeco, dados epidemiolgicos relevantes do provvel local de infeco, dados importantes relacionados a processos invasivos (cirurgia, cateter, sonda vesical, dilise), uso de medicamentos (incio do tratamento), co-morbidades. Caracterizao da amostra: respiratria (trato respiratrio inferior) ou no respiratria (extrapulmonar), qual o stio e o tipo de via de obteno do material (puno, swab, raspado, drenagem, fstula), data da coleta. Aspectos fsicos da amostra: o escarro pode se apresentar como saliva, mucopurulento, sanguinolento ou liquefeito. Essas informaes auxiliam para uma boa interpretao do resultado. Natureza do exame solicitado: exame microscpico direto (baciloscopia) e/ou cultura; outros (identificao da espcie e teste de sensibilidade). O envolvimento do mdico ou de quem solicita o exame e o laboratrio til para ambos, facilitando a interpretao de resultados, propiciando melhor orientao tcnica e mais objetividade.

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Nos itens 1.9.2 e 1.9.4 dos anexos do Captulo 1 apresentamos modelos de solicitao de exames para baciloscopia e cultura para micobactrias incluindo espao para os resultados correspondentes e demais informaes.

5 .6 Consideraes gerais para coleta e armazenamento de amostras clnicas


O profissional responsvel pela coleta ser tambm responsvel pela identificao de forma legvel e correta do frasco que contm a amostra a ser encaminhada ao laboratrio. Esse profissional deve estar devidamente capacitado e seu conhecimento deve ser periodicamente atualizado para essa atividade. Deve saber que o material dever ser destinado, o mais brevemente possvel, ao laboratrio. Deve conhecer ou obter instrues sobre a conservao e/ou transporte do material caso esse no possa ser processado imediatamente3. Algumas consideraes gerais podem ser apontadas, principalmente no caso de solicitao de cultura. Coletar a amostra antes de iniciar o tratamento, preferencialmente. Instruir claramente o paciente sobre o procedimento da coleta. Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clnicos. Coletar uma quantidade suficiente de material para permitir uma completa anlise microbiolgica. Observar que a solicitao do exame contenha as informaes descritas no item 5.5 deste Captulo. Utilizar barreiras de proteo necessrias a cada procedimento. Tratar toda amostra como potencialmente patognica. Usar frascos apropriados a cada tipo de coleta e de amostra. No manusear a amostra em trnsito (durante o transporte). No contaminar a superfcie externa do frasco de coleta e verificar se est firmemente vedado (caso ocorram respingos ou contaminao na parte externa do frasco, fazer descontaminao com Soluo de Fenol a 5%. No contaminar a requisio mdica que acompanha o material. Colocar a identificao no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rtulos. ATENO: Infeces ps-cirrgicas conseqentes de cirurgias estticas, procedimentos cirrgicos-endoscpicos ou procedimentos transcutneos em cavidades ou tecidos estreis que atinjam dois ou mais pacientes podem caracterizar casos de surtos de MNT de crescimento rpido . As manifestaes clnicas podem ser infeces de pele e subcutneas que se apresentam como abscessos frios

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Captulo 5 Amostras Clnicas

e/ou piognicos, com reao inflamatria aguda e supurao, ou evoluo crnica ou com ndulos; ulceraes nos portais de entrada de cnulas ou laparoscpios; fistulizaes; abscessos com secrees com manifestao at um ano aps o ato cirrgico . As amostras clnicas utilizadas para identificao da micobactria, no caso de surtos, devem ser exsudatos de abscessos e fragmentos de tecidos, coletados atravs de puno e/ou bipsia e colocado em soro fisiolgico ou gua destilada estril . Manter sob refrigerao e no colocar em formol . No utilizar tecido externo ou material coletado com swab . Recomenda-se no fazer punes repetidas, para evitar contaminaes e infeces cruzadas8 . O encaminhamento de amostras imediatamente aps a coleta assegura a sobrevivncia e isolamento do microrganismo, evitando o contato prolongado das micobactrias com a microbiota associada. Observar a rotina de encaminhamento ao laboratrio, quanto ao horrio de envio e sempre que houver uma situao especial, consultar o laboratrio antes de enviar. Os cuidados de acondicionamento e transporte esto descritos no Captulo 3.

5 .7 Orientaes para coleta de escarro espontneo


De acordo com as recomendaes da OMS devem ser coletadas duas amostras de escarro de cada paciente para aumentar as chances de se obter um resultado positivo, uma vez que a quantidade de bacilos no escarro varivel9. A primeira amostra deve ser coletada quando o paciente sintomtico respiratrio procurar o atendimento na Unidade de Sade, para aproveitar a presena dele e garantir a realizao do exame laboratorial. No necessrio estar em jejum, porm importante que a boca esteja limpa e sem resduos de alimentos. Uma boa amostra de escarro consta de material proveniente da rvore brnquica, e contm quantidades mnimas de material originado no nariz e na boca. A segunda amostra deve ser coletada na manh seguinte, assim que o paciente despertar. Essa amostra, geralmente mais rica em bacilos porque composta da secreo acumulada na rvore brnquica por toda a noite. O paciente deve estar em jejum e realizar bochecho com gua para a retirada de resduos da orofaringe. Recomenda-se que as amostras sejam coletadas em locais abertos, de preferncia ao ar livre. Se a coleta for realizada em uma sala, esta dever ser arejada, tendo as janelas abertas para reduzir a concentrao de partculas infectantes, os ncleos de Wells (partculas de 1 a 5 m com 1 a 2 bacilos, que ficam suspensas no ar). A porta dever permanecer fechada durante a coleta, dessa forma o fluxo de ar ser direcionado para fora do ambiente atravs da janela.

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Para que a qualidade do material seja satisfatria necessria que contenha material mucopurulento. Isto mais importante que o volume. Em condies ideais uma amostra de escarro deve ter um volume de 5 a 10 ml, porm so aceitveis amostras menores se a qualidade satisfatria. As amostras coletadas para o controle do tratamento devem ser examinadas independentemente da qualidade e quantidade. E deve persistir durante todo o perodo que o paciente esteja recebendo a medicao. Outro aspecto importante que influencia na qualidade da amostra de escarro espontneo a maneira como o profissional transmite essas instrues e a compreenso destas pelo paciente. Alm do contedo falado fundamental a linguagem no-verbal: dirigir-se ao paciente pelo nome, cumpriment-lo, aproximar-se para atend-lo, manter contato visual quando a ele se dirigir ou quando este se dirigir ao profissional, concentrar-se no paciente e manter a fisionomia receptiva. O profissional de sade dever ter sempre a preocupao de avaliar a compreenso das informaes dadas, mudando a linguagem quando necessitar repetir a orientao, alm de sempre deixar espao para que o paciente possa fazer perguntas10. Antes de iniciar as orientaes, o profissional deve reunir todo o material necessrio, bem como verificar se a tampa do pote fecha bem e se o mesmo est devidamente identificado (nome e data da coleta) no corpo do pote. A seguir esto os passos para orientar o paciente a coletar uma boa amostra de escarro10. Explicar a importncia do exame para o paciente utilizando termos claros e de fcil entendimento. Fornecer ao paciente a orientao e simulao da tcnica de coleta utilizando para isso o pote, aproveitando este momento para indicar a quantidade a ser coletada. Orientar o paciente a inspirar profundamente, retendo por alguns instantes o ar dos pulmes. Orientar o paciente a tossir e escarrar diretamente no pote. Orientar a repetir esse procedimento por trs vezes, at atingir a quantidade necessria ao exame (5 a 10 ml), tendo o cuidado para que o material no escorra por fora do pote. Orientar o paciente a tampar o pote rosqueando-o firmemente. Entregar ao paciente o pote para a coleta (identificado), junto com um papeltoalha (ou papel higinico). Indicar ao paciente o local da coleta. Aps a coleta o paciente deve levar o pote at o profissional de sade, que deve verificar a quantidade e a qualidade da amostra, sem abrir o pote. Caso a quantidade seja insuficiente, deve-se pedir para o paciente repetir a operao at obter uma amostra adequada. Ao final, o paciente deve lavar as mos.

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Captulo 5 Amostras Clnicas

Nos itens 5.12.6 e 5.12.7 do anexo deste captulo apresentamos modelos de cartazes com as orientaes para coleta de amostras de escarro espontneo. Recomendamos que o cartaz da coleta da 1 amostra esteja afixado nas Unidades de Sade e que o da 2 amostra seja impresso e entregue ao paciente.

5 .8 Instrues para coleta de escarro induzido


Quando o paciente no consegue coletar normalmente (espontaneamente) o escarro, porque no consegue expelir o escarro ou tem pouca secreo, recomenda-se a obteno de uma amostra de escarro atravs de induo. A tcnica consiste na nebulizao com soluo salina hipertnica (5 ml de NaCl 3 5%), preferencialmente com nebulizador ultra-snico, em uma sala especial que atenda s normas de biossegurana e o profissional que executa a tcnica deve estar habilitado para tal. Os pacientes devem ser rigorosamente agendados com intervalos mnimos de uma hora. Seguir as orientaes padronizadas para coleta de escarro e envio ao laboratrio. Para obteno da soluo a 3%, utilizar o seguinte recurso: usar 5 ml de Soro Fisiolgico 0,9% + 0,5 ml de NaCl 20%. No utilizar soluo preparada com gua destilada e NaCl pois pode causar broncoespasmo, dificultando ainda mais a expectorao11. A tcnica de induo do escarro um procedimento com melhor relao custobenefcio para o diagnstico da TB pulmonar com escarro negativo, sendo seu uso recomendado, sempre associado com a baciloscopia e a cultura para micobactrias, precedendo a mtodos invasivos, como a broncofibroscopia11.

5 .9 Recepo de amostras no laboratrio


O laboratrio no deve ter horrio restrito para recepo de amostras. O profissional responsvel pela rotina de recebimento dever utilizar equipamentos de proteo individuais (EPI) ao receber as amostras. Na recepo, junto com o profissional que trouxe a amostra, importante verificar as seguintes observaes. Comprovar se as amostras esto bem identificadas e correspondem s requisies enviadas. Proceder o registro de cada amostra no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial (GAL) e no Registro de Baciloscopia e/ou Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade, anotando as caractersticas de cada amostra, principalmente as amostras de escarro, de acordo com o item 5.5 deste Captulo. Informar o prazo de entrega do resultado de acordo com o exame solicitado. Se houver deficincias que podem influenciar a qualidade e/ou quantidade da amostra e a forma em que foram enviadas, registrar e comunicar Unidade de

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Sade remetente para esclarecimentos sobre as condies da amostra e solicitar nova coleta, quando necessrio. Recomenda-se que nenhuma amostra clnica seja desprezada, mesmo em situaes em que haja problemas referentes qualidade, quantidade e forma de envio, sem o prvio conhecimento do paciente e do solicitante do exame, salvo em caso de acidente (que tambm deve ser notificado). Notificar o servio que enviou as amostras sobre quaisquer problemas referentes qualidade, quantidade e forma de envio.

5 .10 Controle de qualidade


5 .10 .1 Recebimento de amostras O recebimento criterioso de amostras pelo laboratrio garante uma melhor correlao clnico/laboratorial. Esses critrios devem ser respeitados desde a recepo at o processamento das amostras3. Cada tipo de amostra requer especiais condies de coleta, frascos apropriados, conservao e transporte. Nos quadros apresentados nos itens 5.12.2 e 5.12.3 do anexo deste captulo esto as principais amostras pulmonares e extrapulmonares, solicitadas para o diagnstico de micobactrias e as caractersticas especiais de cada uma delas. Algumas situaes so comuns na rotina dos laboratrios, como a chegada de amostras no identificadas, com tempo prolongado de transporte, frascos no apropriados, frascos quebrados ou com vazamento, amostras no prprias para a hiptese clnica. Sempre que esses problemas forem encontrados, importante informar o local de origem e solicitar esclarecimentos, registrar a ocorrncia e as providncias tomadas em cada situao. Essas prticas asseguram a qualidade dos exames realizados. No item 5.12.7 apresentamos um formulrio para registro das inadequaes encontradas no recebimento das amostras clnicas e as providencias tomadas para solucionar o problema. 5 .10 .2 Aspectos fsicos do escarro O escarro contm partculas slidas ou purulentas produzidas pelos pulmes, que so expelidas junto com a tosse, e a Figura 2 mostra como elas podem se apresentar como saliva, mucopurulento, sanguinolento e liquefeito12. Recomenda-se no deixar o escarro por muito tempo temperatura ambiente, pois isso pode torn-lo liquefeito, com aspecto muco-coloidal ou aguado. Normalmente, a parte sanguinolenta contm menos bacilos porque o sangue contata pouco tempo a leso. A saliva e o muco nasal no so boas amostras para serem examinadas, mas no devem ser desprezadas, pois existe a possibilidade de que se encontrem bacilos.

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Captulo 5 Amostras Clnicas

Figura 2

Aspectos fsicos do escarro

Fonte:

(A) saliva (B) mucopurulento (C) sanguinolento (D) liquefeito Adaptado de Fujiki A. AFB Microscopy Training. Tokyo, Japan: The Research Institute of Tuberculosis, 2005.

5.10.3 Qualidade das amostras de escarro espontneo4 Para avaliar a qualidade das amostras de escarro espontneo recebidas para diagnstico e a necessidade ou no de capacitar o tcnico que orienta o paciente para a coleta, importante calcular o seguinte indicador: percentual das amostras com aspecto de saliva, no perodo em avaliao. recomendado fazer essa avaliao trimestralmente e a fonte dos dados o sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL e Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade. O mtodo de clculo :
N de amostras de escarro recebidas com aspecto de saliva em determinado perodo X 100 Total de amostras recebidas no laboratrio no mesmo perodo

Para interpretar o resultado, o parmetro utilizado 15%. Um percentual maior do que 15% pode indicar que no esto sendo dadas as orientaes adequadas para a coleta de escarro ou que os pacientes s conseguem produzir amostras com aspecto de saliva. Enquanto que um percentual igual ou menor do que 15% indicam que as amostras esto sendo coletadas adequadamente. Exemplo: No perodo de 2 de janeiro a 2 de abril do ano corrente, foram recebidas 400 amostras de escarro para diagnstico com aspecto de saliva. O nmero total de amostras recebidas para diagnstico, no mesmo perodo, foi de 1440. Fazendo o clculo, o percentual foi de 27,7%. Nesse caso, as possveis causas para um valor acima de 15% podem ser: orientao inadequada ao paciente para a coleta de escarro ou o estgio da doena inicial ou o paciente tem pouca expectorao (paciente HIV/Aids) ou amostras coletadas por induo. Para corrigir necessrio treinar o tcnico responsvel pela orientao ao

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paciente e/ou melhorar as instrues fornecidas por escrito. Lembrar de no incluir no clculo as amostras de escarro coletadas por induo.

5 .11 Referncias
1 SEIC/Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica. 2005. Procedimientos em Microbiologia Clnica. Micobactrias. Parte 9. Disponvel em http://www.seimc.org/protocolos/microbiologia. (consulta 25.09.05). MILLER, J.M.; HOLMES, H.T.; KRISHER, K. General Principles of Specimen Collection and Handling. In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.- USA. 2003. BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA). Procedimentos Laboratoriais: da Requisio do Exame Anlise Microbiolgica. Mdulos III, IV e VI. 2005. BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001. ATS/American Thoracic Society. Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in Adults and Children. Am J. Respir Crit Care Med, vol 161, p. 1376-1395. 2000. PFYFFER, G.E.; BROWN-ELLIOT, B.A.; and WALLACE, Jr. R.J. Mycobacterium: General Characteristics, Isolation, and Staining Procedures. Chapter 36, p. 532-559. In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.-USA, 2003. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3 Edio comemorativa. Rio de Janeiro. 2005. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Nota Tcnica N 2/DEVEP/SVS/MS: Ocorrncia de surtos de infeces por Mycobacterium no tuberculosis ps-cirgicas no Rio de Janeiro/RJ. Disponvel em: http://portal.saude.gov.br/SAUDE. WHO/ World Health Organization. Laboratory Services in tuberculosis control. PartIII: Culture. Geneva, Switzerland, WHO/TB/98.258. 1998. CENTRO DE VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA PROF. ALEXANDRE VRANJAC. Diviso de Tuberculose. Manual de orientao para coleta de amostras de escarro e outros materiais para baciloscopia e cultura para diagnstico e controle da tuberculose. So Paulo, 26p. 2002. SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA. II Diretrizes Brasileiras para a Tuberculose. J Bras Pneumol; 30 (Supl 1). 2004. FUJIKI, A. AFB Microscopy Training. Good Quality Smear Examination makes a Good Quality TB Control Programme Tokyo, Japan: The Research Institute of Tuberculosis. 2005.

5 6

9 10

11 12

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5 .12 Anexos do captulo

5 .12 .1 Quadro 2 Recomendaes Tcnicas para Amostras de Origem Pulmonar


COLETA ORIENTAO
pote plstico, tampa de rosca, boca larga (50 mm dimetro), capacidade para 35 a 50 ml, descartvel volume 5 a 10 ml pote plstico, tampa de rosca, boca larga (50 mm dimetro), capacidade para 35 a 50 ml, descartvel volume 5 a 10 ml 2 horas temperatura ambiente abrigo da luz 7 dias 4C 2 horas temperatura ambiente abrigo da luz 7 dias 4C

AMOSTRAS DE ORIGEM PULMONAR TEMPO E TEMPERATURA RECIPIENTE TRANSPORTE ARMAZENAMENTO COMENTRIOS


- 1 amostra coletada na Unidade de Sade, no momento da consulta - 2 amostra coletada na manh seguinte ao despertar - coletar em 2 dias consecutivos - indicado quando o paciente tem pouca secreo ou no consegue expelir - a nebulizao fluidifica a secreo do pulmo e provoca irritao que leva tosse e expulso do escarro - amostra menos viscosa e semelhante saliva - escrever no pote escarro induzido

TIPO DE AMOSTRA

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Escarro espontneo -

lavar a boca / bochechos local arejado, ar livre abrir o pote forar a tosse: inspirar profundamente, prender a respirao, escarrar no pote

Escarro induzido

- sala equipada com cuidados de biossegurana para evitar contaminao do ambiente. - acompanhamento de tcnico treinado. - dia anterior ingerir muito lquido - nebulizao com soluo salina hipertnica a 3%, durante 5 a 20 minutos. - seguir as mesmas instrues do escarro espontneo 2 horas temperatura ambiente abrigo da luz 24 horas 4C -

Lavado Brnquico Escovado Brnquico Lavado Broncoalveolar (LBA) Aspirado transtraqueal bipsias 1 g de tecido ou 3 a 4 mm sonda gstrica frasco estril volume 50 ml 2 horas, temperatura ambiente abrigo da luz 15 minutos temperatura ambiente ou neutralizar em 1 hora de coleta

- sob orientao mdica frasco estril prprio - uso de broncofibroscpio volume mnimo 5 ml - uso de substncia anestsica letal para micobactria - sala deve ter cuidados de biossegurana para evitar contaminao do ambiente

procedimento invasivo processar imediatamente esterilizar o broncofibroscpio anestsico inibe o crescimento bacteriano evitar a contaminao com o trato respiratrio superior - coleta da secreo aps o uso do aparelho pode ser recolhida at 2 dias depois 24 horas, temperatura ambiente > 24 horas, congelar 4 horas 4C - processar imediatamente - evitar o ressecamento

Fragmentos de - sob orientao mdica tecidos pulmonares - usar soluo fisiolgica ou gua destilada - no usar formol

Lavado gstrico

- jejum de 8 a 10 horas - colhido logo ao acordar, antes de levantar. - crianas antes de ver a me para evitar deglutio pelo estmulo visual - realizado com sonda nasogstrica fina, introduzida pela boca ou nariz - injeta 10 a 15 ml de soluo fisiolgica - aps 30 minutos faz lavagem gstrica

- requer hospitalizao - crianas: 40% de positividade com evidncia da doena ao RX - neutralizar o suco gstrico com carbonato de sdio 1 mg/1ml de lavado gstrico - 2 dias consecutivos - laboratrio deve processar em at 4 horas

Captulo 5 Amostras Clnicas

Fonte:

Adaptado de Miller, J. M.; Holmes, H. T.; Krisher K. General Principles of Specimen Collection and Handling. In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.-USA. 2003.

5 .12 .2 Quadro 3 Recomendaes Tcnicas para Amostras de Origem Extrapulmonar


COLETA ORIENTAO - frasco estril de boca larga com tampa de rosca - volume mnimo de 40 ml - frasco estril - volume mnimo 5 ml - frasco estril - volume 10 ml 15 minutos temperatura ambiente 15 minutos temperatura ambiente 15 minutos temperatura ambiente 2 horas temperatura ambiente 24 horas temperatura ambiente 24 horas temperatura ambiente 24 horas temperatura ambiente 24 horas temperatura ambiente 15 minutos temperatura ambiente 24 horas temperatura ambiente 2 horas temperatura ambiente 4 horas, ou centrifugar e armazenar precipitado neutralizado refrigerar 4C RECIPIENTE TRANSPORTE ARMAZENAMENTO COMENTRIOS - material rico em microbiota associada - no aceitar pool de amostras colhidas em 24 horas - no aceitar volumes inferiores a 40 ml - coletar 3 a 6 amostras em dias consecutivos - material estril - suspeita de meningite tuberculosa - coleta em hospitais - lquidos orgnicos estreis - coletados em hospitais ou clnicas especializadas - podem ser estreis ou no - bipsia de pleura tem positividade maior - amostras de pele devem ser incubadas em temperaturas diferentes - podem ser estreis ou no - bipsia de pleura tem positividade maior do que o liquido pleural - nunca refrigerar - para os casos de micobactrias disseminadas - no usar EDTA como anticoagulante TEMPO E TEMPERATURA

AMOSTRAS DE ORIGEM EXTRAPULMONAR

TIPO DE AMOSTRA

Urina

- aps higiene com gua e sabo neutro - toda a urina da 1 mico da manh - levar imediatamente ao laboratrio

Lquido - realizada por procedimento mdico Cefalorraquidiano - recomendado jejum (LCR) - puno lombar

Lquido pleural - realizada por procedimento mdico Lquido sinovial - puno pela via percutnea ou Lquido peritoneal cirrgica - no usar conservantes ou fixadores - frascos estreis - no usar formol

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Fragmentos - realizada por procedimento mdico cutneos e sseos - usar soluo fisiolgica ou gua destilada - frascos estreis - no usar formol - puno venosa - inocular diretamente em frasco de meio de cultura - ou frasco estril - frasco estril - swab imerso - pote de boca larga - sem conservante

Fragmentos de rgos

- realizada por procedimento mdico - usar soluo fisiolgica ou gua destilada

Sangue e Aspirado de medula

- para o aspirado de medula, a coleta deve ser por equipe mdica - com anticoagulante (SPS)

Pus e secrees

- de cavidades fechadas: por puno - de cavidades abertas: com swab

2 horas temperatura ambiente 1 hora temperatura ambiente

24 horas temperatura ambiente 24 horas refrigerar 4C

- de preferncia aspirar ou passar o swab na parte mais profunda da leso - avaliao criteriosa pelo mdico - indicada para pacientes com Aids

Fezes

- de preferncia, antes da medicao

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 141

\Fonte:

Adaptado de Miller, J. M.; Holmes, H. T.; Krisher K. General Principles of Specimen Collection and Handling. In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.-USA. 2003.

Captulo 5 Amostras Clnicas

5 .12 .3 Orientaes para coleta de escarro 1 amostra Coleta da primeira amostra na unidade de sade 1. 3. 2. 4. lave a boca fazendo bochechos com bastante gua. No precisa estar de jejum; abra o pote fornecido pela unidade de sade. fique sozinho em um local arejado, de preferncia ao ar livre;

force a tosse, do seguinte modo: a) inspire profundamente, isto , puxe o ar pelo nariz e fique com a boca fechada; prenda a respirao por alguns instantes e solte o ar lentamente pela boca. Faa isso mais duas vezes.

b)

inspire profundamente mais uma vez, prenda a respirao por alguns instantes e solte o ar com fora e rapidamente pela boca;

c)

inspire profundamente mais uma vez, prenda a respirao por alguns instantes e, em seguida, force a tosse para poder liberar o escarro que est dentro do pulmo.

5.

escarre diretamente dentro do pote. Cuidado para o escarro no escorrer por fora;

6. 7.

repita as orientaes 4 e 5 por mais duas vezes, at conseguir uma quantidade maior de amostra; feche firmemente, proteja da luz solar, carregue sempre com tampa voltada para cima e entregue o pote para o profissional que orientou voc.

Fonte:

Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

5 .12 .4 Orientaes para Coleta de Escarro 2 amostra Coleta da segunda amostra Para coletar a segunda amostra importante que voc: 1. no dia anterior coleta a) beba no mnimo 8 copos de lquidos (gua, refrescos). A gua ajuda a soltar o escarro que est no pulmo; b) durma sem travesseiro. Isso tambm facilita a sada do escarro do pulmo, na hora da coleta.

2.

no dia da coleta e assim que despertar a) lave a boca fazendo bochechos com bastante gua e, em jejum, force a tosse e escarre dentro do pote, seguindo as mesmas orientaes da coleta da primeira amostra; b) feche firmemente, coloque num saco plstico, proteja da luz solar, carregue sempre com a tampa voltada para cima e leve o pote imediatamente para o laboratrio ou unidade de sade. leve tambm a requisio mas fora do saco plstico onde est o pote.

c)

Fonte:

Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 143

Captulo 5 Amostras Clnicas

5 .12 .5 Formulrio de registro de inadequaes no recebimento de amostras clnicas


Formulrio de Registro de Inadequaes no Recebimento de Amostras Clnicas
Identificao
Data de Entrada no Laboratrio: __________/__________/__________ Unidade de Sade: Telefone: Horrio da entrada: N Geral:

Nome do Paciente:

Telefone:

Responsvel na Recepo:

Responsvel no Laboratrio:

Motivo da No Conformidade

Erros de Identificao
Discrepncia entre a identificao da amostra e a requisio

Amostras Inadequadas
Tempo prolongado de transporte

Falta de identificao da amostra

Conservao inadequada (temperatura)

Origem da amostra no identificada

Amostra no prpria para a hiptese clnica

Tipo de amostra no identificada

Frascos no apropriados

Exame a ser realizado no identificado

Frascos quebrados ou com vazeamento

Outro: Providncias tomadas

Outro:

Data:

Responsvel:

144 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

CAPTULO 6

BACILOSCOPIA

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

6 .1 Descrio
A baciloscopia ou exame microscpico a pesquisa de Bacilo lcool-cido Resistente (BAAR) em um esfregao de amostra clnica, preparado e corado com metodologia padronizada1. Apesar dos avanos tecnolgicos na micobacteriologia, a baciloscopia, corada pelo mtodo de Ziehl Neelsen e seguindo tcnica padronizada de observao ao microscpio de campo claro, mesmo sendo um mtodo de simples execuo, continua sendo particularmente importante no combate da tuberculose por ser de baixo custo e por detectar casos bacilferos, ou seja, casos infecciosos de tuberculose pulmonar, responsveis pela manuteno da cadeia de transmisso1. Dessa forma, no Brasil, para o diagnstico laboratorial dos pacientes sintomticos respiratrios (SR) que procuram os servios de sade com tosse e expectorao h mais de trs semanas e constituem os casos suspeitos de tuberculose, importante a realizao da baciloscopia visando detectar os casos infecciosos de tuberculose pulmonar. No ano de 2005, 64% dos casos novos notificados com tuberculose pulmonar apresentaram baciloscopia positiva2. A baciloscopia de controle indicada para acompanhar a eficcia do tratamento atravs da reduo bacilar e/ou negativao do escarro em exames mensais, independentemente do volume da secreo. A baciloscopia geralmente considerada um procedimento de diagnstico com baixa sensibilidade, sendo descrita numa faixa entre 25% a 65% quando comparada com a cultura. O que geralmente no considerado, entretanto, que a sensibilidade da baciloscopia varia com o tipo de leso, o tipo e nmero de amostras, a ateno e persistncia do microscopista. Porm, quando esses fatores so levados em considerao, o diagnstico bacteriolgico da tuberculose pulmonar pela baciloscopia identifica os casos de TB que so fontes de infeco para a comunidade, com uma sensibilidade de aproximadamente 90% 2. O nmero mnimo de Bacilos lcool-cido Resistente (BAAR) necessrio para produzir um esfregao com resultado positivo tem sido estimado entre 5000 a 10000 por mililitro, conforme descrito no Quadro 13.

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Captulo 6 Baciloscopia

Quadro 1

Nmero de BAAR observados nas baciloscopias, concentraes de bacilos cultivveis nos escarros e probabilidade de resultados positivos
CONCENTRAO ESTIMADA DE BACILOS POR ML DE ESCARRO Menos do que 1000 5000 10000 Aproximadamente 30000 Aproximadamente 50000 Aproximadamente 100000 Aproximadamente 500000 PROBABILIDADE DE UM RESULTADO POSITIVO Menos do que 10% 50% 80% 90% 96,2% 99,95%

NMERO DE BACILOS OBSERVADOS 0 em 100 ou mais campos 1 2 em 300 campos 1 9 em 100 campos 1 9 em 10 campos 1 9 por campos 10 ou mais por campo
Fonte:

David HL. Bacteriology of mycobacterioses. US Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, Communicable Disease Centre, Atlanta, USA, 1996.

O escarro de pacientes com tuberculose pulmonar particularmente aqueles com leso cavitria muitas vezes contm um grande nmero de BAAR que facilmente detectado pela microscopia direta. A sensibilidade da baciloscopia pode ser melhorada pela realizao de mais de uma amostra por paciente. Muitos estudos tm mostrado que, quando realizadas duas baciloscopias, detectam-se, em mdia, mais de 90% dos casos infecciosos de TB, nos pases de baixa e alta prevalncia. Nesse caso, o incremento mostrado tem sido de 80 a 82% a partir da primeira, 10 a 14% a partir da segunda e 5 a 8% a partir da terceira baciloscopia2.

6 .2 Mtodos de execuo do esfregao


Nesse manual, sero descritos dois mtodos de execuo do esfregao: o mtodo da baciloscopia direta e o mtodo da baciloscopia com concentrao da amostra clnica. O primeiro mtodo utiliza escarro sem tratamento prvio e recomendado pelo Ministrio da Sade para o diagnstico laboratorial de todos sintomticos respiratrios. No segundo, o esfregao realizado aps tratamento da amostra clnica paucibacilar, e recomendado para o diagnstico laboratorial da tuberculose extrapulmonar, da tuberculose infantil, da tuberculose nos pacientes portadores do vrus HIV e Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (SIDA). Na rotina laboratorial, a baciloscopia realizada, na maioria das vezes, com escarro espontneo, utilizando a poro mais purulenta que colocada e distendida diretamente sobre a lmina baciloscopia direta. As secrees purulentas e o pus, por suas caractersticas fsicas, tambm podem ser distendidos diretamente sobre a lmina. Por outro lado, com o objetivo de aumentar a sensibilidade da baciloscopia, todas as amostras clnicas, sempre que possvel e, de acordo com a necessidade, podem receber tratamento antes da realizao do esfregao. Esse tratamento pode ser: tritura-

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o, digesto com agentes qumicos tais como um Hidrxido de sdio ou hipoclorito, concentrao, sedimentao, flotao ou mesmo filtrao4. 6 .2 .1 Mtodo de execuo do esfregao para baciloscopia direta1,6,7 Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana, tais como as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequado, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um pote de cada vez e com cuidado para evitar a formao de aerossis. Utilizar a poro mais purulenta do escarro para evitar resultados falso-negativos e utilizar lminas sem prvio uso para evitar resultados falso-positivos. Realizar no mximo 12 amostras de cada vez e manter a rea de trabalho com iluminao adequada para evitar a troca de amostras. Materiais Equipamentos Bico de Bunsen. Reagentes Soluo de lcool a 70% Soluo Fenol a 5%. As frmulas e o preparo dos reagentes acima esto descritos nos anexos do Captulo 3. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. 2 Bandejas de metal. Pina anatmica com pelo menos 12 cm, ponta arredondada e internamente serrilhada. Palito de madeira. Lpis de grafite. Lminas de vidro para microscopia de 26 x 76 mm, espessura de 1,2 a 1,4 mm, com borda fosca. Recipiente com tampa contendo pedaos de gaze. Recipiente de vidro com tampa para colocar as lminas imersas em lcool etlico. Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte.

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Captulo 6 Baciloscopia

Procedimentos de organizao 1. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver respingos. 2. Providenciar e organizar na bancada os materiais necessrios para preparar o esfregao. 3. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro. Manter o papel-toalha e o frasco com Soluo de Fenol a 5%, mo na bancada, para desinfeco se houver respingos, conforme descrito no Captulo 3. 4. Forrar as duas bandejas de metal com papel absorvente. Colocar uma delas na bancada sua frente. Ela ser sua rea de trabalho. A segunda bandeja colocar ao lado direito prximo ao bico de Bunsen, para colocar as lminas com esfregao para secar. 5. Colocar as amostras clnicas de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da bandeja de metal a sua frente. 6. Verificar se as lminas a serem utilizadas esto limpas e no foram usadas previamente. As lminas arranhadas podem reter a Fucsina e simular a presena dos bacilos. A limpeza da lmina nova necessria, pois freqentemente elas vm de fbrica, engorduradas pelo polimento. Nesse caso, preciso: a) Lavar essas lminas com gua e detergente neutro, enxagu-las bem e depois coloc-las imersas em um recipiente com lcool etlico. b) Secar com gaze as lminas que vo ser utilizadas. 7. Identificar com o nmero de registro de cada amostra clnica cada lmina. Para isso, escrever, com grafite, na borda fosca da lmina o mesmo nmero colocado no corpo do pote. 8. Colocar em cima da bandeja de metal somente o pote da amostra que ser processada. 9. Colocar a lmina sobre a bandeja de metal. 10. Colocar o bico de Bunsen entre o tcnico e a rea de trabalho, tomando cuidado com a chama. Procedimentos de realizao 1. Retirar lentamente a tampa da amostra para evitar a formao de aerossis e colocar suavemente virada para cima, na bandeja. 2. Quebrar ao meio um palito de madeira. 3. Retirar, com as duas pontas farpadas do palito, a partcula maior e mais purulenta da amostra e depositar na lmina. Conforme Figura 1. Quando existirem apenas pequenas partculas purulentas ou mucosas, pegar trs pores ou mais da amostra, deposit-las na lmina e homogeneiz-las com a ponta do palito.

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Figura 1

Exemplo de retirada da partcula da amostra de escarro e colocao na lmina

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

4.

Distender a amostra, at o extremo oposto da lmina com uma das partes do palito em posio horizontal. Com o palito na mesma posio, fazer movimentos de vai e vem em cima da amostra at obter um esfregao homogneo que cubra 2/3 da lmina, sem deixar espaos vazios. Conforme Figura 2. Preparo do esfregao

Figura 2

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

Obs .: No aquecer a lmina durante a preparao do esfregao . Esse procedimento uma fonte importante de formao de aerossis no ambiente laboratorial e, alm disso, produz precipitados granulosos que prejudicam a colorao e a deteco do bacilo4 . 5. 6. Descartar as duas partes do palito, na caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados. Colocar a lmina com o esfregao voltado para cima, para secar em temperatura ambiente, na bandeja de metal que est a direita, prximo do bico de Bunsen.

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Captulo 6 Baciloscopia

7.

8. 9.

Fechar bem o pote da amostra. Os potes com as amostras j processadas devem ficar armazenadas a temperatura de 2 e 8C, at a liberao dos resultados, para o caso de ser necessrio repetir a baciloscopia ou realizar a cultura. Repetir os passos de 1 a 7, at processar todas as amostras. Depois de secas, fixar as lminas, uma de cada vez, no bico de Bunsen conforme descrito no item 6.3 deste captulo. ATENO: Fixar o esfregao somente quando as lminas estiverem completamente secas, conforme descrito no item 6 .3 deste captulo .

10. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3. 6 .2 .2 Mtodo de Execuo do Esfregao para Baciloscopia aps Concentrao da Amostra Clnica1 Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequados conforme descrito no Captulo 3. Realizar os procedimentos de manipulao da amostras em Cabine de Segurana Biolgica (CSB). Utilizar centrfuga com rotores e adaptadores de tubos (caapas) com tampa de proteo contra disperso de aerossis. Observar a capacidade da centrfuga para estabelecer o nmero de tubos a serem trabalhados a cada lote. A centrfuga deve ser preferencialmente refrigerada para evitar que o aquecimento interfira na viabilidade da micobactria, no caso da amostra ter tambm indicao de cultura. Abrir as caapas da centrfuga dentro da CSB. Abrir um pote de cada vez e com cuidado para evitar a formao de aerossis. Utilizar lminas sem prvio uso para evitar resultados falso-positivos. ATENO: As amostras clnicas que alm da indicao para baciloscopia tambm tiverem indicao de cultura, realizar a manipulao das amostras clnicas e execuo do esfregao conforme descrito no Captulo 7 . Materiais Equipamentos CSB.

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Centrfuga com rotor para tubos de 15, 30 ou 50 ml. Agitador mecnico. Pipetador automtico ou manual. Cronmetro.

Reagentes Soluo de Hidrxido de sdio a 4%. gua destilada estril. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. A frmula e o preparo da soluo de Hidrxido de sdio a 4% est descrita nos anexos do Captulo 7 e a frmula e o preparo da Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do Captulo 3. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Pina anatmica com pelo menos 12 cm, ponta arredondada e internamente serrilhada. Palitos de madeira. Bandeja de metal. Lpis de grafite. Lminas de vidro para microscopia de 26 x 76 mm, espessura de 1,2 a 1,4 mm, com borda fosca. Tubos de centrfuga de polipropileno, estreis, descartveis, com fundo cnico, de 15, 30 ou 50 ml com tampa de rosca. Estante para os tubos de 15, 30 ou 50 ml. Pipetas Pasteur estreis. Recipiente com tampa com pedaos de gaze estril. Recipiente de vidro com tampa para colocar as lminas imersas em lcool etlico. Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num volume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado

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Captulo 6 Baciloscopia

boca de um frasco Erlenmeyer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca estreita). Procedimentos de organizao 1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica no tubo de centrfuga e na lmina, conforme descrito no item 6.2.1. deste manual. 2. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11. Realizar o procedimento 3 fora da CSB 3. Organizar os potes das amostras, observando a correspondente identificao do nmero de registro no corpo do pote, no tubo de centrfuga e na lmina. Colocar os tubos de centrfuga na estante. Realizar os procedimentos de 4 a 6 dentro da CSB. 4. Organizar os materiais que sero utilizados na CSB conforme descrito no Captulo 11. 5. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. 6. Colocar as amostras de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da bandeja. Procedimentos de realizao Realizar os procedimentos de 1 a 7 dentro da CSB 1. Colocar em cima da bandeja de metal somente o pote da amostra que ser processada. 2. Se a amostra clnica tiver indicao somente para baciloscopia, transferir a amostra para o tubo de centrfuga de 15 ml, deixando escorrer suavemente o escarro pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso escorra o material para fora do tubo, limpar com gaze embebida na Soluo de Fenol a 5%. 3. Colocar o tubo de centrfuga contendo a amostra em uma estante. 4. Repetir esse procedimento para todas as amostras. 5. Adicionar, com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga, a Soluo de NaOH a 4%, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Usar uma pipeta para cada amostra. 6. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar com a mo ou em agitador mecnico at formar uma mistura bem homognea. Deixar o tubo em repouso, a temperatura ambiente, por 15 minutos, para que ocorra a muclise ou fluidificao da amostra.

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7.

Abrir os tubos com a amostra e acrescentar gua destilada estril at o volume de 10 ml. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar em agitador mecnico at formar uma mistura bem homognea.

Realizar os procedimentos de 8 a 10 fora da CSB 8. Centrfugar a 3.000 x g por 15 minutos. 9. Aps a parada total da centrfuga, esperar 5 minutos para abrir. 10. Retirar as caapas fechadas da centrfuga e colocar na CSB. Realizar os procedimentos de 11 a 19 dentro da CSB 11. Abrir as caapas e acondicionar os tubos da centrfuga em uma estante. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respingos. 12. Adicionar com uma pipeta Pasteur 3 gotas de gua destilada estril sobre o sedimento. 13. Fechar o tubo e agitar em agitador mecnico para ressuspender o sedimento. 14. Com uma pipeta Pasteur estril depositar duas gotas do sedimento na lmina e, com a ponta da pipeta, preparar um esfregao da baciloscopia concentrada de 1 x 2 cm, no centro da lmina. Obs.: No aquecer a lmina durante a preparao do esfregao. Esse procedimento uma fonte importante de formao de aerossis no ambiente laboratorial e, alm disso, produz precipitados granulosos que prejudicam a colorao e a deteco do bacilo1. 15. Colocar a lmina com o esfregao voltado para cima, sobre a bancada da CSB forrada com papel para secar. 16. Repetir os passos anteriores, at processar todos os esfregaos. 17. Deixar secar completamente todos os esfregaos, a temperatura ambiente. 18. Colocar todas as lminas lado a lado, com esfregao voltado para cima, em uma bandeja de metal forrada com papel absorvente e transportar at a bancada onde as mesmas sero fixadas em bico de Bunsen conforme descrito no item 6.3 deste captulo. ATENO: Fixar o esfregao, somente quando as lminas estiverem completamente secas . 19. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3.

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Captulo 6 Baciloscopia

6 .3 Fixao do esfregao
Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana, tais como as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequados conforme descrito no Captulo 3. Materiais Equipamentos Bico de Bunsen. Reagentes Soluo de lcool a 70% Soluo de Fenol a 5%. A frmula e o preparo da Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do captulo 3. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Pina anatmica com pelo menos 12 cm, ponta arredondada e internamente serrilhada. Recipiente com tampa contendo pedaos de gaze estril. Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Procedimentos de organizao 1. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver respingos. 2. Providenciar e organizar, na bancada, os materiais necessrios para fixar o esfregao. Procedimentos de realizao 1. Retirar da bandeja de metal cada lmina de uma vez, com a pina anatmica, com o esfregao voltado para cima e passar rapidamente, por trs vezes, sobre a chama do bico de Bunsen conforme Figura 3.

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Figura 3

Fixao do esfregao

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

Devolver a lmina, com esfregao fixado, para a bandeja de metal. Repetir os procedimentos 1 e 2 at fixar todos os esfregaos. Transportar a bandeja de metal para a bancada onde as lminas sero coradas. 5. Descartar o papel que est forrando a bancada de trabalho e fazer a descontaminao conforme descrito no Captulo 3. Depois de fixados, os esfregaos ficam aderidos s lminas e esto prontos para a colorao.

2. 3. 4.

6 .4 Mtodos de colorao
A parede celular das micobactrias, responsvel pela morfologia bacilar, tem em sua constituio qumica diversos lipdeos, entre eles os cidos miclicos. A ligao de alguns desses lipdios com o corante Fucsina gera complexos que so responsveis pela caracterstica tintorial de resistncia descolorao por solues lcool-cidas, apresentada pelas clulas bacterianas que so ento designadas como Bacilos lcoolcido Resistentes (BAAR)1. O mtodo original de colorao usou Fucsina Saturada (Ehrlich) ou uma soluo de Fucsina contendo 0,75% de Fucsina Bsica (Neelsen). Em um curto espao de tempo Neelsen fez uma comunicao oral do mtodo estabelecido: uma soluo com Fucsina a 1% aquecida at a emisso de vapores, descorado com cido sulfrico a 25% e uma colorao de fundo com Azul de Metileno. Ao longo do tempo, muitas variaes tm sido desenvolvidas a partir desse mtodo bsico sendo a mais utilizada a que usa uma soluo de Fucsina a 0,3%. O mtodo de colorao a frio, usando um corante de Fucsina Saturada (3%), vrias vezes referenciado como o mtodo de colorao de Kinyoun, embora a descrio original inclusse uma etapa de digesto com hipoclorito. A modificao de Gabbett combinou as solues de descolorao e colorao de fundo, reduzindo o procedimento para duas etapas o que resultou em

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Captulo 6 Baciloscopia

diminuio na carga de trabalho, isso fez com que esse mtodo se tornasse popular especialmente nos pases com mo-de-obra de alto custo. O mtodo de colorao de Tan Thiam Hok combinou a colorao primria a frio e saturada com a modificao de Gabbett e foi tambm amplamente adaptada5. Em um metdico estudo comparativo de vrios mtodos de colorao com diferentes concentraes de Fucsina, o mtodo de colorao usando Fucsina a 1% e aquecimento por 15 minutos produziu os mais consistentes resultados com a mais alta sensibilidade5. Quando a qualidade da Fucsina no boa, sugerimos utiliz-la em uma concentrao de 1%. O microscpio comum tem sido substitudo pelo microscpio de fluorescncia nos pases com baixa prevalncia onde o custo com recursos humanos maior do que com instrumentos, e onde o nmero de amostras clnicas paucibacilares maior. O mtodo de colorao que utilizado para corar os esfregaos que so examinados pelo microscpio de fluorescncia requer solues de corantes diferentes. A Auramina O sempre utilizada como corante primrio, sozinha ou em combinao com a rodamina para melhor diferenciao. Muitas variaes existem para a colorao de fundo do esfregao na microscopia de fluorescncia: permanganato de potssio normalmente usado para fluorescncia no especfica, mas mtodos sem colorao de fundo ou que usem acridina laranja, tiazina vermelha ou Azul de Metileno so padronizados em alguns pases. Recentemente, a tinta nanquim azul diluda tem sido usada, produzindo um bom contraste sem que o fundo se apresente muito escuro, o que dificulta a manuteno do foco como ocorre com o permanganato algumas vezes5. Neste manual esto descritos dois mtodos de colorao, o mtodo de ZiehlNeelsen e o mtodo da Fluorescncia com Auramina O. 6 .4 .1 Mtodo de Ziehl-Neelsen Vrios mtodos de colorao tm sido desenvolvidos na microscopia para BAAR, mas nem todos podem ser usados em uma rede nacional de laboratrios. A padronizao utilizando um nico mtodo em todo pas crucial. O Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT) deve insistir na manuteno de um nico mtodo e na formulao apropriada de corantes para este mtodo. O PNCT deve selecionar um mtodo de colorao que utilize o microscpio comum e um mtodo que utilize o microscpio de fluorescncia que devem ser padronizados para toda a rede nacional de laboratrios. O primeiro mtodo deve ser factvel em todos os laboratrios que realizam baciloscopia. O segundo indicado como triagem, para reduzir o tempo de leitura dos exames negativos e indicado para laboratrios que realizam mais de 50 amostras de escarro por dia. O mtodo de Ziehl Neelsen baseia-se na propriedade de lcool-cido resistncia e sua utilizao recomendada pelo Ministrio da Sade para todos os laboratrios que realizam o diagnstico da TB pulmonar pelo Ministrio da

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Sade, uma vez que possibilita a identificao de BAAR e utiliza o microscpio tico comum, para leitura do esfregao. Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana tais como as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequados conforme descrito no Captulo 3. Seguir rigorosamente o que est descrito no Procedimento Operacional Padro (POP). Realizar Controle de Qualidade Interno. Materiais Equipamentos Cronmetro. Bancada com cuba de inox e gua corrente. OBS .: Para colorao, pode ser utilizada uma cabine de exausto de gases sobre a bancada com cuba de inox . Reagentes Soluo de lcool a 70%. lcool etlico comercial. Fucsina Fenicada a 0,3%. Soluo Descorante de lcool-cido a 3%. Azul de Metileno a 0,3%. As frmulas e o preparo dos corantes e da soluo descorante esto descritas no item 6.9 deste Captulo. A frmula e o preparo Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do Captulo 3. Insumos Suporte para corar lminas. 2 frascos de vidro de 200 ml, cor mbar, tampa de vidro esmerilhada, tipo contagotas, para os corantes Fucsina Fenicada a 0,3% e Azul de Metileno a 0,3%. 1 frasco de vidro de 200 ml, com tampa de vidro esmerilhada, tipo contagotas para a Soluo Descorante de lcool-cido a 3%. Pina anatmica com pelo menos 12 cm, ponta arredondada e internamente serrilhada. Haste de metal com proteo contra aquecimento em uma das extremidades (para suporte do algodo no aquecimento da Fucsina).

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Captulo 6 Baciloscopia

Estante para tubos de 16 mm x 150 mm para secar as lminas. Algodo hidrfilo. Funil de vidro haste curta de 50 a 80 mm de dimetro para filtrar corantes. Papel de filtro de 15 cm e dimetro. Caixa de fsforos. Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados.

Procedimentos de organizao: 1. Providenciar e organizar na bancada com cuba de inox os materiais necessrios para corar o esfregao. 2. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro. Procedimentos de realizao 1. Colocar as lminas (no mximo 12 de cada vez7) com o esfregao voltado para cima, sem encostar umas nas outras e de acordo com o nmero de ordem de registro no suporte para corar. 2. Forrar um funil de vidro com papel de filtro e filtrar a Fucsina Fenicada a 0,3% para dentro do frasco conta-gotas. Filtrar apenas o volume suficiente para cobrir os esfregaos das lminas que voc vai corar. 3. Cobrir com a Fucsina filtrada, todo o esfregao de cada uma das lminas. OBS .: fundamental filtrar a Fucsina, na hora do uso, para retirar os cristais que se formam quando a mesma est em repouso . 4. 5. 6. 7. Enrolar um chumao de algodo na ponta de uma haste de metal com proteo contra aquecimento numa das extremidades. Umedecer o algodo com lcool etlico. Cuidado para no escorrer lcool etlico na haste. Colocar fogo no algodo umedecido com lcool etlico. Passar a chama lentamente por debaixo das lminas at que ocorra a emisso de vapores visveis, conforme Figura 4. Retirar imediatamente a chama para evitar que a Fucsina ferva.

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Figura 4

Aquecimento da Fucsina

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

Marcar o tempo de 5 minutos assim que ocorrer a primeira emisso de vapores, e repita o passo 7 mais duas vezes. Isso significa que, ao todo, deve-se passar trs vezes a chama lentamente at a emisso de vapores e essa operao deve durar 5 minutos, a contar da primeira emisso de vapores. 8. Inclinar cada uma das lminas e derramar a Fucsina na pia. 9. Abrir devagar a torneira at obter um filete de gua corrente para lavar as lminas. 10. Deixar o filete de gua cair em cima do nmero de cada lmina, para que escorra suavemente sobre o esfregao at eliminar todo o corante, conforme Figura 5. Figura 5 Lavagem da Fucsina em gua Corrente

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

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Captulo 6 Baciloscopia

11. Lavar tambm o lado oposto ao esfregao de cada lmina para eliminar a Fucsina ali depositada, se necessrio passar uma gaze para retirar a fuligem do fogo, aderida no lado de baixo da lmina. 12. Colocar cada lmina novamente no suporte com o esfregao voltado para cima. 13. Repetir os itens de 10 a 12 para todas as lminas que esto com fucsina. Descolorao do esfregao pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen 1. Cobrir completamente cada lmina com a Soluo Descorante de lcool-cido a 3%, e esperar 1 minuto. 2. Segurar cada lmina pela borda numerada, inclinar e derramar a soluo descorante na pia. 3. Deixar o filete de gua corrente cair em cima do nmero de cada lmina, para que escorra suavemente sobre o esfregao e eliminar o lcool-cido. 4. Verificar se os esfregaos ficaram descorados. Considera-se descorado o esfregao que apresentar colorao esbranquiada ou levemente rosada. OBS .: Os procedimentos de 1 a 3 no devem ultrapassar 3 minutos, considerando os esfregaos de todas as lminas que esto sendo descoradas . 5. Repetir os itens de 2 a 4 para todas as lminas que esto com a Soluo Descorante de lcool-cido a 3%.

Colorao de fundo pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen 1. Forrar um funil de vidro com papel de filtro e filtre o Azul de Metileno a 0,3% num frasco conta-gotas. Filtrar apenas o volume suficiente para cobrir o esfregao das lminas que vo ser coradas. 2. Cobrir o esfregao de cada uma das lminas com o Azul de Metileno j filtrado. Esperar 30 segundos. 3. Segurar, com uma pina anatmica e pela borda numerada, e inclinar cada lmina para derramar o Azul de Metileno na pia. 4. Deixar cair um filete de gua corrente em cima do nmero da lmina, para que escorra suavemente sobre o esfregao at eliminar todo o Azul de Metileno a 0,3%. 5. Girar cada lmina e lavar tambm o lado oposto ao esfregao para eliminar o Azul de Metileno a 0,3% depositado ali. 6. Colocar cada uma das lminas em p, para secar em uma estante de tubos, conforme Figura 6. Essa estante deve estar forrada com papel absorvente, de preferncia papel de filtro, conforme Figura 6.

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Figura 6

Estante para Secar as Lminas

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

ATENO: A estante com as lminas deve ficar ao abrigo da luz solar . Quando as lminas estiverem secas, proceder leitura microscpica e a interpretao dos resultados conforme descrito no item 6 .5 deste captulo . 6 .4 .2 Mtodo da fluorescncia com Auramina O5 Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana, tais como as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequados conforme descrito no Captulo 3. Seguir rigorosamente o que est descrito no Procedimento Operacional Padro (POP). Realizar Controle de Qualidade Interno. O esfregao a ser corado por esse mtodo deve ser mais delgado do que para o mtodo de Ziehl Neelsen. Materiais Equipamentos Cronmetro. Bancada com cuba de inox e gua corrente. OBS .: Para colorao, pode ser utilizada uma cabine de exausto de gases sobre a bancada com cuba de inox .

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Captulo 6 Baciloscopia

Reagentes Soluo de lcool a 70%. Soluo de Auramina Fenicada. Soluo Descorante de lcool-cido a 1%. Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul. As frmulas e o preparo dos corantes e da soluo descorante esto descritas no item 6.9 deste Captulo. A frmula e o preparo Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do Captulo 3. Insumos Suporte para corar lminas. 2 frascos de vidro de 200 ml, cor mbar, tampa de vidro esmerilhada, tipo conta-gotas, para a Soluo de Auramina Fenicada, Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul. 1 frasco de vidro de 200 ml, com tampa de vidro esmerilhada, tipo contagotas para a Soluo Descorante de lcool-cido a 1%. Pina anatmica com pelo menos 12 cm, ponta arredondada e internamente serrilhada. Estante para tubos de 16 mm x 150 mm para secar as lminas. Algodo hidrfilo. Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados. Procedimentos de organizao 1. Providenciar e organizar na bancada com cuba de inox os materiais necessrios para corar o esfregao. 2. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro. Procedimentos de realizao 1. Colocar as lminas (no mximo 12 de cada vez7) com o esfregao voltado para cima, sem encostar umas nas outras e de acordo com o nmero de ordem de registro no suporte para corar. 2. Cobrir com a Soluo de Auramina Fenicada, todo o esfregao de cada uma das lminas. 3. Marcar o tempo de 20 minutos. 4. Inclinar cada uma das lminas e derramar a Soluo de Auramina Fenicada na pia. 5. Colocar cada lmina novamente no suporte com o esfregao voltado para cima. 6. Repetir os itens de 4 a 5 para toda as lminas que esto com a Soluo de Auramina Fenicada.

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Descolorao do esfregao pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O 1. Cobrir completamente cada lmina com a Soluo Descorante de lcool-cido a 1%, e esperar 2 minutos. 2. Segurar cada lmina pela borda numerada, inclinar e derramar a Soluo Descorante de lcool-cido a 1% na pia. 3. Deixar o filete de gua corrente cair em cima do nmero de cada lmina, para que escorra suavemente sobre o esfregao e eliminar a Soluo Descorante de lcool-cido a 1%. 4. Colocar cada lmina novamente no suporte com o esfregao voltado para cima. Obs .: Os procedimentos de 1 a 2 no devem ultrapassar 3 minutos, considerando os esfregaos de todas as lminas que esto sendo descoradas . 5. Repetir os itens de 2 a 4 para todas as lminas que esto com a Soluo Descorante de lcool-cido a 1%.

Colorao de fundo pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O 1. Cobrir o esfregao de cada uma das lminas com a Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul. Esperar 1 minuto. 2. Segurar, com uma pina anatmica e pela borda numerada, e inclinar cada lmina para derramar a Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul na pia. 3. Deixar cair um filete de gua corrente em cima do nmero da lmina, para que escorra suavemente sobre o esfregao at eliminar todo a Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul. 4. Girar cada lmina e lavar tambm o lado oposto ao esfregao para eliminar a Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul depositado ali. 5. Colocar cada uma das lminas em p para secar em uma estante de tubos. Essa estante deve estar forrada com papel absorvente, de preferncia papel de filtro. ATENO: A estante com as lminas deve ficar ao abrigo da luz solar . Quando as lminas estiverem secas, proceder leitura microscpica e a interpretao dos resultados conforme descrito no item 6 .5 deste captulo .

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Captulo 6 Baciloscopia

6 .5 Leitura e interpretao dos resultados


A tcnica a ser utilizada na leitura das baciloscopias deve ser selecionada em funo do tipo de amostra clnica, mtodo de execuo do esfregao e mtodo de colorao. Na leitura de todas as baciloscopias devem ser lidos no mnimo 100 campos teis de microscpico, ou seja, aqueles campos nos quais se observam elementos celulares de origem pulmonar (leuccitos, fibras mucosas e clulas ciliares). Os campos em que no aparecem esses elementos no devem ser contabilizados na leitura. Para a baciloscopia realizada com escarro espontneo distendido diretamente sobre a lmina ou escarro aps concentrao, corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen a leitura e interpretao dos resultados devem ser realizadas conforme padronizao do Ministrio da Sade1. No caso de baciloscopias a partir de outra amostras clnicas, aps concentrao ou no, o esfregao deve ser oval e a leitura realizada em toda a extenso. Os esfregaos de escarro distendidos em 3/4 da lmina, corados pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O, a leitura deve ser realizada em toda a extenso, sem imerso, com a objetiva de 40x. Os critrios para leitura e interpretao dos resultados da baciloscopia realizada com escarro espontneo distendido e corado pelo o mtodo de Ziehl-Neelsen esto descrito nos Quadro 21. Quadro 2 Critrios para Leitura e Interpretao dos Resultados da Baciloscopia de Escarro, aps Concentrao ou no, Corada pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen
QUANDO: no so encontrados BAAR em 100 campos = relata-se o resultado como NEGATIVO; so encontrados de 1 a 9 BAAR em 100 campos = relata-se apenas a quantidade de BAAR encontrada; so encontrados de 10 a 99 BAAR, em 100 campos = relata-se o resultado como POSITiVO +; encontrada em mdia de 1 a 10 BAAR por campo, nos primeiros 50 campos observados = relata-se o resultado como POSITIVO ++; encontrada em mdia mais de 10 BAAR por campo, nos primeiros 20 campos observados = relata-se o resultado como POSITIVO +++.
Adaptado de: Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.

Os critrios para leitura e interpretao dos resultados da Baciloscopia de outras amostras clnicas aps concentrao ou no, esto descritos no Quadro 31:

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Quadro 3

Critrios para Leitura e Interpretao dos Resultados da Baciloscopia a partir de outras amostras clnicas, aps concentrao ou no
QUANDO:

no so encontrados BAAR no material examinado = relata-se o resultado como NEGATIVO; so encontrados BAAR em qualquer quantidade, no material examinado = relata-se o resultado como POSITIVO.
Fonte: Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.

6 .5 .1 Leitura e interpretao dos resultados da baciloscopia direta do escarro espontneo ou do escarro aps concentrao, corada pelo o mtodo de Ziehl-Neelsen Precaues Limpar a lente de imerso aps a leitura de cada esfregao positivo. Usar um microscpio que esteja em boas condies conforme descrito no Captulo 11. Cuidar para o frasco conta-gotas no tocar no esfregao, a ponta do conta-gotas pode carregar bacilos de uma lmina positiva para uma lmina negativa. Seguir a ordem crescente de numerao das lminas para ler. Verificar sempre se os resultados positivos esto aparecendo de forma consecutiva, isso pode ser indcio de que se est transferindo bacilos nos processos de preparao, colorao e leitura das baciloscopias. Realizar uma anlise semanal e mensal dos resultados da baciloscopia para verificar a porcentagem de resultados positivos. Caso os resultados se diferenciem bruscamente do normal, realize uma investigao para determinar as causas. Materiais Equipamentos Microscpio binocular, condensador de campo claro, com lmpada de halognio, ocular 10x (campo amplo) e objetiva de 10x, 40x acromtica e de imerso de 100x planacromtica com mola. Reagente leo de imerso. Soluo de lcool a 70%. Insumos Caixa porta-lmina, de plstico, com tampa, capacidade de 50 lminas.

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Captulo 6 Baciloscopia

Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados. Papel absorvente para limpar as lentes do microscpio. Etiqueta, fita crepe e fita adesiva. Gaze. Caneta esferogrfica azul e vermelha. Lpis de grafite. Papel quadriculado para registro dos resultados, no item 6.9.1 deste captulo apresentamos modelo de formulrio de papel quadriculado. Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade.

Procedimentos de organizao 1. Providenciar e organizar a bancada com o microscpio de campo claro e os materiais necessrios para realizar a leitura da baciloscopia. 2. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro. Procedimentos de realizao A leitura deve ser feita da esquerda para a direita conforme Figura 7. Figura 7 Sentido de Leitura da Lmina

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

1.

Registrar, no formulrio papel quadriculado de registro de leitura, o nmero da lmina e se para diagnstico ou controle conforme Figura 8.

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Figura 8

Formulrio de Registro de Leitura


Laboratrio: Diagnstico Lmina n : Controle

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes:


Fonte: Adaptado de Ministrio da Sade. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. 2001

2.

Pingar uma gota de leo de imerso, prximo ao nmero e no centro da lmina, sem tocar no esfregao com o conta-gotas para evitar transferir material de uma lmina para outra. 3. Colocar a lmina no charriot do microscpio. 4. Girar o canho do microscpio at que a lente objetiva de 10x esteja sobre a lmina, focar a imagem com os botes macro e micrmetro. 5. Ajustar a distncia entre as lentes oculares de acordo com a distncia entre seus olhos, de modo a enxergar apenas uma imagem. 6. Girar o boto para ajustar a altura do condensador e abrir o diafragma para obter uma boa luminosidade. 7. Trocar a objetiva de 10x pela objetiva de imerso (100x) imergindo-a no leo. 8. Aproximar a objetiva de 100x lentamente para no quebrar a lmina. 9. Ajustar o foco com o boto micromtrico at que a imagem fique ntida. Durante toda a leitura ajustar o foco apenas com esse boto. 10. Dividir mentalmente o campo microscpico, que est visualizando, em quatro quadrantes, utilizando os nmeros 12, 3, 6 e 9, como no mostrador de um relgio conforme Figura 9.

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Captulo 6 Baciloscopia

Figura 9

Campo Microscpico

Fonte:

CGLAB/DEVEP/SVS

11. Iniciar a leitura pelo quadrante superior direito, entre os nmeros 12 e 3. Utilizar o boto micromtrico para verificar a presena de BAAR na superfcie e em profundidade. Contar os bacilos, se os mesmos forem visualizados. 12. Continuar a leitura dos outros quadrantes no sentido dos ponteiros do relgio. Contar os bacilos presentes em todos os quatro quadrantes e anotar no papel quadriculado o nmero total de bacilos que foram encontrados nesse campo. OBS .: Para separar um campo microscpico do prximo, sem que fique sobreposto, usar como referncia um elemento celular no nmero 3 do relgio . Qualquer elemento observado nesse ponto, uma clula, uma fibra, um bacilo, dever ficar imediatamente anterior ao nmero 9 do campo seguinte . 13. Repetir os itens 11 e 12 at completar 20 campos, seguindo os mesmos procedimentos. 14. Somar os resultados dos 20 campos e calcular a mdia. 15. Analisar a mdia obtida para os resultados nos 20 primeiros campos observados, considerando as seguintes possibilidades. i. Se a mdia for de mais de 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa amostra positiva +++. ii. Se a mdia for inferior a 10 BAAR por campo ou no contiver BAAR, continuar a leitura at completar 50 campos.

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16. Fazer a leitura e anotar os resultados at completar 50 campos, seguindo os mesmos procedimentos. 17. Somar os resultados dos 50 campos e calcular a mdia. 18. Analisar a mdia obtida para os resultados dos 50 campos observados, considerando as seguintes possibilidades: i. Se a mdia obtida for de 1 a 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa amostra positiva ++. ii. Se a mdia obtida for inferior a 1 BAAR por campo ou no contiver BAAR, continuar a leitura at completar 100 campos. 19. Fazer a leitura e anotar os resultados at completar 100 campos, seguindo os mesmos procedimentos. 20. Somar e analisar os resultados dos 100 campos considerando as seguintes possibilidades: i. Se for encontrado um total de 10 a 99 BAAR nos 100 campos examinados, encerrar a leitura. Essa amostra positiva +. ii. Se for encontrado um total de 1 a 9 BAAR nos 100 campos examinados, relatar o nmero exato de BAAR encontrados. iii. Se no forem encontrados BAAR, nos 100 campos observados, essa amostra negativa. 21. Repetir os procedimentos a partir do item 2, para cada uma das lminas a serem lidas. 22. Aps a leitura das lminas, descartar os potes que foram guardados na geladeira depois de confeccionados os esfregaos, de acordo com o Captulo 3. 23. Limpar o microscpio conforme descrito no Captulo 11. 6 .5 .2 Leitura e Interpretao dos Resultados da Baciloscopia de outras amostras clnicas, aps concentrao ou no Precaues Apresentadas no item 6.5.1 deste captulo. Materiais Equipamentos Microscpio binocular, condensador de campo claro, com lmpada de halognio, ocular 10x (campo amplo) e objetiva de 10x, 40x acromtica e de imerso de 100x planacromtica com mola. Reagente leo de imerso. Soluo de lcool a 70%.

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Captulo 6 Baciloscopia

Insumos Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados. Papel absorvente para limpar as lentes do microscpio. Gaze. Caneta esferogrfica azul e vermelha. Lpis de grafite. Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade, modelo de registro no Captulo 1 deste manual. Procedimentos de organizao 1. Providenciar e organizar a bancada com o microscpio de campo claro e os materiais necessrios para realizar a leitura da baciloscopia. 2. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro. Procedimentos de realizao 1. Pingar uma gota de leo de imerso, sem tocar no esfregao com o conta-gotas para evitar transferir material de uma lmina para outra. 2. Colocar a lmina no charriot do microscpio. 3. Girar o canho do microscpio at que a lente objetiva de 10x esteja sobre a lmina, focar a imagem com os botes macro e micrmetro. 4. Ajustar a distncia entre as lentes oculares de acordo com a distncia entre seus olhos, de modo a enxergar apenas uma imagem. 5. Girar o boto para ajustar a altura do condensador e abrir o diafragma para obter uma boa luminosidade. 6. Trocar a objetiva de 10x pela objetiva de imerso (100x) imergindo-a no leo. 7. Aproximar a objetiva de 100x lentamente para no quebrar a lmina. 8. Ajustar o foco com o boto micromtrico at que a imagem fique ntida. Durante toda a leitura ajustar o foco apenas com esse boto. 9. Dividir mentalmente o campo microscpico, que est visualizando, em quatro quadrantes, utilizando os nmeros 12, 3, 6 e 9, como no mostrador de um relgio conforme Figura 8. 10. Iniciar a leitura pelo quadrante superior direito, entre os nmeros 12 e 3. Utilizar o boto micromtrico para verificar a presena de BAAR na superfcie e em profundidade. 11. Continuar a leitura dos outros quadrantes no sentido dos ponteiros do relgio. OBS .: Para separar um campo microscpico do prximo, sem que fique sobreposto, usar como referncia um elemento celular no nmero 3 do relgio . Qualquer elemento observado nesse ponto,

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uma clula, uma fibra, um bacilo, dever ficar imediatamente anterior ao nmero 9 do campo seguinte . 12. Repetir os itens 10 e 11 at encontrar BAAR ou at examinar todo o esfregao. 13. Analisar os resultados considerando as seguintes possibilidades. i. Se for encontrado BAAR, em quaisquer quantidades encerrar a leitura. Essa amostra positiva. ii Se no forem encontrados BAAR, no material examinado, essa amostra negativa. 14. Repetir os procedimentos a partir do item 1, para cada uma das lminas a serem lidas. 15. Aps a leitura das lminas, descartar os potes que foram guardados na geladeira depois de confeccionados os esfregaos, de acordo com o Captulo 3. 16. Limpar o microscpio conforme descrito no Captulo 11.

6 .6 Registro dos resultados


Transcreva o resultado encontrado na leitura baciloscpica para o formulrio Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia correspondente, para Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade e para o sistema de informao GAL. 6 .6 .1 Registro dos Resultados da baciloscopia direta do escarro espontneo ou do escarro aps concentrao, corada pelo o Mtodo de Ziehl-Neelsen Transcrever os resultados dos papis quadriculados para o formulrio Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia dos pacientes e encaminhar para o local onde foi indicado aos mesmos. Modelo de formulrio de Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia apresentado no Captulo 1. Registrar o resultado dos papis quadriculados no sistema de informao GAL, Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade. Arquivar os papis quadriculados com resultados, no mnimo por seis meses como referncia para o Controle Externo da Qualidade (CEQ).

Procedimentos a serem realizados com as lminas aps leitura Limpar as lminas depois de lidas pressionando levemente o esfregao com papel absorvente, cuidando para no remover o esfregao. Conservar por um perodo mnimo de seis meses, em temperatura ambiente, todas as lminas examinadas, inclusive as lminas coradas pelo Mtodo da

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Captulo 6 Baciloscopia

Fluorescncia com Auramina O, independentemente do resultado. As lminas devem ser conservadas com a numerao original e em ordem numrica. Colocar em uma caixa porta lminas, identificada com o smbolo de risco biolgico, o ms, o nome do laboratrio e do municpio. Se no houver a caixa especial, envolver as lminas individualmente em papel suave. Depois fazer pacotes com 50 lminas com papel de embrulho e identificar os pacotes da forma descrita, conforme descrito no Captulo 2. Durante este perodo, o LACEN ou Laboratrio de Referncia Regional do Estado - LRRE (Laboratrio Avaliador) poder solicitar que as lminas sejam enviadas juntamente com a cpia das folhas do Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade, que contm o nmero de ordem e os resultados das lminas examinadas durante o perodo a ser controlado para o CEQ conforme descrito no Captulo 2.

6 .6 .2 Registro dos Resultados da Baciloscopia de outras amostras clnicas, aps concentrao ou no Transcrever os resultados encontrados para o formulrio Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia dos pacientes e encaminhar para o local onde foi indicado aos mesmos. O formulrio Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia apresentado no Captulo 1. Registrar o resultado encontrado para o sistema de informao GAL, Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade. Descartar as lminas conforme descrito no Captulo 3.

6 .7 Controle de qualidade
O Controle de Qualidade Interno (CQI) e o Controle Externo da Qualidade (CEQ) da Baciloscopia esto descritos no Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade da Baciloscopia.

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6 .8 Referncias
1. BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. 2001. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part I. Organization and Management. Geneva. Switzerland. WHO/TB/98.258. 1998. WHO/World Health Organization. WHO Report 2007. Global Tuberculosis Control. Surveillance, Planning, Financing. WHO/HTM/TB/2007.376.2007 DAVID, H.L. Bacteriology of mycobacterioses. US Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, Communicable Disease Centre, Atlanta, USA, 1996. RIEDER H.L.; VAN DEUN, A.; KAM, K.M.; KIM, S.J.; CHONDE, T.M.; TRBUCQ, A.; URBANCZIK, R. Priorites for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-Income Countries. Second edition. International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (The IUATLD). Paris, France, 2007. OPAS/Oficina Sanitaria Panamericano, Oficina Regional de la Organizacin Mundial de la Salud. Guia para el Diagnostico de la Tuberculosis por el Examen Microscopico. Publicacin Cientifica n 277. Washington, EUA. 1973. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part II. Microscopy. Geneva, Switzerland. WHO/TB/98.258.1998.

2. 3. 4.

5.

6.

7.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 173

Captulo 6 Baciloscopia

6 .9 Anexos do captulo
6 .9 .1 Formulrio de papel quadriculado para registro dos resultados
Formulrio de Papel Quadriculado para Registro dos Resultados
Laboratrio: Diagnstico Lmina n : Controle Laboratrio: Diagnstico Lmina n : Controle

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes: Laboratrio: Diagnstico Lmina N : Controle

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes: Laboratrio: Diagnstico Lmina N : Controle

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes: Laboratrio: Diagnstico Lmina N : Controle

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes: Laboratrio: Diagnstico Lmina N : Controle

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes:

N de Bacilos: N de Campos: Resultado/cruzes:

174 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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6 .9 .2 Preparao de Reagentes Os corantes e os reagentes devem ser preparados, obrigatoriamente, em capela de exausto qumica e com EPI apropriados. Nesse item, esto descritas as frmulas e as informaes para a preparao dos reagentes para a realizao da Baciloscopia. Os formulrios para o controle da preparao dos reagentes e corantes da Baciloscopia esto descritas no Captulo 2. 6 .9 .2 .1 Quadro 4 Preparao da Fucsina Fenicada a 0,3% Para obter 1 litro de Fucsina Fenicada a 0,3% necessrio que sejam preparadas, separadamente, uma soluo de Fucsina Bsica (soluo A) e uma soluo de fenol aquoso (soluo B).
PREPARAO DA SOLUO A FUCSINA BSICA lcool etlico 95% PA Fucsina Bsica 1. Colocar a Fucsina em um balo de 1.000 ml. 2. Adicione aos poucos os 100 ml de lcool etlico no balo sobre a Fucsina. 3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo da Fucsina. Ateno: 3 gramas a quantidade indicada na frmula, desde que a Fucsina tenha no mnimo 88% de concentrao de corante. Se a concentrao for menor, preciso calcular o fator de correo e depois multiplica-lo por 3 gramas, para encontrar a quantidade de Fucsina necessria obteno de um corante adequado. Frmula do fator de correo = 1 dividido pelo equivalente decimal da concentrao do corante = percentual de concentrao do corante dividido por 100. Por exemplo: Fucsina em p com concentrao de corante = 75%. Equivalente decimal = 75/100 = 0,75 fator de correo = 1/0,75 = 1,33. Quantidade de Fucsina corrigida = 1,33 x 3 g = 3,99 g . Nesse exemplo, preciso pesar 3,99 g de Fucsina para preparar a soluo A. PREPARAO DA SOLUO B FENOL AQUOSO Cristal de fenol gua destilada qsp 1. Colocar o fenol em um balo de 1.000 ml. 2. Adicionar 700 ml da gua destilada aos poucos no balo sobre o fenol. 3. Colocar o balo para aquecer em banho maria at o fenol dissolver completamente. 4. Retirar do banho maria e acrescentar gua destilada at completar 1.000 ml. 5. Deixar esfriar em temperatura ambiente. PREPARAO DA FUCSINA FENICADA A 0,3% 1. Colocar 900 ml da soluo B no balo contendo a soluo A e agitar. 2. Tampar a boca do balo com papel alumnio e deixar repousar por 24 horas. 3. Filtrar, em funil com papel de filtro, diretamente em frasco mbar de 1000 ml j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante, data da preparao, de validade, e a frase Filtrar antes de usar. 4. Armazenar esse corante, ao abrigo da luz e a temperatura ambiente. 50 g 1.000 ml 100 ml 3g

ATENO: Os 100 ml do fenol aquoso (Soluo de Fenol a 5%) que sobraram podem ser utilizados como soluo descontaminante .

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Captulo 6 Baciloscopia

6 .9 .2 .2 Quadro 5 Preparao da Soluo Descorante de lcoolcido a 3%


PREPARAO DA SOLUO DESCORANTE DE LCOOL-CIDO A 3% lcool etlico comercial cido clordrico concentrado 970 ml 30 ml

1. Colocar os 970 ml de lcool-etlico comercial, em um balo de 1.000 ml. 2. Adicionar o cido clordrico, lentamente, deixando escorrer pelas paredes do balo que contm o lcool etlico. Ateno: sempre adicionar o cido cuidadosamente sobre lcool etlico, pois esta mistura aquece. 3. Agitar o balo suavemente. 4. Colocar o lcool-cido em um frasco de 1.000 ml rotulado com as seguintes informaes: nome do descorante, data da preparao, e de validade. 5. Armazenar essa soluo em temperatura ambiente.

6 .9 .2 .3 Quadro 6 Preparao de Azul de Metileno a 0,3%


PREPARAO DE AZUL DE METILENO A 0,3% Azul de Metileno gua destilada qsp 3g 1.000 ml

1. Colocar o azul de metileno em um balo volumtrico de 1.000 ml. 2. Adicionar a 100 ml da gua destilada ao Azul de Metileno. 3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo. 4. Adicionar o restante da gua e agite bem. 5. Filtrar em papel de filtro diretamente em um frasco mbar de 1000 ml j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante, data de preparao e validade, e a frase Filtre antes de usar . 6. Armazenar a soluo de Azul de Metileno ao abrigo da luz e temperatura ambiente. Ateno: 3 gramas a quantidade indicada na frmula, desde que o Azul de Metileno tenha no mnimo 82% de concentrao de corante. Se a concentrao for menor, preciso calcular o fator de correo e depois multiplic-lo por 3 gramas, para encontrar a quantidade de Azul de Metileno necessria obteno de um corante adequado. Siga os mesmos procedimentos apresentados para a Fucsina no item 6.9.2.1 dos anexos

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6 .9 .2 .4 Quadro 7 Preparao da Auramina Fenicada Para obter 1 litro de Auramina Fenicada necessrio que sejam preparadas, separadamente, uma Soluo de Auramina (soluo A) e uma soluo de fenol aquoso (soluo B).
PREPARAO DA SOLUO A AURAMINA lcool etlico 95% PA Auramina O 1. Colocar a Auramina O em um balo de 100 ml. 2. Adicionar aos poucos 70 ml do lcool etlico no balo sobre a Auramina. 3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo. 4. Completar o volume de 100 ml com o lcool etlico. PREPARAO DA SOLUO B FENOL AQUOSO Fenol lquido gua destilada qsp 30 ml 870 ml 100 ml 1g

Fenol lquido usualmente preparado como soluo estoque pela dissoluo de 9 partes (peso) de cristais de fenol em 1 parte (peso ou volume) de gua pelo aquecimento. Esta soluo quente ficar lquida a temperatura ambiente (o ponto de fuso do fenol 43C, fenol com 6% de gua fundir a 20C). 1. Colocar o fenol em um balo de fundo chato de 1.000 ml. 2. Adicionar lentamente 870 ml da gua destilada no balo sobre o fenol. PREPARAO DA AURAMINA FENICADA 1. Misturar todo o volume da soluo A na soluo B. 2. Colocar a Soluo da Auramina Fenicada em um frasco mbar, bem vedado j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante, data da preparao e de validade . 3. Armazenar esse corante, ao abrigo da luz e a temperatura ambiente. Esse corante pode ser utilizado at 3 meses aps a preparao.

6 .9 .2 .5 Quadro 8 Preparao da Soluo Descorante de lcoolcido a 1%


PREPARAO DA SOLUO DESCORANTE DE LCOOL-CIDO A 1% lcool etlico comercial cido clordrico concentrado 990 ml 10 ml

1. Colocar os 990 ml de lcool-etlico comercial, em um balo de 1.000 ml. 2. Adicionar o cido clordrico, lentamente, deixando escorrer pelas paredes do balo que contm o lcool etlico. Ateno: sempre adicionar o cido cuidadosamente sobre lcool etlico, pois esta mistura aquece. 3. Agitar o balo suavemente. 4. Colocar o Soluo Descorante de lcool-cido a 1% em um frasco de 1.000 ml rotulado com as seguintes informaes: nome do descorante, data da preparao, e de validade . 5. Armazenar essa soluo em temperatura ambiente.

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Captulo 6 Baciloscopia

6 .9 .2 .6 Quadro 9 Preparao da Soluo de Permanganato de Potssio


PREPARAO DA SOLUO DE PERMANGANATO DE POTSSIO Permanganato de Potssio gua destilada 0,5 g 100 ml

1. Colocar o Permanganato de Potssio em um balo volumtrico de 100 ml. 2. Adicionar a gua destilada ao Permanganato de Potssio. 3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo 4. Colocar em um frasco mbar de 100 ml j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante, data de preparao e validade. 5. Armazenar a soluo de Permanganato de Potssio ao abrigo da luz e temperatura ambiente.

6 .9 .2 .7 Quadro 10 Preparao da Soluo de Tinta de Nanquim Azul


PREPARAO DA SOLUO DE TINTA NANQUIM AZUL Tinta Nanquim Azul gua destilada 0,5 g 100 ml

1. Colocar a Tinta Nanquim Azul em um balo volumtrico de 100 ml. 2. Adicionar a gua destilada a Tinta Nanquim Azul. 3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo 4. Colocar em um frasco mbar de 100 ml j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante, data de preparao e validade. 5. Armazenar a soluo de a Tinta Nanquim Azul ao abrigo da luz e temperatura ambiente.

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CAPTULO 7

CULTURA PARA MICOBACTRIAS

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7 .1 Descrio
Cultura o exame laboratorial que permite a multiplicao e o isolamento de bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) a partir da semeadura da amostra clnica, em meios de cultura especficos para micobactrias. um mtodo sensvel e especfico para o diagnstico das doenas causadas por micobactrias, principalmente para a tuberculose (TB) pulmonar e extrapulmonar. O limite de deteco de bacilos da cultura de 100 bacilos por mililitro de escarro, mas quando realizada com alta qualidade tcnica capaz de detectar de 10 a 100 bacilos cultivveis por mililitros de escarro1,2. o mtodo de referncia (padro-ouro) para avaliar um novo mtodo diagnstico. Quando realizada no escarro, pode, em geral, adicionar 20% de casos ao total daqueles de TB pulmonar, no confirmados pela baciloscopia. Permite tambm a posterior identificao da espcie de micobactria isolada e o teste de sensibilidade s drogas antituberculose, assim como a realizao de vrias tcnicas moleculares. A especificidade da cultura para o diagnstico da TB maior do que 99%, sendo que a especificidade absoluta conseguida quando so feitos os testes de identificao para o Complexo M. tuberculosis (CMTB)3.

7 .2 Critrios para realizao da cultura


A cultura produz resultados tardiamente, porm mais sensvel que a baciloscopia. De modo geral, sua realizao visa melhorar a sensibilidade do diagnstico laboratorial em trs pontos bsicos: Diagnstico de: Sintomticos respiratrios com suspeita de TB devido presena de sintomas clnicos compatveis, exame de radiologia sugestivo e baciloscopia repetidamente negativa (mais de 3 amostras negativas). Casos suspeitos de TB com amostras paucibacilares (poucos bacilos) e/ou dificuldades de coleta da amostra (crianas, populaes indgenas) e os casos suspeitos de TB extrapulmonar. Contatos de casos afetados por tuberculose resistente s drogas. Pacientes com antecedentes de tratamento prvio. Todos os pacientes imunodeprimidos, principalmente portadores de HIV, mesmo com baciloscopia positiva, visando a identificao da espcie e a realizao do teste de sensibilidade. Casos suspeitos de infeces causadas por Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) para realizar a identificao da espcie.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Controle de: Todo paciente com baciloscopia positiviva ao finalizar o 2 ms de tratamento. Todos os pacientes com indicao de retratamento: aps falncia ao esquema I (E-I) de tratamento com rifampicina, isoniazida e pirazinamida (RHZ), tuberculose multirresistente (TBMR), recidiva da doena ou reincio de tratamento aps abandono. Vigilncia de resistncia s drogas: estudos epidemiolgicos como atividades de vigilncia, para determinar a prevalncia da resistncia primria (inicial) ou adquirida. Esses so os critrios divulgados no II Consenso Brasileiro de Tuberculose, em 2004, e do Guia de Vigilncia Epidemiolgica Tuberculose4,5. Cada estado da Federao pode acrescentar detalhes ao seus Programas Estaduais de Controle da Tuberculose, visando intervir em determinadas situaes por eles definidas como importantes. o caso do Estado de So Paulo que, em 2002, publicou documento recomendando a realizao de cultura para toda a populao considerada de maior risco (moradores de rua, detentos, profissionais da sade)6.

7 .3 Mtodos de cultura
Desde a dcada de 50, os mtodos clssicos de cultura utilizados no laboratrio so manuais. Utilizam meios de cultura slidos e incubao em estufas bacteriolgicas convencionais. A leitura das colnias de micobactrias feita a olho nu e, em vista disso, o tempo de deteco de positividade da cultura varia de 14 a 28 dias at 8 semanas. As formas disseminadas e rapidamente progressivas de tuberculose e de outras micobacterioses, encontradas com freqncia em pacientes com Aids, exigiram um diagnstico mais rpido. A partir de 1980, os mtodos de cultura tiveram avanos tecnolgicos com o desenvolvimento dos sistemas comerciais. Esses sistemas utilizam um mtodo de processamento e semeadura de amostras muito similar aos mtodos clssicos, de maneira que no diminui o trabalho prvio. Assim o que acelera a leitura, pois a incubao monitorada por sistema informatizado que acusa quando h crescimento celular e, portanto, o tempo de deteco da positividade menor que o exigido para os clssicos. A cultura em meio lquido utilizando sistemas automatizados no radiomtricos e com monitorao contnua so os recomendados para laboratrios que recebem um grande volume de amostras clnicas, como hospitais e Laboratrios de Referncia.

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A opo do laboratrio pela utilizao de um sistema comercial automatizado de cultura deve levar em considerao vrios aspectos como: Oramento regular e contnuo para cobrir as prioridades da cultura. Eficincia com que se comercializam os insumos necessrios. Treinamento dos tcnicos no equipamento. Rapidez com que se processam as amostras aps a coleta. Assistncia tcnica. Custo/complexidade/risco biolgico.

7 .4 Etapas da cultura
O exame de cultura abrange 5 etapas: (1) pr-tratamento das amostras clnicas prepara as amostras, de acordo com suas caractersticas, para as demais etapas metodolgicas; (2) fluidificao-descontaminao utiliza agentes qumicos para homogeneizar a amostra clnica e eliminar outros microrganismos da mesma; (3) semeadura em meio de cultura proporciona o contato das micobactrias existentes na amostra com as substncias nutritivas; (4) incubao fornece a temperatura correta e constante, necessria para a multiplicao das micobactrias; e (5) leitura dos tubos semeados e registro dos resultados verifica a presena de colnias ou de turvao e/ou de contaminao, como sinal de presena de micobactrias e registra a ocorrncia.

7 .5 Pr-tratamento das amostras


Essa etapa inclui o preparo das amostras clnicas quanto necessidade de centrifugao e/ou macerao, de acordo com as suas caractersticas. No Quadro 1, esto descritos esses procedimentos para os diferentes tipos de amostras. As amostras consideradas contaminadas so aquelas provenientes de stios no estreis, tais como escarro, urina, secrees, lavado brnquico, lavado gstrico e fragmento de tecido cutneo. As amostras consideradas no contaminadas so aquelas provenientes de stios estreis, tais como LCR, lquidos (pleural, sinovial, peritonial, pericrdico), fragmentos de rgos, sangue e medula ssea. Para estas, no necessrio descontaminar. No entanto, para garantir que a cultura no seja perdida por contaminao, caso as amostras no tenham sido acondicionadas em condies estreis, recomendvel, aps os procedimentos de pr-tratamento, semear metade da amostra diretamente nos meios de cultura e descontaminar a outra metade conforme o mtodo escolhido. As condies de coleta e armazenamento de amostras clnicas esto descritos no Captulo 5.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Quadro 1

Procedimentos de pr-tratamento de amostras clnicas para cultura de micobactrias


Procedimento de pr-tratamento No necessitam de pr-tratamento. Transferir a amostra para tubos de centrfuga e centrifugar durante 15 minutos a 3.000 x g. Desprezar o sobrenadante e proceder cultura conforme o mtodo escolhido.

Amostras clnicas Escarro espontneo Escarro induzido; lavado brnquico; lavado broncoalveolar (LBA); aspirado transtraqueal; lavado gstrico Urina

Executar o mais rapidamente possvel. Amostras com mais de 50 ml de volume devem ser distribudas em vrios tubos de centrfuga e centrifugado por 15 minutos a 3000 x g. Desprezar os sobrenadantes, juntar os sedimentos num nico tubo de centrfuga e proceder cultura conforme o mtodo escolhido. Transferir a amostra para tubos de centrfuga e centrifugar por 15 minutos a 3.000 x g. Quando coletadas assepticamente, semear diretamente nos meios de cultura escolhidos. Entretanto, caso seja desconhecida a qualidade da coleta, recomendvel semear metade da amostra diretamente nos meios de cultura e descontaminar a outra metade conforme o mtodo escolhido. Quando proveniente de rgos sem microbiota associada macerar em gral com pistilo, estreis, ou em tubos contendo prolas de vidro estreis, com um pouco de gua ou salina estreis, at a formao de uma suspenso homognea. Dividir a suspenso obtida, e semear metade diretamente nos meios de cultura, e a outra metade descontaminar conforme o mtodo escolhido. Macerar em gral com pistilo estril, com um pouco de gua ou salina estreis, at a formao de uma suspenso homognea. Misturar bem e proceder descontaminao conforme o mtodo escolhido. No necessitam de descontaminao. Inocular diretamente nos meios de cultura, no momento da coleta, preferencialmente em sistemas semiautomatizados e automatizados de diagnstico. Quando no disponveis, inocular 5 ml diretamente no frasco de meio de cultura lquido ou bifsico. Para aspirado de medula na ausncia de meio lquido semear 0,2 ml em dois tubos de meio slido a base de ovo ou agar. Quando coletados assepticamente no descontaminar, podendo todo o volume ser inoculado diretamente nos meios de cultura escolhidos. Entretanto, caso seja desconhecida a qualidade da coleta, recomendvel semear metade da amostra diretamente nos meios de cultura e descontaminar a outra metade conforme o mtodo escolhido. Atritar o swab, imerso em gua destilada ou soluo salina estreis, contra a parede do tubo para liberar a amostra clnica nele contida. Descartar o swab e descontaminar a suspenso obtida conforme o mtodo escolhido. Caso o swab no tenha sido encaminhado imerso em gua destilada ou soluo salina estreis, acrescentar um dos referidos lquidos ao mesmo e proceder como descrito anteriormente.

Lquidos: pleural, sinovial, peritonial, pericrdico, asctico e lquido cefalorraquidiano (LCR)

Fragmentos de rgos

Fragmentos cutneos e de ossos Sangue e aspirado de medula

Aspirados de gnglios e de tumores (cavidades fechadas)

Pus e secrees (cavidades abertas)

182 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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7 .6 Agentes fluidificantes-descontaminantes
Os agentes qumicos (cidos, bases) liberam as micobactrias do muco e da fibrina (fluidificando o escarro) ou dos tecidos em que esto includos, homogeneizando a amostra clnica e eliminando outros microrganismos da mesma (Quadro 2). A eliminao destes proporciona o crescimento das micobactrias sem a competio pelos nutrientes contidos nos meios de cultura. Portanto, essa etapa realizada apenas nas amostras contaminadas por microbiota associada ou ambiental. A escolha do agente fluidificante-descontaminante e do meio de cultura est relacionada com o tipo de amostra clnica a ser processada. Para as amostras de escarro, a concentrao do Hidrxido de sdio pode estar em concentraes de at 4%, e para as outras amostras pulmonares e extrapulmonares a concentrao no deve ser superior a 2%. Quadro 2 Agentes fluidificantes-descontaminantes usados no tratamento de amostras clnicas para cultura de micobactrias
ATIVIDADE o mais amplamente empregado, tem propriedades tanto fluidificantes como descontaminantes. Por se tratar de uma substncia alcalina drstica, a concentrao de uso crtica e deve ser cuidadosamente observada, assim como o tempo em que fica em contato com a amostra. Nos mtodos em que utilizada sozinha, sua concentrao de 4%, sendo considerada alta. um agente mucoltico utilizado em combinao com o NaOH. Como no tem efeito direto sobre as micobactrias, permite que seja usada uma concentrao de NaOH de 2%. Dessa maneira, a combinao NALC-NaOH a indicada para amostras paucibacilares e a recomendada para a maioria dos sistemas comerciais de cultura com meios lquidos. um agente descontaminante para amostras de escarro, contaminadas sucessivamente por Pseudomonas sp, principalmente quando provenientes de pacientes com fibrose cstica. Utilizado na concentrao de 5%.

AGENTES FLUIDIFICANTESDESCONTAMINANTES Hidrxido de sdio (NaOH)

N-acetil-L-cistena (NALC)

cido oxlico

A preparao dos reagentes utilizados nos mtodos de cultura e os respectivos formulrios para o controle da preparao esto descritas no item 7.17 dos anexos deste captulo.

7 .7 Meios de cultura
As micobactrias so exigentes para sua multiplicao em meios de cultura e requerem meios especficos. Os meios de cultura podem ser de consistncia slida base de ovos ou de agar e de consistncia lquida (Quadro 3). Os meios lquidos so mais enriquecidos que os slidos e por isso so indicados para amostras paucibacilares, como sangue, LCR e macerados de tecidos. Tambm so utilizados para subcultivos e armazenamento de cepas em freezer. Os sistemas

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

comerciais de cultura utilizam meios lquidos especiais, desenvolvidos a partir do Middlebrook 7H9. Quadro 3
Slidos

Meios de cultura utilizados no isolamento de micobactrias


UTILIZAO Os mais utilizados Lwenstein-Jensen (LJ) e Ogawa-Kudoh (OK), so preparados em tubos ou frascos e podem ficar por at 8 semanas em refrigerao. Todos contm o corante verde de malaquita 2%, para inibir a microbiota contaminante. Esses meios permitem a incorporao de substncias como cido p-nitrobenzico (PNB) a 500 g/ml que pode ser utilizada na semeadura primria da amostra para agilizar uma identificao prvia da espcie de micobactria. Os meios Lwenstein-Jensen com adio de PNB (LJ-PNB) ou Ogawa-Kudoh com adio de PNB (OK-PNB) so utilizados para diferenciar o CMTB das demais micobactrias. Para isolar M. bovis e M. africanum e M. microti substituir o glicerol pelo piruvato de sdio (0,5%) no meio de LJ (LJ-piruvato) ou OK (OK-piruvato). Para pesquisa de M. haemophilum, isolado de leses de pele, adicionar citrato frrico amoniacal (2,5%) ao meio LJ ou OK. A preparao de meios de cultura utilizados nos mtodos clssicos e os formulrios para o controle de qualidade esto descritas no item 7.17 dos anexos deste Captulo. So meios transparentes, o que permite a visualizao precoce das colnias em lupas ou microscpio. Os meios Middlebrook base de agar (Middlebrook 7H10 e Middlebrook 7H11) devem ser enriquecidos com o suplemento Middlebrook OADC, composto por cido oleico, albumina bovina (frao V), dextrose e catalase. o meio lquido que necessita do enriquecimento ADC (albumina, dextrose e catalase). O sistema comercial BBLTM MGITTM Mycobacteria Growth Indicator Tube (Becton & Dickinson), de leitura tanto manual como automatizada consiste em um meio lquido (Middlebrook 7H9), acrescido de antibiticos e enriquecimento OADC, acondicionado em um tubo contendo um sensor fluorescente sensvel ao oxignio, composto de rutnio pentahidratado em uma base de silicone. O sistema MB BacT Culture System BacT/ALERT MP (BioMerieux) utiliza meio lquido Middlebrook 7H9 modificado, enriquecido com fatores de crescimento e soluo antibitica. O sistema ESP Culture System II (AccuMed/Difco) utiliza um tubo contendo o meio lquido Middlebrook 7H9, com suplementos de antibiticos e enriquecimento OADC. O sistema BACTEC srie 9000 utiliza o meio lquido Middlebrook 7H9 modificado (MycoF Lytic) para isolar micobactrias de amostras de sangue e medula ssea. base de ovos

MEIOS DE CULTURA

base de agar

Lquidos

Middlebrook 7H9 Middlebrook 7H9 modificado

Bifsicos

O sistema Septi-Check utiliza um meio bifsico, cuja fase lquida o meio Middlebrook 7H9 e a fase slida composta por 3 meios slidos (LJ modificado, Middlebrook 7H11 e agar chocolate).

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7 .8 Incubao
Aps a realizao das etapas de pr-tratamento, fluidificao-descontaminao e semeadura nos meios de cultura indicados, estes so colocados em temperaturas apropriadas e constantes, para o tempo de incubao necessrio ao desenvolvimento de micobactrias. A maioria das micobactrias, como as do CMTB, necessita de temperaturas entre 35C e 37C para multiplicao. Outras micobactrias como M. marinum, M. ulcerans e M. haemophilus somente se multiplicam em temperaturas que variam de 25C a 30C e M. avium ou M. xenopi exibem um timo crescimento entre 40C e 42C.

7 .9 Leitura, interpretao e registro dos resultados


Essa etapa da cultura verifica a presena de crescimento de micobactria e/ou de contaminao nos meios de cultura. Registrar o resultado com todas as observaes referentes a cada cultura como: data da leitura, nmero de colnias visualizadas, caractersticas morfolgicas da colnia em relao presena de pigmento e aspecto (lisa ou rugosa), e contaminao parcial ou total de cada tubo.

7 .10 Mtodos clssicos de cultura


No Quadro 4, esto listados os mtodos clssicos ou convencionais de cultura que apresentam comprovadamente melhores taxas de isolamento de micobactrias e menores ndices de contaminao. Quadro 4 Mtodos clssicos ou convencionais para cultura de micobactrias e suas indicaes, agentes qumicos e meios de cultura utilizados
MEIO DE CULTURA MTODOS INDICAO FLUIDIFICANTEDESCONTAMINANTE SLIDOS A BASE DE OVO Petroff modificado Principalmente para as amostras de escarro espontneo Para todas as amostras clnicas, principalmente as amostras paucibacilares Para amostras de escarro espontneo Hidrxido de sdio (NaOH) 4% LowensteinJensen (LJ) AGAR Middlebrook 7H10 Middlebrook 7H10 LQUIDOS

Middlebrook 7H9

N-acetil-L-cistena (NALC) Ogawa-Kudoh

N-acetil-L-cisteina com LowensteinHidrxido de sdio Jensen (LJ) (NALC-NaOH) 2% Hidrxido de sdio (NaOH) 4% Ogawa-Kudoh (OK) LowensteinJensen (LJ)

Middlebrook 7H9

cido Oxlico

Para amostras pulmonares que contm Pseudomonas sp cido Oxlico 5% (pacientes com fibrose cstica)

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

A seguir sero descritos para cada um dos quatro mtodos de cultura, a indicao, as precaues, os materiais (equipamentos, reagentes, insumos) e os procedimentos de organizao e de realizao (detalhes passo a passo da tcnica) at a semeadura em meio de cultura. As frmulas para o preparo dos reagentes de fluidificao-descontaminao e dos meios de cultura esto descritas no item Anexos deste captulo e da Soluo de lcool a 70% est descrita no Captulo 3. As recomendaes de incubao e leitura dos tubos semeados, comuns a todos os trs mtodos, sero descritas no item 7.11 deste captulo. O mtodo do cido oxlico no utilizado na rotina diria dos laboratrios, mas importante para casos especiais, como o caso de escarros que contm Pseudomonas sp, como por exemplo, o escarro de pacientes com fibrose cstica e para urina e outros fluidos orgnicos persistentemente contaminados quando descontaminados por mtodos de descontaminao alcalina, respectivamente. 7 .10 .1 Mtodo de Petroff modificado Descrio: Esse mtodo utiliza Soluo de NaOH a 4% como agente de fluidificao-descontaminao, igual volume do escarro, chegando a uma concentrao final de NaOH 2%. indicado principalmente para amostras de escarro. Necessita de centrifugao e de neutralizao. A neutralizao pode ser realizada com a adio: (a) de cido e indicador de pH (normalmente o Vermelho de fenol); (b) Soluo de Tampo Fosfato pH 6,8 ou (c) de gua destilada estril1,7,8,9,10,11. Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um pote de cada vez, com cuidado para evitar a formao de aerossis. Observar a capacidade da centrfuga para estabelecer o nmero de tubos a serem trabalhados a cada lote. A centrfuga deve ser preferencialmente refrigerada para evitar que o aquecimento interfira na viabilidade da micobactria. As caapas devem ter proteo individual para evitar contaminao pela produo de aerossis durante a centrifugao e devem ser abertas dentro da CSB. Como a concentrao de NaOH 4% pode ocasionar tambm a eliminao de BAAR e, no caso de amostras paucibacilares, levar a resultados falsamente negativos, seguir rigorosamente as indicaes de respeitar o tempo (menor ou igual a 15 minutos) em que a amostras ficam em contato com o agente descontaminante.

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A preparao dos reagentes utilizados neste mtodo est descrita no Anexo 7.17.2 deste Captulo. Materiais Equipamentos Cabine de Segurana Biolgica (CSB). Centrfuga com rotor para tubos de 30 ml ou de 50 ml. Agitador mecnico. Estufa bacteriolgica a 36 1C e outra a 30 1C. Pipetador automtico ou manual. Cronmetro. Reagentes Soluo de NaOH a 4%. Soluo Neutralizante. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. gua destilada estril ou Soluo Tampo Fosfato pH 6,8. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Tubos de centrfuga de polipropileno, estreis, descartveis, com fundo cnico, de 30 ml ou de 50 ml, com tampa de rosca. Estante para tubos de centrfuga 30 ml ou 50 ml. Gaze estril em pedaos. Pipetas estreis de 5 ml, 2 ml e Pasteur. Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num volume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado a boca de um frasco Erlenmeyer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca estreita). Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ ou 3 tubos quando houver suspeita de micobacteriose, um tubo com meio LJ-PNB, para cada amostra. Na suspeita de M. bovis, acrescentar 2 tubos com meio LJ-piruvato. Na suspeita de

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

M. haemophilum acrescentar um tubo com meio LJ com adio de citrato frrico amoniacal. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. Lminas para baciloscopia. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Fita de pH e placa de Petri ou tubo de ensaio pequeno.

Procedimentos de organizao 1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica na lmina, nos tubos de meios de cultura e nos tubos de centrfuga. 2. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11. Realizar o procedimento 3 fora da CSB 3. Organizar os potes das amostras a serem descontaminadas, observando a correspondente identificao do nmero de registro no corpo do pote, no tubo de centrfuga, nos tubos de meios de cultura e na lmina. Colocar os tubos de centrfuga e os de meio de cultura em uma mesma estante. Realizar os procedimentos de 4 a 6 dentro da CSB 4. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3. 5. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. 6. Colocar as amostras que sero descontaminadas de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da bandeja. Procedimentos de realizao Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras descrito no Quadro 1. Acompanhar o Fluxograma do item 7.17.3.1 - Figura 2 do Anexo deste Captulo. Realizar os procedimentos de 1 a 6 dentro da CSB 1. Colocar em cima da bandeja de metal somente o pote da amostra que ser processada. 2. Transferir a amostra, no mximo 5 ml, para o tubo de centrfuga de 30 ml ou 50 ml, deixando escorrer suavemente o escarro pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso escorra o material para fora do tubo, limpar com gaze embebida em Soluo de Fenol a 5%

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3. 4. 5.

6.

Colocar o tubo de centrfuga contendo a amostra em uma estante. Repetir esse procedimento para todas as amostras. Adicionar com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga a Soluo de NaOH 4%, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Usar uma pipeta para cada amostra. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar com a mo ou em agitador mecnico at formar uma mistura bem homognea.

Realizar o procedimentos 7 fora da CSB 7. Colocar os tubos de centrfuga na estufa 36 1C por 15 minutos, para fluidificao-descontaminao. Realizar os procedimentos 8 e 9 dentro da CSB 8. Completar at o volume de 30 ml ou 50 ml com gua destilada estril ou Soluo Tampo Fosfato pH 6,8. 9. Proceder neutralizao gotejando a Soluo Neutralizante at o material apresentar a cor amarela mbar. Aps cada gota deve-se agitar suavemente o tubo para homogeneizar. A cor amarela mbar indica que houve mudana do pH para a faixa entre 6,5 e 7,2 e que a amostra est adequada para ser semeada. Em caso de dvida, quando houver mudana de cor mas sem aparecer a cor mbar caracterstica, por exemplo, durante a neutralizao de materiais sanguinolentos, preciso utilizar a fita de pH para verificar se houve a viragem. Para tanto, colocar com uma pipeta estril, uma gota da amostra que est sendo processada, sobre uma fita de pH dentro de uma placa de Petri ou um pequeno tubo de ensaio e observar o pH da amostra. Se o pH estiver acima de 7,2 continuar gotejando a Soluo Neutralizante. Se o pH estiver abaixo de 6,5 gotejar a Soluo de NaOH a 4%, gota a gota at atingir o pH adequado. Realizar os procedimentos de 10 a 12 fora da CSB 10. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos. 11. Aps a parada total da centrfuga, esperar 5 minutos para abrir. 12. Retirar as caapas fechadas da centrfuga e colocar na CSB. Realizar os procedimentos de 13 a 15 dentro da CSB 13. Abrir as caapas e acondicionar os tubos da centrfuga em uma estante. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respingos; 14. Semear com pipeta estril, 0,1ml do sedimento em cada um dos tubos de meio de cultura, distribuindo em toda a superfcie do meio. No caso de existir gua

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de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze ou papel de filtro estril antes de semear. Preparar o esfregao da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do sedimento na lmina; 15. Fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante; Realizar os procedimentos de 16 a 20 fora da CSB 16. Retirar os tubos de meios de cultura semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. 17. Acondicionar os tubos de meios inclinados em uma bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja. 18. Realizar a incubao dos tubos de cultura semeados conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 19. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3. 20. Efetuar a fixao, colorao da lmina de baciloscopia aps concentrao e leitura conforme descrito no Captulo 6. 7 .10 .2 Mtodo de N-Acetil-L-Cistena-Hidroxido de Sdio (NALC-NaOH) Descrio Esse mtodo utiliza uma soluo depurante contendo N-acetil-L-cistena (NALC) como agente de liquefao e o uso de NaOH como descontaminante numa concentrao final de 2%. O mtodo tambm utiliza o Citrato de sdio com a funo de seqestrar os ons de metais pesados que estando presentes na amostra clnica poderiam inativar a NALC. Essa soluo depurante compatvel com todos os meios de cultura, sendo recomendado para todas as amostras clnicas, principalmente as paucibacilares. o mtodo recomendado para descontaminar amostras que sero semeadas em sistemas automatizados1,7,12,13,14,15. Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um pote de cada vez, com cuidado para evitar a formao de aerossis. Observar a capacidade da centrfuga para estabelecer o nmero de tubos a serem trabalhados a cada lote. A centrfuga deve ser preferencialmente refrigerada para

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evitar que o aquecimento interfira na viabilidade da micobactria. As caapas devem ter proteo individual para evitar contaminao pela produo de aerossis durante a centrifugao e devem ser abertas dentro da CSB. A Soluo Depurante, que dever ser adicionada amostra clnica para a fluidificao-descontaminao, composta pela mistura de NaOH a 4%, Citrato de sdio a 2,9% e NALC. No Anexo 7.17 deste Captulo est descrita a preparao de todos os reagentes. A Soluo de NaOH a 4% e a Soluo de Citrato de sdio a 2,9% so preparadas separadamente e aps, so misturadas v/v, de acordo com o volume final desejado. A mistura NaOH-Citrato de sdio pode ser preparada em frasco com tampa de rosca, esterilizada e guardada sob refrigerao. A quantidade de NALC a ser pesada depende da quantidade de amostras que sero tratadas (calculada para um dia de trabalho) e sua adio deve ser feita no momento do uso, pois perde sua atividade dentro de 24 horas. Materiais Equipamentos Cabine de Segurana Biolgica (CSB). Agitador mecnico Centrfuga com rotor para tubos de 50 ml. Estufa bacteriolgica a 36 1C e outra para 30 1C. Pipetador automtico ou manual. Cronmetro. Reagentes Soluo Depurante (Soluo de NaOH a 4%, Soluo de Citrato de sdio a 2,9%, NALC). Soluo Tampo Fosfato pH 6,8. Soluo salina estril. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Tubos de centrfuga de polipropileno, estreis, descartveis, com fundo cnico, de 30 ml ou de 50 ml, com tampa de rosca. Estante para tubos de centrfuga de 50 ml. Gaze estril em pedaos. Pipetas estreis de 5 ml e de 10 ml.

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Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num volume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado a boca de um frasco Erlenmeyer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca estreita). Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ ou 3 tubos quando houver suspeita de micobacteriose, um tubo com meio LJ-PNB, para cada amostra. Na suspeita de M. bovis, acrescentar 2 tubos com meio LJ-piruvato. Na suspeita de M. haemophilum acrescentar um tubo com meio LJ com adio de citrato frrico amoniacal. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. Lminas para baciloscopia. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte.

Procedimentos de organizao 1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica na lmina, nos tubos de meios de cultura e no tubo de centrfuga. 2. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11. 3. Preparar diariamente a soluo de trabalho, calculando a quantidade necessria de acordo com a quantidade de amostras a serem processadas (v/v) Realizar o procedimento 4 fora da CSB 4. Organizar os potes das amostras a serem descontaminadas, observando a correspondente identificao do nmero de registro no corpo do pote, no tubo de centrfuga, nos tubos de meios de cultura e na lmina. Colocar os tubos de centrfuga e os de meio de cultura em uma mesma estante. Realizar os procedimentos de 5 a 7 dentro da CSB 5. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3. 6. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. 7. Colocar as amostras que sero descontaminadas de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da bandeja.

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Procedimentos de realizao Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras descritas no Quadro 1. Acompanhar o Fluxograma do item 7.17.3.2 Figura 3 do Anexo deste Captulo. Realizar os procedimentos de 1 a 8 dentro da CSB 1. Colocar em cima da bandeja somente o pote da amostra que ser processada. 2. Transferir a amostra para o tubo de centrfuga de 50 ml, deixando escorrer suavemente o escarro pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso escorra o material para fora do tubo, limpar com gaze embebida em Soluo de Fenol a 5%. 3. Colocar o tubo de centrfuga contendo a amostra em uma estante. 4. Repetir esse procedimento para todas as amostras. 5. Adicionar com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga a Soluo Depurante, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Usar uma pipeta para cada amostra. 6. Fechar bem os tubos de centrfuga e inverter cuidadosamente o tubo para misturar bem, evitando a agitao forte que resulta em oxidao e inativao da NALC. 7. Deixar os tubos de centrfuga em repouso por 15 minutos temperatura ambiente, para fluidificao/descontaminao. 8. Completar at o volume de 50 ml com Soluo Tampo Fosfato pH 6,8. Realizar os procedimentos de 9 a 11 fora da CSB 9. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos. 10. Aps a parada total da centrfuga, esperar 5 minutos para abrir. 11. Retirar a caapas fechadas da centrfuga e colocar na CBS. Realizar os procedimentos de 12 a 15 dentro da CSB 12. Abrir as caapas e acondicionar os tubos da centrfuga em uma estante. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respingos. 13. Ressuspender o sedimento com 0,3 ml de gua destilada estril ou soluo salina. 14. Semear com pipeta estril 0,1ml do sedimento em cada um dos tubos de meio de cultura, distribuindo em toda a superfcie do meio. No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze estril ou papel de filtro antes de semear. Preparar o esfregao da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do sedimento na lmina.

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15. Fechar os tubos com meio de cultura sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Realizar os procedimentos de 16 a 20 fora da CSB 16. Retirar os tubos de meios de cultura semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. 17. Acondicionar os tubos de meios de cultura, inclinados em uma bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja. 18. Realizar a incubao dos tubos de meio de cultura semeados conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 19. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3. 20. Efetuar a fixao, colorao da lmina de baciloscopia concentrada e leitura conforme descrito no Captulo 6. 7 .10 .3 Mtodo de Ogawa-Kudoh Descrio Esse mtodo de execuo simples, rpida e fcil, utiliza o NaOH 4% como agente descontaminante, sendo recomendado para a utilizao em laboratrios de menor complexidade, pois no requer o uso de centrfuga. Indicado para amostras de escarro espontneo. Utiliza swab de algodo que, aps ser embebido na parte purulenta do escarro, colocado em NaOH 4% por at 2 minutos. Aps semeado diretamente em meio de OK (meio levemente acidificado pH 6,4)1,16,17. Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um pote de cada vez, com cuidado para evitar a formao de aerossis. Observar a forma correta de utilizar o bico de Bunsen de modo que a chama fique entre o tcnico que est manipulando e a amostra. Esse mtodo utiliza apenas o meio de OK e indicado para amostras de escarro.

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Materiais Equipamentos Bico de Bunsen. Estufa bacteriolgica a 36 1C. Pipetador automtico ou manual. Cronmetro. Reagentes Soluo de NaOH a 4%. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Gaze estril em pedaos. Swab estril: palito de madeira com algodo hidrfilo enrolado na ponta, esterilizado em autoclave ou forno de Pasteur que atinja temperatura de 200C. Observar que o volume de algodo dever ser suficiente para absorver a maior quantidade de escarro e no ultrapassar o dimetro do tubo onde ser introduzido. A altura do algodo enrolado dever ser de modo a ficar submersa no volume de 3 ml de Soluo de NaOH a 4%. Tubos de ensaio estril para colocar 3 ml de Soluo de NaOH a 4%. Estante para os tubos de ensaio estril 20 x 150 mm. Pipetas estreis de 5 ml. Um recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado e um recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Meios de cultura: 2 tubos com meio OK, um tubo com meio OK-PNB, para cada amostra. Na suspeita de M. bovis, acrescentar 2 tubos com meio OKpiruvato. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. Lminas para baciloscopia. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Procedimentos de organizao 1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica na lmina, nos tubos de meios de cultura e no tubo estril.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

2.

3. 4.

Forrar a bancada com papel absorvente ao redor do bico de Bunsen e colocar atrs do mesmo a bandeja de metal, forrada com papel absorvente, onde sero realizados os procedimentos. Organizar os potes das amostras por trs da bandeja, e colocar a lmina correspondente identificao da amostra em frente ao pote. Colocar os tubos de ensaio estril onde ser adicionado a Soluo de NaOH a 4% em uma estante e os tubos de meios de cultura em outra.

Procedimentos de realizao Sendo indicado somente para amostras de escarro espontneo, no necessitam de pr-tratamento. 1. Colocar 3 ml de Soluo de NaOH a 4% em cada tubo estril j identificado, utilizando pipeta estril e auxlio de pipetador automtico ou manual. 2. Colocar em cima da bandeja de metal somente o pote da amostra que ser processada e a correspondente lmina. 3. Abrir lentamente o pote da amostra a ser processada. 4. Preparar a baciloscopia direta conforme descrito no Captulo 6. 5. Introduzir o swab no pote contendo escarro, girando cuidadosamente dentro da amostra at que o mesmo fique impregnado com a poro mais purulenta. 6. Inserir o swab impregnado com a amostra no tubo contendo Soluo de NaOH a 4%, sem encostar na parede, e deixar em repouso at 2 minutos (mximo). Ateno: No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze estril ou papel de filtro antes de semear. 7. Aps esse tempo, passar o swab sobre a superfcie dos 2 tubos com meio OK e OK-PNB mediante movimentos rotatrios e em zigue-zague de maneira a espalhar bem o inculo. Se houver suspeita de infeco pelo M. bovis passar o swab sobre a superfcie dos 2 tubos com o meio OK, a seguir no meio OK-piruvato e por ltimo no meio OK-PNB. O PNB um inibidor qumico de crescimento do CMTB. 8. Descartar o swab no recipiente plstico. 9. Fechar os tubos de meio de cultura sem rosquear a tampa at o fim e colocar na estante. 10. Repetir os procedimentos de 1 a 9 para todas as amostras. 11. Fechar as tampas. Acondicionar os tubos de meios de cultura inclinados em uma bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa do tubo fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja. 12. Guardar na geladeira os potes de amostras, para repetio, se necessrio.

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13. Realizar a limpeza e descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado conforme descritos no Captulo 3. 14. Efetuar a colorao da lmina de baciloscopia direta e leitura conforme descritos no Captulo 6. 15. Realizar a incubao dos tubos de meio de cultura semeados conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 7 .10 .4 Mtodo do cido oxlico Descrio um mtodo alternativo, particularmente indicado para amostras pulmonares que contm Pseudomonas sp, como, por exemplo, o escarro de pacientes com fibrose cstica ou amostras de urina12,13. Materiais Equipamentos Cabine de Segurana Biolgica (CSB). Agitador mecnico Centrfuga com rotor para tubos de 50 ml. Estufa bacteriolgica a 36 1C. Pipetador automtico ou manual. Cronmetro. Reagentes Soluo de cido oxlico a 5%. Soluo salina estril. Soluo Indicadora (NaOH + Vermelho de fenol). Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Tubos de centrfuga de polipropileno, estreis, descartveis, com fundo cnico, de 30 ml ou de 50 ml, com tampa de rosca. Estante para tubos de centrfuga de 50 ml. Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ para cada amostra. Gaze estril em pedaos. Pipetas estreis de 5 ml e de 10 ml.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num volume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado a boca de um frasco Erlenmayer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca estreita). Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. Lminas para baciloscopia. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte.

Procedimentos de organizao 1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica na lmina, nos tubos de meios de cultura e no tubo de centrfuga. 2. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11. Realizar o procedimento 3 fora da CSB 3. Organizar os potes das amostras a serem descontaminadas, observando a correspondente identificao do nmero de registro no corpo do pote, no tubo de centrfuga, nos tubos de meios de cultura e na lmina. Colocar os tubos de centrfuga e os de meio de cultura em uma mesma estante. Realizar os procedimentos de 4 a 6 dentro da CSB 4. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3. 5. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. 6. Colocar as amostras que sero descontaminadas de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da bandeja. Procedimentos de realizao Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras descritas no Quadro 1. Acompanhar o Fluxograma do item 7.17.3.4 Figura 5 do Anexo deste Captulo. Realizar os procedimentos de 1 a 8 dentro da CSB 1. Colocar em cima da bandeja somente o pote da amostra que ser processada.

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2.

3. 4. 5.

6. 7. 8.

Transferir a amostra para o tubo de centrfuga de 50 ml, deixando escorrer suavemente o escarro pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso escorra o material para fora do tubo, limpar com gaze embebida em Soluo de Fenol a 5%. Colocar o tubo de centrfuga contendo a amostra em uma estante. Repetir esse procedimento para todas as amostras. Adicionar com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga a Soluo de cido oxlico a 5%, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar os tubos em agitador mecnico. Deixar os tubos de centrfuga em repouso por 30 minutos, para fluidificaodescontaminao agitando de vez em quando. Completar at o volume de 50 ml com Soluo salina estril.

Realizar os procedimentos de 9 a 11 fora da CSB 9. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos. 10. Aps a parada total da centrfuga, esperar 5 minutos para abrir. 11. Retirar as caapas fechadas da centrfuga e colocar na CSB. Realizar os procedimentos de 12 a 16 dentro da CSB 12. Abrir as caapas e acondicionar os tubos da centrfuga em uma estante. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respingos. 13. Neutralizar o sedimento com Soluo indicadora at o aparecimento de cor rsea. 14. Semear com pipeta estril, 0,1 ml do sedimento em cada um dos tubos de meio de cultura, distribuindo em toda a superfcie do meio. No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze ou papel de filtro estreis antes de semear. Preparar o esfregao da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do sedimento na lmina. 15. Fechar os tubos de meio de cultura slidos sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Realizar os procedimentos de 17 a 21 fora da CSB 16. Retirar os tubos de meios slidos semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. 17. Acondicionar os tubos de meios slidos, inclinados em uma bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a su-

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

perfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja. 18. Realizar a incubao dos tubos de cultura slidos semeados conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 19. Realizar a limpeza e descontaminao da bancada e o descarte do material conforme descrito no Captulo 3. 20. Efetuar a fixao, colorao da lmina de baciloscopia concentrada e leitura conforme descrito no Captulo 6. OBSERVAO: Uma alternativa acrescentar cido oxlico a 5% no sedimento obtido aps centrifugao pelo mtodo NALC-NaOH .

7 .11 Procedimentos para incubao nos mtodos clssicos


Aps a realizao das etapas de pr-tratamento, fluidificao-descontaminao e semeadura nos meios de cultura indicados, esses so colocados em temperaturas apropriadas e constantes, para o tempo de incubao necessrio ao desenvolvimento de micobactrias. 1. Inclinar os tubos de meios de cultura semeados em bandejas de polipropileno, com a superfcie do meio voltada para cima e as tampas semi-rosqueadas, para garantir a secagem do inculo. 2. Incubar temperatura de 36 1C os tubos de meio de cultura semeados com qualquer tipo de amostra clnica, visando o desenvolvimento das espcies do CMTB. 3. No caso de meios de cultura com adio de piruvato para pesquisa de M. bovis, incubar temperatura de 36 1C e , se possvel, dar condies de microaerofilia (5 a 10% de CO2). 4. No caso de suspeita clnica de patologia causada por M.marinum e M. ulcerans (amostras oriundas de tecido cutneo), incubar temperatura de 30 1C um dos tubos de meio de cultura. 5. No caso de meios de cultura com adio de citrato frrico amoniacal para pesquisa de M. haemophilum, incubar temperatura de 30 1C. 6. Aps 48 horas de incubao, conferir se h contaminao em todos os tubos, rosquear completamente as tampas e conservar incubados pelo tempo recomendado no item 7.11.

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7 .12 Procedimentos de leitura, interpretao e registro dos resultados nos mtodos clssicos
Realizar a leitura dos tubos semeados em bancada bem iluminada, prxima janela ou com foco de luz prximo (luminria), aps 48 horas de incubao e posteriormente de 7 em 7 dias (leituras semanais) at completar 8 semanas. Nos meios de cultura slidos, as colnias de micobactrias podem ser visualizadas a olho nu, entre 3 e 7 dias (espcies de crescimento rpido) ou aps (espcies de crescimento lento). Em amostras paucibacilares podem ser necessrias at 8 semanas para as colnias se tornarem visveis. No caso de meios de cultura com adio de piruvato para pesquisa de M. bovis, o tempo de incubao de at 16 semanas. O crescimento disgnico, com colnias pequenas, lisas e planas. Para acompanhar a leitura, observar o Fluxograma de Leitura das Culturas em Meios Slidos descritos no item 7.17.3.6 do anexo deste captulo. Os formulrios Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade e Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias esto descritos no Captulo 1. Procedimentos de leitura aps 48 horas de incubao 1. Fechar os tubos rosqueando as tampas completamente. 2. Verificar a contaminao (presena de colnias microbianas bactrias ou fungos) pela mudana de colorao ou liquefao dos meios. Quando presentes, descartar o tubo. Se todos os tubos estiverem contaminados e no existir mais a amostra, registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidadee emitir o resultado no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias como Cultura contaminada. Solicitamos nova amostra (Situao 3). A cultura no pode ter continuidade apenas com o tubo com meio OK-PNB ou LJ-PNB. 3. Voltar a incubar os tubos em que no houve contaminao ou alterao do meio. Procedimentos de leituras semanais 1. Registrar a leitura semanal no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL com todas as observaes, referentes a cada tubo de cultura de cada amostra, como: data da leitura, nmero de colnias visualizadas de acordo com a escala semiquantitativa, caractersticas morfolgicas das colnias em relao presena de pigmento, aspecto (lisa ou rugosa), e contaminao parcial ou total de cada tubo.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Os critrios para leitura das culturas em meio slido so apresentados na escala semiquantitativa abaixo. Escala Semiquantitativa Menos de 20 colnias = Cultura Positiva (nmero de colnias). De 20 a 100 colnias = Cultura Positiva (+). Mais de 100 colnias separadas = Cultura Positiva (++). Colnias confluentes (tapete) = Cultura Positiva (+++). As seguintes situaes so possveis 2. Situao 1: Incubar novamente os tubos em que no so visualizadas colnias, realizar as leituras nas prximas semanas at completar oito semanas. Permanecendo negativos na oitava semana desprezar os tubos registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade, no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL e emitir o resultado no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias como Cultura Negativa. 3. Situao 2: Para os tubos onde so visualizadas colnias, realizar a baciloscopia conforme descrito no Captulo 6, para confirmar a presena de BAAR. ATENO: Para os laboratrios que realizarem o Mtodo de OgawaKudoh e no possurem CSB, no realizar a baciloscopia desses tubos nesses laboratrios . Os tubos onde so visualizadas colnias devem ser encaminhados para um Laboratrio de Referncia conforme descrito no Captulo 1, pois a baciloscopia realizada a partir de colnias aumenta muito o risco biolgico . Quando h presena de BAAR: Situao 2A: aps 7 dias de incubao, havendo visualizao de mais de 20 colnias de cor creme e rugosas, em um ou mais dos tubos com meio LJ ou OK e ausncia de colnias no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB consultar a escala semi-quantitativa para a interpretao dos resultados, levando em conta o nmero de colnias visualizadas. A seguir: a) registrar todas as informaes observadas e o resultado Cultura positiva para BAAR (......), sugestiva de micobactrias do Complexo M. tuberculosis (CMTB) no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL. b) separar o tubo com meio LJ ou OK com crescimento e encaminhar para a identificao e para o TS se atender aos critrios e realizao;

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emitir o resultado no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias como Cultura positiva para BAAR (......), sugestiva de micobactrias do Complexo M. tuberculosis (CMTB). Situao 2B: aps 7 dias de incubao, havendo visualizao de menos de 20 colnias de cor creme e rugosas, em um ou mais dos tubos com meio LJ ou OK e ausncia de colnias no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB, consultar a escala semi-quantitativa para a interpretao dos resultados, levando em conta o nmero de colnias visualizadas. A seguir: a) registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidadee no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL todas as informaes observadas e o resultado Cultura positiva para BAAR (......), sugestiva de micobactrias do Complexo M. tuberculosis (CMTB). b) realizar subcultivo e aps encaminhar para a identificao e TS se atender aos critrios de realizao. c) emitir no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias o resultado como Cultura positiva para BAAR (......), sugestiva de micobactrias do Complexo M. tuberculosis (CMTB). Situao 2C: havendo visualizao de mais de 20 colnias com ou sem pigmento, lisas, opacas ou brilhantes, em um ou mais dos tubos com meio LJ ou OK e no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB antes ou aps 7 dias de incubao, consultar a escala semi-quantitativa e: a) registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL o nmero de colnias e todas as demais informaes observadas e o resultado Cultura positiva para BAAR (......), sugestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT). b) separar um dos tubos com meio LJ ou OK e encaminhar para a identificao TS se atender aos critrios de realizao. c) emitir no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias o resultado Cultura positiva para BAAR (......), sugestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT). Situao 2D: havendo visualizao de menos de 20 colnias com ou sem pigmento, lisas, opacas ou brilhantes, em um ou mais dos tubos com meio LJ ou OK e no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB, antes ou aps 7 dias de incubao, consultar a escala semi-quantitativa: a) registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL o nmero de colnias, todas as demais informaes

c)

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

4.

5.

6.

observadas e o resultado como Cultura positiva para BAAR (......), sugestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT). b) separar um dos tubos com meio LJ ou OK, realizar subcultivo antes de encaminhar para a identificao e TS se atender aos critrios de realizao. c) Emitir no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias o resultado Cultura positiva para BAAR (......), sugestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT). Para a situao 2D, se o isolamento dessas colnias foi a partir de amostra colhida de stio no estril, solicitar novas amostras (3 isolados de um mesmo tipo de amostra). Esse procedimento para verificar se o isolamento de colnias de micobactrias indica uma presena temporria ou se representa um possvel quadro clnico de micobacteriose. Em todas as situaes, realizar a identificao conforme descrito no Captulo 8. Se o laboratrio que no estiver habilitado a realizar a identificao, encaminhar para um Laboratrio de Referncia conforme descrito no Captulo 1. Quando a baciloscopia no confirma a presena de BAAR, indica que h contaminao. Se o tubo de meio estiver contaminado parcialmente, incubar novamente. Se todos os tubos estiverem contaminados, informa-se o resultado como Cultura contaminada (Situao 3). A cultura no pode ter continuidade apenas com o tubo com meio OK-PNB ou LJ-PNB.

7 .13 Subcultivo
Descrio Consiste na preparao de uma suspenso bacteriana a partir de uma cultura com raras colnias que sero inoculadas em meios com LJ ou OK, cujo objetivo aumentar a massa bacteriana, pois para realizar as provas de identificao das espcies de micobactrias necessrio um crescimento abundante. Precauo Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um tubo de cultura de cada vez, com cuidado para evitar a formao de aerossis. Materiais Equipamentos Cabine de Segurana Biolgica (CSB). Estufa bacteriolgica a 36 1C.

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Pipetador automtico ou manual. Agitador mecnico.

Reagentes gua destilada estril. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Tubos de ensaio 20 x 150 mm, de paredes reforadas, com tampa de rosca, contendo 10 prolas de vidro, estreis. Estante para os tubos de ensaio estril 20 x 150 mm. Gaze estril em pedaos. Pipetas estreis de 1 ml. Ala descartvel. Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ ou OK. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Procedimentos de organizao Realizar os procedimentos de 1 a 3 fora da CSB 1. Identificar o nmero da cultura nos tubos de meios com LJ ou OK e no tubo de ensaio com prolas. 2. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11. 3. Organizar os tubos de cultura observando a correspondente identificao do nmero de registro no tubo de ensaio com prolas e nos tubos de meios de cultura. Colocar os tubos de ensaio com prolas e os de meio de cultura em uma mesma estante. Realizar os procedimentos de 4 a 5 dentro da CSB 4. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

5.

Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente.

Procedimentos de realizao Realizar os procedimentos de 1 a 5 dentro da CSB 1. Transferir, com ala descartvel estril, algumas colnias da cultura para um tubo de ensaio com prolas e 1 ml de gua destilada estril. 2. Homogeneizar em agitador mecnico. 3. Manter em repouso por 10 minutos. 4. Semear com pipeta estril 0,1 ml da suspenso em 2 tubos com meio LJ ou OK. No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze ou papel de filtro antes de semear. 5. Fechar os tubos com meio de cultura sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Realizar os procedimentos de 6 a 10 fora da CSB 6. Retirar os tubos de meios de cultura semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. 7. Acondicionar os tubos de meios de cultura, inclinados em uma bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja. 8. Realizar a incubao dos tubos de meio de cultura semeados conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 9. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado de acordo com as instrues descritas no Captulo 3. 10. Realizar a leitura das culturas conforme descrito no item 7.12 deste captulo.

7 .14 Sistemas comerciais automatizados de cultura


7 .14 .1 Descrio Os sistemas comerciais automatizados de cultura so compostos por: (a) um frasco contendo meio de cultura com um sensor interno que pode ser colorimtrico, fluorimtrico ou de presso, de acordo com o fabricante; (b) um suplemento antibitico e de enriquecimento; e (c) uma incubadora para acondicionamento dos frascos inoculados com as amostras clnicas que monitoram de forma contnua a deteco do crescimento bacteriano. Podem ser usados para a maioria das amostras clnicas e apresentam a vantagem de detectar precocemente o crescimento bacteriano. Contribui para melhorar o diagnstico de micobactrias14,15,16,18.

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7 .14 .2 Procedimentos de semeadura em sistemas comerciais Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana, como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados conforme descrito no Captulo 3. Dependendo do sistema comercial escolhido, amostras de sangue e medula ssea no podero ser processadas, sendo que cada fabricante esclarece essas caractersticas. O pr-tratamento das amostras clnicas segue as mesmas recomendaes para os mtodos clssicos e a fluidificao-descontaminao das amostras deve ser realizada preferencialmente pelo mtodo de NALC-NaOH. Semear em paralelo um tubo com meio LJ. Observaes As frmulas para o preparo dos reagentes de fluidificao-descontaminao e do meio de cultura LJ esto descritas no anexo deste captulo e Soluo de lcool a 70% esto descritas no Captulo 3. Materiais Equipamentos Cabine de Segurana Biolgica (CSB) Sistema de incubao e deteco automtica a 36 1C. Estufa bacteriolgica convencional a 36 1C. Micropipetas automticas. Reagentes Suplemento de enriquecimento (de acordo com o fabricante). Suplemento antibitico liofilizado (de acordo com o fabricante). Soluo salina estril. gua destilada estril. Soluo de lcool 70%. Soluo Tampo Fosfato pH 6,8. Soluo de Fenol a 5%. Insumos. Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandeja de metal. Estante para tubos de centrfuga de 30 ml e 50 ml.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Amostras clnicas j descontaminadas (quando necessrio) em tubos de 50 ml, com tampa de rosca. Criotubos. Ponteiras com barreiras, estreis. Gaze estril em pedaos. Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num volume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado boca de um frasco Erlenmeyer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca estreita). Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Meio de cultura slido: 1 tubo com meio LJ. Frascos com meio de cultura lquido especfico de cada sistema. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. Lminas para baciloscopia. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte.

Procedimentos de organizao Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras conforme descrito no item 7.5 deste captulo e realizar a etapa de descontaminao pelo mtodo NALC-NaOH, conforme descrito no item 7.10.2 deste captulo. Realizar os procedimentos de 1 a 7 fora da CSB 1. Separar os frascos de meio lquido de acordo com o nmero de amostras a ser inoculadas e deixar temperatura ambiente de 30 a 60 minutos antes da inoculao. 2. Todas as amostras clnicas que foram descontaminas pelo mtodo NALC-NaOH devem estar nos tubos de centrfuga de 50 ml, devidamente identificadas com o nmero de resgistro e colocadas em estante. Ressuspender o sedimento com Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 at um volume final de 1 a 3 ml. 3. Identificar com o nmero de registro as amostras clnicas que no necessitam de descontaminao. 4. Identificar com o mesmo nmero de registro das amostras clnicas as lminas, os frascos de meio lquido e os tubos com meio LJ correspondentes. 5. Cadastrar os frascos de meio lquido no sistema de incubao e deteco automtica, pelo cdigo de barras, de acordo com instrues do fabricante. 6. Preparar a CSB, conforme descrito no Captulo 11.

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7.

Reconstituir o suplemento antibitico com o suplemento de enriquecimento, dissolvendo com cuidado o liofilizado. Ateno: aliquotar o suplemento antibitico reconstitudo em criotubos, uma vez que a validade de 7 dias quando guardado em refrigerao (2 a 8C) e 30 dias em freezer (-20C). Marcar a data de validade em cada criotubo.

Realizar os procedimentos de 8 a 10 dentro da CSB 8. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3. 9. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. 10. Colocar as amostras de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da bandeja. Procedimentos de realizao Realizar os procedimentos de 1 a 10 dentro da CSB 1. Colocar em cima da bandeja de metal a estante com as amostras previamente descontaminadas e/ou as amostras estreis. 2. Desinfetar os frascos de meio lquido com Soluo de lcool a 70% e deixar secar a temperatura ambiente. 3. Para as amostras previamente descontaminadas assepticamente, adicionar com micropipeta o volume adequado do suplemento antibitico reconstitudo com o enriquecimento a cada frasco de meio lquido. 4. Para as amostras estreis adicionar somente o suplemento de enriquecimento, com micropipeta, a cada frasco de meio lquido. Ateno: cuidado especial com a manipulao do suplemento de enriquecimento para no introduzir contaminantes no tubo de meio lquido. 5. Inocular assepticamente, com micropipeta, o volume de amostra recomendado pelo fabricante, no frasco de meio lquido. 6. Antes de colocar no sistema de incubao e deteco automtica, desinfetar os frascos de meio lquido com Soluo de lcool a 70% e deixar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7. Colocar os tubos de meio lquido inoculados no sistema de incubao e deteco automtica, de acordo com as instrues do manual do fabricante. 8. Inocular assepticamente, com micropipeta, a amostra previamente descontaminada ou a amostra no estril em um tubo com meio LJ. 9. Preparar o esfregao da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do sedimento na lmina.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

10. Fechar os tubos de meio de cultura LJ sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Realizar os procedimentos de 11 a 16 fora da CSB 11. Retirar os tubos com meio LJ semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. 12. Acondicionar os tubos de LJ, inclinados em uma bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. 13. Incubar na estufa a 36C ( 1C) os tubos com meio LJ inclinados. 14. Realizar a incubao dos tubos de meio LJ semeados conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 15. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado de acordo com as instrues descritas no Captulo 3. 16. Realizar a leitura das culturas conforme descrito no item 7.12 para os meios LJ e item 7.14.2 para os meios lquidos deste captulo. 7 .14 .3 Procedimentos para incubao nos sistemas comerciais Aps a realizao das etapas de pr-tratamento, fluidificao-descontaminao e semeadura (inoculao) nos meios de cultura lquidos, incubar os mesmos em temperaturas apropriadas e constantes, durante o tempo necessrio ao desenvolvimento de micobactrias. Seguir o protocolo do fabricante. 1. Colocar os frascos no sistema de incubao e deteco automtica, onde sero monitorados continuamente durante 42 dias. Ateno: Nos sistemas automatizados que aceitam amostras de sangue, os frascos de meio lquido, inoculados com essas amostras devero permanecer incubados por 56 dias, no mnimo. 2. Quando o sistema de incubao e deteco automatizada acusar que um frasco de meio lquido positivo, retirar do sistema, assim como todos os frascos negativos aps 42 dias de incubao. 7 .14 .4 Leitura dos meios lquidos nos sistemas comerciais De acordo com o fabricante, o sistema de deteco de crescimento bacteriano pode ser realizado pelo consumo de O2 ou produo de CO2. O sistema de leitura do equipamento registrar as variaes de presso que, mediante um programa de computador, prprio de cada sistema, indicar a existncia ou no do crescimento micobacteriano e/ou bacteriano sinalizando o frasco de meio de cultura como positivo. Em todos os

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frascos de meio lquido, detectados como positivos confirmar a presena de BAAR pela realizao da baciloscopia, conforme descrita no Captulo 6. Realizar o procedimento 1 dentro da CSB 1. Agitar bem o frasco de meio lquido detectado como positivo para obter uma suspenso homognea. Retirar com micropipeta metade do volume do frasco do meio lquido e acondicionar em um tubo cnico de 30 ml ou 50 ml. Realizar os procedimentos de 2 a 4 fora da CSB 2. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos. 3. Aps a parada total da centrfuga, esperar 5 minutos para abrir. 4. Retirar as caapas fechadas da centrfuga e colocar na CSB. Realizar os procedimentos de 5 a 8 dentro da CSB 5. Abrir as caapas e acondicionar os tubos em uma estante. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respingos. 6. Ressuspender o sedimento com 1 ml de gua destilada estril ou Soluo salina estril. 7. Passar o sedimento ressuspenso para um criotubo. 8. Preparar esfregao de baciloscopia concentrada depositando duas gotas sobre lmina de microscopia. Realizar os procedimentos 9 a 12 fora da CSB 9. Manter o frasco de meio lquido com a metade do volume em estufa bacteriolgica a 36 1C e o criotubo com o sedimento ressuspenso a 20C, enquanto se aguarda o resultado da baciloscopia. 10. Para o descarte dos frascos de meio lquidos, seguir as recomendaes do fabricante. 11. Realizar a limpeza e descontaminao da CSB e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3. 12. Efetuar a fixao, colorao da lmina de baciloscopia concentrada e leitura conforme descrito no Captulo 6. Interpretao dos resultados 13. Se confirmada a presena de BAAR, semear com pipeta estril, 0,1 ml do sedimento ressuspenso conservado no criotubo em 2 tubos com meio LJ ou OK. No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze ou papel de filtro estreis antes de semear em um tubo com meio LJ.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

14. Realizar a incubao dos tubos de meio de cultura semeados, conforme descrito no item 7.11 deste captulo. 15. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado de acordo com as instrues descritas no Captulo 3. 16. Realizar a leitura das culturas conforme descrito no item 7.12 deste captulo. 17. Se a baciloscopia apresentar resultado negativo, pode indicar resultado falso-positivo. Nesse caso, reincubar o frasco no sistema de incubao e deteco automatizada. 18. Se houver presena de BAAR e de outros microrganismos contaminantes centrifugar o restante do volume do frasco de meio lquido que foi conservado na estufa a 36 1C (subitem 9) e proceder conforme descrito nos subitens 2 a 6. Juntar o sedimento obtido com aquele conservado a 20C, proceder a descontaminao utilizando mtodo descrito no item 7.10 e inocular em um novo frasco de meio lquido obedecendo as recomendaes descritas nos subitens 1 a 6 da etapa de procedimentos de realizao.

7 .15 Controle de qualidade da cultura


7 .15 .1 Controle de qualidade interno 7 .15 .1 .1 Descrio Um sistema de garantia da qualidade um conjunto de atividades planejadas que, inseridas ao processo de um produto ou servio, tem como objetivo reduzir o risco de falhas. A garantia da qualidade com relao cultura de micobactrias um sistema projetado para melhorar continuamente a confiabilidade, eficincia e o uso dessa metodologia nos servios que a realizam. Os componentes do Sistema de Garantia da Qualidade (SGQ) so: Controle de Qualidade Interno (CQI); Melhoria da Qualidade e Teste de Proficincia. Para um SGQ ser efetivo, ele deve ser prtico e factvel. O CQI da cultura um dos componentes do Sistema de Garantia da Qualidade e responsabilidade de cada laboratrio que executa as tcnicas. um processo de efetivo e sistemtico monitoramento interno do desempenho da bancada de trabalho, assegurando que a informao gerada seja confivel, precisa, reprodutvel e sirva de mecanismo mediante o qual os laboratrios possam validar a competncia dos servios de diagnstico. Essa estratgia de controle interna porque feita dentro do prprio laboratrio, que deve estabelecer na sua rotina de trabalho um sistema de controle sistemtico e tambm registrar os resultados decorrentes desses controles. O responsvel tcnico deve realizar uma reviso peridica dos pontos crticos e monitorar os resultados com objetivo de evitar ou minimizar erros tcnicos.

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O CQI da cultura inclui o controle dos materiais, insumos, reagentes, equipamentos, procedimentos tcnicos (metodologias), o monitoramento dos resultados e as medidas corretivas a serem aplicadas quando a impreciso dos resultados excede os limites considerados aceitveis. Todos os procedimentos tcnicos usados na rotina do laboratrio devem ser aqueles publicados em livros, manuais ou peridicos de microbiologia reconhecidos pela comunidade cientfica e devem ser registrados em documentos que permitam seu monitoramento. O uso correto e o monitoramento dos equipamentos esto descritos no Captulo 11 e so fundamentais para a qualidade dos exames realizados e este implica executar um conjunto de procedimentos que registrem o desempenho de um determinado equipamento. Dessa forma, o profissional do laboratrio responsvel no s pela tcnica correta de uso, como tambm pelo monitoramento e a conservao de todos os equipamentos que fazem parte de sua rotina laboratorial. No item 7.17.4 esto descritos modelos de formulrios para acompanhar os procedimentos relativos ao CQI da cultura19. Esses documentos devem ser mantidos em lugar acessvel no laboratrio para uma consulta fcil e qualquer mudana deve ser registrada pelo profissional responsvel. 7 .15 .1 .2 CQI dos meios de cultura LJ e OK Normalmente os meios de cultura para micobactrias utilizados nos laboratrios da rede pblica so LJ ou OK, preparados pelo prprio laboratrio. Cada novo lote de meios deve ser submetido ao CQI, antes de ser utilizado na rotina, considerando o processo de produo, os aspectos macroscpicos, controle de esterilidade e microbiolgico dos meios prontos. O laboratrio deve organizar e estabelecer um cronograma de produo e CQI dos meios de cultura capaz de evitar a interrupo no suprimento e prejuzos rotina do diagnstico. Uma boa prtica reservar alguns tubos de meios de cultura aprovados pelo CQI para semear as amostras clnicas de rotina enquanto est sendo realizado o CQI do novo lote de meios. As recomendaes quanto ao preparo dos meios de cultura esto descritos no item 7.17.2 deste captulo: qualidade dos ovos, homogeneizao, volume e agitao durante a distribuio nos tubos, inclinao da bandeja do coagulador, temperatura e tempo de coagulao. Outras consideraes so importantes ressaltar: utilizar produtos qumicos de qualidade analtica certificada, vidraria limpa e esterilizada e seguir estritamente as instrues para preparao. Os formulrios para registrar as atividades da produo dos meios de cultura esto descritas no item 7.17.4 deste captulo. Os meios de cultura em processo de CQI devem ser devidamente acondicionados em local separado dos meios de cultura j aprovados.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

No perodo em que o lote de meios de cultura estiver sendo testado, este dever ser guardado ao abrigo da luz, acondicionados em recipientes fechados com etiqueta externa contendo as informaes do nome do meio, nmero do lote, data de fabricao e a advertncia: CQI em andamento. Os itens a seguir orientam para um roteiro de monitoramento do CQI dos meios de cultura produzidos pelo laboratrio: (1) produo do lote de meio de cultura. (2) avaliao dos aspectos macroscpicos. (3) controle de esterilidade. (4) controle microbiolgico. Ao final, o lote pode ser ou no aprovado para uso na rotina do laboratrio. 7 .15 .1 .2 .1 Aspectos macroscpicos Aps a coagulao os meios de cultura devem ser avaliados quanto ao aspecto macroscpico. Descartar os tubos de meios que estiverem fora dos critrios especificados a seguir: Cor: considera-se normal quando a colorao homognea. Diferena de colorao entre os tubos de um mesmo lote de meios de cultura evidenciam que a homogeneizao no foi completa durante a preparao. Uma colorao mais clara pode indicar alcalinidade do meio, menor concentrao e/ou soluo no fresca do verde malaquita ou resduo de detergente no tubo. Uma colorao mais intensa pode indicar acidez do meio ou maior concentrao de verde malaquita. Consistncia: o meio de cultura dever estar firme e aderido s paredes do tubo de tal forma que no se rompa no momento da semeadura, especialmente com o uso do swab. Os meios com consistncia mole so produto de mistura inadequada dos componentes e/ou do tempo ou temperatura da coagulao insuficiente. Volume e inclinao: o volume ideal para um tubo de 20 x 150 mm aquele que permite que, aps a coagulao, o tubo tenha 1 cm na parte inferior preenchido com meio e o restante distribudo em bisel com espao suficiente para uma boa leitura visual, terminando a 2 cm da rosca. Para que isso acontea, acertar o volume envasado no tubo com a inclinao da bandeja do coagulador. A Figura 1 mostra a proporo do volume distribudo e a inclinao do tubo no momento da coagulao20. Figura 1. Meio de cultura com distribuio do meio e volumes corretos

Instituto Nacional de salud. Subdirecion de Epidemiologia y Laboratrio Nacional de Referencia. Laboratrio de Micobactrias. Bacteriologia del Mycobacterium tuberculosis y de Micobactrias no Tuberculosas. Manual de Procedimientos. Bogot, Colmbia. 2001.

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Textura: durante a distribuio do meio nos tubos de ensaio recomenda-se uma agitao constante para manter o meio homogeneizado e a agitao deve ser suave para evitar a formao de bolhas de ar. Mesmo com esse cuidado, se aps a coagulao, houver orifcios e irregularidades na superfcie do meio, estes indicam que a temperatura de coagulao foi superior a 80C e a qualidade do meio est comprometida. 7 .15 .1 .2 .2 Controle de esterilidade o procedimento utilizado no laboratrio para monitorar a esterilidade dos reagentes e insumos utilizados na produo dos meios de cultura e assim verificar a presena de contaminantes que prejudiquem o crescimento de micobactria. Considera-se contaminao a presena de microrganismos que produzam enzimas proteolticas capazes de liquefazer o meio que contm ovos, alterando a cor e a consistncia do meio. A presena de alguns fungos s ser percebida ao final de 2 semanas. Para realizar os testes, seguir os procedimentos. 1. Incubar todo o lote de meios produzidos por 48 horas a 36 1C, para verificar a ausncia de bactrias e deixar 1% do lote at completar duas semanas para verificar a ausncia de fungos. 2. Afrouxar as tampas de rosca para que penetre o oxignio e tambm proporcione a secagem da gua de condensao formada durante a coagulao. 3. Havendo ausncia de contaminao, o lote ser considerado aprovado pelo controle de esterilidade. 4. Havendo contaminao total dos meios, o lote dever ser considerado reprovado pelo controle de esterilidade e imediatamente descartado. 5. Caso ocorra contaminao parcial do lote, descartar os tubos contaminados e reincubar os outros por mais 24 horas. Aps esse perodo, no havendo contaminao, o lote considerado aprovado pelo controle de esterilidade; se houver contaminao, o lote considerado reprovado pelo controle de esterilidade e imediatamente descartado. 6. O lote de meios aprovados pelo controle de esterilidade encaminhado para o controle microbiolgico. 7 .15 .1 .2 .3 Controle microbiolgico O controle microbiolgico do meio de cultura utiliza cepas de referncia e mede a capacidade do meio de cultura em proporcionar crescimento de micobactrias, avaliado pelo nmero de unidades formadoras de colnias estabelecidas como critrios de desempenho do meio de cultura.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Cepas de Referncia So culturas de microrganismos, padro da descrio original da espcie, devidamente classificados segundo suas caractersticas qualitativas, a partir das quais novas espcies so descritas. So fornecidos por instituio de reconhecimento internacional: ATCC Amercican Type Culture Colection (EUA) e NCTC National Collection of Type Cultures (Reino Unido). So utilizadas para controlar o desempenho e a qualidade de testes laboratoriais, de meios de cultura e de reagentes, pois mantm sua estabilidade gentica assegurada, desde que bem conservados e manipulados no laboratrio. No Captulo 10, so apresentadas as recomendaes para conservao e manuteno. Tambm chamadas cepas-controle, amostras-tipo ou cepas-padro. A cepa de referncia a ser utilizada no teste depende do meio de cultura que est sendo testado. Para testar os meios LJ ou OK utilizados para isolamento de micobactrias em geral, utiliza-se cepas de M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 ou M tuberculosis H37Ra ATCC 25177. Para os meios com piruvato de sdio a cepa utilizada a de M. bovis ATCC 19210 e para meios com adio de citrato frrico amoniacal a cepa de M. haemophilum ATCC 29548. Procedimentos de realizao Realizar os procedimentos do controle microbiolgico dentro da CSB. Os procedimentos para preparao da Escala McFarland esto descritos no item 7.17.2.9 deste captulo. 1. Aps a aprovao no item controle de esterilidade, separar 6 tubos do lote de meios em estudo, escolhidos ao acaso, para ser testado pelo controle microbiolgico. 2. Preparar suspenso da cepa referncia, padronizada pela turvao do tubo N 1 da Escala McFarland, a partir de um crescimento em meio slido, em fase logartmica (mdia de 21 dias): Retirar com ala bacteriolgica descartvel estril o maior nmero possvel de colnias para ser representativa. 3. Transferir para um tubo de ensaio com tampa de rosca, 20 x 150 mm (de paredes reforadas), contendo 10 prolas de vidro, estreis e 0,5 (at 1 ml) de gua destilada estril. 4. Homogeneizar em agitador mecnico por 20 a 30 segundos. 5. Manter em repouso por 10 minutos para sedimentar os grumos maiores. 6. Transferir, com pipeta estril, o sobrenadante para outro tubo de ensaio estril, tendo cuidado para no levar os grumos. 7. Ajustar a turvao da suspenso da cepa de referncia com a turvao do tubo N 1 da Escala McFarland utilizando gua destilada estril, gota a gota. 8. A partir dessa suspenso padronizada, efetuar seis novas diluies em escala decimal: Identificar seis tubos de ensaio de 20 x 150 mm e com tampa de rosca, estreis, como 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6.

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9. Colocar 9 ml de gua destilada estril em cada um deles. 10. Transferir 1 ml da suspenso padro para o tubo 10-1, agitar no agitador mecnico. 11. Trocar a pipeta e seguir as diluies, transferindo 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-6. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis. 12. Identificar 2 tubos do lote de meios em estudo como 10-3, 2 tubos como 10-5 e 2 como 10-6 e inocular 0,1 ml das diluies nesses tubos. 13. Acondicionar os tubos de meios inoculados em bandeja de polipropileno, inclinados de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. 14. Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 48 horas e aps fechar as tampas completamente e aguardar na estufa. 15. Aps 20 dias, realizar a leitura em cada um dos tubos de cada diluio e registrar as contagens correspondentes das colnias (UFC = Unidade Formadora de Colnias). Obter a mdia das UFC, de forma separada para cada diluio. Interpretao dos resultados Aps obter a mdia do nmero de colnias em cada diluio, para o crescimento nos meios de cultura em estudo, interpret-los comparando com o nmero de colnias esperado para cada diluio, como segue: Tubo 10-3: crescimento confluente de colnias (incontveis) Tubo 10-5: crescimento de 50 a 150 UFC (colnias contveis) Tubo 10-6: crescimento de 1 ou 2 colnias O lote de meios de cultura ser considerado aprovado pelo controle microbiolgico quando a mdia das UFC forem compatveis com as mdias das UFC esperadas. Se nesse perodo no houver crescimento de nenhuma colnia, ou raras colnias no tubo 10-3, o lote em estudo no est satisfatrio e as amostras semeadas neste lote esto comprometidas. Nesse caso, identificam-se quais as amostras foram semeadas com esse lote e para aquelas cujos resultados so negativos devem ser semeadas novamente em outro lote aprovado. O lote deve ser etiquetado: aprovado pelo CQI, assim como as demais identificaes, nome do produto, nmero do lote, data de fabricao e de validade e as condies de armazenamento e conservao. 7 .15 .1 .2 .4 Meios de cultura LJ comerciais No Brasil, existem meios de cultura LJ comercialmente produzidos. importante que o produto seja registrado no Ministrio da Sade e, no caso da aquisio, o fabricante deve apresentar documento da certificao de qualidade para a produo.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Para uso na rede de laboratrios de diagnstico de tuberculose, recomenda-se que os mesmos sejam testados de acordo com o descrito neste captulo. Para cada lote do meio adquirido, em cada tubo, dever constar o nome do produto, nmero do lote, a data de fabricao e de validade e as condies de armazenamento e conservao. 7 .15 .1 .2 .5 Utilizao e armazenamento do lote aprovado A utilizao do meio de cultura para uso em rotina de amostras clnicas deveria ser somente aps a liberao do CQI, com aprovao. Entretanto, devido ao lento crescimento das micobactrias que requer aproximadamente um ms, e ao tempo de validade do meio preparado (2 meses), prtica aceita internacionalmente, a semeadura das amostras clnicas simultaneamente ao controle microbiolgico do meio21,22. O laboratrio deve registrar no Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade, para cada amostra semeada, o nmero do lote do meio utilizado. Esta prtica assegura que qualquer irregularidade encontrada no lote testado pelo controle de qualidade, possa servir para medidas corretivas na preparao dos prximos lote de meios. Para contornar situaes em que o lote de meio testado for reprovado e com isso haja perda de amostras clnicas, indicada a utilizao, em paralelo, de um lote de meio j conhecidamente testado e aprovado pelo CQI para a semeadura das amostras clnicas. Portanto, o laboratrio deve se organizar para ter na geladeira alguns tubos de meios do lote anterior j aprovado pelo CQI para semear em paralelo s amostras clnicas at ter a aprovao do novo lote que est sendo testado simultaneamente. Os meios de cultura LJ e OK, quando armazenados dentro de sacos de plstico fechados para no desidratar, mantidos sob refrigerao (2-8C) e ao abrigo da luz, tm validade de at 2 meses. No item 7.17.4.1.7 deste captulo est descrito o formulrio que permite identificar individualmente os lotes de meios de cultura deficientes e descart-los. 7 .15 .1 .3 CQI dos reagentes Para cada lote de produo ou de aquisio dos reagentes utilizados na etapa de fluidificao-descontaminao da cultura importante monitorar a qualidade da preparao do reagente, a qualidade de uso do reagente e os resultados das culturas comparados s baciloscopias. As Planilhas do CQI dos reagentes esto descritas no item 7.17.2 deste captulo. Qualidade da preparao do reagente 1. Procedncia (fabricante), nmero do lote do fabricante, data de validade. 2. Pesagem, pH, processo de esterilizao em autoclave.

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3.

Depois de pronto e antes do uso, realizar o controle de esterilidade, semeando uma placa de agar sangue e incubando a 36 1C por 5 dias. Para aprovao o lote no dever apresentar crescimento de microrganismos.

Qualidade de uso dirio 4. Aliquotar em volumes suficientes para um dia de trabalho e diariamente, antes do uso, comprovar que os reagentes apresentam as caractersticas macroscpicas de estabilidade e esterilidade. Monitoramento das culturas 5. A observao dos resultados da baciloscopia e da cultura (escala de cruzes) tambm pode avaliar o lote do reagente de descontaminao, pois: resultados de baciloscopia positiva e cultura positiva prximos de resultados de baciloscopia negativa e cultura negativa ou positiva: o lote do reagente est adequado e prprio para o uso. resultado de baciloscopia negativa e cultura positiva confirmam a efetividade do reagente e do procedimento de descontaminao, porque a cultura um mtodo mais sensvel que a baciloscopia. resultados de baciloscopia positiva e cultura negativa indicam que o reagente utilizado est com nvel de concentrao mais alto do que o especificado e, portanto, imprprio para uso. Nesse caso, o lote do reagente est inadequado e no pode ser utilizado. 7 .15 .1 .4 CQI do processamento das amostras As recomendaes e os formulrios para o controle de qualidade do recebimento, coleta e transporte de amostras clnicas esto descritos no Captulo 5. A seguir, esto as recomendaes durante o processamento das amostras clnicas para a cultura22. Aps o recebimento e o registro, mant-las em ordem sistemtica para a descontaminao, processando em primeiro lugar as amostras provenientes de stios estreis e depois delas, as amostras consideradas possveis fontes de contaminao. O nmero de amostras a serem processadas deve ser capaz de assegurar tranqilidade e segurana para o profissional que est manipulando. recomendvel colocar as amostras que sero processadas naquele momento dentro de uma bandeja e ento lev-las at a CSB. Durante a etapa de fluidificao-descontaminao controlar estritamente o tempo de contato entre o reagente e a amostra, de acordo com o mtodo padronizado, pois um tempo demasiado curto resulta em aumento da taxa de contaminao e tempo demasiado longo resulta em perda da viabilidade do bacilo.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Para evitar a transferncia de bacilos de uma amostra para outra, recomenda-se utilizar os reagentes aliquotados em quantidades suficientes para um dia de trabalho. No reutilizar os reagentes de um dia para o outro. No abrir mais de um pote de amostra de cada vez assim como no tocar com a pipeta na borda dos tubos no momento da transferncia do material. Fazer o descarte do sobrenadante com movimentos cautelosos para no respingar fora do frasco de descarte. Observar que no devem ser manipuladas num mesmo momento amostras clnicas para a descontaminao e os subcultivos. O laboratrio deve se organizar de modo que esses procedimentos possam ser realizados em turnos diferentes ou em CSB separadas. Durante os procedimentos de subcultivo, que envolvem a preparao de suspenso lquida bacteriana, h a produo de aerossis, os quais podem causar contaminao cruzada entre as culturas que esto sendo processadas simultaneamente. Para isso, observar o tempo de repouso da suspenso recomendada pela tcnica. Verificar a velocidade alcanada pela centrfuga (3.000 x g), o tempo indicado pela tcnica em uso e que a centrfuga seja refrigerada para no afetar a viabilidade dos bacilos. As condies de 3.000 x g por 15 minutos a recomendada para se obter uma boa recuperao de micobactrias, que tm baixo peso especfico. Verificar a temperatura da Estufa bacteriolgica a 36 1C, que deve ser de 36 1C, em que as flutuaes no devem exceder 35-37C. Os termmetros, no interior da estufa, devem estar em lugares facilmente visveis e os registros dirios devem ser monitorados.

7 .15 .1 .5 CQI do sistema automatizado Para o CQI dos sistemas automatizados de cultura e dos meios de cultura lquidos, devem-se seguir as recomendaes do fabricante. Quando se utilizam os equipamentos de leitura automatizada, realizar leitura dirias e manter os controles peridicos do equipamento leitor, de acordo com as instrues do fabricante. Quanto ao ndice de contaminao, quando se utiliza uma concentrao menor de Hidrxido de sdio, essa porcentagem pode ser a 8 a 9% de contaminao aceitvel. 7 .15 .1 .6 Organizao do trabalho e qualidade dos registros responsabilidade do laboratrio disponibilizar um tcnico que no esteja diretamente envolvido com a semeadura e leitura das culturas para verificar uma vez por semana, aleatoriamente, Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade22. No item 7.17.4.3 esto descritos formulrios para controle e monitoramento dos registros e resultados das culturas.

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7 .15 .1 .6 .1 Registros das leituras Verificar se as culturas esto sendo revisadas sistematicamente: nas primeiras 48 horas para detectar e registrar uma possvel contaminao e semanalmente para detectar o mais rpido possvel a positividade. Em casos em que a temperatura exceder a 40C, todos os resultados negativos para as culturas que estavam incubadas durante o ocorrido esto prejudicados. Se possvel, solicitar novas amostras. Constatar que sejam solicitadas novas amostras para os casos em que foram consideradas irrecuperveis por contaminao. Registrar os resultados de contaminao de cada tubo da cultura para que o monitoramento da eficcia do processo de fluidificao-descontaminao seja avaliado com o clculo da porcentagem de contaminao. Verificar se as seguintes anotaes esto presentes: data da leitura, caractersticas das colnias dos resultados positivos, culturas negativas, contaminao parcial e total da cultura (para cada tubo semeado), data da emisso do laudo. Se for possvel, recomenda-se elaborar uma ficha individual para cada paciente que tenha resultado positivo em amostras semeadas para diagnstico e a essa ficha sero adicionados todos os exames bacteriolgicos realizados para esse paciente. Dessa maneira, possvel alimentar um banco de dados com essas informaes, facilitando a deteco de possveis problemas como: pacientes que sistematicamente apresentam baciloscopia positiva com cultura negativa; resultados que no se reproduzem. Alm disso, permitir calcular vrios indicadores: contribuio da cultura no diagnstico, porcentagem de micobacterioses, etc. 7 .15 .1 .6 .2 Monitoramento dos resultados O monitoramento dos resultados feito com controles dirios e controles peridicos22,23. 7 .15 .1 .6 .2 .1 Controle dirio dos resultados Permite fazer correes de forma precoce, servem de sinal de alerta e devem ser investigados imediatamente. Amostras com baciloscopia positiva e com cultura negativa Se a amostra foi coletada com o objetivo de controle de tratamento, o resultado pode refletir simplesmente que o paciente est eliminando bacilos inviveis e que o tratamento est efetivo. Se a amostra foi coletada com o objetivo de diagnstico, verificar se esse tipo de resultado se repete e investigar o controle microbiolgico do lote de meios de cultura em uso, a concentrao e o tempo de contato do reagente descontami-

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

nante ou a temperatura da Estufa bacteriolgica a 36 1C e observar se no excedeu o limite aceitvel. Amostras contaminadas Se houve muito tempo entre a coleta e o processamento da cultura, corrigir o fluxo de rotina de trabalho do laboratrio ou reorganizar o sistema de transporte de amostras. Se as contaminaes se repetem em amostras do mesmo paciente, utilizar tcnicas mais enrgicas de descontaminao. Contaminaes sistemticas Se vrias contaminaes ocorreram num mesmo dia com todas as amostras descontaminadas ou com todas as amostras provenientes de um mesmo lugar. Descartar os reagentes. Verificar os procedimentos tcnicos de descontaminao. Observar se houve desvios das normas tcnicas e se as correes tcnicas foram feitas na ocasio em que essas foram detectadas. Organizar o transporte e a rotina de trabalho do laboratrio no caso em que a demora no processamento seja conseqncia da demora desde a coleta. Treinar o profissional que tenha sido identificado como o responsvel pelo processamento das amostras que contaminaram. Contaminao cruzada A ocorrncia de uma concentrao de culturas positivas em seqncia num curto perodo de tempo um sinal de alerta para a investigao de uma possvel situao de contaminao cruzada entre as culturas realizadas. Um resultado falso-positivo pode ocorrer e ser registrado como tal quando uma amostra foi contaminada antes ou durante o processamento do exame por outros organismos lcool-cido resistentes no originrias do paciente ou quando os registros do paciente ou os resultados de seus exames foram registrados de forma incorreta. Uma cultura falso-positiva significa que o resultado de uma amostra proveniente de um paciente declarado positivo para uma espcie de micobactria, quando, na realidade, o paciente no tem doena por essa determinada micobactria. preciso examinar com ateno alguns sinais tpicos de que falso-positivos esto ocorrendo. Um aumento repentino no nmero de isolamentos de um determinado microrganismo. No correlao entre os isolamentos e sinais clnicos da doena.

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Uma discrepncia entre os resultados da baciloscopia e os resultados da cultura. O aparecimento de um grupo de positivos, quando uma amostra se torna positiva e alguns dias depois uma seqncia de amostras se tornam positivas. Quando uma ou vrias amostras envolvidas no episdio resultaram em culturas com crescimento de raras colnias (menos de 10 colnias) e se foram processadas imediatamente depois de uma amostra com baciloscopia positiva.

Quando estas situaes ocorrem, verificar se: se os pacientes envolvidos nesse grupo de culturas positivas tm dados clnicos compatveis com tuberculose. se outras amostras do mesmo paciente tambm tiveram resultado positivo. Havendo confirmao de algum desses sinais preciso procurar estratgias para eliminar ou modificar esses casos de falso-positivos. A transferncia de bacilos pode ter sido a partir de uma amostra com alta carga bacilar ou ser feita atravs dos reagentes utilizados durante o processo de descontaminao. Para tanto, verificar se: se os reagentes utilizados no processamento das amostras esto sendo aliquotados para uso dirio. se est sendo obedecida a ordem sistemtica de processar em primeiro lugar amostras de stios estreis e por ltimo as amostras com alta carga bacilar. se o tempo de repouso que os tubos devem ser deixados ao sair da centrfuga est sendo respeitado. se o descarte do lquido sobrenadante est sendo feito com cuidado e suavidade. Diante da suspeita de contaminao cruzada, se possvel, encaminhar as culturas envolvidas nesse episdio a um laboratrio de referncia para genotipagem. 7 .15 .1 .6 .2 .2 Controle peridico dos resultados Depende da carga de trabalho e da incidncia de casos de bacteriologia positiva, onde uma anlise mensal, trimestral ou semestral dos registros do laboratrio permite detectar erros sistemticos mantidos no tempo. Qualidade da cultura De maneira geral, a cultura tem o propsito de aumentar a sensibilidade do diagnstico ou realizar o teste de sensibilidade. Devido sua maior sensibilidade comparada com a da baciloscopia, espera-se que a cultura contribua em certa proporo ao diagnstico dos casos de TB pulmonar entre os pacientes sintomticos respiratrios que tm resultados repetidamente negativos na baciloscopia. Na maioria dos pases, esse tipo de paciente de TB pulmonar constitui aproximadamente 20% de todos os casos de TB confirmados bacteriologicamente.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

O laboratrio precisa conhecer a classificao de todos os casos de pacientes adultos pulmonares que foram diagnosticados, num perodo de tempo (normalmente este monitoramento anual). Para que tenhamos condies de classificar os casos diagnosticados pelo laboratrio nas categorias abaixo mencionadas, preciso que as informaes estejam contidas na requisio do exame, descritas no Captulo 1. A seguir, esto as categorias: (a) Baciloscopia Positiva e Cultura Positiva. (b) Baciloscopia Positiva e Cultura No Realizada. (c) Baciloscopia Negativa e Cultura Positiva. (d) Baciloscopia Positiva e Cultura Negativa. (e) Baciloscopia Positiva e Cultura Contaminada. Cada uma das categorias tem seu significado: (a) + (b): esses dois grupos juntos devem concentrar o maior nmero de casos. Estima-se que, numa situao epidemiolgica real, 80% dos casos com diagnstico confirmado bacteriologicamente devem ser diagnosticados pela baciloscopia. (c): esse grupo deve contribuir com aproximadamente 20% do total de casos diagnosticados bacteriolgicamente. Em pases ou reas onde as amostras so sistematicamente cultivadas para todos os sintomticos respiratrios, a cultura pode contribuir com cerca de 30 a 40% do diagnstico. Geralmente baixos valores se devem a solicitaes inadequadas de cultura, solicitaes de culturas de casos que no justifiquem essa ao ou deficincias tcnicas, que reduzem a sensibilidade desse mtodo. (d): esse grupo deve ser muito baixo em amostras para diagnstico pulmonar, porque a cultura de casos de baciloscopia positiva o resultado esperado uma cultura positiva. Em casos excepcionais, encontram-se pacientes cujas baciloscopias de diagnstico so sistematicamente positivas e suas culturas so negativas. Em geral se trata de amostras de controle de tratamento. Valores acima de 2 a 3% das baciloscopias positivas e culturas negativas geralmente indicam problemas tcnicos no laboratrio que reduzem ou eliminam a viabilidade do bacilo. Isso pode acontecer em decorrncia de procedimentos drsticos de descontaminao, do caso de meios de cultura com baixa sensibilidade ou estufas com temperatura altas demais ou oscilantes. Tambm amostras mal conservadas ou resultados falso-positivos da baciloscopia podem contribuir para esses resultados de culturas falso-negativas. (e): esse grupo deve ser muito baixo, cerca de 1%. Valores altos indicam problemas tcnicos no laboratrio. A partir dessas informaes possvel calcular indicadores que auxiliam o monitoramento peridico dos resultados da cultura:

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Clculo da contribuio da cultura ao diagnstico:


Contribuio da cultura ao diagnstico = (c) (a) + (b) + (c) + (d) + (e) x 100

Clculo da porcentagem de casos de baciloscopia positiva e cultura negativa:


Porcentagem de casos de baciloscopia positiva e cultura negativa = (d) (a) + (b) + (c) + (d) + (e) x 100

Relao entre os resultados da baciloscopia e da cultura Tanto a baciloscopia como a cultura tm seus resultados expressos em escala de cruzes para o grau de positividade. Sendo a cultura mais sensvel que a baciloscopia, normalmente amostras de diagnstico com resultado de baciloscopia positiva deve ter resultado de cultura positiva e o grau de positividade da cultura deve ser igual ou maior do que a da baciloscopia. Quando ocorrem mais de 3% de amostras com resultado de cultura com grau de positividade menor do que a da baciloscopia, estas devem ser investigadas. ndice de contaminao calculado mensalmente como a porcentagem de tubos contaminados entre o total de tubos semeados, a partir das informaes do Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade. A margem aceitvel de 3 a 5%. Valores mais baixos podem indicar uma descontaminao excessivamente drstica, uma exposio muito longa da amostra descontaminao ou uma concentrao muito alta de verde de malaquita no meio de cultura. Valores mais altos podem indicar concentrao muito baixa do reagente descontaminante, tempo curto de contato entre a amostra e a soluo descontaminante, amostras mal conservadas durante o transporte ou o armazenamento, tempo muito longo entre a coleta da amostra e seu processamento, problemas na preparao do meio de cultura (soluo salina no estril, autoclave que no atinge a temperatura necessria, etc.) ou a presena de contaminantes no ambiente do laboratrio e/ou na estufa de cultura (geralmente fungos ambientais). 7 .15 .1 .6 .2 .3 Monitoramento do tempo de entrega dos resultados Considerando que o laboratrio utilize as metodologia clssicas ou convencionais para cultura e identificao, a maioria dos resultados (95%) deve sair dentro de 62 dias. Se utilizar sistemas de leitura automatizados o prazo em torno de 30 dias. Verificar se a partir do momento em que foi detectada a positividade da cultura o resultado tenha sido informado em at 48 horas.

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Confirmar se os laudos de resultados esto sendo recebidos pelo solicitante do exame (local em que o paciente foi atendido e vai buscar o resultado) e em que prazo isto est acontecendo (tempo entre a digitao do laudo at o recebimento pelo solicitante). Em caso de haver demora entre a sada do resultado do laboratrio e o recebimento, viabilizar outra maneira de envi-los (fax, correio eletrnico ou outra maneira). Observar em que momento est ocorrendo demora: leitura das culturas, registro dos resultados, digitao dos laudos, envio dos laudos. Reorganizar o fluxo para agilizar esta situao.

7 .15 .2 Controle de qualidade externo Como o Brasil tem uma grande rea geogrfica, a rede de laboratrios est estabelecida e muitos laboratrios (LRR, LRE/LACEN,alguns LRM e alguns laboratrios conveniados do SUS) realizam cultura, o LRN deve manter um programa de controle de qualidade externo dos isolados bacterianos, meios de cultura e reagentes produzidos por essa rede. Como o nmero de laboratrios grande o LRN pode elaborar e executar esse programa em conjunto com os LRR. Desse programa deve fazer parte o envio para o LRN de isolados bacterianos e amostras dos lotes produtos da rede, bem como do envio de painis elaborados pelo LRN aos laboratrios participantes para anlise frente a padres estabelecidos, de acordo com a literatura internacional. Aps analise dos resultados, cada laboratrio participante deve ser informado dessa avaliao. No caso de serem observados resultados imprecisos, dever ser identificada a causa da impreciso, assim como sugestes para reverter essa situao. Como conseqncia pode ser oferecido treinamento, se for o caso e enviado novo painel ao laboratrio, desenhado especialmente de acordo com o problema detectado. importante manter todos os registros de monitoramento da preciso alcanada pelos laboratrios em sucessivos controles. O LRN deve estabelecer, tambm em parceria com os LRR, um comit tcnico, para o qual sejam convidados, tambm, os Centros Colaboradores CC e haja uma combinao de conhecimentos terico-prticos na anlise dos dados produzidos por esse programa visando aperfeioar os servios prestados.

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7 .16 Referncias
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SEIC/Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica. 2005. Procedimientos em Microbiologia Clnica. Micobactrias. Parte 9. Disponvel em (http://www.seimc.org/protocolos/microbiologia). Acesso em 25 Set 2005. AMCI/Associazione dei Microbiologi Clinic Italiani. Centro di Referimento della Regione Toscana per i Micobatteri. 1998. Quaderni di Microbiologia Clinica N. 7: Manuale di Micobatteriologia. Disponvel em http://www.ao-careggi.toscana.it/ microbiologia/CRRM/Testi/MICOBACTT.pdf. Acesso em 25 Set 2005. KUDOH, S. & KUDOH, T. A simple technique for culturing tubercle bacilli. Bulletin of the World Health Organization, 51:71-82. 1974. SUSEMIHL, M.A.A.M.M.; FERRAZOLI, L.; UEKI, S.Y.M.; GIMENEZ, R.D.; PALACI, M. Avaliao do mtodo de Ogawa-Kudoh para o cultivo de micobactrias. Rev Brasileira Patologia Clinica, 29(2):51-54. 1993. SIDDIQI, S.H.; RSCH-GERDES, S. MGITTM Procedure Manual for BactecTM MGITTM TB System. Mycobacteria Growth Indicator Tube Culture and Drug Susceptibility Demonstration Project. Prepared for The Foundation for Innovation New Diagnostics, 2006. Disponvel em (http://www.finddiagnostics.org). Acesso em 04 Jul. 2007 BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3 edio comemorativa, Rio de Janeiro, Brasil, 2005. INS/Instituto Nacional de Salud. Subdirecion de Epidemiologia y Laboratrio Nacional de Referencia. Laboratrio de Micobactrias. Bacteriologia del Mycobacterium tuberculosis y de Micobactrias no Tuberculosas. Manual de Procedimientos. Bogot, Colmbia. 2001. The Australian Society for Microbiology. Guidelines for Assuring Quality of Solid Media used in Australia for the Cultivation of Medically Important Mycobacteria. Disponivel em: (http://www.theasm.com.au/). Acesso em 03 Maro 2007. OPAS/Organizacin Panamericana de la Salud. Manual para el Diagnstico Bacteriolgico de la Tuberculosis. Normas y Guas Tcnica. Parte II Cultivo, 107 p., 2008. Center for Disease Control and Prevention (CDC). Association of State and Territorial. Public Health Laboratory Directors. Recognition and Prevention of False-Positive Test Results in Mycobacteriology. A Laboratory Training Program. 1997.

228 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 Anexos do captulo


7 .17 .1 Preparao de meios de cultura Nesse item esto descritas as frmulas e as informaes para a preparao dos meios de cultura. Os respectivos formulrios para o controle das preparaes esto descritas no item 7.17.4.1. 7 .17 .1 .1 Quadro 5 Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK
Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK (a) Soluo de sais minerais meio base Fosfato Monopotssico (KH2PO4) Sulfato de Magnsio (MgSO4.7H2O) Citrato de Magnsio Glutamato de Sdio Asparagina Glicerol gua destilada 1. 2. 3. 4. LJ 2,4 g 0,24 g 0,6 g 3,6 g 12 ml 600 ml OK 12,0 g 0,6 g 3,0 g 24 ml 600 ml

Dissolver os ingredientes, em ordem, em gua destilada aquecida. Autoclavar a 121C por 30 minutos para esterilizar. Esfriar a temperatura ambiente. Esta soluo pode ser mantida sob refrigerao. No caso do meio LJ, se usar meio base desidratado comercial de qualidade, preparar de acordo com o fabricante, acrescentando o glicerol. LJ 2g 100 ml OK 2g 100 ml

(b) Soluo Verde malaquita Verde malaquita (p) gua destilada estril

5. Usando tcnicas asspticas dissolver o corante na gua destilada estril. 6. Colocar na Estufa bacteriolgica a 36 1C por 1 a 2 horas para melhor dissoluo. 7. Preparar esta soluo no momento do uso; (c) Homogeneizado de ovos LJ OK 8. Usar ovos de galinhas no alimentadas com antibiticos, recm-colhidos (com menos de 7 dias). 9. Limpar os ovos com escova, gua morna e sabo alcalino e deixar de molho na gua com sabo por 30 minutos. 10. Aps, enxaguar com gua corrente, deixar de molho na Soluo de lcool a 70% por 15 minutos. Retirar e secar com pano estril. 11. Antes de quebrar os ovos, lave bem as mos. Quebre os ovos, um a um, separadamente, num recipiente estril para observar a qualidade dos mesmos e colocar no copo do liquidificador estril para homogeneizar. 12. Filtrar o homogeneizado atravs de gaze estril num funil, para um frasco de vidro graduado estril. A quantidade de ovos para preparar 1000 ml, depende do tamanho destes, aproximadamente 20 a 25 ovos.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 229

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

(d) Preparao do meio completo Soluo de sais minerais (a) Soluo Verde malaquita 2% (b) Homogeneizado de ovos (c) qsp

LJ 600 ml 20 ml 1000 ml

OK 600 ml 20 ml 1000 ml

13. Adicionar (b) soluo de verde malaquita ao (a) meio base. 14. Aps, adicionar o (c) homogeneizado de ovos. 15. Manter o meio homogneo, sob agitao peridica, durante sua distribuio nos tubos. A agitao deve ser suave para evitar a formao de bolhas de ar. 16. Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. 17. Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C. 18. Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. Validade: 2 meses sob refrigerao

7 .17 .1 .2

Quadro 6 Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio


Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio LJ 2,4 g 0,24 g 0,6 g 3,6 g 7,2 g 600 ml OK 12 g 0,6 g 3g 7,2 g 600 ml

(e) Soluo de sais minerais meio base com piruvato Fosfato Monopotssico (KH2PO4) Sulfato de Magnsio (MgSO4.7H2O) Citrato de Magnsio Glutamato de Sdio Asparagina Piruvato de sdio gua destilada 1. 2. 3. 4.

Dissolver os ingredientes, em ordem, em gua destilada aquecida. Autoclavar a 121C por 30 minutos para esterilizar. Esfriar a temperatura ambiente. Esta soluo pode ser mantida sob refrigerao. No caso do meio LJ, havendo possibilidade, usar meio base desidratado comercial, de qualidade, e prepar-lo de acordo com o fabricante, acrescentando piruvato de sdio;

As demais etapas da preparao do meio completo seguem como j descritas em (b), (c) e (d) do item 7.17.1.1 Validade: 2 meses sob refrigerao

230 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .1 .3

Quadro 7 Preparao de Meio Slido LJ com Citrato Frrico Amoniacal


Preparao de Meio Slido LJ com Citrato Frrico Amoniacal 2,5% 5g 200 ml

Citrato frrico amoniacal Meio completo LJ preparado em (d) do item 7.17.1.1

1. Pesar o citrato frrico amoniacal. 2. Adicionar em 200 ml do meio LJ completo. 3. Manter o meio homogneo, sob agitao peridica, durante sua distribuio nos tubos. A agitao deve ser suave para evitar a formao de bolhas de ar. 4. Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. 5. Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados no coagulador a 80-85C por 45 minutos. 6. Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. Validade: 2 meses sob refrigerao

7 .17 .1 .4

Quadro 8 Preparao de Meio Slido LJ com PNB


Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK com PNB 500 g/ml

(f) Preparao da Soluo A (PNB + Propilenoglicol) cido p-nitrobenzico (PNB) Propilenoglicol 1. Pesar o PNB. 2. Dissolver em propilenoglicol. 3. Autoclavar 121C por 10 minutos ou filtrar em filtro Millipore 0,20 . (g) Preparao da Soluo B (PNB + Hidrxido de sdio) cido p-nitrobenzico (PNB) NaOH 1N gua destilada estril 1. Dissolver o PNB em 15 ml de NaOH. 2. Completar com gua destilada at 80 ml. 3. Adicionar Fenolftalena alcolica 0,1% (soluo em etanol) 1-2 gts 4. Adicionar gotas (cerca de 3 ml) de HCl 1N mexendo constantemente at a viragem da cor (incolor). 5. Se houver formao de um precipitado branco (excesso de cido) adicionar gotas de NaOH 1N. 6. Adicionar gua destilada estril qsp (h) Preparao do meio com PNB 1. Adicionar 5 ml da soluo de PNB preparada em (f) ou (g) em 200 ml do meio completo LJ ou OK preparado em (d). 2. Manter o meio homogneo, sob agitao peridica, durante sua distribuio nos tubos. A agitao deve ser suave para evitar a formao de bolhas de ar. 3. Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. 4. Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados no coagulador a 80-85C por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. Validade: 2 meses sob refrigerao 100 ml 2,5 g 15 ml 80 ml 0,2 g 10 ml

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 231

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .1 .5

Quadro 9 Preparao de Meio de Agar Sangue


Preparao de Meio de Agar Sangue de acordo com o fabricante 100 ml 5 ml

Base Mueller-Hinton gua destilada qsp Sangue desfibrinado de carneiro 1. 2. 3.

Dissolver a base de Mueller-Hinton em gua destilada. Autoclavar a 121C por 15 minutos. Esperar esfriar at 45-50C. Adicionar o sangue de carneiro e distribuir em placas ou tubos com tampa de rosca.

7 .17 .2 Preparao de Reagentes Nesse item, esto descritas as frmulas e as informaes para a preparao dos reagentes para a realizao das culturas. Os respectivos formulrios para o controle das preparaes esto descritas no item 7.17.4.2. 7 .17 .2 .1 Quadro 10 Preparao da Soluo de Hidrxido de Sdio
Preparao da Soluo de Hidrxido de sdio 4% Hidrxido de sdio (NaOH) gua destilada 1. Dissolver o Hidrxido de sdio na gua destilada. 2. Autoclavar a 121C por 15 minutos. 4,0 g 100 ml

7 .17 .2 .2

Quadro 11 Preparao da Soluo de Vermelho de Fenol 0,4% Mtodo de Petroff


Preparao da Soluo de Vermelho de Fenol 0,4% Mtodo Petroff 0,4 g 100 ml

Vermelho de fenol (p) Soluo Hidrxido de sdio 4% 1. Dissolver o Vermelho de fenol na Soluo de Hidrxido de sdio 4%. 2. Autoclavar a 121C por 15 minutos.

7 .17 .2 .3

Quadro 12 Preparao da Soluo Neutralizante- Mtodo de Petroff


Preparao da Soluo Neutralizante Mtodo Petroff 8,5 ml 1 ml 100 ml

cido clordrico (HCl) concentrado 37% Soluo de Vermelho de fenol 0,4%. gua destilada qsp

1. Adicionar 8,5 ml de cido clordrico a aproximadamente 80 ml de gua; Acrescentar 1 ml de Soluo de Vermelho de fenol. 2. Completar o volume para 100 ml com gua destilada. 3. Autoclavar a 121C por 15 minutos.

232 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .2 .4

Quadro 13 Preparao da Soluo de Citrato de Sdio 2,9%- Mtodo NALC-NaOH


Preparao da Soluo de Citrato de Sdio 2,9% Mtodo NALC-NaOH 2,9 g 100 ml

Citrato de sdio bi-hidratado gua destilada 1. Dissolver o Citrato de sdio na gua destilada. 2. Autoclavar a 121C por 15 minutos. Observao: Se o Citrato de sdio for anidro, pesar 2,6 g.

7 .17 .2 .5

Quadro 14 Preparao da Soluo Depurante Mtodo NALC-NaOH


Preparao da Soluo Depurante Mtodo NALC-NaOH Mistura NaOHCitrato de sdio *** NaOH 4% 25 ml 50 ml 100 ml 250 ml 500 ml Citrato de sdio 2,9% 25 ml 50 ml 100 ml 250 ml 500 ml

Volume de Soluo Depurante necessria ** 50 ml 100 ml 200 ml 500 ml 1000 ml ** ***

Quantidade de NALC a ser adicionada **** 0,25 g 0,5 g 1g 2,5 g 5g

Preparar diariamente a soluo de trabalho, calculando a quantidade necessria de acordo com a quantidade de amostras a serem processadas (v/v). A mistura de NaOH-Citrato de sdio pode ser preparada em frasco com tampa de rosca, esterilizada e guardada sob refrigerao.

**** Aps a adio de NALC, a Soluo Depurante dever ser usada em 24 horas porque o NALC perde a atividade mucoltica.
Fonte: Kent P.T.and Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta,USA. 1985.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 233

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .2 .6

Quadro 15 Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH


Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH

(h) Preparao da Soluo A Fosfato dissdico (Na2HPO4) gua destilada 1. Dissolver o fosfato dissdico em gua destilada (i) Preparao da Soluo B Fosfato monopotssico (KH2PO4) gua destilada 2. Dissolver o fosfato monopotssico em gua destilada (j) Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 3. Misturar 50 ml de (Soluo A) e 50 ml de (Soluo B) e verificar o pH, que dever ser 6,8. 4. Se precisar ajustar o pH, use a soluo (Soluo A) para aumentar e a soluo (Soluo B) para diminuir. 5. Autoclavar a 121C por 15 minutos 9,07 g 1000 ml 9,47 g 1000 ml

7 .17 .2 .7

Quadro 16 Preparao da Soluo de cido Oxlico 5% Descontaminante


Preparao da Soluo de cido oxlico 5% Descontaminante 5g 100 ml

cido oxlico gua destilada 1. Dissolver o cido oxlico na gua destilada. 2. Autoclavar a 121C por 15 minutos.

7 .17 .2 .8

Quadro 17 Preparao da Soluo Indicadora Mtodo Oxlico


Preparao da Soluo Indicadora Mtodo Oxlico 8 mg 20 ml 1000 ml

Vermelho de fenol (p) Soluo NaOH 4% gua destilada qsp 1. Dissolver o vermelho de fenol na Soluo de NaOH. 2. Acrescentar gua destilada qs para completar 1000 ml.

234 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .2 .9

Quadro 18 Preparao do Tubo n 1 da Escala McFarland


Preparao do Tubo n 1 da Escala McFarland

(k) Preparao da Soluo de Cloreto de brio Cloreto de brio dihidratado (BaCl2.2H2O) gua destilada qsp 1. Dissolver o Cloreto de brio em gua destilada = Cloreto de brio 1% (l) Preparao da Soluo de cido sulfrico cido sulfrico concentrado gua destilada 2. Lentamente, adicionar o cido sulfrico na gua destilada = cido sulfrico 1%. 3. Guardar sob refrigerao (2-8C). (m) Preparao do Tubo N 1 da Escala McFarland Soluo de Cloreto de brio 1% cido sulfrico 1% 5. 6. 7. 8. 0,1 ml 9,9 ml 1 ml 100 ml 1,175 g 100 ml

Adicionar v/v o Cloreto de brio e o cido sulfrico. Acondicionar em tubo de ensaio de vidro com tampa de rosca. Fechar bem o tubo (selar) e guardar ao abrigo da luz, temperatura ambiente; Validade por um ms. Agitar vigorosamente antes do uso. Descartar se apresentar grumos ou depsitos de partculas.

A escala McFarland utilizada na padronizao da turvao de suspenses de bactrias. O tubo N 1 corresponde a uma concentrao bacteriana de 300 milhes por mililitro. Validade: 1 ms

7 .17 .2 .10 Quadro 19 Preparao da Soluo Salina 0,85%


Preparao da Soluo Salina 0,85% Cloreto de sdio (NaCl) gua destilada 1. Dissolver o Cloreto de sdio na gua destilada. 2. Autoclavar a 121C por 15 minutos. 0,85 g 100 ml

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 235

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .3 Figuras e Fluxogramas 7 .17 .3 .1 Figura 2 Fluxograma do Mtodo de Petroff Modificado

236 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .3 .2

Figura 3 Fluxograma do Mtodo de NALC NaOH

7 .17 .3 .3

Figura 4 Fluxograma do Mtodo de Ogawa-Kudoh

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 237

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .3 .4

Figura 5 Fluxograma do Mtodo do cido Oxlico

238 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .3 .5

Figura 6 Fluxograma de leitura das culturas em meio slido

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 239

7 .17 .4 Formulrios do CQI da cultura

7 .17 .4 .1

Formulrios do CQI dos Meios de Cultura

7 .17 .4 .1 .1
Formulrio - Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK
Quantidade Produzida Meio LJ Frmula Procedncia N Lote Fabricante Validade Meio OK Pesagem/Volume Validade N Lote Produzido

Formulrio Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK

Data de Preparao

240 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Substncia

Fosfato Monopotssico

Sulfato de Magnsio

Citrato de Magnsio

Glutamato de Sdio

Asparagina

Glicerol

Verde Malaquita

Ovos

ou Meio Base LJ Comercial

gua destilada

Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Base


Temperatura Tempo Data Controle Aprovado Reprovado Responsvel

Equipamento

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Observaes:

Coagulao - Meio Completo (Meio Base + Ovos)


Temperatura Aprovado Reprovado Tempo Data Controle Responsvel

Equipamento

Aspectos Macroscpicos
Consistncia AP Data: REP AP REP AP REP AP REP Volume Inclinao Textura Responsvel

Cor

AP

REP

Observaes:

AP = Aprovado = conforme esperado

REP = Reprovado = em desacordo com o esperado

Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C


Reprovado = Houve Crescimento de microrganismos Responsvel:

Aprovado = No Houve Crescimento de microrganismos

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Observaes:

Controle Microbiolgico - Cepa Referncia:


Tubo 10-5 mdia das UFC = ______ UFC Tubo 10-6 mdia das UFC = ______ UFC

Tubo 10-3

mdia das UFC = ______ UFC

Aprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = 50 a 150 Data:

Reprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = inferior ao valor esperado

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 241

Responsvel:

7 .17 .4 .1 .2
Formulrio - Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio
Quantidade Produzida Meio LJ - Piruvato Frmula Procedncia N Lote Fabricante Validade Meio OK - Piruvato Pesagem/Volume Validade N Lote Produzido

Formulrio Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio

242 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Data de Preparao

Substncia

Fosfato Monopotssico

Sulfato de Magnsio

Citrato de Magnsio

Glutamato de Sdio

Asparagina

Piruvato de Sdio

Verde Malaquita

Ovos

ou Meio Base LJ Comercial

gua destilada

Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Base


Temperatura Tempo Data Controle Aprovado Reprovado Responsvel

Equipamento

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Observaes:

Coagulao - Meio Completo (Meio Base + Ovos)


Temperatura Aprovado Reprovado Tempo Data Controle Responsvel

Equipamento

Aspectos Macroscpicos
Consistncia AP Data: REP AP REP AP REP AP REP Volume Inclinao Textura Responsvel

Cor

AP

REP

Observaes:

AP = Aprovado = conforme esperado

REP = Reprovado = em desacordo com o esperado

Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C


Reprovado = Houve Crescimento de microrganismos Responsvel:

Aprovado = No Houve Crescimento de microrganismos

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Observaes:

Controle Microbiolgico - Cepa Referncia:


Tubo 10-5 mdia das UFC = ______ UFC Tubo 10-6 mdia das UFC = ______ UFC

Tubo 10-3

mdia das UFC = ______ UFC

Aprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = 50 a 150 Data:

Reprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = inferior ao valor esperado

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 243

Responsvel:

7 .17 .4 .1 .3
Formulrio - Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ com Citrato Frrico Amoniacal
Quantidade Produzida Validade N Lote Produzido

Formulrio Controle da Preparao de Meios de Cultura Slido LJ com Citrato Frrico Amoniacal

Data de Preparao

244 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS


Frmula Procedncia N Lote Fabricante Validade Pesagem/Volume

Substncia

Fosfato Monopotssico

Sulfato de Magnsio

Citrato de Magnsio

Glutamato de Sdio

Asparagina

Piruvato de Sdio

Verde Malaquita

Ovos

ou Meio Base LJ Comercial

gua destilada

Citrato Frrico Amoniacal

Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Base


Temperatura Tempo Data Controle Aprovado Reprovado Responsvel

Equipamento

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Observaes:

Coagulao - Meio Completo (Meio Base + Ovos)


Temperatura Aprovado Reprovado Tempo Data Controle Responsvel

Equipamento

Aspectos Macroscpicos
Consistncia AP Data: REP AP REP AP REP AP REP Volume Inclinao Textura Responsvel

Cor

AP

REP

Observaes:

AP = Aprovado = conforme esperado

REP = Reprovado = em desacordo com o esperado

Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C


Reprovado = Houve Crescimento de microrganismos Responsvel:

Aprovado = No Houve Crescimento de microrganismos

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Observaes:

Controle Microbiolgico - Cepa Referncia:


Tubo 10-5 mdia das UFC = ______ UFC Tubo 10-6 mdia das UFC = ______ UFC

Tubo 10-3

mdia das UFC = ______ UFC

Aprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = 50 a 150 Data:

Reprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = inferior ao valor esperado

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 245

Responsvel:

246 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

7 .17 .4 .1 .4

Formulrio Controle da Preparao da Soluo de PNB para Adio em Meios Slidos LJ ou OK


Formulrio - Controle da Soluo de PNB para Adio em Meios de Cultura Slidos LJ ou OK
Soluo B (PNB + Hidrxido de sdio)

Soluo A (PNB + Propilenoglicol)

Observao: esta soluo ser adicionada na preparao do meio do formulrio - Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com PNB Quantidade Produzida N Lote Produzido

Data de Preparao

Soluo A (PNB + Propilenoglicol) ou Frmula Procedncia N Lote Fabricante

Soluo B (PNB + Hidrxido de sdio) Validade Pesagem/Volume

Substncia

cido p-nitrobenzico (PNB)

Propilenoglicol

Hidrxido de sdio

gua destilada

Esterilizao Autoclave: Soluo B Temperatura Tempo Data Controle Aprovado Reprovado Responsvel

Soluo A ou

Equipamento

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Responsvel e Data:

7 .17 .4 .1 .5
Formulrio - Controle da Preparao de Meio de Cultura Slido LJ ou OK com PNB
Validade LJ com PNB OK com PNB Quantidade Produzida N Lote Produzido

Formulrio Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com PNB

Data de Preparao

Preparao do Meio Base LJ ou OK com adio de PNB


Frmula Procedncia N Lote Fabricante Validade Pesagem/Volume

Substncia

Fosfato Monopotssico

Sulfato de Magnsio

Citrato de Magnsio

Glutamato de Sdio

Asparagina

Glicerol

Verde Malaquita

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Ovos

ou Meio Base LJ Comercial

gua destilada

Soluo de PNB (A ou B)

Fomulrio-Controle da Soluo de PNB para Adio em Meios de Cultura Slidos LJ ou OK

Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Completo LJ ou OK com PNB


Temperatura Tempo Data Controle Aprovado Reprovado Responsvel

Equipamento

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 247

Observaes:

Coagulao - Meio Completo (Meio Base + Ovos)


Temperatura Aprovado Reprovado Tempo Data Controle Responsvel

Equipamento

Aspectos Macroscpicos
Consistncia AP REP AP REP AP REP AP REP Data: Volume Inclinao Textura Responsvel

248 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS


REP = Reprovado = em desacordo com o esperado

Cor

AP

REP

Observaes:

AP = Aprovado = conforme esperado

Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C


Reprovado = Houve Crescimento de microrganismos Responsvel:

Aprovado = No Houve Crescimento de microrganismos

Observaes:

Controle Microbiolgico - Cepa Referncia:


Tubo 10-5 mdia das UFC = ______ UFC Tubo 10-6 mdia das UFC = ______ UFC

Tubo 10-3

mdia das UFC = ______ UFC

Aprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = 50 a 150 Data:

Reprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = inferior ao valor esperado

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Responsvel:

7 .17 .4 .1 .6
Formulrio - Controle da Preparao do Meio de Agar Sangue
Quantidade Produzida N Lote Produzido

Formulrio Controle da Preparao do Meio de Agar Sangue

Data de Preparao

Substncia

Frmula

Procedncia

N Lote Fabricante

Validade

Pesagem/Volume

Blood Agar Base ou Mueller Hinton Media

Sangue Desfibrinado de Carneiro

Esterilizao Autoclave
Temperatura Tempo Data Controle Aprovado Data: Reprovado Responsvel

Equipamento

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Responsvel:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 249

7 .17 .4 .1 .7

Formulrio Controle da Produo e Consumo de todos os Meios de Cultura utilizados no Laboratrio


Formulrio - Controle da Produo e Consumo de todos os Meios de Cultura utilizados no Laboratrio
Produo/ Aquisio Data de Semeadura Inicio Trmino Aspectos macroscpicos Controle Esterilidade Controle Microbiolgico Crescimento Cepa Referncia com 20 dias Responsvel

250 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

N Lote

Meio de Cultura

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

Interpretao - Providncias Esta Formulrio permite verificar individualmente os lotes de meios deficientes e descart-los;

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .4 .2 7 .17 .4 .2 .1

Formulrios do CQI dos Reagentes Formulrio Controle da Preparao da Soluo de Hidrxido de sdio 4%

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 251

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .2 .2

Formulrio Controle da Preparao da Soluo de Vermelho de Fenol a 0,4% Mtodo Petroff

252 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .4 .2 .3

Formulrio Controle da Preparao da Soluo Neutralizante Mtodo Petroff

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 253

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .2 .4

Formulrio Controle da Preparao da Soluo Citrato de Sdio 2,9% Mtodo NALC-NaOH

254 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .4 .2 .5

Formulrio Controle da Preparao da Soluo Depurante Mtodo NALC-NaOH


Formulrio Controle da Preparao da Soluo Depurante Mdodo NALC-NaOH

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia/Soluo NALC Soluo Citrato de sdio 2,9% Soluo Hidrxido de sdio 4%

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

Pesagem (g) / volume (ml)


Substncia/Soluo NALC Soluo Citrato de sdio 2,9% Soluo Hidrxido de sdio 4% Pesagem Balana Marca: Responsvel: Esterilizao Autoclave Equipamento Marca: Temperatura Tempo Presso Aprovado Reprovado Responsvel: Data de Execuo: Quantidade

Controle de Esterilidade
Semeadura em gar sangue Aprovado. No houve crescimento de microrganismos Responsvel: Incubao a 36 1C por 5 dias Reprovado. Houve crescimento de microrganismos Data de Execuo:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 255

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .2 .6

Formulrio Controle da Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH


Formulrio Controle da Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH

Data de Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia Fosfato de Sdio M/15 Fosfato de Potssio M/15 Soluo A Fosfato de Sdio M/15 gua Destilada Soluo B Fosfato de Potssio M/15 gua Destilada

Frmula

Procedncia

N Lote do Fabricante

Validade

Observaes

Frmula

Pesagem / volume

Data de Produo

N Lote de Produo

Validade

Frmula

Pesagem / volume

Data de Produo

N Lote de Produo

Validade

Esterilizao Autoclave Solues A e B


Equipamento: Temperatura: Tempo: Aprovado Data: Reprovado

Responsvel

Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8


Soluo Soluo Fosfato de Sdio (A) Soluo Fosfato de Potssio (B) Volume (ml) Data Produo N Lote de Produo Validade CQ

Controle de Esterilidade Soluo Tampo Fosfato pH 6,8


Semeadura em Agar Sangue /Incubao a 36 10C por 5 dias Aprovado. No houve crescimento de microrganismos Responsvel Reprovado. Houve crescimento de microrganismos data:

256 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .4 .2 .7

Formulrio Controle da Preparao da Soluo de cido Oxlico 5% Descontaminante

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Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .2 .8

Formulrio Controle da Preparao da Soluo Indicadora Mtodo cido Oxlico


Formulrio Controle da Preparao da Soluo Indicadora Mdodo cido Oxlico

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia/Soluo Vermelho de fenol Soluo Hidrxido de sdio4% gua destilada

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

Pesagem (g) / volume (ml)


Substncia/Soluo Vermelho de fenol Soluo Hidrxido de sdio 4% gua destilada Pesagem Balana Marca: Responsvel: Esterilizao Autoclave Equipamento Marca: Temperatura Tempo Presso Aprovado Reprovado Responsvel: Data de Execuo: Quantidade

Controle de Esterilidade
Semeadura em gar sangue Aprovado. No houve crescimento de microrganismos Responsvel: Incubao a 36 1C por 5 dias Reprovado. Houve crescimento de microrganismos Data de Execuo:

258 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .4 .2 .9

Formulrio Controle da Preparao do Tubo N 1 da Escala de McFarland


Formulrio Controle da Preparao do Tubo n 1 Escala McFarland

Data de Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia Cloreto de Brio bihidratado cido Sulfrico concentrado

Frmula BaCl2.2H2O

Procedncia

N Lote do Fabricante

Validade

Observaes

H2SO4

Preparao da Soluo A
Substncia Cloreto de Brio gua Destilada Pesagem / volume N Lote de Produo Validade

Preparao da Soluo B
Substncia cido Sulfrico gua Destilada Pesagem / volume N Lote de Produo Validade

Preparao do Tubo N 1 da Escala McFarland


Substncia Soluo A Soluo B Responsvel Data: Volume N Lote de Produo Validade

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 259

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .2 .10 Formulrio Controle da Preparao da Soluo Salina 0,85%

260 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

7 .17 .4 .3

Formulrios de Monitoramento dos Resultados

7 .17 .4 .3 .1

Formulrio Monitoramento dos Registros e Resultados das Culturas


Formulrio Monitoramento dos Registros e Resultados das Culturas
Leitura Origem 48 h 1 2 3 4 5 6 7 8 Material DiagnsControle clnico tico Semanais Baciloscopia Data da Sem. Lote Meio Resultado cultura Encaminhado p/ identif.

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

N do registro

Data Entrada

Iniciais paciente

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 261

Responsvel:

Data

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .3 .2

Formulrio Monitoramento da Contribuio da Cultura ao Diagnstico


Formulrio Monitoramento da Contribuio da Cultura ao Diagnstico

Ano / Perodo avaliado

N de Culturas realizadas no perodo

(A) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura Positiva =

(B) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura No realizada =

(C) Nmero de casos com Baciloscopia Negativa e Cultura Positiva =

(D) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura Negativa =

(E) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura Contaminada = (C) (A) + (B) + (C) + (D) + (E) (D) (A) + (B) + (C) + (D) + (E)

Contribuio da Cultura ao Diagnstico =

x 100 =

Casos de Baciloscopia Positiva e Cultura Negativa = Interpretao: (A) + (B) (C) (D)

x 100 =

deve concentrar o maior nmero possvel de casos. Estima-se que, numa situao epidemiolgica real, 80% dos casos devem ser diagnosticados pela Baciloscopia; deve contribuir com aproximadamente 20% do total de casos diagnosticados; deve ser muito baixo em amostras para diagnstico pulmonar. Valores acima de 2 a 3% das Baciloscopias Positivas e Culturas Negativas geralmente indicam problemas tcnicos no laboratrio que reduzem ou eliminam a viabilidade do bacilo: procedimentos drsticos de descontaminao, meios de cutura com baixa sensibilidade (controle microbiolgico) ou estufas com temperaturas altas demais ou oscilantes. Tambm amostras mal conservadas ou resultados falso-positivos da Baciloscopia podem contribuir para esses resultados de culturas falso-negativas; deve ser muito baixo, cerca de 1%. Valores altos indicam problemas tcnicos;

(E)

Responsvel:

262 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

7 .17 .4 .3 .3

Formulrio Monitoramento do ndice de Contaminao


Formulrio Monitoramento do ndice de Contaminao
ndice de Contaminao = Nmero Total de Tubos Contaminados Nmero Total de Tubos Semeados N de tubos contaminados x 100

Mtodo de descontaminao janeiro

Ms

N total de tubos semeados

ndice de contaminao

Responsvel

Obs: fevereiro

Obs: maro

Obs: abril

Obs: maio

Obs: junho

Obs: julho

Obs: agosto

Obs: setembro

Obs: outubro

Obs: novembro

Obs: dezembro

Obs:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 263

Captulo 7 Cultura para Micobactrias

7 .17 .4 .3 .4

Formulrio Monitoramento da Qualidade da Cultura


Formulrio Monitoramento da Qualidade das Cultura
Perodo de tempo avaliado:
Valores normais esperados Valores encontrados Se os valores encontrados forem muito maiores, investigar: (A) (C) e (D) (C) e (E) (F Se os valores encontrados forem muito menores, investigar: (B) e (D) No h problemas No h problemas G)

Contribuio da Cultura ao Diagnstico Porcentagem de amostras baciloscopia positiva e cultura negativa Porcentagem de culturas com positividade menor do que na baciloscopia ndice de Contaminao (A)

20% 2 a 3% 3% 3 a 5%

erros de leitura da Baciloscopia = falsos-negativos; se a cultura para investigar sintomticos respiratrios (SR) com alta suspeita, no h problema; se a cultura para investigar pacientes pulmonares com doena pouco avanada, incluindo crianas, no h problema; a solicitao est deficiente, pois no esto sendo investigados os SR pouco avanados. Nesta situao esto sendo investigados pacientes que no so SR; Excessiva demora entre a coleta e o processamento da amostra; Descontaminao muito drstica (alta concentrao de reagente ou tempo muito longo de contato); Baixa velocidade ou superaquecimentoda centrfuga; Baixa sensibilidade dos meios de cultura (falta de homogeneidade, superaquecimento do coagulador, excesso de verde malaquita, e pH excessivamente cido;

(B) (C)

(D) (E) (F)

Erros de leitura da Baciloscopia = falsos-positivos; Tendncia a atribuir Baciloscopia uma positividade maior do que a real; Amostras conservadas sem refrigerao; Demora entre a coleta e o processamento da amostra; Concentrao do reagente de descontaminao mais baixa do que o recomendado; Pouco tempo de contato da amostra com o reagente descontaminante; Erros no processo de esterilizao do reagente; Descuidos nos procedimentos que requerem esterilidade e de biossegurana (excessivo movimento de pessoas no ambiente de trabalho, gerao de correntes de ar por ventiladores ou ar condicionado, etc.)

(G)

Concetrao do reagente descontaminante mais alta do que o recomendado; Muito tempo de contato da amostra com o reagente descontaminante; Concentrao de verde malaquita nomeio de cultura mais alta do que o recomendado;

264 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

CAPTULO 8

IDENTIFICAO DE MICOBACTRIAS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

8 .1 Descrio
Conforme exposto anteriormente, o gnero Mycobacterium constitudo por espcies do Complexo M. tuberculosis (CMTB) e outras denominadas de micobactrias no causadoras de tuberculose (MNT)1, 2. Os laboratrios que realizam cultura para micobactrias devem ser capazes de separar espcies do CMTB das MNT, do contrrio tero que reportar o resultado das culturas positivas, como Mycobacterium sp., ou encaminhar a cultura a um laboratrio de referncia para realizao da identificao da espcie. Um dos aspectos mais importante do processo de isolamento e identificao das micobactrias o tempo decorrido entre a coleta da amostra clnica e a emisso do laudo com a espcie identificada, para que esse dado seja utilizado pelo mdico em benefcio do tratamento do paciente. A identificao das MNT realizada pelo LRN ou LRR e pode ser feita por mtodos fenotpicos, moleculares ou pela combinao de ambos. Assim, a seqncia de mtodos para identificao composta de testes para separao do CMTB das MNT, testes para diferenciao das espcies do CMTB e testes para identificao das MNT conforme apresentado na Figura 1. Figura 1 Seqncia para identificao de micobactrias a partir de uma cultura de micobactrias

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 265

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .2 Material para os testes fenotpicos para separao das espcies do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) e diferenciao das espcies do Complexo M. tuberculosis
Equipamentos Agitador mecnico de tubos. CSB Coagulador de meios. Estufa bacteriolgica a 36 1C. Microscpio ptico. Reagentes gua destilada estril. Solues para colorao pelo mtodo de Ziehl-Neelsen, conforme o Captulo 6 deste manual. leo de imerso. Soluo saturada de Cloreto de mercrio. O Cloreto de mercrio cancergeno e por isso deve ser manuseado com cuidado, utilizando EPI apropriados e preparado em pequenas quantidades. Placas de Petri contendo meio de Middlebrook 7H10 com enriquecimento OADC, preparado de acordo com as recomendaes do fabricante. Soluo de cido oxlico a 3%. Soluo de Tween 80 a 0,1% (v/v) estril. Tubos de 20 x 180 mm com meio de Lwenstein-Jensen (LJ) (Anexo 7.17.1.1 Captulo 7). Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio LJ-piruvato de sdio (Anexo 7.17.1.2 Captulo 7). Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio LJ com PNB 500 g/ml (Anexo 7.17.1.4 Captulo 7). Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ com 5g/ml de TCH (Anexo 8.12.1 neste captulo). Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ com 2g/ml de SM (Anexo 8.12.2 neste captulo). Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ com 20 g/ml de CS (Anexo 8.12.3 neste captulo). Tubos de 20 x 100 mm com 10 ml de meio de Middlebrook 7H9 com 0,1% de agar, preparado de acordo com as instrues do fabricante ou meio de Kirchner com 0,1% de agar (Anexo 8.12.4 neste captulo).

266 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Tubos de 20 x 100 mm com 5 ml de meio de Dubos modificado para o teste da pirazinamidase (Anexo 8.12.5 neste captulo). Soluo de Sulfato ferroso amoniacal (Anexo 8.12.6 neste captulo). Fitas comerciais para o Teste da niacina. Soluo substrato de nitrato de sdio 22 mM (Anexo 8.12.7 neste captulo). Reagente A (Anexo 8.12.8 neste captulo). Reagente B (Anexo 8.12.8 neste captulo). Reagente C (Anexo 8.12.8 neste captulo). Zinco em p. Soluo uria indol (anexo 8.12.9 neste captulo) ou discos de uria.

Insumos Alas bacteriolgicas descartveis estreis. Caixas para guardar as lminas. Frascos de vidro esterilizados com tampa de rosca contendo 5-6 prolas de vidro de 3 mm de dimetro e 2 ml de gua destilada estril. Os frascos com as prolas de vidro devem ser previamente esterilizados e depois acrescentados os 2 ml de gua destilada estril. Lminas de vidro com borda fosca para microscopia. Luvas descartveis. Pipetas Pasteur descartveis estreis. Sacos plsticos autoclavveis. Swabs. Tubos de vidro com tampa de rosca 12 x 120 mm estreis.

8 .3 Pr-requisitos para identificao de espcies3, 4


Antes de iniciar a identificao da espcie deve, se fazer uma avaliao da cultura original, preparar uma suspenso bacteriana (item 8.3.1) e conservar a cepa para eventuais repeties, conforme descrito no Captulo 10. O primeiro passo para a identificao a observao do aspecto da cultura. O objetivo : 1. Confirmar a pureza da cultura, verificando a ausncia de contaminao, pois uma cultura contaminada com outras bactrias causa resultados falsos positivos nos testes de identificao. 2. Verificar o nmero de colnias na cultura que no deve ser inferior a 20, pois poucas colnias no so suficientes para realizao de todos os testes. Nesse caso, recomenda-se fazer um subcultivo da cultura original. 3. Verificar a morfologia e pigmentao das colnias.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

4.

Verificar a mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura, pela observao de diferenas na morfologia e pigmentao das colnias. ATENO: Quando a cultura for em meio lquido, a observao acima no pode ser feita . A identificao pode ser iniciada com base apenas nas caractersticas microscpicas da cultura . Se essa cultura tiver grande quantidade de BAAR pode-se fazer a semeadura diretamente nos meios dos testes de inibio de crescimento, tempo e temperatura de crescimento . Os testes bioqumicos devero ser feitos com o subcultivo do meio lquido .

Se a cultura em meio lquido tiver poucos bacilos, pode-se incubar a cultura por mais alguns dias at obter um bom crescimento ou centrifugar toda a cultura para concentrar os bacilos, ressuspender em 2 ml de gua destilada estril e inocular nos meios testes para identificao. O segundo passo para a identificao a realizao de um esfregao a partir da cultura em meio slido ou lquido, corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen com o objetivo de: 1. Confirmar se a cultura de BAAR. 2. Verificar a morfologia dos bacilos e a formao de corda, a qual sugere que a cultura possa ser do CMTB. 3. Confirmar se a cultura no est contaminada por outras bactrias ou fungos. Caso a cultura esteja contaminada, fazer a descontaminao como descrito no item de preparao da suspenso bacteriana (item 8.3.1). 4. Verificar se h mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura. Caso seja detectada cultura mista proceder como no item 8.3.2 O terceiro passo a preparao da suspenso bacteriana como ser descrita a seguir. 8 .3 .1 Preparo da suspenso bacteriana3, 4 Descrio Para uniformizao do inculo para os testes de inibio de crescimento em meios contendo diversos componentes e alguns testes bioqumicos, recomenda-se preparar uma suspenso bacteriana.

268 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Procedimento Transferir com ala descartvel estril de 10 l colnias da cultura para um tubo contendo 5-6 prolas de vidro e 2 ml de gua destilada estril. Homogeneizar em agitador mecnico por aproximadamente 10 segundos. Deixar em repouso por 10 minutos para sedimentao dos aerossis. Essa suspenso contm aproximadamente 105 unidades formadoras de colnias por ml. Caso a cultura esteja contaminada por outras bactrias ou fungos, substituir a gua destilada por 2 ml de uma Soluo de cido oxlico a 3%, deixar agir por 2 minutos antes de inocular nos meios. Nesse caso, os testes bioqumicos devero ser realizados com as colnias da subcultivo descontaminada. 8 .3 .2 Isolamento de colnias Descrio A mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura um fator de erro no processo de identificao. Essa mistura nem sempre detectada pela anlise microscpica ou macroscpica da cultura, por essa razo, anteriormente, recomendava-se iniciar a identificao a partir de uma colnia isolada. Mas esse procedimento acarreta um atraso de um ms na identificao. Devido exigncia pela rapidez na liberao de resultados, recomenda-se fazer o isolamento das colnias somente quando for detectada cultura mista pela anlise microscpica ou macroscpica. Em alguns casos a cultura mista s detectada no final do processo e, nesse caso, faz-se o isolamento das colnias e repete-se todos os testes para identificao6. Procedimento 1. Preparar a suspenso bacteriana como descrito no item 8.3.1 utilizando Soluo de Tween 80 a 0,1% (v/v) ao invs de gua destilada. 2. Fazer uma diluio dessa suspenso a 10-6 e semear, com ala bacteriolgica, uma placa de Petri contendo meio middlebrook 7H10 ou 7H11 acrescido de OADC. 3. Incubar a 36 1C at que o crescimento seja detectado. 4. A partir das colnias isoladas fazer os subcultivos dos diferentes tipos de colnias. 5. Iniciar a identificao a partir dos subcultivos das colnias isoladas.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 269

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .4 Separao das espcies do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT)
A separao das espcies do CMTB das MNT pode ser feita por quatro testes fenotpicos a partir do primo-cultivo (Quadro 1). muito importante que os testes sejam feitos utilizando-se culturas com crescimento ativo de 3 a 4 semanas. indispensvel a incluso de controles positivos e negativos ao realizar os testes. 1. Anlise microscpica da cultura. 2. Anlise macroscpica da cultura. 3. Inibio de crescimento em meio de LJ-PNB. 4. Teste da Niacina. ATENO: Todo material utilizado nos testes de identificao devem ser descontaminados em autoclave antes de serem descartados como resduos biolgicos, conforme descrito no Captulo 3 . 8 .4 .1 Anlise microscpica da cultura3, 6 Descrio A anlise microscpica consiste na confeco de um esfregao em lmina de vidro a partir de uma amostra da colnia para avaliar a pureza da cultura, presena de BAAR e a formao de corda. De modo geral, as micobactrias apresentam-se na forma de bacilos curvos ou retos, com 0,2 a 0,7 m de largura por 1 a 10 m de comprimento7. Quando isolados, os bacilos do CMTB, geralmente, apresentam tamanho entre 3-4 m. Outra caracterstica a ausncia de emulsificao da colnia na soluo utilizada para confeco do esfregao, ficando visveis pequenos grumos da colnia. Por outro lado, as colnias de MNT so de fcil emulsificao As espcies do CMTB apresentam a formao de corda, ou grumos aglomerados lineares. A formao de corda pode ser observada em esfregaos de cultura em meio slido ou lquido, corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Geralmente, os bacilos apresentam-se em paliada adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam-se como grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes. A formao de corda mais evidente na cultura em meio lquido. A maioria das MNT no forma corda, exceto algumas espcies como, M. kansasii, M fortuitum e M. chelonae. O aspecto microscpico das MNT de bacilos isolados e de tamanho menor que 2 m (cocobacilos) ou maiores que 5 m. A diferenciao entre a formao da corda das espcies do CMTB e MNT pode ser feita pela observao do tamanho do bacilo isolado no esfregao.

270 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Precauo Os testes de identificao de micobactrias devero ser realizados em CSB, inclusive o esfregao para exame microscpico. O tcnico dever estar utilizando equipamentos de proteo individual (EPI), conforme descrito Captulo 3. Procedimentos 1. Identificar o nmero de registro da cultura na parte fosca da lmina de vidro. 2. Colocar uma gota da Soluo saturada de Cloreto de mercrio, ou de Soluo salina ou de gua destilada estril, no centro da lmina de vidro. 3. Retirar com o auxlio de uma ala bacteriolgica descartvel uma pequena amostra da colnia e colocar em cima da gota. 4. Homogeneizar a amostra na gota fazendo movimentos circulares com a ala bacteriolgica. 5. Colocar a lmina em um suporte e deixar secar temperatura ambiente, dentro da CSB. 6. Fixar o esfregao, passando a lmina trs vezes pela chama de um bico de Bunsen, fora da CSB. 7. Corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen conforme descrito no Captulo 6. 8. Realizar a leitura da baciloscopia no microscpio. ATENO: O Cloreto de mercrio mata quase que instantaneamente os bacilos, permitindo que a fixao e colorao do esfregao sejam feitas sem risco biolgico . No entanto, por ser um produto txico recomenda-se preparar pequenas quantidades e sempre estar utilizando EPI quando for manuse-lo . Interpretao de resultados BAAR positivo: bacilos corados em vermelho. BAAR negativo: ausncia de bacilos corados em vermelho. Formao de corda positivo: bacilos em paliada com um aspecto de corda ou grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes. Formao de corda negativa: bacilos dispersos no esfregao, geralmente com tamanho diferente do observado para membros do CMTB. Contaminao positiva: presena de outras bactrias (cocos ou bacilos), fungos (leveduras ou filamentos), geralmente corados em azul. Contaminao negativa: ausncia de outras bactrias ou fungos.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 271

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Controles de Referncia para interpretao do teste Formao de corda positivo: esfregao de cultura de M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Formao de corda negativo: esfregao de cultura de M. avium (ATCC 25291). Figura 2 Esfregaos de cultura de micobactrias

A) M. tuberculosis
Fonte: Foto cedida por Gleize Villela

B) MNT

8.4.2 Anlise macroscpica da cultura3, 4, 5 Descrio Essa avaliao feita na cultura original em meio slido. As colnias de micobactrias cultivadas em meio slido apresentam diferentes morfologias e pigmentao. A morfologia das colnias pode ser lisa, rugosa, opaca ou transparente. A pigmentao , tambm, uma caracterstica importante utilizada na classificao e pode variar de laranja a amarelo intenso. Procedimento 1. Observar a cultura de preferncia com uma lupa manual em um ambiente iluminado e anotar as caractersticas da colnia. 2. Observar e anotar o aspecto da colnia: lisa, rugosa, aspecto de couve-flor. 3. Observar e anotar a pigmentao da colnia: acromgena (creme), pigmentada (laranja, amarela, salmo).

272 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Leitura e Interpretao Colnia de M. tuberculosis: acromgena, geralmente de cor creme, colnia rugosa com aspecto de couve-flor. Colnia de MNT: pigmentada ou acromgena, lisa ou rugosa. 8 .4 .3 Teste de inibio de crescimento em meio com cido p-nitrobenzico 500 g/ml3, 4, 8, 9 Descrio Esse teste foi descrito por Tsukamura em 1964 e pode ser realizado a partir da cultura ou da semeadura da amostra clnica conforme descrito no Captulo 7. um teste muito til para separao das espcies do CMTB das MNT, pois ao contrrio da maioria das MNT, todas as espcies do CMTB no crescem nesse meio. As espcies de MNT que eventualmente podem no crescer em presena de PNB o M. kansasii, M. xenopi e M. gastri. Por essa razo, esse teste pode auxiliar na deteco de cultura mista (M. tuberculosis + MNT). Procedimento 1. Semear, com uma pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana das culturas em teste e dos controles de referncia positivo e negativo, tubos contendo meio de LJ (tubo controle) e LJ-PNB. A gota deve ser semeada no pice do meio de cultura e deixar escorrer at fim do tubo. Incubar o tubo na posio vertical a 36 1C por 15 dias. Leitura e interpretao 1. Quando realizado a partir da semeadura da amostra clnica, os resultados obtidos devero ser interpretados conforme descrito no Captulo 7. 2. Quando realizado a partir de uma cultura, comparar o crescimento do tubo controle LJ com o tubo LJ-PNB. Positivo (resistente): presena de crescimento no meio LJ-PNB. Negativo (sensvel): ausncia de crescimento no meio LJ-PNB. Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. fortuitum (ATCC 6841) ou M. avium (ATCC 25291). Negativo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .4 .4 Teste da Niacina10, 11, 12, 13 Descrio A niacina atua como um precursor na biossntese de co-enzimas envolvidas nas reaes de xido-reduo da sntese metablica de todas as micobactrias. Embora a niacina seja produzida por todas as micobactrias, somente algumas espcies do CMTB como M. tuberculosis, M. africanum e raras espcies de MNT, como M. simiae, M chelonae e M. marinum produzem quantidades detectveis pelo teste in vitro. As fitas comerciais esto impregnadas com cloramina e tiocianato de potssio acidificado e cido p-aminosaliclico (PAS). A combinao desses reagentes leva a formao e liberao de cloreto de cianognio, o qual reage com PAS na presena da niacina produzindo uma colorao amarela. Precauo O teste da niacina deve ser realizado para as espcies de crescimento lento acromgena e a cultura deve ter entre 4 e 5 semanas de crescimento em meio slido, com pelo menos 50 colnias. Procedimento 1. Usar um dos tubos da cultura original para realizar o teste da niacina. Se no houver crescimento suficiente para o teste de niacina, fazer um subcultivo do tubo original. 2. Adicionar 1,5 ml de gua destilada estril nos frascos das culturas teste e nos controles de referncia positivo e negativo. 3. Fazer vrios cortes na superfcie do meio com uma ala descartvel estril, para permitir a extrao da niacina contida no meio de cultura. 4. Colocar os tubos em posio horizontal, de modo que o lquido cubra toda a superfcie do meio. Deixar por 20 30 minutos. Os tubos podem ser colocados a 36C para acelerar a extrao. 5. Transferir 0,6 ml do lquido com uma pipeta Pasteur descartvel, estril, para um tubo com tampa de rosca 12 x 120 mm. 6. Colocar a fita do Teste Niacina dentro de cada tubo teste. Fechar bem a tampa. 7. Deixar temperatura ambiente por 15 minutos, agitando de vez em quando. Observar a cor amarela que se desenvolve no lquido, no considerar a cor na fita. Leitura e interpretao Teste positivo: desenvolvimento de cor amarela no lquido. Teste negativo: no h desenvolvimento de cor amarela.

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Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. tuberculosis H37Ra ATCC 25177. Negativo: M. avium ATCC 25291. Quadro 1 Separao do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No causadoras de Tuberculose
Complexo M. tuberculosis Pigmentao Formao de corda Crescimento em LJ-PNB Produo de niacina ausente + +/MNT presente/ausente +/-/+

+/- = predominantemente positivo; -/+= predominantemente negativo; PNB = cido -nitrobenzico.

8 .5 Diferenciao dos membros do Complexo M. tuberculosis


As espcies do CMTB causam tuberculose (TB) no homem e nos animais. Esse complexo composto por sete espcies (M. tuberculosis, M. bovis, M africanum, M. microti, M. bovis BCG, M. caprae, M. pinnipedii). O M. canetti, uma variante de M. tuberculosis encontrada na regio da Somlia, ainda no foi reconhecido oficialmente como uma espcie do complexo1, 3, 13, 14, 15. A identificao do CMTB essencial para confirmao do diagnstico, enquanto que a diferenciao das espcies desse complexo necessria somente em algumas situaes, como por exemplo, na suspeita de infeco por M. bovis, uma vez que essa espcie naturalmente resistente a pirazinamida (PZA). Para fins epidemiolgicos, entretanto, pode-se identificar no apenas a espcie, mas tambm as variantes geogrficas de M. tuberculosis (as clssicas, as asiticas) e as duas variantes geogrficas de M. africanum (tipo I e tipo II). A diferenciao dessas variantes pode ser feita por alguns testes fenotpicos. No entanto, h limitaes metodolgicas, uma vez que essas variantes apresentam resultados variveis, (Quadro 2). A diferenciao mais precisa pode ser feita com testes moleculares, tais como RFLP-IS6110 (Restriction Fragment Length Polymorphism), Spoligotyping e/ou MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersal Repetitive Units Variable Numbers of Tandem repeats)3, 4.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Mycobacterium tuberculosis A espcie M. tuberculosis, variante clssica ou asitica, foi classificada no gnero em 1896 por Lehmann e Neumann, redefinida por Runyon e col. em 1967 e posteriormente por Kubica e col. em 19723, 7. As colnias de M. tuberculosis em meio slido tm aspecto rugoso, assemelhandose a farelos de po e de couve-flor, e crescem em meios de cultura contendo glicerol ou piruvato de sdio como fonte de carbono. Os bacilos medem cerca de 0,3-0,5 m de largura por 2-4 m de comprimento, podendo apresentar-se ocasionalmente mais curtos ou longos. O esfregao da cultura, geralmente, apresenta formao de corda. A temperatura de crescimento restrita faixa de 34-38C. Essa espcie aerbica, sensvel PZA e cicloserina (CS) e positiva no teste da reduo do nitrato3, 4. A variante clssica resistente a hidrazida do cido tiofeno 2-carboxlico (TCH) e a asitica sensvel. Ambas so sensveis ao PNB, e positivas ao teste da niacina, embora existam algumas excees. Os isolados de M. tuberculosis sensveis a isoniazida (INH) produzem uma reao fortemente positiva da catalase, enquanto que os resistentes a INH freqentemente produzem reaes fracas ou negativas3. Mycobacterium bovis A espcie M. bovis causa, principalmente, TB em bovinos, mas pode acometer outros animais e o homem. Os bacilos da espcie M. bovis costumam ser mais curtos do que os do M. tuberculosis e a formao de corda menos freqente. As colnias em meio slido so mais planas e lisas do que a variante humana. Crescem em meio de cultura contendo piruvato de sdio em substituio ao glicerol. O crescimento restrito a faixa de temperatura entre 34-38C. Essa espcie microaerfila, sensvel ao TCH e a CS, resistente a PZA. O teste da niacina negativo3, 4. Mycobacterium africanum A espcie M. africanum, foi isolada pela primeira vez na frica ocidental por Castets e col. em 1969. Essa espcie apresenta caractersticas intermedirias entre M. bovis e M. tuberculosis. Existem duas variantes de M. africanum. A variante africana I, originria da frica ocidental, negativa para o teste do nitrato e suas colnias em meio slido assemelham-se s de M. bovis, no apresentando preferncia por piruvato de sdio. A variante africana II, originria da frica oriental, positiva para o teste do nitrato e suas colnias assemelham-se s de M. tuberculosis. As duas variantes so microaerfilas e so sensveis a TCH, PZA e CS. O Teste de Niacina varivel para ambas. O crescimento restrito faixa de temperatura entre 34-38C3,4.

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Bacilo Calmette-Gurin (BCG) derivado atenuado do M. bovis, utilizado na vacina BCG. No entanto, apresenta caractersticas morfolgicas e de cultura semelhantes s de M. tuberculosis. No apresenta preferncia por piruvato de sdio. negativo para o teste do nitrato (ou fraco reator), aerbico, sensvel TCH, mas resistente PZA e CS. O Teste de Niacina negativo3. Mycobacterium microti O M. microti foi descrito por Wells em 1937, e foi inicialmente denominado de vole bacillus. M. microti causa doena em pequenos roedores. A doena rara em gatos e sunos e muito rara em humanos. Recentemente, isolados de M. microti de humanos foram caracterizados com o uso de mtodos moleculares16. De acordo com Yates (1984)17, as poucas cepas existentes em colees de cultura tm as caractersticas da variante I de M. africanum. Os bacilos de M. microti podem se diferenciados dos outros membros do CMTB por apresentarem formato curvo18. Mycobacterium canetti Essa espcie foi descrita, em 1969, por George Canetti e foi denominada de M. tuberculosis canetti em sua homenagem. Em 1997, van Soolingen e col. descreveram o isolamento de uma cepa denominada So93 com as mesmas caractersticas fenotpicas e genotpicas da cepa isolada por Canetti. Desde ento alguns casos causados por M. canetti tm sido relatados19. Essa espcie apresenta colnias lisas, teste de niacina negativo e reduo de nitrato positiva. resistente TCH, PZA e estreptomicina (SM). Mycobacterium caprae Foi originalmente isolada de caprinos na Espanha. Posteriormente foi isolado de gado, sunos e humanos que tiveram contato com caprinos. Apresenta preferncia de crescimento em meio com piruvato de sdio em substituio ao glicerol20, 21. Mycobacterium pinnipedii Foi originalmente isolado a partir de casos de TB em lees marinhos, focas e tapires brasileiros. Apresenta preferncia de crescimento em meio com piruvato de sdio e cresce em temperatura de 33C15, 22. 8 .5 .1 Testes Fenotpicos para diferenciao das espcies do Complexo M. tuberculosis A diferenciao das espcies do CMTB pode ser feita por nove testes fenotpicos descritos abaixo. muito importante que os testes enzimticos sejam feitos utilizan-

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

do-se culturas com crescimento ativo de 3 a 4 semanas. indispensvel a incluso de controles de referncia positivos e negativos ao realizar os testes. (Quadro 2). 1) Crescimento em meio LJ com glicerol e LJ com piruvato de sdio. 2) Inibio de crescimento em meio com TCH. 3) Inibio de crescimento em meio com SM. 4) Inibio de crescimento em meio com CS. 5) Preferncia de oxignio. 6) Pirazinamidase. 7) Teste de reduo do nitrato. 8) Urease. 9) Niacina. 8 .5 .1 .1 Crescimento em meio LJ e LJ com Piruvato de Sdio3, 4 Descrio As espcies do CMTB apresentam variaes quanto a preferncia de fonte de carbono empregada nos meios de cultura. Os meios base de ovos podem ser formulados com glicerol ou piruvato de sdio como fonte de carbono. As espcies, M. bovis, M microti, M caprae e M. pinnipedii, usualmente crescem melhor em meio de LJ com piruvato de sdio3, 15. Procedimento 1. Semear, com uma pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana (preparada como descrito no item 8.3.1) em meio de LJ (tubo controle) e LJ com piruvato de sdio. 2. Incubar a 36 1C por 15 dias. Leitura e interpretao Aps 15 dias observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos dois tubos incubar por mais sete dias. Controles de referncia para interpretao do teste Crescimento no meio de LJ com piruvato de sdio: M. bovis (ATCC 19210) e M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Crescimento no meio de LJ com glicerol: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).

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8 .5 .1 .2 Teste de inibio de crescimento em meio com Hidrazida do cido Tiofeno 2-Carboxlico (TCH)3, 4 Descrio As espcies do CMTB apresentam variaes quanto ao crescimento em meio de cultura contendo TCH. As espcies M. bovis, M. africanum, M. microti e M. tuberculosis variante asitica no crescem nesse meio, ao contrrio das outras espcies de micobactrias3, 9. um teste til para diferenciao entre M bovis e M. tuberculosis. As cepas de M. bovis resistentes INH podem apresentar resistncia TCH3. Procedimento 1. Semear, com uma pipeta Pasteur, uma gota da suspenso bacteriana (preparada como descrito no item 8.3.1) em meio de LJ (tubo controle) e LJ-TCH, preparada a partir das culturas teste e das culturas dos controles de referncia. 2. Incubar a 36 1C por 15 dias. Leitura e interpretao Aps 15 dias observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos dois tubos incubar por mais sete dias. Controles de referncia para interpretao do teste Crescimento no meio de LJ: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177) e M. bovis (ATCC 19210). Crescimento no meio de LJ-TCH: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). 8 .5 .1 .3 Teste de inibio de crescimento em meio com Estreptomicina (SM)4 Descrio Esse teste til para diferenciao do M. canetti das outras espcies do CMTB. Procedimento 1. Semear, com uma pipeta Pasteur, uma gota da suspenso bacteriana (preparada como descrito no item 8.3.1), em meio de LJ (tubo controle) e LJ-SM, preparada a partir das culturas teste e das culturas dos controles de referncia. 2. Incubar a 36 1C por 15 dias. Leitura e interpretao Aps 15 dias, observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos dois tubos incubar por mais sete dias.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Controles de referncia para interpretao do teste Crescimento no meio de LJ: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177), M. canetti. Crescimento no meio de LJ com SM: M. canetti ou M. tuberculosis resistente a SM. 8 .5 .1 .4 Teste de inibio de crescimento em meio com Cicloserina (CS)3 Descrio Esse teste til para diferenciar M. bovis-BCG de outras espcies do CMTB. A espcie M. bovis-BCG cresce em meio de LJ-CS ao contrrio das outras espcies do CMTB (David et al., 1989). Procedimento 1. Semear, com uma pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana (preparada como descrito no item 8.3.1), em meio de LJ (tubo controle) e LJ-CS. 2. Incubar a 36 1C por 15 dias. Leitura e interpretao Aps 15 dias, observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos dois tubos incubar por mais sete dias. Controles de referncia para interpretao do teste Crescimento no meio de LJ: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177) e M. bovisBCG (cepa Moreau). Crescimento no meio de LJ-CS: M. bovis-BCG (cepa Moreau). 8 .5 .1 .5 Preferncia de oxignio3, 4 Descrio Essa tcnica pode ser feita com meio de Middlebrook 7H9 ou com o meio de Kirchner contendo 0,1% de agar. Procedimento 1. Preparar o meio de cultura semi-slido (Middlebrook 7H9 ou Kirchner) e distribuir 10 ml em tubos de 20 x 100 mm com tampa de rosca. Manter na posio vertical. 2. Pipetar 0,2 ml da suspenso bacteriana preparada como no item 8.3.1, a partir das culturas teste e das culturas dos controles de referncia, cerca de 10 mm abaixo da superfcie do meio; fechar bem o tubo e misturar com movimentos circulares tomando cuidado para no formar bolhas. 3. Incubar a 36 1C por 14 dias.

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Leitura e interpretao Aerbico: presena de crescimento prximo superfcie. Microaerfilo: presena de crescimento na forma de um anel a cerca de 10 a 20 mm abaixo da superfcie (s vezes o crescimento pode se estender para cima). Controles de referncia para interpretao do teste Aerbico: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Microaerfilo: M. bovis (ATCC 19210). 8 .5 .1 .6 Piramidaze (PZAse)4 Descrio Os isolados bacterianos sensveis PZA possuem a enzima pirazinamidase que converte a PZA em cido pirazinico e amnia. A deteco dessa enzima uma alternativa utilizada para fins de identificao. Precaues necessrio inocular pelo menos uma alada de bactria para que no ocorra um resultado falso negativo. Procedimento 1. Colocar sobre a superfcie do meio (anexo 8.12.5), com auxlio de uma ala bacteriolgica, uma quantidade grande do crescimento bacteriano. 2. Incubar a 36 1C por seis dias. Leitura e interpretao 1. Adicionar 1 ml de Soluo de Sulfato ferroso amoniacal 1% a cada tubo (preparado no momento de uso). 2. Colocar na geladeira por 3 horas. Teste positivo: a formao de um anel rosa imediatamente abaixo da superfcie do agar difundindo para dentro do meio significa que o teste sensvel PZA. Teste negativo: a ausncia da formao do anel rosa no agar significa que o teste resistente a PZA.

Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25 177). Negativo: M. bovis-BCG (cepa Moreau).

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8 .5 .1 .7 Teste da reduo do nitrato12, 23 Descrio O teste do nitrato detecta a capacidade da micobactria de reduzir o nitrato (NO3-) a nitrito (NO2-) pela ao da enzima nitrato-redutase. As espcies que produzem a nitrato-redutase reduzem o nitrato a nitrito em condies anaerbicas com objetivo de obter o oxignio do nitrato para seu metabolismo. Os nitritos formados na reao, em contato com cido actico ou clordrico desenvolvem colorao rosa quando adicionado de sulfanilamida e naftiletilenodiamina reao de Griess. Precauo Para o teste da reduo do nitrato, a cultura de micobactrias de crescimento lento no deve ter mais de quatro semanas de crescimento em meio slido. As culturas de micobactrias de crescimento rpido devem ser testadas com at duas semanas de crescimento. Procedimento 1. Adicionar 2 ml do substrato nitrato de sdio 22 mM em tubos de 12 x 120 mm. 2. Transferir, para o tubo contendo substrato, uma ala cheia de crescimento bacteriano das culturas teste e das culturas dos controles de referncia. 3. Incubar a 36 1C por 2 horas. 4. Aps 2 horas, adicionar: Uma gota do reagente A Duas gotas do reagente B Duas gotas do reagente C Leitura e interpretao Observar e anotar imediatamente o aparecimento de cor no substrato de acordo com a escala abaixo:
COR Rosa plido Rosa claro Rosa escuro Vermelho Vermelho escuro Vermelho arroxeado Teste positivo: 3+ a 5+ Teste negativo: incolor, +/- a 2+ INTENSIDADE DA COR +/1+ 2+ 3+ 4+ 5+

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Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Negativo: substrato do teste ou M. avium (ATCC 25291). ATENO: Todos os resultados devem ser confirmados porque algumas micobactrias so capazes de reduzir o nitrito a amonaco, podendo dar resultados falsos negativos (David et al ., 1994) . Para confirmao, adicionar uma pequena quantidade (pitada) de zinco em p a todos os tubos negativos . Se houver NaNO3 na suspenso, no momento em que o zinco adicionado ocorre imediatamente mudana de cor para o vermelho . Essa mudana caracteriza o teste verdadeiro negativo . Se, aps a adio do zinco, a cor continuar inalterada, significa que a reao j ocorreu e foi alm da reduo de nitrito, caracterizando, portanto, um teste positivo . 8 .5 .1 .8 Teste combinado da produo de niacina e reduo de nitrato10 Descrio Os testes da niacina e reduo do nitrato podem ser combinados, reduzindo o tempo e material. Procedimentos 1. Em uma cultura em LJ com menos de quatro semanas, acrescentar 2,5 ml do substrato de nitrato de sdio e fazer vrios cortes na superfcie do meio. 2. Repetir o item acima para as culturas dos controles de referncia. 3. Deixar os tubos na posio vertical, por 2 horas, em Estufa bacteriolgica a 36 1C. 4. Transferir 0,6 ml do lquido para um tubo de rosca 12 x 120 mm e proceder como no teste da niacina (item 8.4.4). 5. Adicionar ao tubo de cultura, com o substrato nitrato de sdio, os reagentes de revelao (A, B e C), de acordo com o teste da reduo do nitrato (item 8.5.1.7). Controles de referncia para interpretao do teste Teste Niacina Positivo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Negativo: M. avium (ATCC 25291). Controles de referncia para interpretao do teste Teste do Nitrato Positivo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Negativo: substrato do teste ou M. avium (ATCC 25291).

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .5 .1 .9 Urease4, 10 Descrio Algumas espcies de micobactrias so capazes de hidrolisar a uria, que pode ser detectada por um simples teste baseado na mudana de pH da soluo. Esse teste til na identificao das espcies acromgenas e escotocromgenas e na identificao de M. bovis e M. bovis-BCG, que apresentam reao fortemente positiva4, 10. Procedimentos 1. Inocular um tubo contendo 0,5 ml da Soluo Uria-indol com uma alada de crescimento bacteriano da cultura teste e das culturas dos controles de referncia. 2. Incubar a 36 1C. Leitura e interpretao Fazer a leitura aps 2 e 18 horas de incubao. Teste positivo: mudana de cor amarela para rosa. Teste negativo: sem alterao de cor (amarelo). Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. bovis-BCG (cepa Moreau) ou M. kansasii (ATCC 12478). Negativo: substrato do teste ou M. avium (ATCC 25291). 8 .5 .1 .10 Mtodo alternativo da Urease Procedimento 1. Preparar tubos de 12 x 120 mm contendo 0,5 ml de gua destilada estril. 2. Colocar um disco de uria em cada um dos tubos. 3. Adicionar uma alada de crescimento bacteriano da cultura nos tubos teste e uma alada nos tubos controles com as culturas de referncia. 4. Incubar a 36 1C. Leitura e interpretao Fazer a leitura aps uma hora, e diariamente, por 3 dias seguidos. Teste positivo: mudana da cor do meio para roxo ou rosa escuro. Teste negativo: no h mudana de cor do meio. Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. bovis-BCG (cepa Moreau) ou M. kansasii (ATCC 12478). Negativo: M. avium (ATCC 25291).

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Quadro 2 Caractersticas das espcies pertencentes ao Complexo M. tuberculosis


M. tuberculosis Testes Clssico Morfologia da colnia Niacina Nitrato Urease PZAse TCH SM CS LJ/PS Preferncia de oxignio eugnica rugosa + + + + R S S aerbico Asitica eugnica rugosa + + + + S S S aerbico Clssico disgnica lisa S S S + micro BCG eugnico rugosa + S S R aerbico Tipo I disgnica rugosa +/+/+ S S S + micro Tipo II eugnica rugosa +/+ + + R S S micro disgnica rugosa + +/+ S S SI + micro eugnica lisa + + R R S ND disgnica lisa ND + ND ND + micro M. bovis M. africanum M. microti M. canetti M. caprae M. pinnipedii disgnica rugosa -* ND + S ND + ND

+/- = resultado varivel, R = resistente droga, S = sensvel droga, ND = No h dados, micro = microaeroflico, LJ/PS = preferncia por piruvato de sdio, PZAse = pirazinamidase, TCH = hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico, SM = estreptomicina, CS = cicloserina, -*= geralmente negativo.

8 .6 Identificao fenotpica das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT)


Descrio O mtodo fenotpico de identificao inclui um conjunto de testes baseados em caractersticas culturais e bioqumicas, tais como: tempo e temperatura de crescimento, que varia de acordo com a espcie de 25 a 45C, pigmentao, capacidade de crescimento em meios seletivos e testes enzimticos. Em 1958, Runyon props uma classificao das MNT em quatro grupos baseada na pigmentao e tempo de crescimento das colnias. As espcies que apresentam crescimento em meio slido aps sete dias so classificadas como de crescimento lento e aquelas que apresentam crescimento em menos de sete dias, de crescimento rpido24. Essa classificao , ainda, utilizada para identificao das MNT juntamente com outros testes.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Quadro 3 Classificao das micobactrias de acordo com tempo de crescimento e pigmentao das colnias
Grupo I Caracterstica da cultura Fotocromgenas caracteriza-se pelo crescimento lento das colnias. As culturas desenvolvem pigmento amarelo somente quando expostas luz. Exemplo: M. kansasii, M. marinum. Escotocromgenas caracteriza-se pelo crescimento lento das colnias. As culturas desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Exemplo: M. gordonae, M. szulgai. Acromgenas caracteriza-se pelo crescimento lento das colnias. As culturas no produzem pigmento. Exemplo: M. avium, M. terrae. Crescimento rpido caracteriza-se pelo crescimento rpido das colnias. As colnias podem ser pigmentadas ou no. Exemplo: M. fortuitum, M. chelonae.

II III IV

Abaixo, sero descritos os principais testes de identificao empregados no mtodo fenotpico, exceto os que j foram descritos previamente nos itens 8.3 e 8.4. O primeiro passo para identificao organizar o conjunto de meios de cultura controles, de meios contendo inibidores e tubos contendo as solues e substratos dos testes bioqumicos. O segundo passo, comum a todos os testes, o preparo da suspenso bacteriana para o inculo nos meios e substratos conforme item 8.3.1, das culturas testes e das culturas dos controles de referncia. Os procedimentos de semeadura, leitura e interpretao sero descritos separadamente para cada mtodo. Testes 1. Produo de pigmento. 2. Crescimento a 25C. 3. Crescimento a 45C. 5. Determinao do tempo de crescimento: a) teste do tempo de crescimento em LJ; b) teste de inibio de crescimento em meio de Sauton com cido pcrico; c) teste de inibio de crescimento em meio de agar comum. 6. Inibio de crescimento em meio com NaCl 5%. 7. Arilsulfatase 3 e 14 dias. 8. Hidrlise do tween 80. 9. -galactosidase. 10. Reduo do telurito de potssio. Provas descritas nos itens 8.3 e 8.4. 11. Inibio de crescimento em meio com PNB.

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12. Reduo do nitrato. 13. Urease. 14. Pirazinamidase. Testes para identificao de espcies de MNT de crescimento rpido 15. Captao do ferro. 16. Inibio de crescimento em meio com citrato de sdio. 17. Inibio de crescimento em meio com manitol. 18. Inibio de crescimento em meio com inositol. Precaues muito importante que os testes sejam feitos utilizando-se culturas jovens, com crescimento ativo de 3 a 4 semanas. Culturas com mais de cinco semanas no so apropriadas. indispensvel a incluso de controles positivos e negativos ao realizar os testes. Nos testes bioqumicos, o controle negativo sempre feito com o substrato especfico ou meio de cultura no qual o teste realizado. Os testes de identificao de micobactrias devero ser realizados em CSB. O tcnico dever estar utilizando EPI, como luva e avental. Material Equipamentos Agitador mecnico de tubos. Coagulador de meios. CSB. Estufa bacteriolgica a 24 1C, 36 1C e 45 1C Reagentes gua destilada estril. Tubos 12 x 120 mm com 2 ml de meio de LJ. (Anexo 7.17.1.1 - Captulo 7) Tubos 12 x 120 mm com 2 ml de meio de LJ com 5% de NaCl (Anexo 8.12.12). Tubos com 2 ml do substrato arilsulfatase 3 dias (Anexo 8.12.13). Tubos com 2 ml do substrato arilsulfatase 14 dias (Anexo 8.12.13). Soluo de reveladora de Carbonato de sdio 2N (Anexo 8.12.13.1). Tubos 12 x 120 mm com 2 ml do substrato Tween 80 (Anexo 8.12.14). Tubos 12 x 120 mm com 2 ml de meio Dubos modificado (Anexo 8.12.15). Tubos com 2,5 ml de meio de Middlebrook 7H9 acrescido de ADC, preparado conforme recomendaes do fabricante. Soluo de Telurito de potssio 0,2% (Anexo 8.12.16).

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ-citrato frrico amoniacal (Anexo 7.17.1.3 Captulo 7). Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio base para os testes de utilizao de inositol, manitol, citrato de sdio (Anexo 8.12.17). Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio citrato de sdio (Anexo 8.12.19). Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio manitol (Anexo 8.12.20). Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio inositol (Anexo 8.12.21).

Insumos Alas bacteriolgicas descartveis estreis. Frascos de vidro esterilizados com tampa de rosca contendo 5-6 prolas de vidro de 3 mm de dimetro e 2 ml de gua destilada estril. Os frascos com as prolas de vidro devem ser previamente esterilizados e depois acrescentados os 2 ml de gua destilada estril. Luvas descartveis. Pipetas Pasteur descartveis estreis. Papel alumnio ou caixa com tampa. Sacos plsticos para autoclave. Swabs. Tubos de vidro de 12 x 120 mm estreis. 8 .6 .1 Temperatura de crescimento e pigmentao das colnias3, 4, 10 Descrio Esses testes permitem classificar a micobactria em um dos quatro grupos de Runyon e identificar a temperatura tima de crescimento. Em geral, a temperatura tima de crescimento 36-37C. No entanto, algumas espcies crescem melhor em temperaturas mais baixas (25-30C) como o M. marinum, M. ulcerans, M. haemophilum e outras em temperaturas mais elevadas, como M. xenopi (42C) e M. thermoresistible (52C). Precaues Para avaliao das temperaturas de crescimento, imprescindvel que as estufas sejam calibradas e monitoradas com termmetros de mxima e mnima. Procedimento Com pipeta Pasteur descartvel e estril, inocular cinco tubos com meio de LJ, uma gota da suspenso bacteriana no incio da superfcie do meio e incubar os tubos na posio horizontal por 15 dias.

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1)

Dois tubos de LJ para a prova de produo de pigmento. Tubo 1 a 36 1C, dentro de uma caixa fechada, sem penetrao de luz ou embrulhado em papel alumnio. Tubo 2 a 36 1C, em uma bandeja exposta luz da estufa. 2) Trs tubos de LJ para a prova das temperaturas de crescimento. Incubar nas temperaturas de Estufa bacteriolgica a 24 1C, 36 1C e 44 1C. Os tubos dos testes da temperatura sero utilizados como controle de crescimento. No caso de identificao de micobactrias isoladas de leses de pele e tecidos moles, incubar a 24 1C. Leitura e interpretao do teste produo de pigmento Comparar o crescimento do tubo 1 com o crescimento do tubo 2 e classificar: a) Escotocromgena, se as colnias dos tubos 1 e 2 forem pigmentadas. b) Fotocromgena, se as colnias do tubo 1 no apresentarem pigmentao e as colnias do tubo 2 forem pigmentadas. c) Acromgenas, se as colnias dos tubos 1 e 2 no apresentarem pigmento. Controles de referncia para interpretao do teste a) Escotocromgena M. gordonae (ATCC 14470). b) Fotocromgena M. kansasii (ATCC 12478). c) Acromgena M. terrae (ATCC 15755) ou M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Leitura e interpretao da temperatura de crescimento Comparar o crescimento do tubo 2 mantido a 36 1C com os tubos incubados nas temperaturas de 24 1C e 44 1C. Anotar o resultado. 8 .6 .2 Determinao do tempo de crescimento9 Descrio Esse teste permite a classificao das MNT em micobactrias de crescimento lento ou rpido. No entanto, algumas espcies apresentam crescimento intermedirio, por isso a definio de crescimento lento ou rpido feita com base em trs testes9. a) Determinao do tempo de crescimento das colnias em meio LJ. b) Crescimento em meio de agar comum. c) Crescimento em meio de Sauton com cido pcrico 0,2%.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Procedimento para determinao do tempo de crescimento das colnias em meio LJ Inocular um tubo de LJ, com uma gota da suspenso bacteriana. Incubar por 15 dias a 36 1C. Leitura e interpretao Observar o crescimento aps sete dias de incubao e classificar em: Crescimento rpido: se houver crescimento abundante. Crescimento lento: se no houver crescimento. Controles de referncia para interpretao do teste Crescimento rpido: M. fortuitum (ATCC 6841). Crescimento lento: M. avium (ATCC 25291) ou M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Procedimento para determinao do crescimento em agar comum e meio contendo cido pcrico 1. Inocular, com pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana nos tubos agar comum e Sauton com cido pcrico. 2. Incubar por 15 dias a 36 1C. Leitura e interpretao Crescimento rpido: crescimento nos dois meios. Crescimento lento: ausncia de crescimento nos dois meios. 8 .6 .3 Teste de inibio de crescimento em meio com NaCl 5%4, 9 Descrio Algumas espcies de micobactrias so capazes de crescer em meio de cultura contendo NaCl a 5%. A maioria das espcies de crescimento rpido cresce nesse meio, exceto M. chelonae, M. immunogenum e M. mucogenicum. Dentre as espcies de crescimento lento somente o M. triviale cresce nesse meio. Procedimento 1 Com pipeta Pasteur descartvel e estril, inocular uma gota da suspenso bacteriana no incio da superfcie dos meios LJ e LJ-NaCl. Incubar os tubos na posio horizontal por 15 dias. Leitura e interpretao Ausncia de crescimento: sensvel.

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Crescimento leve ou at 10 colnias: +. Crescimento mdio de 11 a 100 colnias: ++. Crescimento confluente ou acima de 100 colnias: +++. Comparar crescimento do tubo controle com o tubo com droga considerando o nmero de cruzes. Sensvel: crescimento no tubo controle e nenhum crescimento no tubo teste. Resistente: se houver crescimento semelhante, em cruzes, no tubo controle e teste.

Controles de referncia para interpretao do teste Sensvel: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). Resistente: M. fortuitum (ATCC 6841), M. triviale (ATCC 15754). 8 .6 .4 Arilsulfatase 3 e 14 dias10 Descrio A arilsulfatase uma enzima capaz de hidrolisar a ligao entre o grupo sulfato e o anel aromtico em um composto dissulfato potssico de fenolftalena. A deteco da fenolftalena liberada pela hidrlise enzimtica evidenciada pelo desenvolvimento da cor rosa aps adio do carbonato de sdio. A intensidade da cor varia de acordo com a espcie. um teste til para identificao das espcies acromgenas de crescimento rpido e M. xenopi10. Procedimento 1. Inocular 5 gotas da suspenso bacteriana em cada um dos tubos: arilsulfatase 3 e 14 dias. 2. Incubar a 36 1C. 3. Aps 3 dias de incubao, adicionar 4 gotas da Soluo de Carbonato de sdio 2N ao tubo de 3 dias. 4. Aps 14 dias de incubao adicione 4 gotas de Soluo de Carbonato de sdio 2N ao tubo de 14 dias. Leitura e interpretao Positivo: aparecimento de cor que varia do rosa ao vermelho. Anotar o resultado em cruzes de acordo com a intensidade da cor. Negativo: substrato permanecer incolor. Obs .: Considerar positivo a partir do tubo 3+ da escala do Nitrato . Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. fortuitum (ATCC 6841), M. xenopi (ATCC 6841). Negativo: M. avium (ATCC 25291).
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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .6 .5 Hidrlise do tween 8010, 13 Descrio O vermelho neutro ligado ao tween 80 adquire uma cor mbar. A hidrlise do tween por uma esterase libera o vermelho que retorna sua cor original. Esse teste til para identificao das espcies de crescimento lento. Procedimento 1. Inocular 5 gotas da suspenso bacteriana no tubo com o substrato do teste. Incubar a 36 1C por 10 dias. Leitura e interpretao Observar a mudana de cor aps 5 e 10 dias. Positivo: alterao da cor do substrato de mbar para rosa ou vermelho. Negativo: sem alterao da cor do substrato. NOTA: necessrio que o meio mude de cor; se as colnias apresentarem cor vermelha, mas o meio permanecer mbar, o teste considerado negativo . Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. kansasii (ATCC 12478). Negativo: M. avium (ATCC 25291). 8 .6 .6 -Galactosidase9, 10 Descrio A -galactosidase uma enzima induzida, ou seja, produzida somente quando exposta ao substrato especfico. Sua ao especfica contra as galactosidases simples. Esse teste consiste na deteco da enzima -galactosidase utilizando o composto 2-nitrofenil--D-galactopiranosideo (ONPG)10. Procedimento 1. Inocular 5 gotas da suspenso bacteriana no tubo com o substrato do teste. 2. Incubar a 36 1C por sete dias. Leitura e interpretao Positivo: alterao da cor do substrato de incolor para amarelo. Negativo: sem alterao da cor do substrato.

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Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. chelonae (NCTC 946). Negativo: M. avium (ATCC 25291). 8 .6 .7 Reduo do Telurito de Potssio4, 10, 13 Descrio A maioria das micobactrias pode reduzir o telurito de potssio a telurito metlico em um cultivo lquido. A diferena entre as espcies consiste na velocidade da reduo. As espcies do complexo M. avium e as de crescimento rpido so capazes de reduzir o telurito em trs dias4, 10, 13. Procedimento 1. Inocular uma gota da suspenso bacteriana no tubo contendo 2,5 ml de meio Middlebrook 7H9. 2. Incubar a 36 1C por sete dias. 3. Aps sete dias adicionar 2 gotas da Soluo de Telurito de potssio. 4. Re-incubar a 36 1C por mais trs dias. Leitura e interpretao Observar a formao de um precipitado preto metlico no fundo do tubo. Se aps trs dias no houver formao do precipitado, incubar por mais 6 dias. Positivo: formao de um precipitado preto metlico no fundo do tubo. Negativo: ausncia do precipitado. Algumas espcies podem produzir um precipitado marrom que deve ser considerado negativo. Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. avium (ATCC 25291). Negativo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177). 8 .6 .8 Captao do Ferro4, 13 Descrio Esse teste baseia-se na capacidade de algumas espcies de micobactrias em captar o Citrato frrico amoniacal e reduzi-lo a xido de ferro. indicado para separar M. chelonae de M. fortuitum4, 13 Procedimento Inocular uma gota da suspenso bacteriana no tubo contendo LJ com Citrato frrico amoniacal. Incubar a 36 1C por duas semanas.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Leitura e interpretao do teste produo de pigmento Positivo: colnias adquirem colorao marrom metlica escura. Negativo: sem alterao de cor. Controles de referncia para interpretao do teste Positivo: M. fortuitum (ATCC 6841). Negativo: M. chelonae (NCTC 946) ou M. abscessus (ATCC 19977). 8 .6 .9 Utilizao dos Substratos Inositol, Manitol e Citrato de Sdio4, 25 Descrio Esses testes se baseiam na capacidade das MNT acromgenas de crescimento rpido de utilizarem diversas substncias como nica fonte de carbono. um teste til para diferenciao entre M. fortuitum, M. peregrinum, M. chelonae, M. abscessus. Procedimento 1. A partir da suspenso bacteriana, preparar diluies seriadas em gua destilada estril at que no seja visvel turbidez. 2. Usar essa ltima diluio para inocular 0,1 ml em cada um dos tubos com meio com Citrato de sdio, inositol ou manitol e um tubo controle. 3. Incubar a 36 1C por 14 dias. Leitura e interpretao Positivo: crescimento no tubo controle e nos meios testes contendo Citrato de sdio, inositol ou manitol. Negativo: crescimento no tubo controle e ausncia de crescimento no meio teste. Controles de referncia para interpretao do teste Manitol positivo: M. smegmatis (ATCC 19420). Inositol positivo: M. smegmatis (ATCC 19420). Citrato de sdio positivo: M. smegmatis (ATCC 19420).

8 .7 Controle de qualidade interno


Todos os meios e reagentes utilizados no testes de identificao devem ser submetidos ao CQI realizado pelo laboratrio, em todo novo lote de meios e reagentes, considerando os aspectos macroscpicos (cor, consistncia, volume) e o controle microbiolgico, de acordo as recomendaes feitas no Captulo 7.

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Quadro 4 Testes teis para a identificao das MNT de crescimento lento mais freqentemente isoladas de material clnico
Pigmento PNB 3 dias 15 dias +/+/+/+/+ + + +/+ +/ND + + +/+ +/+ + + + + + + ND +/+ + + ND + + + +/+ + + +/+ + +/+ + + + + + + + +/+ + + + +/+ + + + + + + + + + + + + 3 dias 9 dias Nitrato Urease 25C A A A A A A A F F F F E E E/F E E/A +/+ + + + + + + ND +/+ + +/+ +/+ + + +/+ + + + +/+ +/+ + + + cido pcrico gal Agar NaCl PZA comum 5% Aril Tween 80 Telurito 45C +/+ +/+/+

Espcie

M. avium

M. intracellulare

M. terrae

M. triviale

M. nonchromogenicum

M. celatum

M. malmoense

M. kansasii

M. marinum

M. asiaticum

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M. simiae

M. lentiflavum

M. gordonae

M. szulgai*

M. scrofulaceum

M. xenopi

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A=acromgena, F= fotocromgena, E= escotocromgena; + >85% dos isolados so positivos; < 15% dos isolados so positivos; +/- 50-85% dos isolados so positivos; * Fotocromgena a 25C; ND, no definido

296 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Quadro 5 Testes teis para a identificao das MNT de crescimento rpido mais freqentemente isoladas de material clnico
Pigm Agar comum Ferro + ND + + + ND + + + + V + + V + + + + + + V + + + + + V + + Nitrato Manitol Inositol + + + + + + + + ND + + + + + + + ND + + + + + + + + + + + ND V V E E E E A A A A A A A A + + + + + + + ND + + + + + + + + + + + + + + + PNB cido pcrico NaCl 5% -gal + + + + + V Aril (3 dias) Citrato 25C + + + V + + + + + + + + 45C + V + v + +

Espcie

M. aurum

M. neoaurum

M. flavescens

M. phlei

M. chelonae

M. abscessus

M. fortuitum

M. peregrinum

M. immunogenun

M. mucogenicum

M. smegmatis

M. wolinskyi

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

A=acromgena, F= fotocromgena, E= escotocromgena; + >85% das cepas so positivas; < 15% cepas so positivas; V=varivel; ND=no definido.

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8 .8 Identificao molecular pelo Mtodo Molecular de PRA-hsp6526


Descrio O mtodo de PRA-hsp65 (do ingls Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65) foi descrito por Telenti e col. em 1993. Esse mtodo diferencia a maioria das espcies de MNT, mas no as do CMTB. Resumidamente, um fragmento de 439 pb do gene hsp65 amplificado pela reao em cadeia da polimerase (PCR) e digerido com duas enzimas de restrio, BstE II e Hae III. A determinao da espcie possvel comparando os padres de restrio com um algoritmo. O algoritmo apresentado neste manual consiste de um compilado de perfis publicados por Telenti e col. (1993), ampliado por outros autores27, 28, 29 e disponvel na pgina eletrnica http://app.chuv.ch/prasite/index.html). Materiais Equipamentos Banho-maria a 36 1C e 59 1C. CSB. Microcentrfuga. Micropipetas automticas. Sistema de gel eletroforese. Sistema para documentao de gel de agarose. Termociclador. Reagentes Agarose ultrapura. Enzimas de restrio Hae III e BstE II. gua ultrapura esterilizada do tipo Milli-Q. Glicerol para biologia molecular esterilizado. Marcador de peso molecular de 50 e 100 pb. Oligonucleotdeo iniciador TB11 (5-ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT). Oligonucleotdeo iniciador TB12 (5-CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT). Deoxinucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Soluo de arraste de Azul de bromofenol (Anexo 8.12.23). Soluo de Brometo de etdio a 0,5% (Anexo 8.12.24). Manter em frasco escuro. Taq DNA polimerase. Tampo TBE 0,5x concentrado (Anexo 8.12.22).

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Insumos Microtubos de polipropileno de 0,2 e 1,5 ml estreis, livres de Dnase. Ponteiras com barreira estreis. Precaues Para realizao da reao de PCR so necessrias salas separadas para extrao de DNA, preparao da mistura para PCR e adio de DNA na reao e eletroforese dos produtos amplificados. Extrao do DNA 1. Retirar uma ala cheia do crescimento bacteriano em meio slido e colocar em um microtubo contendo 500 l de gua ultrapura esterilizada. 2. Se for utilizar cultura em meio lquido, transferir 1,5 ml da cultura em um microtubo esterilizado, centrifugar a 12.000 x g por 5 minutos e ressuspender o sedimento em 100 l de gua purificada do tipo Milli-Q esterilizada. 3. Aquecer por 20 minutos a 99C em termobloco localizado dentro da CSB. 4. Congelar a -20C. No momento de uso, descongelar, centrifugar brevemente e usar 5 l do sobrenandante. Figura 3 Microtubo contendo uma ala de crescimento bacteriano em 500 l de gua ultrapura esterilizada

Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS

Reao em Cadeia da Polimerase do gene hsp65 1. Preparar a mistura de reagentes para a reao de PCR, descrita no quadro a seguir, em uma sala limpa ou em fluxo lminar utilizado para preparao da PCR. 2. Pr-incubar o glicerol em banho-maria a 36 1C para facilitar a pipetagem. 3. Numerar os tubos testes, mantendo-os fechados at o momento de uso.

298 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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ATENO: A mistura com os reagentes para a reao de PCR pode ser adquirida pronta necessitando apenas acrescentar o glicerol e os iniciadores . Nesse caso, calcular a quantidade de acordo com as recomendaes do fabricante . Mistura de reagentes para reao de PCR
Reagentes H2O ultrapura estril Glicerol estril Tampo 10X MgCl2 DNTP (A, T, C, G) Iniciador Tb11 Iniciador Tb12 Taq DNA polimerase Volume total Concentrao dos reagentes estoque 10% 10x 50 mM 1 mM 25 pmoles/l 25 pmoles/l 5 U/l Uma reao 27,8 l 5 l 5 l 1 l 4 l 1 l 1 l 0,2 l 45 l

4. 5. 6.

Distribuir 45 l da mistura em cada tubo teste. Em outra sala, acrescentar 5 l do DNA preparado previamente. Colocar os tubos em um termociclador programado com os ciclos abaixo.

Ciclos programados em um termociclador


Desnaturao inicial 45 ciclos: Desnaturao Anelamento Extenso Extenso final 94C 60C 72C 72C 1 minuto 1 minuto 1 minuto 10 minutos 95C 5 minutos

Eletroforese para confirmar a amplificao 1. Preparar um litro de tampo TBE 0,5 x ou volume necessrio para preparar o gel de agarose e encher a cuba de eletroforese. 2. Preparar o gel de agarose a 1% em tampo TBE 0,5 x. Misturar e dissolver a agarose em forno de microondas. Deixar esfriar at 50-60C, distribuir na bandeja do sistema de eletroforese e colocar o pente. Quando a agarose estiver solidifi-

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

3. 4. 5. 6.

cada, colocar a bandeja na cuba de eletroforese, cobrir com tampo TBE 0,5 x e retirar o pente. Em microtubos esterilizados de 1,5 ml, pipetar 5 l do produto amplificado, acrescentar 2 l da Soluo de arraste em todos os tubos. Aplicar o produto amplificado nos orifcios do gel de agarose. Incluir em uma das linhas um marcador de 100 pb. Iniciar a eletroforese a 5 V/cm at que o marcador azul da Soluo de arraste atinja o final do gel.

Colorao do gel com brometo de etdio ATENO: O Brometo de etdio cancergeno e deve ser manuseado com muito cuidado, usando luva e avental . Todos os gis corados com Brometo de etdio e a soluo que no for mais ser usada devero ser descartados como resduo qumico ou tratados antes de serem desprezados . 1. 2. Em uma cuba com tampa, colocar um litro de gua destilada e 1-2 gotas da Soluo estoque do Brometo de etdio 0,5%. Incubar o gel na Soluo de Brometo de etdio por 10 minutos e depois coloc-lo em uma cuba contendo gua, para remoo do excesso de Brometo de etdio, por mais 10 minutos. Observar sobre luz UV e documentar com sistema fotogrfico. As amostras que apresentarem amplificao devero ser digeridas com as enzimas de restrio Hae III e BstE II.

Digesto dos produtos amplificados 1. Numerar em duplicata microtubos de 1,5 ml estreis e deix-los fechados at o momento do uso. 2. Em dois microtubos, preparar as misturas abaixo, utilizando o clculo para o nmero de reaes que sero realizadas.
Reagentes Tampo 10x gua Enzima Produto do PCR Volume total BstEII 1 reao 1,5 l 8,5 l 1 l 4 l 15 l HaeIII 1 reao 1,5 l 7,5 l 1 l 5 l 15 l

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3. 4.

Incubar os tubos BstE II em banho-maria a 59 1C por 3 horas. Incubar os tubos Hae III a 36 1C por 3 horas.

Eletroforese dos produtos digeridos 1. Preparar o gel de agarose a 3%. 2. Misturar e dissolver a agarose em forno de microondas como descrito acima 3. Deixar esfriar at 50-60C e distribuir na bandeja do sistema de eletroforese e colocar o pente. 4. Quando a agarose estiver solidificada, colocar na cuba de eletroforese e cobrir com tampo TBE 0,5x. Retirar o pente. 5. Acrescentar 5 l da Soluo de arraste em todos os tubos com 15 l do produto digerido e aplicar nos orifcios do gel de agarose conforme descrito abaixo. 6. No primeiro orifcio aplicar marcador de 50 pb (M), seguida pelas amostras digeridas com BstE II. No prximo orifcio aplicar novamente o marcador de 50pb seguida pelas amostras digeridas com a enzima Hae III e no ltimo orifcio marcador de 50 pb. Exemplo:
BstE II M 1 2 3 4 5 M 1 2 Hae III 3 4 5 M

7.

Iniciar a eletroforese a 5 V/cm (entre os eletrodos) at que o marcador azul da Soluo de arraste atinja o final do gel.

Colorao com Brometo de etdio 1. Incubar o gel na Soluo de Brometo de etdio, preparada como descrito anteriormente, por 10 minutos e depois em gua por 10 minutos. 2. Observar sobre luz UV e documentar com sistema fotogrfico. Leitura e Interpretao 1. Determinar o tamanho dos fragmentos obtidos, baseando-se no marcador de 50 pb aplicado em ambas as laterais e no meio do gel. Figura 4. 2. Anotar os resultados e comparar com o algoritmo descrito a seguir.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Figura 4. Gel de agarose contendo perfis de PRA aps digesto com as enzimas de restrio BstE II e Hae III. Linhas 1, 16 e 31 = Marcador de peso moelcular de 50pb. Amostras 2-15 digeridas com BstE II e amostras 17-30 digeridas com Hae III.
BstE II Hae III

1 2 3 4

6 7 8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Fonte:

Fotografia cedida por Erica Chimara

Controle de qualidade interno do mtodo de PRA-hsp65 a) Controle de qualidade da gua purificada do tipo Milli-Q. Esterilizar em autoclave a gua a ser utilizada na extrao do DNA e na reao do PCR. Fazer alquotas de 500 l em microtubos esterilizados em autoclave. Registrar e dar nmero ao lote conforme as regras da qualidade do laboratrio. Antes de utilizar esse lote nas extraes de DNA e na PCR, realizar uma reao de PCR com um controle positivo contendo DNA e duas reaes de controle negativo contendo amostra desse lote de gua. Se no houver amplificao do controle negativo, esse lote de gua est aprovado para uso. b) Controle da reao de PCR. A PCR, por ser um mtodo bastante sensvel, exige muitos cuidados para preveno de contaminao da reao com produto de PCR de reaes anteriores. Esse controle muito importante para monitoramento de resultados falso positivos. Por essa razo, deve-se incluir em toda reao um tubo com os reagentes da reao e ao invs do DNA acrescentar gua purificada do tipo Milli-Q esterilizada. Caso ocorra amplificao do controle contendo gua, toda reao dever ser repetida. Nesse caso, deve-se rever todo processo para identificar a origem da contaminao. c) Controle da digesto enzimtica. O controle da efetividade das enzimas de restrio utilizada deve ser feito incluindo na reao de PCR uma amostra de DNA de uma cepa de referncia com padro de restrio conhecido. Incluir o produto da amplificao dessa cepa na etapa da digesto enzimtica e aplic-la no ltimo orifcio do gel de eletroforese. Se o padro de restrio no corresponder ao esperado, essa etapa dever ser repetida com um novo lote da enzima de restrio.

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d) Controle da eletroforese e colorao com Brometo de etdio. Para o controle da colorao dos produtos amplificados ou digeridos e da eletroforese, aplicar no ltimo orifcio do gel, um marcador de peso molecular de 50 ou 100 pb. A no visualizao do marcador aps a colorao indica que o processo de colorao no foi adequado. Nesse caso, pode se preparar uma nova Soluo de Brometo de etdio e repetir a colorao. A eletroforese estar aprovada se todas as bandas do marcador de peso molecular forem visualizadas separadamente no gel de agarose, como indicado pelo fabricante. Tratamento de gis e da Soluo de Brometo de etdio30 Os gis corados e a Soluo de Brometo de etdio podem ser descartados seguindo as normas de descarte de resduos qumicos ou fazer a descontaminao no prprio laboratrio, com Permanganato de potssio. A soluo corante pode ser inativada com carvo ativado. Proceder separadamente a inativao do Brometo de etdio contido nos gis e na soluo de colorao. 1. Colocar os gis ou a Soluo de Brometo de etdio em um Becker de 1000 ml. Quando o volume atingir a metade do recipiente acrescentar um pouco de gua para reduzir a concentrao do Brometo de etdio. 2. Adicionar um volume de 0,5 M de Permanganato de potssio (KMnO4) (Anexo 8.12.25). 3. Misturar cuidadosamente e, ento, adicionar um volume de HCl 2,5 N (Anexo 8.12.26). Deixar a soluo em repouso por vrias horas. 4. Adicionar um volume de NaOH 2,5 N (Anexo 8.12.27). Misturar cuidadosamente. 5. Descartar a soluo na pia e os gis no lixo hospitalar. Inativao da soluo de BrEt com carvo ativado 1. Em uma garrafa rotulada, colocar um funil de vidro com filtro de papel e um pouco de carvo ativado. 2. Umedecer levemente o carvo com gua. 3. Verter a soluo corante cuidadosamente. 4. O lquido recolhido na garrafa deve ser desprezado na pia. 5. Abrir a torneira e deixar a gua correr por alguns segundos. 6. O filtro com o carvo ativado pode ser utilizado 2 a 3 vezes. 7. Se o lquido filtrado apresentar colorao, o carvo dever ser trocado. 8. O filtro com o carvo ativado deve ser colocado dentro de um saco de autoclave e embalado em uma caixa de papelo. 9. Fechar e rotular a caixa e descartar de acordo com as normas de descarte de resduos qumicos.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 303

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Algoritmo dos perfis de restrio de 441 pb do gene hsp65 digeridos com as enzimas BstE II e Hae III
BstEII HaeIII 170 130 160 90 60 160 85 55 145 130 145 130 140 55 50 130 115 70 60 130 105 70 200 70 60 55 200 60 55 50 160 110 145 70 60 55 140 130 50 140 95 80 140 65 60 185 140 180 130 170 140 145 130 145 130 50 145 130 140 90 60 140 90 60 140 90 60 140 60 50 130 115 60 130 110 70 60 130 95 75 60 125 105 Espcie M. triviale 1 M. vaccae 1 M. flavescens 3 M. lentiflavum 1 M. simiae 5 M. flavescens 1 M. aurum 2 M. szulgai 1 M. immunogenum 2 M. chelonae 1 M. haemophilum 1 M. immunogenum 1 M. elephantis 1 M. cosmeticum 1 M. mucogenicum 1 M. terrae 2 M. terrae 1 M. neoaurum 1 M. simiae 4 M. triplex 1 M. lentiflavum 2 M. chitae 1 M. nonchromogenicum 2 M. mucogenicum 3 M. terrae 3 M. gordonae 4 M. gordonae 8 M. kansasii 5 M. genavense 1

440

130

320

115

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210

200 70 60 50 200 70 60 -50 200 70 60 50 190 105 80 200 70 55 185 130 180 135 -70 50 180 100 50 155 140 145 140 100 50 145 130 95 145 130 145 130 145 130 145 130 145 130 145 105 145 105 80 145 105 80 145 105 80 145 70 60 55 140 125 100 50 140 125 100 50 140 105 80 140 90 60 140 80 60 50 130 115 130 105 130 105 130 105 80 60 130 105 80 130 105 60 130 80 60 120 115 110 115 105

M. abscessus 2 M. bolletii 1 M. massiliense 1 M. ulcerans 2 M. ulcerans 2 M. simiae 1 M. thermoresistibile 1 M. hassiacum 1 M. simiae 2 M. peregrinum 1 M. scrofulaceum 1 M. avium 3 M. intermedium 1 M. interjectum 1 M. intracellulare 3 M. simiae 3 M. bohemicum M. malmoense 2 M. ulcerans 1 M. marinum 1 M. abscessus 1 M. porcinum 1 M. peregrinum 2 M. intracellulare 2 M. obuense 1 M. phlei 1 M. gordonae 5 M. avium 1 M. avium sub paratuberculosis 1 M. branderi 1 M. kansasii 1 M. avium 2 M. celatum 1 M. intracellulare 4 M. asiaticum 1

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

130/85

235

100

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85

175 80 160 90 60 145 140 -100 60 145 130 145 130 145 125 60 145 125 60 145 125 60 140 105 70 140 120 95 130 105 80 130 105 70 130 105 130 105 70 130 95 70 160 115 60 155 110 160 105 60 145 130 145 130 60 145 105 80 140 60 130 115 130 110 95 215 110 160 115 60 165 105 60 150 130 70 145 60 55 145 120 60 55 145 120 60 55 140 125 60 55 140 125 60 -50 135 90 85 130 115 75 60 130 95

M. aurum 1 M. monacense M. peregrinum 3 M. simiae 3 M. Sherrisii 1 M. smegmatis 1 M. wolinski 1 M. mageritense 1 M. shimoidei 1 M. gordonae 6 M. celatum 2 M. gastri 1 M. kansasii 2 M. kansasii 6 M. kansasii 3 M. gordonae 9 M. gordonae 7 M. heckeshornense 1 M. lentiflavum 3 M. intracellulare 1 M. malmoense 1 M. hibernae 1 M. gordonae 3 M. gordonae 10 M. gordonae 2 M. gordonae 1 M. xenopi 1 Complexo M. tuberculosis 1 M. nonchromogenicum 1 M. fortuitum 1 M. fortuitum sub.acetamidolyticum M. farcinogenes 1 M. senegalense 1 M. fortuitum 3 M. kansasii 4 M. lentiflavum 4

Fonte:

Prasite http://app.chuv.ch/prasite/index.html

8 .9 Testes fenotpicos e moleculares combinados


Descrio Tanto o mtodo fenotpico como o PRA-hsp65 apresentam algumas limitaes. As principais limitaes do mtodo fenotpico consistem na demora para obteno de resultados e a dificuldade de diferenciao de diversas espcies. Alguns testes bioqumicos podem apresentar resultados duvidosos, mesmo utilizando-se controles de

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qualidade adequados. Para obteno do resultado final de identificao pelo mtodo fenotpico, deve-se considerar o conjunto de todos os testes. As principais limitaes do mtodo de PRA-hsp65 consistem no fato de que algumas espcies apresentam perfil de PRA ainda no descrito na literatura ou um perfil de PRA compartilhado por mais de uma espcie. Por isso, a combinao de ambos facilita e evita alguns erros na identificao de espcies (Figura 1). Para no causar uma demora no resultado, recomenda-se realizar simultaneamente o PRA-hsp65 e alguns testes fenotpicos, de acordo com os passos abaixo. 1) Avaliao das caractersticas culturais como morfologia e pigmentao das colnias (cultura original). 2) Avaliao microscpica da morfologia dos bacilos (cocobacilos, bacilos curtos, longos, formao de corda). 3) Preparo da suspenso bacteriana para inculo nos testes: a) inibio de crescimento em meio contendo PNB, NaCl 5%, cido pcrico; b) crescimento em meio de agar comum; c) avaliao das temperaturas de crescimento e pigmentao. 4) Extrao do DNA bacteriano e PRA-hsp65. Interpretao dos resultados O resultado da identificao poder ser liberado se a espcie identificada pelo PRA apresentar as caractersticas culturais (morfologia e pigmentao) compatveis com a tabela de identificao fenotpica. Caso os resultados no sejam compatveis, aguardar o resultado das provas em andamento e se for necessrio, realizar outras provas ou encaminhar a cultura para um Laboratrio de Referncia (LR). A cultura mista composta por duas espcies de micobactrias causa erros na identificao. s vezes, mas nem sempre, a presena de duas espcies pode ser detectada pelo PRA ou nas subculturas em LJ. Nesse caso, a cultura deve ser subcultivada a partir de diluies da suspenso bacteriana, a fim de se obter colnias isoladas. Repetir novamente todo o processo a partir das subculturas das colnias isoladas. Em alguns casos, mesmo utilizando vrios mtodos fenotpicos e moleculares no se chega a uma identificao conclusiva. Nesse caso, pode se liberar o resultado baseado na classificao de Runyon. Vale lembrar a importncia da manuteno das cepas congeladas para eventuais repeties dos testes.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

Figura 5

Fluxograma para identificao de micobactrias pela combinao de mtodos fenotpicos e moleculares

Liberar o resultado e se necessrio realizar testes fenotpicos para diferenciao das espcies do CMTB

8 .10 Consideraes sobre critrios para diagnstico de doena causada por MNT
O diagnstico de doena por MNT exige muita cautela, pois o seu isolamento a partir de espcimes clnicos no estreis pode significar colonizao transitria ou contaminao. A American Thoracic Society recomenda que o diagnstico dessas doenas seja feito com base em uma srie de critrios bacteriolgicos, clnicos e radiolgicos2. Por essa razo, a correlao clnico-laboratorial de fundamental importncia para o estabelecimento do diagnstico de doena por MNT e para determinao da estratgia teraputica.

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8 .11 Referncias
BROSCH, R.; GORDON, S.V.; MARMIESSE, M.; BRODIN, P.; BUCHRIESER, C.; EIGLMEIER, K.; GARNIER, T.; GUTIERREZ, C.; HEWINSON, G.; KREMER, K.; PARSONS, L.M.; PYM, A.S.; SAMPER, S.; van SOOLINGEN, D.; COLE, S. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 3684-3689, 2002. 2. GRIFFITH, D.E.; AKSAMIT, T.; BROWN-ELLIOTT, B.A.; CATANZARO, A.; DALEY, C.; GORDIN, F.; HOLLAND, S.M.; HORSBURGH, R.; HUITT, G.; IADEMARCO, M.F.; ISEMAN, M.; OLIVIER, K.; RUOSS, S.; von REYN, C.F.; WALLACE, R.J. Jr, WINTHROP, K.; An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med, 15;175(4):367-416, 2007. 3. COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M.; YATES, M.D. Tuberculosis Bacteriology: Organization and Practice. Butter Worth-Heinemann, Oxford, 2nd edition. 139 p, 1997. 4. LEO, S.C.; MARTIN, A.; MEJIA G.I.; PALOMINO, J.C.; ROBLEDO, J.; TELLES, M.A.S. Portaels. Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria. Brugges, Vanden Broelle, 164 p. 2004. 5. MONTEIRO, P.H.T.; MARTINS, M.C.; UEKI, S.Y.M.; GIAMPAGLIA, C.M.S.; TELLES, M.A.S, Cord formation and colony morphology for the presuntive identification of Mycobacterium tuberculosis complex. Braz J Microbiol, 34: 171-174, 2003. 6. INUMARO, V.T.G.; BLANCO, R.M.; MARTINS, M.C.; GIAMPAGLIA, C.M.S.; UEKI, S.Y.M.; CHIMARA. E.; FERRAZOLI, L.; TELLES, M.A. Culturas Mistas de micobactrias: importante isolar e identificar?. Rev Inst Adolfo Lutz, 64:137-41, 2005. 7. HOLT, J.G.; KRIEG, N.R.; SNEATH, P.H.A.; STALEY, J.T.; WILLIAMS, S.T.; Bergeys manual of determinative bacteriology. 9 ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 597-603, 1994. 8. TSUKAMURA, M.; TSUKAMURA, S. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by p-nitro-benzoic acid susceptibility. Tubercle, 45: 64-65, 1964. 9. TSUKAMURA, M. Identification of Mycobacteria. Mycobacteriosis Research Laboratory of the National Chubu Hospital, Aichi, Japan, 1984. 10. KENT, P.T.; KUBICA, G.P.; Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, 1985. 11. DAVID, H.; LEVY-FLEBAULT, V.; THOREL, M.F. Mthodes de laboratoire pour mycobactriologie clinique. Institut Pasteur, Paris, 1989. 12. DAVID H.; BRUM, L.; PRIETO, E. Manual de Micobacteriologia em Sade Pblica: Princpios e Mtodos. Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Lisboa, 1994. 1.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

13. FERNNDEZ, de Vega F.A.; MORENO, J.E.; MARTN, J.G.; GUTIRREZ, J.J.P. Procedimentos em Microbiologia Clnica. Recomendaciones de la Sociedade espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica: Micobactrias. 2005. disponvel em <http://www.seimc.org/protocolos/microbiologia/> Acesso em 14 mar 2006. 14. van SOOLINGEN, D.; HOOGENBOEZEM, T.; de HAAS P.E.; HERMANS, P.W.; KOEDAM, M.A.; TEPPEMA, K.S.; BRENNAN, P.J.; BESRA, G.S.; PORTAELS, F.; TOP, J.; SCHOULS, L.M.; van EMBDEN, J.D. A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex. Canetti: characterization of an exceptional isolate from Africa. Int J Syst Bacteriol, 47:1236-45, 1997. 15. EUZBY, J.P. List of bacterial names with standing in nomenclature. Disponvel em: (http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.htm) Acesso em 09 mar 2007. 16. van SOOLINGEN, D.; van der ZANDEN, A.G.; de HAAS, P.E.; NOORDHOEK, G.T.; KIERS, A.; FOUDRAINE, N.A.; PORTAELS, F.; KOLK, A.H.; KREMER, K.; van EMBDEN, J.D. Diagnosis of Mycobacterium microti infections among humans by using novel genetic markers. J Clin Microbiol, 36:1840-5, 1998. 17. YATES, M.D. The differentiation and epidemiology of the tubercle bacilli and a study into the identification of other mycobacteria. MPhil Thesis: University of London, 1984. 18. FROTA, C.C.; HUNT, D.M.; BUXTON, R.S.; RICKMAN, L.; HINDS, J.; KREMER, K.; van SOOLINGEN, D.; COLSTON, M.J. Genome structure in the vole bacillus, Mycobacterium microti, a member of the Mycobacterium tuberculosis complex with a low virulence for humans. Microbiology, 150:1519-27, 2004. 19. MILTGEN, J.; MORILLON, M.; KOECK, J.L.; VARNEROT, A.; BRIANT, J.F.; NGUYEN, G.; VERROT, D.; BONNET, D.; VINCENT, V. Two cases of pulmonary tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis subsp canetti. Emerg Infect Dis, 8:1350-2, 2002. 20. ARANAZ, A.; LIEBANA, E.; GOMEZ-MAMPASO, E.; GALAN, J.C.; COUSINS, D.; ORTEGA, A.; BLAZQUEZ, J.; BAQUERO, F.; MATEOS, A.; SUAREZ, G.; DOMINGUEZ, L. Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae subsp. nov.: a taxonomic study of a new member of the Mycobacterium tuberculosis complex isolated from goats in Spain. Int J Syst Bacteriol, 49:1263-73, 1999. 21. ARANAZ, A.; COUSINS, D,; MATEOS, A.; DOMINGUEZ, L. Elevation of Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae Aranaz et al. 1999 to species rank as Mycobacterium caprae comb. nov., sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol, 53:1785-9, 2003. 22. COUSINS, D.V.; BASTIDA, R.; CATALDI, A.; QUSE, V.; REDROBE, S.; DOW, S.; DUIGNAN, P.; MURRAY, A.; DUPONT, C.; AHMED, N.; COLLINS, D.M.; BUTLER, W.R.; DAWSON, D.; RODRIGUEZ, D.; LOUREIRO, J.; ROMANO, M.I.; ALITO, A.; ZUMARRAGA, M.; BERNARDELLI, A. Tuberculosis in seals caused by a novel

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23. 24. 25. 26.

27.

28.

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30.

member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol, 53:1305-14, 2003. Mac FADDIN, J.F. Pruebas Bioquimicas para la identification de bacterias de importancia clinica. The Williams & Wilkins Co, Baltimore, 1980. RUNYON, E.H. Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med Clin North Am, 43:273-290, 1959. BRASIL. Ministrio da Sade. SVS., Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3 ed. 2005. TELENTI, A.; MARCHESI, F.; BALZ, M.; BALLY, F.; BTTGER, E. C.; BODMER, T. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol, 31: 175-178, 1993. BRUNELLO, F.; LIGOZZI, M.; CRISTELLI, E.; BONORA, S.; TORTOLI, E.; FONTANA, R. Identification of 54 mycobacterial species by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene. J Clin Microbiol, 39: 2799-806, 2001. DEVALLOIS, A.; GOH, K.S.; RASTOGI, N. Rapid identification of mycobacteria to species level by PCR-restriction fragment lenght polymorphism analysis of the hsp65 gene and proposition of an algorithm to differentiate 34 mycobacterial species. J Clin Microbiol, 35: 2969-2973, 1997. CHIMARA, E. Avaliao de mtodos moleculares para identificao de micobactrias e elaborao de um algoritmo de identificao 2005. Tese de Doutorado, apresentada a Universidade Federal de So Paulo. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor laboratory Press. 2nd edition. 1989.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .12 Anexos do captulo


8 .12 .1 Meio de Lwenstein Jensen com hidrazida do cido 2-tiofeno carboxlico (TCH) na concentrao final de 5 g/m Pesar 50 mg de TCH e adicionar a 5 ml de gua destilada estril. Transferir 1 ml dessa soluo para um tubo com 9 ml de gua destilada estril. Adicionar 1 ml dessa soluo a 100 ml meio LJ. Distribuir 3 ml em tubos com tampa de rosca 12 x 120 mm. Coagular o meio, colocando os tubos inclinados, a 85C por 45 minutos. Incubar a 36C + 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses. 8 .12 .2 Meio de Lwenstein Jensen com estreptomicina (SM) na concentrao final de 2 g/ml Pesar 0,1 g de SM e dissolver em 10 ml de gua destilada estril. Transferir 1 ml dessa soluo para um tubo com 9 ml de gua destilada estril. Adicionar 0,2 ml dessa diluio em 100 ml de meio LJ. Distribuir 3 ml de meio em tubos de rosca 12 x 120 mm. Coagular o meio, colocando os tubos inclinados a 85C por 45 minutos. Incubar a 36C + 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses. 8 .12 .3 Meio de Lwenstein Jensen com cicloserina (CS) na concentrao final de 20 g/ml Pesar 0,1 g de CS e dissolver em 10 ml de gua destilada estril. Adicionar 0,3 ml dessa soluo em 100 ml de meio LJ. Distribuir 3 ml em tubos de rosca 12 x 120 mm. Coagular o meio, colocando os tubos inclinados a 85C por 45 minutos. Incubar a 36C + 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses.

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8 .12 .4 Meio de Kirchner com 0,1% de Agar


Fosfato dissdico (Na2HPO412H2O) Fosfato monopotssico (KH2PO4) Asparagina Citrato trissdico Sulfato de magnsio (MgS047H2) Glicerol Soluo aquosa de vermelho fenol 0,4% (P/V) Agar gua destilada q.s.p. pH 7,4 7,6 Aquecer para dissolver os reagentes e ajustar o pH. Distribuir 10 ml em tubos 20 x 100 mm. Esterilizar em autoclave a 115C por 10 minutos. Manter em geladeira. No momento de uso adicionar em cada tubo 1 ml de soro de cavalo estril ou o enriquecimento Middlebrook OADC. Validade: 2 meses. 19,0 g 2,5 g 5,0 g 2,5 g 0,6 g 20,0 ml 3,0 ml 1,0 g 1000 ml

8 .12 .5 Meio para o teste da pirazinamidase


Meio de Dubos desidratado gua destilada Pirazinamida Piruvato de sdio Agar 6,5 g 1000 ml 0,1 g 2,0 g 15 g

Dissolver o meio desidratado de Dubos em gua destilada; adicionar a pirazinamida, o piruvato de sdio e o agar. Aquecer at dissolver o agar e distribuir 5 ml em tubos de 16 x 125 mm com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos. Retirar da autoclave e deixar os tubos na posio vertical at solidificar o agar. Incubar a 36 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Conservar em geladeira. Validade: 2 meses.

8 .12 .6 Soluo de Sulfato Ferroso Amoniacal a 1% Preparar a soluo no momento de uso. Dissolver 0,1 g de Sulfato Ferroso amoniacal em 10 ml de gua destilada estril. Para facilitar o trabalho, alquotas de 0,1 gramas de Sulfato Ferroso amoniacal podem ser estocadas e colocadas em tubos estreis de 16 x 125 mm com tampa de rosca. No momento de uso s adicionar 10 ml de gua destilada estril.

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .12 .7 Substrato de nitrato de sdio 22 mM, pH 7,0


Nitrato de sdio (NaNO3) Fosfato dipotssico (KH2PO4) Fosfato dissdico (Na2HPO412H2O) gua destilada 0,85 g 1,17 g 4,85 g 1000 ml

Ajustar o pH 7,0. Distribuir em vrios frascos ou bales. Esterilizar em autoclave a 121por 15 minutos. Validade: 6 meses sob refrigerao.

8 .12 .8 Reagentes de revelao do teste reduo do nitrato Reagente A


HCl gua destilada estril Ateno: Adicionar lentamente o HCl na gua, nunca adicione gua ao cido . Validade: 2 meses sob refrigerao 50 ml 50 ml

Reagente B
Sulfanilamida gua destilada estril 0,2 g 100 ml

Validade: 2 meses sob refrigerao. Descartar se o reagente apresentar mudana de cor ou formao de precipitado.

Reagente C
Hidrocloridrato N-naftiletilenodiamina gua destilada estril 0,1 g 100 ml

Validade: 2 meses sob refrigerao. Descartar se o reagente apresentar mudana de cor ou formao de precipitado

Escala padro de cores para leitura do teste de reduo do nitrato Preparar as seguintes solues estoque: 1 Fosfato dissdico 0,067 M
Fosfato dissdico (Na2HPO4) gua destilada estril q.s.p 0,95 g 100 ml

2 Fosfato monopotssico 0,067 M


Fosfato monopotssico KH2PO4 gua destilada estril q.s.p 0,91 g 100 ml

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3 Fosfato trissdico 0,067 M


Fosfato trissdico (Na3PO412H2O) gua destilada estril q.s.p 2,55 g 100 ml

4 Fenolftalena 1%
Fenolftalena lcool etlico 95 1,0 g 100 ml

5 Azul de bromotimol 1%
Azul de bromotimol lcool etlico 95 1,0 g 100 ml

6 Azul de bromotimol 0,01%


Soluo estoque 5 gua destilada estril 1,0 ml 100 ml

Substrato:
Soluo estoque 1 Soluo estoque 2 Soluo estoque 3 35 ml 5 ml 100 ml

Procedimento Colocar numa estante 8 tubos com tampas de rosca 12 x 120 mm e numer-los de 1 a 8. Distribuir 2 ml do substrato nos tubos 2 a 8.
Escala: Substrato Soluo estoque 4 Soluo estoque 6 10 ml 0,1 ml 0,2 ml

Transferir 2 ml desta soluo para o tubo n 1 e 2 ml para o tubo n 2. Do tubo n 2 transferir 2 ml para o tubo n 3 depois de homogeneizar, e assim sucessivamente at o tubo n 8, desprezando os 2 ml excedentes deste ltimo tubo. Descartar os tubos de n 4 e n 7. Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 121C. Lacrar e conservar em geladeira. A escala padro de leitura para o teste de reduo do nitrato vai da cor rosa plido a vinho e corresponde a: tubo n 8 (+/-) tubo n 6 (1+) tubo n 5 (2+) tubo n 3 (3+) tubo n 2 (4+) tubo n 1 (5+)

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Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .12 .9 Soluo de Uria-indol para o Teste da Urase (pH final 7,0)


L-triptofano Fosfato dipotssico (KH2PO4) Fosfato monopotssico (K2HPO4) Cloreto de sdio (NaCl). lcool etlico 95 Soluo de vermelho de fenol 0,2% Soluo de uria 20% estril gua destilada 3g 1g 1g 5g 10 ml 12,5 ml 100 ml 900 ml

Dissolver os componentes (exceto a soluo de uria) aquecendo levemente sem ferver. Deixar esfriar e ajustar o pH para 7,0. Filtrar em papel de filtro, distribuir em frascos de 50 ml, lacrar e identificar. Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos. Aps esfriar, adicionar, com assepsia, 100 ml de soluo de uria 20% (20 g de uria em 100 ml de gua destilada, esterilizar por filtrao com membrana de 0,22 ). Distribuir 1,5 ml em tubos estreis de 12 x 120mm com tampa de rosca. Conservar em geladeira ao abrigo da luz. Validade: 2 meses.

8 .12 .10 Meio agar comum Preparar o agar comum de acordo com recomendaes do fabricante. Distribuir 4 ml em tubos com tampa de rosca (12 x 120 mm). Esterilizar em autoclave a 121C, por 15 minutos. Inclinar os tubos em bandejas at solidificao. Incubar a 36 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses. 8 .12 .11 Meio de Sauton com cido Pcrico 0,2% (pH final 7,0)
Glicerina KH2PO4 MgSO4.7H2O cido ctrico Citrato frrico amoniacal Glutamato de sdio Agar cido pcrico gua destilada 6 ml 0,1 g 0,1 g 0,4 g 0,01 g 0,8 g 4g 0,4 g 194 ml

Dissolver os componentes, exceto o agar, por aquecimento. Resfriar e ajustar o pH com KOH 10% para 7,0. Acrescentar o agar e levar ao fogo para fundir. Distribuir 3 ml em tubo 12 x 120 mm, com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121 C, por 15 minutos. Inclinar os tubos em bandejas at solidificao. Realizar o teste de esterilidade, colocando os meios na estufa a 36 1C por 24 horas. Validade 2 meses sob refrigerao.

316 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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8 .12 .12 Meio de LJ com Cloreto de sdio 5%


Base de LJ Cloreto de sdio 200 ml 10 g

Adicionar o cloreto de sdio na base de LJ e misturar bem. Colocar os tubos inclinados no coagulador a 80-85C por 45 minutos. Realizar o teste de esterilidade, colocando os meios j coagulados na estufa a 36 1C por 24 horas. Validade 2 meses sob refrigerao.

8 .12 .13 Substrato para o Teste da Arilsulfatase 3 e 14 dias Meio lquido Preparar em duas garrafas ou bales os seguintes meios: 180 ml de meio lquido Dubos (ou Middlebrook 7H9) teste dos 3 dias. 180 ml de meio lquido Dubos (ou Middlebrook 7H9) teste dos 14 dias. Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 121C. Aps o resfriamento, adicionar 20 ml de enriquecimento Bacto Dubos Medium Albumin (ou o enriquecimento Middlebrook ADC) em cada um. Soluo substrato 0,08 M de dissulfato tripotssico de fenolftalena
Dissulfato tripotssico de fenolftalena gua destilada estril Esterilizar por membrana filtrante de 0,22 m. Validade: 3 meses sob refrigerao. 2,6 g 50 ml

Meio para o teste de 3 dias


Meio lquido Dubos ou Middlebrook 7H9 Soluo de dissulfato tripotssico de fenolftalena 0,08 M. 180 ml 2,5 ml

Distribuir 2 ml em tubos de 12 x 120 mm com tampa de rosca, estreis. Identificar os tubos (A3) dias. Validade: 2 meses sob refrigerao.

Meio para o teste de 15 dias


Meio lquido Dubos ou Middlebrook 7H9 Soluo de Dissulfato Tripotssico de Fenolftalena 0,08 M. 180 ml 7,5 ml

Distribuir 2 ml em tubos de 12 x 120 mm com tampa de rosca, estreis. Identificar os tubos (A15) dias. Validade: 2 meses sob refrigerao.

8 .12 .13 .1

Soluo Reveladora Carbonato de Sdio 2 N


10,6 g 100 ml

Carbonato de sdio anidro (Na2CO3) gua destilada estril Validade: 3 meses temperatura ambiente

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 317

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .12 .14 Soluo Substrato para Teste do Tween 80


Tampo Fosfato 0,067 M, Tween 80 Soluo aquosa de vermelho neutro a 0,1%. 100 ml 0,5 ml 2 ml

Adicionar o Tween 80 no Tampo Fosfato at completa dissoluo, acrescentar o vermelho neutro. Distribuir 2 ml em tubos de 12 x 120 mm com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos. O substrato deve ter cor mbar aps a esterilizao. Manter em geladeira ao abrigo da luz envolvido em papel alumnio. Validade: 2 semanas.

Tampo Fosfato 0,067 M pH 7,0 Soluo A Fosfato de sdio M/15


Fosfato de sdio (Na2HPO4) gua destilada Dissolver o sal na gua, esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos. Validade 6 meses. 9,47 g 1000 ml

Soluo B Fosfato de Potssio M/15


Fosfato de potssio (KH2PO4) gua destilada Dissolver o sal na gua, esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos. Validade 6 meses. 9,07 g 1000 ml

Tampo Fosfato 0,067 M pH 7,0


Soluo A Soluo B Ajustar o pH da soluo final para 7,0. Validade 6 meses. 61,1 ml 38,9 ml

8 .12 .15 Meio de Dubos modificado para o Teste da -galactosidase


Sulfato de sdio (Na2SO4) Fosfato monopotssico (KH2PO4) Asparagina Citrato de sdio (C6H5Na3O7.2H2O) Sulfato de magnsio (MgSO4.7H2O) Soluo tween 80 10% gua destilada q.s.p. 2,48 g 1,0 g 2,0 g 1,5 g 0,6 g 5,0 ml 1000 ml

Dissolver todos os reagentes na gua. Preparar alquotas de 100 ml. Esterilizar em autoclave a 115C por 15 minutos. Manter em refrigerador. Validade: 3 meses. Substrato para -galactosidase Dissolver 0,1g de 2-nitrofenil--D-galactopiranosideo em 20 ml do meio de Dubos modificado esterilizado. Esterilizar por membrana filtrante de 0,22 m. Completar o volume para 100 ml com o meio de Dubos modificado esterilizado. Adicionar 7,5 ml do enriquecimento de Middlebrook OADC. Distribuir 2 ml em tubos estreis de 12 x 120 mm com tampa de rosca. Manter em refrigerador. Validade: uma semana.

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8 .12 .16 Soluo de Telurito de Potssio 0,2%


Telurito de potssio gua destilada 0,1 g 50 ml

Preparar alquotas de 2 ml em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 115C por 15 minutos. Validade 2 meses sob refrigerao.

8 .12 .17 Meio base para os Testes de Utilizao de Inositol, Manitol, Citrato de Sdio
Sulfato de amnio (NH4)2SO4 Fosfato de potssio (KH2PO4) Sulfato de magnsio (MgSO4.7H2O) Agar gua destilada 1,05 g 0,2 g 0,2 g 8g 400 ml

Dissolver em gua destilada todos os ingredientes. Aquecer at completa dissoluo do agar. Dividir em quatro alquotas de 100 ml. Ajustar o pH para 7,0 em duas alquotas e pH 7,2 em outras duas. Esterilizar em autoclave a 121C, por 20 minutos. Validade 2 meses temperatura ambiente.

8 .12 .18 Meio Controle pH 7,0


Meio base pH 7,0 100 ml Distribuir 3 ml em tubos 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em posio inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.

8 .12 .19 Meio com Citrato de Sdio pH 7,0


Meio base pH 7,0 Soluo de citrato de sdio 100 ml 5 ml

Fundir o meio base em forno de microondas ou em banho-maria at a temperatura aproximada de 56C. Adicionar assepticamente 5 ml da soluo de citrato de sdio, preparada previamente. Distribuir 3 ml em tubos estreis 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em posio inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.

8 .12 .20 Meio com Manitol pH 7,2


Meio base pH 7,2 Soluo de Manitol 100 ml 5 ml

Fundir o meio base em forno de microondas ou em banho-maria at a temperatura aproximada de 56C. Adicionar assepticamente 5 ml das Soluo de Manitol, preparada previamente. Distribuir 3 ml em tubos estreis 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em posio inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 319

Captulo 8 Identificao de Micobactrias

8 .12 .21 Meio com Inositol pH 7,2


Meio base pH 7,2 Soluo de inositol 100 ml 5 ml

Fundir o meio base em forno de microondas ou em banho-maria at a temperatura aproximada de 56C. Adicionar assepticamente 5 ml das Soluo de Inositol preparada previamente. Distribuir 3 ml em tubos estreis 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em posio inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.

Soluo de Inositol ou Manitol 0,5%


Inositol ou manitol gua destilada estril Dissolver o inositol ou manitol em gua. Filtrar em membrana 0,22 m. Manter em frasco bem vedado, para evitar evaporao. Validade 6 meses sob refrigerao. 1,5 g 15 ml

Soluo Citrato de Sdio 0,6%


Citrato de sdio gua destilada estril Dissolver o Citrato de sdio em gua. Filtrar em membrana 0,22 m. Manter em frasco bem vedado, para evitar evaporao. Validade 6 meses sob refrigerao. 1,8 g 15 ml

8 .12 .22 Tampo TBE 10X (pH 8,0)


Tris base cido brico EDTA 2H2O Agua destilada Ajustar o pH. Validade: 6 meses temperatura ambiente 107,8 g 55,0 g 7,4 g 1000 ml

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8 .12 .23 Tampo de Arraste


Ficoll Azul de bromofenol gua destilada estril 1,5 g 0,025 g 10 ml

Dissolver os reagentes em gua. Manter em frasco escuro.Validade: 6 meses temperatura ambiente.

8 .12 .24 Soluo de Brometo de Etdio


Brometo de etdio gua destilada esterilizada 50 mg 10 ml

Diluir o brometo de etdio em gua destilada. No momento de uso, diluir duas a trs gotas desta soluo em dois litros de gua destilada. Manter em frasco escuro.Validade: 1 ano a temperatura ambiente. OBS . O Brometo de etdio cancergeno e deve ser manuseado com cuidado, utilizando todos os EPIs .

8 .12 .25 Soluo de Permanganato de Potssio 0,5 M


Permanganato de Potssio (KMnO4) gua destilada estril q.s.p. Dissolver o KMnO4 na gua. Validade: 6 meses temperatura ambiente. 79,02 g 1000 ml

8 .12 .26 Soluo de HCl 2,5 N


cido clordrico P.A. gua destilada estril q.s.p. 207 ml 1000 ml

Lentamente adicionar o cido clordrico na gua destilada. Validade: 6 meses temperatura ambiente.

8 .12 .27 Soluo de NaOH 2,5 N


Hidrxido de sdio (NaOH) P.A. gua destilada estril q.s.p. Dissolver o NaOH na gua. Validade: 6 meses temperatura ambiente. 100 g 1000 ml

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CAPTULO 9

TESTE DE SENSIBILIDADE PARA MICOBACTRIAS

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9 .1 Descrio
O Teste de Sensibilidade (TS) o exame laboratorial realizado para detectar a resistncia/sensibilidade dos isolados de M. tuberculosis s drogas utilizadas no tratamento da tuberculose. Resistncia s drogas antituberculose definida pelos resultados dos testes bacteriolgicos, como a diminuio da sensibilidade in vitro de um isolado de M. tuberculosis comparado a um isolado que nunca entrou em contato com a droga1. Os casos de tuberculose resistentes s drogas tm aumentado em todo o mundo e constituem atualmente um grave problema, associados aos fatores relacionados com o paciente, com o sistema de sade e com os fatores contextuais. Em muitos pases, os fatores que afetam negativamente o Programa de Controle da Tuberculose (PCT) incluem a falta de um esquema teraputico padronizado, a deficincia na sua implementao e manuteno, escassez no fornecimento das drogas em reas com inadequados recursos ou instabilidade poltica. O uso de drogas antituberculose de baixa qualidade uma preocupao adicional. O desenvolvimento de resistncia pode envolver tambm uma seleo inapropriada do esquema teraputico, algumas vezes devido ao desconhecimento de um tratamento anterior, ignorncia sobre a importncia de esquemas padronizados e aos erros como prescrio de uma nica droga. Outro fator importante a no adeso do paciente ao tratamento prescrito. A freqncia da resistncia s drogas um indicador da qualidade do PCT, pois evidencia a ausncia de um sistema organizado para assegurar um rpido diagnstico, um tratamento eficiente e uma superviso ao tratamento do doente2,3.

9 .2 Vigilncia da resistncia s drogas


A vigilncia da resistncia s drogas feita atravs de pesquisas, chamadas inquritos epidemiolgicos de resistncia. Esses estudos tm o objetivo de medir a prevalncia da resistncia s drogas do tratamento da TB, utilizando protocolos epidemiolgicos e laboratoriais padronizados, fazendo uma correlao entre as taxas de resistncia e o controle do tratamento da TB. De acordo com o protocolo do II Inqurito Nacional de Resistncia a Drogas em Tuberculose no Brasil, resistncia primria definida como a presena de organismos resistentes a uma ou mais drogas em pacientes que nunca foram tratados para TB ou que foram tratados por menos de um ms. Resistncia adquirida definida como a presena de organismos resistentes a uma ou mais drogas em pacientes tratados para TB por um ms ou mais, sendo que esto inclusos os casos de recidiva, de retorno aps abandono e de falncia de tratamento. Os casos de resistncia a isoniazida e rifampicina, com ou sem resistncia a outra droga antituberculose so definidos, como tuberculose multirresistente (TBMR)4.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 323

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Desde 1994, a Organizao Mundial de Sade (OMS) e a International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD) vm realizando um Projeto Global de Vigilncia da Resistncia s Drogas do Tratamento da Tuberculose em todo o mundo. Os resultados do estudo mostraram que o M. tuberculosis resistente est presente em todas as reas geogrficas estudadas e tambm apontaram para o problema de TBMR em regies do Leste Europeu onde a prevalncia maior que 3% entre os casos novos de TB1. O Brasil participou do primeiro estudo mundial com uma amostra representativa, de 5.138 amostras, oriundas de pacientes atendidos ambulatorialmente, sendo 866 com tratamento anterior para TB e 4.272 sem tratamento prvio. Considerando a resistncia a qualquer droga, a taxa de resistncia primria foi de 8,5% (INH 4,4%, RMP 1,3%, EMB 0,1% e SM 0,2%) e a taxa de resistncia adquirida foi de 21% (INH 11,3%, RMP 6,6%, EMB 0,1% e SM 0,8%). Considerando a TBMR, a taxa de resistncia primria foi de 1,1% e de 7,9% para a resistncia adquirida5. O segundo estudo global de resistncia, realizado entre 1996 e 1999, completou uma cobertura mundial de 33% da populao e de 28% dos casos de TB. Os resultados mostraram que o problema da TBMR persiste em algumas reas geogrficas do mundo. A anlise dos resultados dos dois estudos indica que as taxas mdianas de TBMR primria e adquirida no modificaram significativamente, indicando que as taxas de multirresistncia preocupam porque so elevadas, alertando para a necessidade de incrementar aes de preveno e tratamento nessas reas6. O terceiro estudo foi realizado entre 1999 e 2002 e os dados confirmam a concentrao geogrfica de TBMR na Europa Oriental e sia Central, onde 79% de TBMR so resistentes a pelo menos trs das quatro principais drogas usadas no tratamento de primeira linha, e coincide com o rpido aumento das taxas de incidncia de HIV entre essa populao7. At o momento, os estudos globais de resistncia (de 1994 a 2002) abrangeram cerca de um tero dos casos notificados de TB no mundo. Entretanto, grandes lacunas ainda so encontradas em reas cruciais, que necessitam serem estudadas, como China, ndia e pases da antiga Unio Sovitica. Em vrios locais, novos estudos esto sendo realizados. O Brasil, que participou do primeiro inqurito, est realizando um novo estudo de resistncia, com amostragem de novos casos e de retratamento, sendo que pacientes com TB e HIV tambm sero includos7.

9 .3 Mecanismo de resistncia
Em Microbiologia Mdica, o mecanismo mais freqente de resistncia a presena de plasmdeos de genes que controlam a sntese de enzimas modificadoras dos antibiticos que os tornam inativos na sua ao antibacteriana. No caso do M. tuberculosis, no h indicao de uma transferncia horizontal de genes, isto , aquisio

324 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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de resistncia por plasmdeos ou transposons e o mecanismo de resistncia exclusivamente por mutaes. No caso de outras micobactrias (MNT), a maioria apresenta uma resistncia natural a todas as drogas, provavelmente devido estrutura da parede celular, que atuaria como uma barreira. Assim, no estudo das resistncias, temos que considerar a tuberculose separadamente das outras micobacterioses8,9. O mecanismo clssico pelo qual a mutao confere resistncia aquele que ocorre no gene que codifica para o alvo da droga, diminuindo a habilidade desta se ligar enzima. A mutao pode inibir uma enzima que transforma a droga que inativa em droga ativa contra a micobactria. Outro tipo de mutao no altera a protenaalvo, mas simplesmente aumenta sua expresso, havendo assim maior quantidade de protena do que a droga capaz de inibir. H um tipo de mutao que tambm pode produzir resistncia, diminuindo o acmulo da droga dentro da clula, quer por dificultar sua entrada ou por acelerar sua remoo da clula. A modificao qumica que inativa a droga tambm um mecanismo de resistncia8,9. Durante a infeco, nas cavidades pulmonares, a populao de 107 a 109 bacilos. Todos os bacilos que formam uma colnia, apesar de se originarem de uma nica clula, no apresentam um comportamento homogneo frente a todas as drogas antituberculose. Em toda a populao de bacilos sensveis existe uma pequena proporo de bacilos (cerca de um a cada 108 bacilos, por gerao), que sofreram mutaes espontneas e se comportam como resistentes a alguma das drogas9,10. As mutaes que levam resistncia no M. tuberculosis ocorrem espontaneamente e ao acaso, sendo, portanto, importante conhecer a proporo de mutantes que se espera obter numa populao de bacilos e a taxa de mutao para as drogas usadas no tratamento da tuberculose para uma melhor interpretao dos testes laboratoriais de sensibilidade. As mutaes genticas do M. tuberculosis que levam a resistncia RMP ocorrem numa taxa de 10-10 mutaes por diviso celular e levam a uma prevalncia estimada de 1 em cada 108 bacilos, em ambiente sem a droga. A taxa para INH de aproximadamente 10-7 a 10-9, resultando em resistncia em 1 a cada 106 bacilos. Portanto, a resistncia gentica (mutaes espontneas) ocorre mesmo na ausncia da exposio antimicrobiana, e diluda pela maioria das micobactrias sensveis. A presena de antimicrobianos fornece uma presso seletiva para os organismos resistentes tornarem-se predominantes, especialmente em pacientes com uma grande carga de bacilos, isto , com uma extensa leso cavitria. Portanto, a resistncia s drogas em tuberculose o resultado da inter-relao do fenmeno da mutao espontnea e da seleo de populao predominantemente resistente, como conseqncia de tratamento irregular e/ou inadequado8,9,10. O tratamento da TB no Brasil adota dois esquemas: (a) Esquema E-I, para casos novos, sem tratamento anterior para TB e utiliza isoniazida (INH=H), rifampicina

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 325

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

(RMP=R), pirazinamida (PZA=Z) e (b) Esquema E-III, para casos de falncia ao E-I e acrescenta etambutol (EMB=E), estreptomicina (SM=S) ou etionamida (ETH=Et)11. Para situaes de TBMR, so indicados esquemas especiais com drogas de segunda linha (alternativas), sob os cuidados de um sistema de Vigilncia Epidemiolgica da TBMR, pois a transmisso de isolados de M. tuberculosis resistentes resistentes pode ter srias repercusses na epidemiologia e controle da TB3,12.

9 .4 Critrios para realizao do Teste de Sensibilidade


O objetivo do TS determinar se os microrganismos presentes no paciente respondero ao tratamento com as drogas de primeira linha. Existe controvrsia sobre a utilizao do TS no manejo do tratamento individual de pacientes. Os pases que possuem recursos financeiros recomendam a realizao do TS para todos os pacientes no momento do diagnstico. J os pases com poucos recursos no seguem esta prtica e o TS fica ento recomendado para casos especiais. As indicaes prioritrias para a realizao do Teste de Sensibilidade do M. tuberculosis s drogas so: Retratamento aps falncia bacteriolgica ao esquema E-I. Recidiva da doena. Reincio aps abandono. Pacientes com suspeita de resistncia primria. Contatos de um caso de tuberculose resistente. Vigilncia epidemiolgica. Esses so os critrios divulgados no II Consenso Brasileiro de Tuberculose, em 200411, e do Guia de Vigilncia Epidemiolgica Tuberculose13. Cada estado da Federao pode acrescentar detalhes ao seus Programas Estaduais de Controle da Tuberculose, visando intervir em determinadas situaes por eles definidas como importantes. o caso do Estado de So Paulo que, em 2002, publicou documento recomendando a realizao de cultura e Teste de Sensibilidade para toda a populao considerada de maior risco (moradores de rua, detentos, profissionais da sade)14.

9 .5 Mtodos de Teste de Sensibilidade


A sensibilidade do M. tuberculosis s drogas pode ser avaliada pelo mtodo das concentraes absolutas, mtodo da razo de resistncia e o mtodo das propores. Esses so considerados os mtodos clssicos ou convencionais para Teste de Sensibilidade de M. tuberculosis. Os mtodos padronizados e validados para investigar a sensibilidade do M. tuberculosis s drogas antituberculose de primeira linha quantificam a proporo de mutantes resistentes a cada uma das drogas contidos isolado bacteriano que afeta o paciente. Esses mtodos so muito precisos, alcanando uma eficincia de 97% e 99%

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para determinar a atividade da INH e RMP, respectivamente e em torno de 92% para EMB e SM. No entanto, para assegurar essa preciso importante observar todas as etapas com muito cuidado e ateno, desde a aquisio das drogas, conservao, pesagem, preparao dos meios de cultura, padronizao do inculo, preparao das diluies, semeadura, observao do tempo de leitura do teste at o clculo da proporo de colnias resistentes15. A utilizao desses mtodos para avaliar a sensibilidade de outras micobactrias, que no sejam do Complexo M. tuberculosis (CMTB), no recomendada, pois os resultados obtidos no apresentam uma boa correlao com a resposta teraputica do paciente. Atualmente, para algumas espcies de micobactrias, a determinao da Concentrao Mnima Inibitria (CMI) da droga o mtodo recomendado16. Assim como para a cultura, existem os sistemas comerciais automatizados para realizar o Teste de Sensibilidade utilizando meios de cultura lquidos.

9 .6 Mtodo das propores em meio LJ


Esse mtodo foi descrito por Canetti, Rist e Grosset em 1963 (teste padro) e em 1969 (teste simplificado). A verso simplificada do teste, com apenas uma concentrao da droga, a mais utilizada. Consiste em detectar a proporo de bacilos resistentes contidos em uma amostra de M. tuberculosis, frente a uma concentrao da droga que capaz de inibir o desenvolvimento das clulas sensveis, mas no o das clulas resistentes concentrao crtica. Para cada droga foi definida uma proporo de mutantes resistentes em uma populao bacilar, igual ou acima da qual a amostra considerada resistente proporo crtica17,18,19. No Quadro 1, esto as concentraes crticas para cada droga (concentrao final no meio de cultura) e a proporo crtica, que d o critrio para definir se o isolado bacteriano resistente ou sensvel droga. Quadro 1 Critrios de resistncia do M. tuberculosis s drogas no meio LJ com drogas
Drogas Isoniazida (INH) Rifampicina (RFP) Etambutol (EMB) Estreptomicina (SM) Concentrao Crtica (g/ml) 0,2 40 2 4 Proporo Crtica (%) 1 1 1 1

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Desse modo, considera-se que uma droga de primeira linha no tem atividade no tratamento da TB quando ela testada frente a um isolado de M. tuberculosis que contm mais de 1% de bacilos resistentes a uma concentrao crtica da determinada droga, previamente estabelecida20. O mtodo das propores pode ser realizado diretamente a partir de escarro positivo baciloscopia (teste direto) ou a partir do isolado bacteriano (teste indireto). O teste indireto feito a partir do crescimento em meio de cultura e deve ser realizado em isolados bacterianos identificados como M. tuberculosis. mais demorado do que o direto, com a vantagem de apresentar menor risco de contaminao. O teste direto aquele feito a partir da amostra clnica que j passou pelo processo de descontaminao. Deve-se diluir o material homogeneizado, antes de inocular nos meios de cultura, de acordo com o resultado da baciloscopia. 9 .6 .1 Meios de cultura slidos LJ com drogas A verso do mtodo das propores em meios de cultura slidos base de ovos (Lwenstein-Jensen LJ) a mais utilizada na maioria dos pases da Amrica Latina, incluindo o Brasil. No mtodo das propores em meio LJ, as drogas so incorporadas antes da coagulao. As drogas utilizadas no TS so as do esquema de tratamento de primeira linha (INH, RMP, EMB e SM). Para facilitar a operacionalizao da realizao do TS no laboratrio so includas outras duas drogas para identificao de micobactrias, que no so utilizadas no tratamento (cido p-nitrobenzico PNB e Hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico TCH)20. O mtodo das propores tambm pode ser realizado em meios de cultura slidos base de agar (Middlebrook 7H10), recomendado pelo Center for Disease Control (CDC). Essa variante utiliza as drogas em concentraes diferentes daquelas utilizadas nos meios base de ovos21. Para o mtodo das propores, emprega-se o meio LJ sem droga e com droga. O meio sem droga permite conhecer o nmero total de bacilos semeados e o meio com droga, o nmero de mutantes resistentes droga correspondente. 9 .6 .1 .1 Preparao do meio LJ com drogas Os cuidados com a qualidade das drogas e seu manuseio so fundamentais para assegurar resultados confiveis dos Testes de Sensibilidade16.

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Pesagem das drogas Para a preparao da soluo-me, o clculo da quantidade a ser pesada de cada droga, tendo em conta a sua potncia, :
Peso (mg) = concentrao (g/ml) x volume (ml) Potncia (g/mg)

Potncia = pureza x frao ativa x (1- contedo de gua)

Exemplo 1: Sendo a potncia da Dihidroestreptomicina sulfato = 800 mg de SM ativa por grama, calcular:
10.000 x10 800 = 125 mg

Pesar 125 mg da droga e dissolver em 10 ml de gua destilada estril para obter uma soluo-me na concentrao de 10.000 g/ml de SM. Exemplo 2: Sendo a potncia da isoniazida = 1000 mg de INH ativa por grama, calcular:
10.000 x10 1000 = 100 mg

Pesar 100 mg da droga e dissolver em 10 ml de gua destilada estril para obter uma soluo-me na concentrao de 10.000 g/ml de INH. Soluo-Me (estoque) A soluo estoque da droga deve conter uma concentrao tal que, por um lado, assegure uma completa dissoluo e por outro lado seja suficientemente alta para no se inativar. Considerando a potncia de cada lote da droga e fazendo o ajuste quando necessrio, preciso preparar uma soluo-me de 10.000 g/ml em 10 ml de gua destilada estril, etilenoglicol, propilenoglicol ou outro diluente. Essas solues podem ser guardadas, aliquotadas, em temperatura de -20C ou menos. Essa prtica pode ser adotada se houver garantia da estabilidade da rede de frio do laboratrio. Soluo de uso No dia de preparao do lote de meio com droga, a soluo de uso de cada droga preparada a partir da soluo-me, tendo o cuidado de desprezar o restante da soluo-me descongelada que no for utilizada no dia. importante garantir a preciso das diluies da soluo-me utilizando pipetas graduadas e de volume compatvel com o desejado. Ter o cuidado de sempre trocar de

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 329

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

pipeta depois de transferir o volume necessrio para o tubo seguinte, antes de homogeneizar. Para incorporao no meio LJ, cada droga requer uma maneira diferente de preparo, com uma, duas ou sem diluies. O Quadro 2 resume as concentraes de cada droga, a quantidade a ser incorporada ao meio de cultura e a concentrao final. Quadro 2
Soluo me (10 .000 g/ml) Isoniazida (INH) Rifampicina (RMP) Etambutol (EMB) Estreptomicina (SM)** TCH PNB

Preparao da droga para incorporar ao meio LJ


Diluies a realizar Duas 1:10 Nenhuma Uma 1:10 Uma 1:10 Uma 1:10 Nenhuma Concentrao da droga na ltima diluio (g/ml) 100 10.000 1.000 1.000 1.000 10.000 Quantidade adicionada em 200 ml de meio LJ (ml) 0,4 0,8 0,4 0,8 0,4 5 Concentrao final de droga no meio (mg/ml) 0,2 40 2 4 2 500

Diluente

gua destilada estril Etilenoglicol ou N,N-dimetilformamida gua destilada estril gua destilada estril gua destilada estril *
* **

Para a preparao do PNB seguir as recomendaes do anexo deste captulo. Usar a Dihidroestrptomicina por ser uma droga mais estvel e a tcnica padronizada para o uso desta formulao

Nos anexos deste captulo esto descritas a preparao das solues-me e solues de uso de cada droga, a preparao dos meios com drogas e os formulrios para o CQI destas preparaes. O tempo de validade do meio LJ com drogas , no mximo, de 2 meses sob refrigerao5,20. 9 .6 .1 .2 Mtodo das propores em LJ - teste indireto

Descrio O mtodo das propores indireto o mais utilizado nos laboratrios de sade pblica e consiste em se realizar o Teste de Sensibilidade a partir de um isolado puro de M. tuberculosis. Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de Equipamentos de Proteo Individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3.

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Realizar o teste preferncialmente a partir da cultura primria que deve estar na sua fase de crescimento logartmica (mdia de 21 dias). Por outro lado, deve-se evitar realizar Teste de Sensibilidade em culturas com mais de 60 dias de semeados. Nas culturas em que o nmero de colnias menor que 20, no recomendamos a realizao do Teste de Sensibilidade, pois essa amostra pode no ser representativa da populao bacilar na leso. Observaes O preparo do meio LJ e do tubo n 1 da Escala McFarland esto descritos nos anexos do Captulo 7. O preparo da Soluo de lcool a 70% e Soluo de Fenol a 5%, esto descritos no Captulo 3. Materiais Equipamentos CSB Agitador mecnico. Estufa bacteriolgica a 36 1C. Pipetador automtico ou manual. Reagentes gua destilada estril. Soluo de lcool a 70% Soluo de Fenol a 5%. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Gaze estril em pedaos. Estante para os tubos de ensaio estril 20 x 150 mm. Ala bacteriolgica descartvel e estril. Tubos de ensaio 20 x 150 mm, de paredes reforadas, com tampa de rosca, contendo 10 prolas de vidro, estreis. Tubos de ensaio 20 x 150 mm para as diluies. Pipetas estreis de 1 e 10 ml. Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. De preferncia, uma bandeja para cada conjunto de tubos de uma mesma amostra.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Para cada amostra: seis tubos de meios LJ sem droga e dois tubos de meios LJ com as drogas (INH, RMP, EMB, SM) e um tubo para o TCH e PNB. Cepas de referncia para controle de qualidade do TS (cepa sensvel e cepa resistente): sugerimos que estas cepas sejam preparadas junto com as amostras a serem testadas. O CQI do TS est descrito no item 9.9 deste captulo. Tubo n 1 da Escala McFarland.

Procedimentos de organizao Realizar os procedimentos de 1 a 3 fora da CSB 1. Identificar o nmero da cultura no tubo de ensaio com prolas, para a suspenso bacteriana. 2. Identificar a diluio e o nmero da cultura nos tubos de ensaio para as diluies, de acordo com o seguinte: para cada amostra, incluindo as cepas controle: tubos 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.. 3. Identificar o nmero da cultura nos tubos de meios LJ sem e com droga para a semeadura do TS, de acordo com o seguinte (para cada amostra): 1 srie, rotulados 10-3: dois tubos de meio LJ sem droga (controle) os demais tubos de meio LJ contendo cada um a droga correspondente. 2 srie, rotulados 10-5: dois tubos de meio LJ sem droga (controle) os demais tubos de meio LJ contendo cada um a droga correspondente. 3 srie, rotulados 10-6: dois tubos de meio LJ sem droga (controle). Observao: a diluio 10-6 nem sempre utilizada, facilita a leitura do TS quando o inculo foi muito turvo (espesso) e a contagem das colnias ficou prejudicada nas outras diluies. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11. Realizar os procedimentos de 4 a 5 dentro da CSB 4. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3. 5. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. Para acompanhar a realizao do teste indireto do mtodo das propores em LJ, observar o item 9.12.2.1 - Figura 1, dos anexos deste Captulo.

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Procedimentos de realizao: Etapa 1 suspenso bacteriana (inculo) Realizar os procedimentos de 1 a 5 dentro da CSB 1. Transferir, com ala bacteriolgica descartvel estril, o maior nmero possvel de colnias de uma cultura em meio slido para um tubo de ensaio com prolas e 0,5 ml de gua destilada estril. 2. Homogeneizar em agitador mecnico por 20 a 30 segundos. 3. Manter em repouso por 10 minutos. 4. Acrescentar aproximadamente 2 ml de gua destilada estril. 5. Deixar em repouso por 10 minutos para sedimentar as partculas maiores. Procedimentos de realizao: Etapa 2 diluies seriadas Realizar os procedimentos de 6 a 11 dentro da CSB 6. Ajustar a turvao de cada suspenso com a turvao do tubo n 1 da Escala McFarland utilizando gua destilada estril, gota a gota. 7. A partir dessa suspenso padronizada, efetuar seis novas diluies em escala decimal. 8. Colocar 9 ml de gua destilada estril em cada um dos tubos. 9. Transferir 1 ml da suspenso padro para o tubo 10-1, agitar no agitador mecnico. 10. Trocar a pipeta e seguir as diluies, transferindo 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-6. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis. 11. As diluies 10-3 (1/1.000), 10-5 (1/100.000) e 10-6 (1/1.000.000) sero as diluies semeadas nos meios LJ com e sem droga. Procedimentos de realizao: Etapa 3 semeadura nos meios de cultura Realizar os procedimentos de 12 a 13 dentro da CSB 12. Inocular 0,1 ml das diluies 10-3, 10-5 em cada tubo de meio de cultura com droga e sem droga, j identificados e 0,1 ml da diluio 10-6 em dois tubos de meio LJ sem droga. Trocar a pipeta para semear cada diluio. 13. Fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Realizar os procedimentos de 14 a 15 fora da CSB 14. Retirar os tubos de meios de cultura semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. Distribuir o inculo em toda a superfcie do meio para facilitar o crescimento de colnias separadas para a contagem. 15. Acondicionar os tubos de meios inoculados em bandeja de polipropileno, inclinados de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para que os tubos no rolem, pois isto propicia crescimento nas bordas do meio de cultura impossibilitando a contagem das colnias. 16. Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 48 horas e aps, fechar as tampas completamente, somente se o inculo tiver sido absorvido totalmente; se ainda permanecer mido manter a tampa frouxa por mais 24 ou 48 horas. 17. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3. 9 .6 .1 .3 Mtodo das propores em LJ - teste direto

Descrio O mtodo das propores direto aquele realizado a partir do escarro positivo pela baciloscopia. Com o objetivo de abreviar o tempo do diagnstico, principalmente nos casos de falncia de tratamento, cujos escarros tm grande nmero de bacilos. Quando o resultado no for conclusivo, repete-se o teste3. Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Observaes Os procedimentos de fluidificao-descontaminao do escarro seguem os descritos no Captulo 7. Materiais Equipamentos CSB Agitador mecnico. Estufa bacteriolgica a 36 1C. Pipetador automtico ou manual. Reagentes gua destilada estril. Soluo de lcool a 70% Soluo de Fenol a 5%. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada.

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Gaze estril em pedaos. Estante para os tubos de ensaio estril 20 x 150 mm. Ala bacteriolgica descartvel e estril. Tubos de ensaio 20 x 150 mm para as diluies. Pipetas estreis de 1 e 10 ml. Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser autoclavado e lavado. Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos tubos semeados. De preferncia, uma bandeja para cada conjunto de tubos de uma mesma amostra. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Para cada amostra: Controles: seis tubos de meios LJ sem droga. Testes: uma bateria de dois tubos de meios LJ para cada uma das drogas (INH, RMP, EMB, SM) e outra bateria de um tubo de meio LJ para as drogas TCH e PNB.

Preparao do inculo para semear no teste direto Antes de realizar o teste direto preciso fazer a baciloscopia do escarro de acordo com o Captulo 6. O quadro 3 mostra as diluies a serem semeadas nos meios LJ com e sem droga, conforme o nmero de cruzes da baciloscopia. Quadro 3 Diluies semeadas de acordo com a baciloscopia
Diluies semeadas em tubos LJ sem droga No diludo, 10-2 e 10-3 10-1, 10-3 e 10-4 10-2, 10-4 e 10-5 Diluies semeadas em tubos LJ com droga No diludo e 10-2 10-1 e 10-3 10-2 e 10-4

Resultado da Baciloscopia (+) (++) (+++)

Procedimentos de organizao Realizar a baciloscopia de cada escarro conforme descrito no captulo 6 para conhecer o resultado. Realizar tambm a etapa da fluidificao-descontaminao conforme descrito no Captulo 7 e utilizar o sedimento. Realizar os procedimentos 1 e 2 fora da CSB 1. Identificar o nmero da cultura nos tubos de ensaio para as diluies, de acordo com o seguinte: Escarro (+): 10-1; 10-2; 10-3. Escarro (++): 10-1; 10-2; 10-3; 10-4.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

2.

Escarro (+++): 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5. Identificar o nmero da cultura nos tubos de meios LJ sem e com droga para a semeadura do TS, de acordo com o seguinte (para cada amostra): Escarro (+): seis tubos controles (meios LJ sem droga): dois tubos para semear o sedimento no diludo e dois tubos para cada uma das diluies 10-2 e 10-3. Testes (meio LJ com drogas): uma bateria contendo um tubo de meio LJ para cada uma das drogas (INH, RMP, EMB, SM, TCH e PNB) para semear o sedimento no diludo e outra bateria (INH, RMP, EMB e SM) para semear a diluio 10-2. Escarro (++): seis tubos controles (meio LJ sem droga): dois tubos para semear cada uma das diluies 10-1, 10-3 e 10-4. Testes (meio LJ com drogas): uma bateria contendo um tubo de meios LJ para cada uma das drogas (INH, RMP, EMB, SM, TCH e PNB) para semear a diluio 10-1 e outra bateria (INH, RMP, EMB e SM) para semear a diluio 10-3. Escarro (+++): seis tubos controles (meio LJ sem droga): dois tubos para semear cada uma das diluies 10-2, 10-4 e 10-5. Testes (meio LJ com drogas): uma bateria contendo um tubo de meio LJ para cada uma das drogas (INH, RMP, EMB, SM, TCH e PNB) para semear a diluio 10-2 e outra bateria (INH, RMP, EMB e SM) para semear a diluio 10-4.

Realizar os procedimentos 3 e 4 dentro da CSB 3. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3. 4. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB sua frente. Para acompanhar a realizao do teste direto do mtodo das propores em LJ, observar o item 9.12.2.2 - Figura 2, dos anexos deste Captulo Procedimentos de realizao Para escarro (+) Realizar os procedimentos de 5 a 10 dentro da CSB 5. Colocar 9 ml de gua destilada estril nos tubos de ensaio j identificados para fazer as diluies de acordo com o item 1 (10-1 a 10-3). 6. Transferir 1 ml do sedimento tratado no diludo para o tubo 10-1 e misturar bem. Trocar a pipeta e transferir 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-3. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis. 7. Inocular 0,1 ml do sedimento tratado no diludo nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com drogas (INH, RMP, EMB, SM, TCH, PNB), correspondentes.

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Inocular 0,1 ml da diluio 10-2 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com drogas (INH, RMP, EMB, SM), correspondentes. 9. Inocular 0,1 ml da diluio 10-3 nos tubos LJ controle correspondentes. 10. Fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Escarro (++) Realizar os procedimentos de 5 a 10 dentro da CSB 5. Colocar 9 ml de gua destilada estril nos tubos de ensaio j identificados para fazer as diluies, de acordo com o item 1 (10-1 a 10-4). 6. Transferir 1 ml do sedimento tratado para o tubo 10-1 e misturar bem. Trocar a pipeta e transferir 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-4. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis. 7. Inocular 0,1 ml do da diluio 10-1 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com droga (INH, RMP, EMB, SM, TCH, PNB) correspondentes. 8. Inocular 0,1 ml da diluio 10-3 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com droga (INH, RMP, EMB, SM), correspondentes. 9. Inocular 0,1 ml da diluio 10-4 nos tubos LJ controle correspondentes. 10. Fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante. Procedimentos de realizao Escarro (+++) Realizar os procedimentos de 5 a 10 dentro da CSB 5. Colocar 9 ml de gua destilada estril nos tubos de ensaio j identificados para fazer as diluies, de acordo com o item 1 (10-1 a 10-5). 6. Transferir 1 ml do sedimento tratado para o tubo 10-1 e misturar bem. Trocar a pipeta e transferir 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-5. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis. 7. Inocular 0,1 ml da diluio 10-2 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com droga (INH, RMP, EMB, SM, TCH, PNB), correspondentes. 8. Inocular 0,1 ml da diluio 10-4 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com droga (INH, RMP, EMB, SM), correspondentes. 9. Inocular 0,1 ml da diluio 10-5 nos tubos LJ controle correspondentes. 10. Fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar esses tubos na estante.

8.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Realizar os procedimentos de 11 a 14 fora da CSB Os procedimentos de 11 a 14 so vlidos para as trs situaes de escarro: 11. Retirar os tubos de meios de cultura semeados da estante e movimentar cada um deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. Distribuir o inculo em toda a superfcie do meio para facilitar o crescimento de colnias separadas para a contagem. 12. Acondicionar os tubos de meios inoculados em bandeja de polipropileno, inclinados de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para que os tubos no rolem, pois isso propicia crescimento nas bordas do meio de cultura impossibilitando a contagem das colnias. 13. Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 48 horas e, aps, fechar as tampas completamente, somente se o inculo tiver sido absorvido totalmente; se ainda permanecer mido manter a tampa frouxa por mais 24 ou 48 horas. 14. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material contaminado, conforme descrito no Captulo 3. 9 .6 .1 .4 Incubao do TS em meio LJ Aps observar os tubos semeados e verificar secagem do inculo e ausncia de contaminao, em torno de 48 horas, fechar bem as tampas dos tubos e deixar incubando na estufa bacteriolgica a 36 1C. 9 .6 .1 .5 Leitura e interpretao do TS em meio LJ Para poder interpretar o resultado do TS necessrio que aconteam trs condies simultaneamente: Crescimento suficiente (mais de 100 colnias) no tubo controle (LJ sem droga) semeado com a diluio mais concentrada (10-3), para que seja possvel detectar mutantes resistentes que estejam em menor porcentagem (cerca de 1%) entre os bacilos inoculados. Colnias separadas e contveis no tubo controle (LJ sem droga) semeado com a diluio menos concentrada (10-5). Essa condio indispensvel quando aparecem colnias resistentes cuja proporo deve ser determinada (clculo da porcentagem). Boa correlao entre o nmero de colnias desenvolvidas em cada um dos meios semeados com as suspenses, de acordo com o fator de diluio aplicado, para que sejam vlidas as quantificaes que se aplicam com base na srie de diluies. Com 28 dias de incubao fazer a primeira leitura e observar se houve desenvolvimento de colnias suficiente para interpretar os resultados, sendo que a maioria

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isolados bacterianos resistentes INH e RMP (mais de 95%) pode ser detectada nesse perodo. Se houve casos de resistncia com contagem de colnias suficiente para interpretar o resultado, este pode ser emitido nesse perodo. Se no houve resistncia (todas as drogas esto sensveis), aguarda-se a segunda leitura ao final de 42 dias. Essa precauo para assegurar o aparecimento tardio de colnias mutantes resistentes15. Procedimentos para leitura e interpretao do TS Realizar a leitura dos tubos semeados em bancada bem iluminada, prxima janela ou com foco de luz prximo (luminria). Se possvel, utilizar lupa para melhorar a visualizao das colnias pequenas. Para acompanhar a leitura, observar o fluxograma de leitura e interpretao dos resultados do TS em LJ descritos no item 9.12.2.3 - Figura 3 dos anexos deste captulo. Para que os clculos sejam vlidos, as diluies devem ser realizadas com suspenses homogneas e com muita preciso, trocando as pipetas toda vez que passar de uma suspenso concentrada para outra mais diluda e que o volume semeado em cada tubo seja exatamente o mesmo. 1. Quantificar o inculo contando e fazendo a mdia das colnias desenvolvidas nos tubos de meio LJ controle (sem droga). Se o nmero de colnias na diluio 10-3 incontvel, contar o nmero de colnias da diluio 10-5 ou 10-6, de maneira que seja possvel contar colnias separadas. Fazer a mdia entre os tubos da mesma diluio. A partir dessa mdia podemos inferir o nmero de UFC (unidades formadoras de colnias) desenvolvidas nos controles semeados com diluies mais concentradas, multiplicando pelo fator de diluio correspondente. 2. Quantificar o nmero de UFC nos tubos contendo cada uma das drogas. Da mesma maneira, procurar o tubo onde as colnias estejam separadas e contveis. 3. Calcular a porcentagem de UFC desenvolvidas na presena de cada droga com relao mdia de UFC dos tubos controles. Se essa proporo maior do que 1%, o isolado bacteriano considerado resistente droga em questo. Se a proporo menor do que 1% o isolado bacteriano considerado sensvel.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Exemplo para a leitura do TS


Nmero de UFC observadas Diluio Tubos controle Meio sem droga incontveis 6 incontveis 3 Tubos com droga INH incontveis 2 RMP incontveis 3 SM 1 0 EMB 0 0

10-3 10
-5

1. 2.

3.

4.

5.

Tubos controle: 10-3= incontveis colnias e 10-5= mdia (6+3)/2 = 4,5 UFC. Podemos inferir que na diluio 10-3 tem 450 UFC. Tubo INH: 10-3= incontveis colnias e 10-5= 2 colnias. Fazendo a proporo (regra de trs): se 4,5 UFC 100% ento 2 UFC 44%. Sendo a proporo crtica para a INH=1%, o isolado bacteriano com 44% resistente. Tubo RMP: 10-3= incontveis colnias e 10-5= 3 colnias. Fazendo a proporo (regra de trs): se 4,5 UFC 100% ento 3 UFC 67%. Sendo a proporo crtica para a RMP=1%, o isolado bacteriano com 67% resistente. Tubo SM: 10-3=1 colnia e 10-5 = nenhuma. A leitura feita na diluio 10-3. Fazendo a proporo (regra de trs): se 450 UFC 100% ento 1 UFC 0,2%. Sendo a proporo crtica para a SM=1%, o isolado bacteriano sensvel. Tubo EMB: 10-3 e 10-5= nenhuma colnia, o isolado bacteriano sensvel.

9 .7 Sistemas comerciais automatizados de TS


9 .7 .1 Descrio Os mtodos baseados em meios de cultura lquidos constituem atualmente a opo mais utilizada, por apresentarem a vantagem do menor tempo de incubao, a padronizao do inculo e a leitura automatizada. O sistema BACTEC 460TB (BD), um sistema semi-automatizado que utiliza meio lquido Middlebrook 7H9 modificado, foi o primeiro a ser utilizado nos pases desenvolvidos, por apresentar resultados de resistncia e/ou sensibilidade s drogas em 5 a 12 dias de incubao. Por ser um mtodo radiomtrico utilizando 14C na deteco do crescimento bacteriano, foi substitudo por sistemas automatizados constitudos por um frasco contendo meio de cultura lquido com um sensor interno de deteco de crescimento bacteriano que pode ser colorimtrico, fluorimtrico ou de presso, de acordo com o fabricante. Estes sistemas comerciais seguem o mesmo princpio do mtodo das propores, utilizando concentraes de drogas com atividade equivalente e propores crticas de mutantes resistentes. A seguir sero descritas as etapas para a realizao do Teste de Sensibilidade no sistema BACTECTM MGITTM 960 (BD)22,23.

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9 .7 .2

Procedimentos do TS em sistemas automatizados

Precaues Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados conforme descrito no Captulo 3. Observaes: O preparo de criotubos com miangas e meio lquido Sauton com 10% de glicerol para manuteno dos isolados bacterianos est descrito no Captulo 10. Materiais Equipamentos CSB Sistema de incubao e deteco automtica. Estufa bacteriolgica a 36 1C. Freezer 20C. Geladeira. Micropipeta automtica capacidade 10 a 100 l. Micropipeta automtica capacidade 100 a 1000 l. Reagentes gua destilada estril. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. Escala McFarland n 1. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Bandejas quadriculadas de alumnio. Estantes de metal. Estantes de plstico compatveis com o equipamento (AST Set Carrier). Estante de metal para transporte das estantes AST. Canetas para marcar vidro ponta fina e comum. Ala bacteriolgica descartvel estril. Criotubos com 6 miangas estreis. Frasco de vidro com tampa de rosca, capacidade cerca de 3 ml, contendo 6 prolas de 3 mm estreis. Tubo 12 x 120 mm com tampa de silicone estril. Frasco de vidro com tampa de rosca, capacidade para cerca de 10 ml.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Frasco de vidro com tampa de rosca, capacidade para cerca de 30 ml. Pipeta Pasteur descartvel estril. Dispensador com seringa plstica de volume especfico. Ponteiras com capacidade 10 a 100 l. Ponteiras com capacidade 100 a 1000 l. Gaze estril em pedaos. Algodo. BD BBL MGIT Tubo de meio de cultura com indicador do crescimento de micobactrias (Tubo MGIT). Kit SIRE (S estreptomicina (SM), I isoniazida (INH), R Rifampicina (RMP) e E etambutol (EMB) BACTEC: MGIT Estreptomicina (MGIT-S): 83 g/ml. MGIT Isoniazida (MGIT-I): 8.3 g/ml. MGIT Rifampicina (MGIT-R): 83 g/ml. MGIT Etambutol (MGIT-E): 415 g/ml. BACTEC MGIT SIRE Supplement (OADC960). Enriquecimento OADC (cido oleico, albumina, dextrose, catalase). Tubo com meio de cultura Tryptic Soy Agar (TSA) ou similar. Soluo estoque de cido -nitrobenzico (PNB). Meio Sauton com 10% de glicerol. Lmina para microscopia. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Preparao do inculo

9 .7 .2 .1

(a) A partir de crescimento em meio lquido (MGIT) Para acompanhar a preparao do inculo a partir de crescimento em meio lquido, observar o item 9.12.2.4 - Figura 4 dos anexos deste Captulo. 1. Utilizar o tubo MGIT 7 ml positivo (tubo controle sem drogas) aps 1 dia da positividade at no mximo 5 dias. Ateno: O dia que a positividade detectada pelo equipamento considerado dia 0. 2. Se o tubo passar de 5 dias, dever ser repicado em outro tubo MGIT 7 ml e incubado no instrumento at a positividade. 3. Se o tubo estiver dentro de 2 dias de positividade (dia 1 ou dia 2): diluir com micropipeta automtica 0,1 ml do crescimento bacteriano em 10 ml de gua destilada estril (suspenso 1:100) e inocular no tubo controle. Nos tubos com droga inocular diretamente do tubo com crescimento (dia 1 ou dia 2).

342 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

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4.

Se o tubo estiver com positividade (dia 3, dia 4 ou dia 5), diluir com micropipeta automtica 1 ml do meio com crescimento do tubo positivo em 4 ml de gua destilada estril, fazendo uma diluio 1:5 e inocular nos tubos com droga. Para os tubos controle: diluir com micropipeta automtica 0,1 ml do crescimento bacteriano em 10 ml de gua destilada estril (suspenso 1:100).

(b) A partir de crescimento em meio slido Para acompanhar a preparao do inculo a partir de crescimento em meio slido, observar o item 9.12.2.5 - Figura 5 dos anexos deste Captulo. Procedimentos de organizao Frasco 1 para fazer a suspenso Utilizar um frasco com tampa de rosca, capacidade para cerca de 3 ml. Colocar aproximadamente 6 prolas de vidro. Esterilizar em estufa a 180 C por 2 horas. Distribuir, assepticamente, 2 ml de gua destilada estril com pipeta graduada, em cada um dos frasquinhos. Frasco 2 para fazer a diluio 1/5 Utilizar um frasco com tampa de rosca, capacidade para cerca de 10 ml. Esterilizar os frascos a 180 C por 2 horas. Assepticamente, distribuir 4 ml de gua destilada estril. Frasco 3 para fazer a diluio 1/100 Utilizar um frasco com tampa de rosca, capacidade para cerca de 30 ml. Esterilizar os frascos a 180 C por 2 horas. Assepticamente, distribuir 10 ml de gua destilada estril. Bandeja preparar uma bandeja de alumnio com divises colocando um frasco 1, um frasco 2 e um criotubo com miangas. Numerar todos os tubos com o nmero de cada isolado a ser testado. Para os criotubos marcar o nmero do isolado bacteriano no corpo e tampa dos tubos, com etiqueta prpria para congelamento; numerar o frasco 3 com os nmeros de cada isolado bacteriano a ser testado colocar os frascos 3 em bandeja separada. Preparar uma listagem com o nmero dos isolados a serem testados .

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Procedimentos de realizao 1. Colocar a estante com os isolados bacterianos, a bandeja de alumnio com divises com um frasco 1, um frasco 2 e um criotubo com mianga, e a bandeja com os frascos 3 dentro da CSB. 2. Com ala bacteriolgica descartvel estril retirar uma boa poro da massa bacteriana que est sobre o meio (procurar no retirar o meio junto). Procurar tocar em todas as colnias para ter uma boa representatividade da amostra. 3. Abrir o frasco 1, colocar a ala sobre as prolas, fazer uma suspenso homognea de bactrias. 4. Pegar mais massa bacilar com ala e fazer o mesmo no criotubo com as miangas. 5. Descartar a ala no saco autoclavvel. 6. Repetir esse procedimento at que todas as suspenses dos isolados bacterianos e da cepa controle (M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294) estejam prontas. 7. Deixar a suspenso em repouso por 15 minutos, para decantar as partculas maiores e para evitar disperso de aerossis. 8. Com uma pipeta Pasteur, retirar cerca de 1 ml do sobrenadante e gotejar pela parede do tubo, ajustando a turvao da suspenso com o Tubo n 1 McFarland. 9. Com a mesma pipeta, retirar todo o meio lquido Sauton do criotubo. 10. Realizar os procedimentos 8 e 9 para todas os isolados bacterianos, utilizando uma pipeta para cada isolado. 11. Com micropipeta automtica, diluir 1 ml da suspenso acima em 4 ml de gua destilada estril (frasco 2) suspenso 1:5. 12. Com micropipeta automtica, diluir 0,1 ml da suspenso preparada no item 8, em 10 ml de gua destilada estril (frasco 3) suspenso 1:100. Suspenso 1:5 = Inculo para uso nos meios com drogas e no TSA (Tryptic Soy Agar) Suspenso 1:100 = Inculo para uso no meio controle 13. Guardar os isolados bacterianos originais na geladeira at liberao dos resultados dos testes. 9 .7 .2 .2 Preparao dos meios MGIT Para a preparao dos meios de cultura MGIT para TS utilizados no sistema automatizado, seguir as instrues do fabricante, consistindo em preparar um tubo de MGIT com PNB e 4 tubos com as drogas SIRE (S=SM, I=INH, R=RMP e E=EMB).

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Preparao do Meio MGIT com PNB 1. Assepticamente, adicionar 0,8 ml de OADC em cada tubo MGIT (1 tubo para cada teste). Este OADC no deve ser retirado do kit SIRE, pois o kit utilizado para o preparo dos meios com droga SM, INH, RMP e EMB. 2. Assepticamente, utilizando uma micropipeta automtica, pipetar 168 l da soluo estoque PNB em cada tubo MGIT. Marcar os tubos com o smbolo na cor padronizada pelo laboratrio. Exemplo: smbolo dois traos em X na cor preta. Preparao do Meio MGIT com drogas SIRE 1. Preparo das drogas SIRE 2. Para o preparo da soluo estoque das drogas SIRE, adicionar 4 ml de gua destilada estril em cada frasco com as drogas SIRE conforme orientaes do fornecedor. Preparo do meio com as drogas SIRE 1. Assepticamente, adicionar 0,8 ml de suplemento SIRE (OADC) em cada tubo MGIT (5 tubos para cada teste). 2. Assepticamente, utilizando uma micropipeta automtica, pipetar 100 l de cada droga (SIRE) em cada tubo marcado, (um tubo para cada droga). 3. Marcar os tubos com o smbolo na cor padronizada pelo laboratrio. Exemplo: smbolo= um trao inclinado. Cores: vermelha = estreptomicina, preta = isoniazida, azul = rifampicina e verde = etambutol. 4. Um tubo sem droga ser usado como controle de crescimento bacteriano (CC). 9 .7 .2 .3 Inoculao da suspenso bacteriana nos tubos Para acompanhar a inoculao da suspenso bacteriana, observar o item 9.12.2.6 - Figura 6 dos anexos deste Captulo. Procedimentos de organizao 1. Colocar o tubo controle de crescimento e um tubo de cada droga numa estante seguindo a ordem SIRE, o tubo de PNB e o de TSA. 2. Identificar com o nmero do isolado bacteriano, o tubo controle de crescimento, o tubo PNB e tubo TSA. Procedimentos de realizao 1. Inocular o tubo controle de crescimento (CC): com micropipeta automtica, inocular 0,5 ml da suspenso 1:100 no tubo MGIT CC.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

2.

3. 4. 5.

Inocular os tubos contendo drogas: com micropipeta automtica inocular 0,5 ml da suspenso 1: 5 em cada um dos tubos contendo drogas estreptomicina (S), isoniazida (I), rifampicina (R), etambutol (E) e cido p-nitrobenzico (PNB). Rosquear e homogeneizar bem cada um dos tubos, para no prejudicar a leitura. Inocular um tubo com TSA ou similar: com micropipeta automtica inocular 0,5 ml da suspenso. Aps a inoculao de todos os testes, realizar a limpeza, descontaminao da CSB e da bancada e o descarte do material contaminado, conforme descrito no Captulo 3.

9 .7 .2 .4 Incubao no sistema automatizado 1. Dispor 5 tubos (CC e SIRE) na estante AST Set Carrier, na seguinte seqncia: (CC, S, I, R, E). 2. Incubar sistema de incubao BACTEC MGIT 960. 3. Antes de incubar cada estante, verificar o nmero do isolado bacteriano e localiz-lo na listagem de cepas. Na coluna posio anotar letra e nmeros da gaveta na qual a estante ser incubada. 4. Aps a incubao de todas as estantes repetir, o procedimento para os tubos MGIT PNB. 5. Antes de incubar cada tubo, verificar o nmero do isolado bacteriano e anotar a letra e o nmero da gaveta que o tubo ser incubado. 6. Aps o trmino aguardar cerca de dois minutos para verificar se ocorreu algum erro no momento da incubao. 7. No caso de erro, iro acender os botes (+) e (-) da gaveta onde estiver o problema. Consultar o manual de instrues do instrumento BACTEC MGIT 960. 8. Incubar o tubo com TSA ou similar a 36 1C. Verificar aps 48 horas. Se houver contaminao com outros microrganismos, anotar o resultado de contaminao. 9 .7 .2 .5 Leitura e registro dos resultados no sistema automatizado 1. Verificar diariamente a indicao de resultados finalizados no equipamento BACTEC MGIT 960 que fornecer os resultados de resistncia ou sensibilidade das drogas a cada isolado bacteriano testado. 2. Imprimir os resultados dos testes finalizados. 3. Registrar o resultado para o Formulrio de Leitura do TS Automatizado MGIT (item 9.12.1.10 nos anexos deste Captulo). e para o registro de cultura e Teste de Sensibilidade e para o livro de registro, e liberar o resultado utilizando os laudos padronizados de cada laboratrio.

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4. 5.

Antes da liberao dos resultados os laudos devem ser conferidos por duas pessoas quanto ao nmero da cultura, o nome e o resultado. Anotar os testes que apresentarem erro e tomar as providncias devidas, descritas em intercorrncias.

Intercorrncias: 1. Erro 10 erro imediatamente aps a colocao na gaveta; posicionamento da estante de forma incorreta, correo imediata. 2. Erro 400 crescimento rpido; pode ser excesso de inculo, MNT de crescimento rpido ou contaminao: Fazer uma lmina dos tubos PNB e TSA. Caso seja contaminao descartar o teste e soltar o resultado como contaminado. PNB positivo e TSA negativo e lmina do tubo controle BAAR = provvel MNT encaminhar para identificao. PNB negativo e TSA negativo e lmina do tubo controle BAAR = CMTB repetir o teste. 3. Erro 200 ocorre aps 12 dias, quando no h crescimento no tubo controle (cepa NC). Pegar o isolado bacteriano original e repicar em meios LJ, LJ + PS, OK, 7H9; incubar a 36 1C para tentar recuperar. Aps o crescimento repetir o teste. 4. Discordncia entre os resultados do Teste de Sensibilidade de isolado bacteriano isolado e/ou recebido anteriormente e do atual. Repetir novamente o TS dos dois isolados e no caso de manter a discordncia soltar o resultado com uma carta explicativa. Resultados do PNB 1. Acompanhar o tubo PNB de acordo com o protocolo de leitura dos meios com droga, ou seja, resultado positivo ou erro. O teste com PNB finaliza e ser interpretado como negativo, 3 dias aps a finalizao de todos os Testes de Sensibilidade. 2. Anotar os resultados do PNB no livro de registro. Os testes PNB (+) sero concludos aps preparao de lmina e confirmao da presena de BAAR ou outras bactrias. PNB negativo = isolado bacteriano identificado como provvel M. tuberculosis. PNB positivo: lmina com presena de BAAR = provvel MNT. Utilizar o isolado bacteriano original e encaminhar para realizar a identificao da micobactria.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

PNB positivo: lmina no BAAR = PNB contaminado. Verificar o resultado do TSA: a. Se o resultado do TSA for contaminado anotar no livro de registro resultado CO (contaminado) e liberar esse resultado finalizando o teste. b. Se o TSA estiver negativo, sugere que a contaminao foi localizada no tubo do PNB; fazer lmina do tubo controle e dos tubos com drogas que estiverem (+). Se na lmina, o resultado for presena de BAAR sem contaminao, o teste pode seguir at a finalizao.

9 .8 Teste de Sensibilidade para drogas alternativas


9 .8 .1 Descrio A capacidade das MNT em produzir doena est documentada na literatura e sua importncia vem aumentando progressivamente, com isolamentos de diferentes espcies nos laboratrios de micobactrias24,25,26. O diagnstico de doena causada por MNT exige muita cautela, pois o isolamento dessas espcies a partir de materiais clnicos no estreis pode significar colonizao transitria ou contaminao. Por isso, a correlao clnico-laboratorial de fundamental importncia para o estabelecimento do diagnstico de doena e para determinao da estratgia teraputica25,27. So poucos os estudos sobre correlao do resultado dos Testes de Sensibilidade convencionais, descritos anteriormente neste captulo, e o prognstico clnico para as doenas causadas por MNT. Por esse motivo, no recomendvel a realizao do TS convencional para todas as espcies. Em alguns casos, com confirmao de que a cepa isolada clinicamente significante para o paciente, pode-se realizar o TS, desde que haja cautela na interpretao do resultado27. De acordo com as recomendaes do NCCLS/CLSI e ATS/IDSA, o mtodo mais aceito o que determina a Concentrao Mnima Inibitria (CMI), que definida como a menor concentrao da droga capaz de impedir o crescimento microbiano e est validado para ser realizado em algumas espcies de MNT16,25. 9 .8 .2 Utilidades do mtodo Atualmente vrios estudos so realizados utilizando essa metodologia de determinao da CMI de M. tuberculosis e de MNT frente s drogas de tratamento28,29,30 na busca de alternativas para avaliar: Drogas alternativas para o tratamento de TBMR. Drogas alternativas para o tratamento de MNT. Novas drogas ou produtos ativos para desenvolvimento de novas drogas para determinar sua potencialidade.

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9 .8 .3 Micobactrias e drogas testadas As drogas para determinao da CMI sero utilizadas de acordo com a micobactria isolada: Quadro 4 Espcies de MNT e as drogas utilizadas para CMI
Espcies de MNT Amikacina (AK) Micobactrias de Crescimento Rpido (MCR) M. fortuitum M. chelonae M. abscessus Claritromicina (CLAR) Ciprofloxacina (CIP) Sulfamethoxazole (SUL) Tobramicina (TO) Observao: Imipenem no deve ser testado para M.chelonae e M.abscessus Complexo M. avium M. avium e M. intracellulare Claritromicina (CLAR) Azitromicina (AZ) Estreptomicina (SM) M. kansasii Isoniazida (INH) Etambutol (EMB) Rifampicina (RMP) Estreptomicina (SM) Isoniazida (INH) Para estudos de ao de drogas ou caracterizao de outras espcies Etambutol (EMB) Rifampicina (RMP) Rifabutina (RB) Ciprofloxacina (CIP) Rifabutina (RB) Ciprofloxacina (CIP) Amikacina (AK) Claritromicina (CLAR) Amikacina (AK) Clofazemina (CLOF) Claritromicina (CLAR) Etionamida (ETH) D-cicloserina (CS) Doxiciclina Drogas utilizadas Imipenem (IMI) Cefoxitina (CEF) Doxiciclina (DX) Linezolide (LIN)

9 .8 .4

Preparao das drogas

Soluo-me das drogas Preparar uma soluo-me de cada droga a 10.000 g/ml de cada droga: pesar 0,1 g da droga e dissolver em 10 ml de gua destilada estril ou outro diluente, de acordo com o Quadro 5.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Quadro 5

Preparao da soluo-me das drogas e os diluentes correspondentes


Diluentes Drogas CS, DX, SM, INH, EMB, CIP e AZ CLA, ETH, CLOF e RB RMP

H2O DMSO (Dimetil sulfxido) Metanol

CS = cicloserina, DX = doxiciclina, SM = estreptomicina, AK = amicacina, RB = rifabutina, ETH = etionamida, CLA = claritromicina, INH = isoniazida, CIP = ciprofloxacina, EMB = etambutol, RMP = rifampicina, CLOF = clofazemina, AZ = azitromicina

A soluo-me pode ser aliquotada em criotubos e conservada a -70C, por at 12 meses, com estabilidade satisfatria16. Quando conservada a -20C, a validade de 6 meses. A clofazemina no deve ser armazenada, pois no mantm a estabilidade e a etionamida tem prazo de validade de 30 dias a -20C. Soluo de uso das drogas A soluo de uso das drogas preparada a partir da soluo-me, em meio lquido Middlebrook 7H9 enriquecido com OADC. No dia da preparao da soluo de uso, descongelar a soluo-me e descartar o volume restante. Para as drogas: CS, DX, SM, AK, CLA, ETH, INH, EMB, CIP, CLOF e RB, realizar uma diluio 1:10 a partir da soluo-me, ficando assim numa concentrao de 1.000 g/ml. A partir desta concentrao, seguir as informaes do Quadro 6 para obter a concentrao final que ser levada aos orifcios da linha A da microplaca. Para a droga AZ, no precisa fazer a diluio 1:10 e podemos partir da soluo-me, diretamente. Para calcular a concentrao final que cada droga dever ter nos orifcios da linha A da microplaca, utilizar os dados do Quadro 6:

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Quadro 6

Preparao da soluo de uso para obteno das concentraes finais de cada droga, nos orifcios da linha A da microplaca, para um volume de 1 ml.
Concentrao final nos orifcios da linha A da microplaca (g/ml) 128 64 32 32 32 32 16 16 16 8 8 4 512 Soluo de uso = Soluo-me diluda 1:10 (1 .000 g/ ml)* l + meio 7H9 l 512 + 488 256 + 744 128 + 872 128 + 872 128 + 872 128 + 872 64 + 936 64 + 936 64 + 936 32 + 968 32 + 968 16 + 984 250 + 970

Drogas CS DX SM AK CLA ETH INH EMB CIP RMP CLOF RB AZ*

* Para a droga AZ utilizar a soluo-me sem diluir CS = cicloserina, DX = doxiciclina, SM = estreptomicina, AK = amicacina, RB = rifabutina, ETH = etionamida, CLA = claritromicina, INH = isoniazida, CIP = ciprofloxacina, EMB = etambutol, RMP = rifampicina, CLOF = clofazemina, AZ = azitromicina

A concentrao da soluo de uso dever ser quatro vezes maior do que a concentrao final, primeira concentrao da diluio seriada e corresponde a linha A da microplaca. Para exemplificar: o primeiro orifcio contm 100 l de meio, ao colocar 100 l de droga a concentrao cai pela metade, e ao inocular 100 l da suspenso bacteriana a concentrao novamente cai pela metade. Observar os itens 9.12.1.11, 9.12.1.12 e 9.12.1.13 dos anexos deste Captulo que mostra os esquemas das microplacas da CMI para Micobactrias de Crescimento Rpido, Complexo M. avium e M. kansasii, respectivamente. 9 .8 .5 Procedimentos da CMI

Precaues Ao trabalhar com meios lquidos necessrio intensificar os cuidados com a produo de aerossis. Realizar os procedimentos utilizando as recomendaes de biossegurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Considerando que o mtodo utiliza volumes muito pequenos importante que as micropipetas automticas estejam calibradas para evitar erros significativos.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Cuidado especial no preparo das drogas e diluies para obter a concentrao correta. Observaes: A preparao do meio de cultura Middlebrook 7H9/OADC e formulrio para controle da preparao esto descritas no anexo deste captulo. A preparao da Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a 5% est descrito no Captulo 3. A preparao do tubo n 1 da Escala McFarland est descrito no Captulo 7. Materiais Equipamentos CSB Estufa bacteriolgica a 36 1C. Freezer 20C. Geladeira. Micropipeta automtica capacidade de 1 a 50 l. Micropipeta automtica capacidade de 50 a 200 l, com variao de volume de 1 l. Micropipeta automtica capacidade de 100 a 1000 l, com variao de volume de 1 l. Micropipeta multicanal com 12 canais capacidade de 100 a 200 l. Micropipeta multicanal com 8 canais capacidade de 100 a 200 l. Distribuidor de meio (repete) com seringa de 100, 10 e 30 l. Suporte com espelho para leitura das placas. Reagentes gua destilada estril. Drogas de escolha (de acordo com a micobactria). Metanol. Dimetilsulfxido (DMSO). Resazurina e MTT. Soluo de lcool a 70%. Soluo de Fenol a 5%. Tubo n 1 McFarland. Insumos Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada. Canetas para marcar vidro ponta fina e comum. Ala bacteriolgica descartvel estril. Tubo de ensaio 13 x 100 mm, com tampa de rosca, estril (2 para cada cepa testada, para preparar o inculo).

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Microplacas com 96 orifcios, fundo em U, com tampas, estreis. Pipeta Pasteur descartvel estril. Ponteiras para micropipetas de 1, 200 e 1000 l. Meio lquido Middlebrook 7H9 ou Caldo Muller-Hinton ction suplementado. Enriquecimento Middlebrook OADC (cido oleico, albumina, dextrose e catalase). Reservatrio canaleta estril, para distribuio de meio com micropipeta multicanal. Criotubo de 1,5 ml. Gaze estril em pedaos. Saco plstico tipo zippack ou filme plstico. Caixa plstica com tampa e trava para acondicionar microplacas na estufa. Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado. Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte. Balo volumtrico capacidade de 200 ml e de 10 ml. Frasco erlenmeyer capacidade de 200 ml. Frascos de vidro com tampa de rosca capacidade de 10 a 30 ml, um para cada droga utilizada. Formulrio com esquema da microplaca e as drogas que esto sendo testadas e leitura dos resultados (itens 9.12.2.11, 9.12.2.12 e 9.12.2.13). Cepas de referncia para controle de sensibilidade e resistncia.

Procedimentos de organizao Realizar os procedimentos de 1 a 3 fora da CSB 1. Como uma tcnica que exige muita ateno, organizar todo o material necessrio para sua execuo e dedicar-se exclusivamente a essa atividade. 2. Trazer para prximo CSB, em local visvel, o Formulrio com esquema da microplaca a ser utilizada para seguir o esquema atentamente. 3. Identificar na microplaca o nmero do isolado bacteriano a ser testado. Os formulrios com os esquemas das microplacas e as diferentes drogas assim como o espao para anotaes da leitura das CMI obtidas, encontram-se no anexo deste captulo: Item 9.12.1.11 Formulrio de Determinao da CMI de Micobactrias de Crescimento Rpido (MCR). Item 9.12.1.12 Formulrio de Determinao da CMI do Complexo M. avium. Item 9.12.1.13 Formulrio de Determinao da CMI de M. kansasii.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Procedimentos de realizao preparao das microplacas Utilizar microplacas novas, descartveis, estreis, de 96 orifcios, com fundo em U, com tampa para baixa evaporao, prpria para cultura de clulas. Realizar os procedimentos de 1 a 4 dentro da CSB 1. Distribuir 100 l de meio 7H9-OADC em todos os orifcios da microplaca utilizando micropipeta multicanal de 12 canais. 2. Colocar 100 l da soluo de uso de cada droga na linha A da microplaca, com exceo da fileira H. Executar esse procedimento com muito cuidado, trocando as ponteiras para cada droga. Seguir um dos esquemas dos itens 9.12.1.11, 9.12.1.12 ou 9.12.1.13 3. Realizar as diluies seriadas: colocar a micropipeta multicanal na linha A, homogeneizar, retirar 100 l e passar para a linha B, homogeneizar e passar para a linha C e assim sucessivamente at a linha G, desprezando 100 l desta linha. Em cada linha preciso homogeneizar (2 vezes) antes de transferir para a linha seguinte. Na linha H no vai droga, fica apenas com o meio de cultura e ser o controle de crescimento da cepa (CCC). 4. As microplacas prontas, com as drogas diludas, podem ser conservadas -20C e tm validade de um ms. Procedimentos de realizao suspenso bacteriana (inculo) A cepa de micobactria deve estar identificada como espcie. Realizar os procedimentos de 1 a 6 dentro da CSB 1. A partir da cepa em meio slido LJ, que deve estar na fase logartmica de crescimento, fazer um subcultivo: retirar com ala bacteriolgica descartvel estril uma boa quantidade do crescimento bacteriano, de forma a ser representativo da amostra e transferir para um tubo contendo 3 ml de meio 7H9/OADC. 2. Incubar a 36 1C durante um perodo de 3 dias para as micobactrias de crescimento rpido e de 7 dias para as de crescimento lento. 3. Aps o perodo de incubao, homogeneizar, deixar sedimentar durante 5 minutos e utilizar o sobrenadante. 4. Suspenso padro: em tubo de ensaio contendo meio 7H9/OADC, gotejar o sobrenadante at ajustar a turvao com a do tubo n 1 da Escala McFarland. 5. Suspenso de uso: num volume final de 10 ml, fazer uma diluio 1:25 da suspenso padro em meio 7H9/OADC. Para isso, colocar 9,6 ml de meio 7H9/ OADC num tubo de ensaio e adicionar 0,4 ml da suspenso padro e misturar suavemente.

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Procedimentos de realizao inoculao nas microplacas Realizar o procedimento 6 dentro da CSB 6. Com micropipeta multicanal (4 canais) transferir 100 l da suspenso de uso para todos os orifcios da microplaca. Na linha H tambm coloca-se o inculo, com exceo de um dos orifcios que ser o controle do meio (CM). Realizar o procedimento 7 e 8 fora da CSB 7. Colocar as microplacas dentro de sacos plsticos, fechar bem e coloc-las dentro de uma caixa de plstico fechada e com trava e levar para a estufa. Esses cuidados evitam a evaporao pelo calor da estufa e protege de acidentes graves como o derrame de lquido e produo de aerossol. 8. Realizar a limpeza, descontaminao da CSB e da bancada e o descarte do material contaminado conforme descrito no Captulo 3. Incubao das microplacas Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 3 a 5 dias para MCR de 7 a 10 dias para as de MNT de crescimento lento. Revelao e leitura nas microplacas Aps o perodo de incubao de acordo com a micobactria testada, fazer a leitura das microplacas. Antes de retirar as microplacas da estufa, preparar a soluo reveladora, que poder ser Resazurina ou MTT. Soluo reveladora Trata-se de indicadores colorimtricos de crescimento celular, baseados na oxireduo de um indicador colorido adicionado ao meio de cultura depois que a micobactria ficou exposta s drogas antituberculose. A resistncia detectada pela mudana de cor do indicador, a qual diretamente proporcional ao nmero de micobactrias viveis presentes no meio de cultura. Os indicadores, resazurina e MTT -3-(4,5-dimethyl-2-thyazolyl)-2,5-diphenyl2-tetrazolium bromide, tm sido utilizados como reveladores nos testes de determinao da CMI em microplacas, para micobactrias frente s drogas de primeira e segunda linha, com resultados comparveis e em concordncia com o mtodo das propores,31,32.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Preparao da soluo reveladora Realizar os procedimentos dentro da cabine de exausto Resazurina: Preparar uma soluo 0,01 % de resazurina em gua destilada: pesar 0,002 g em 20 ml de gua destilada. MTT: Preparar uma soluo de 5 mg/ml de MTT em gua destilada: pesar 50 mg em 10 ml de gua destilada. Ambas as solues podem ser conservadas a 4C por uma semana, protegida da luz. Leitura do teste Realizar os procedimentos dentro da CSB A leitura feita dentro da CSB, com o auxlio de um suporte com espelho, onde a microplaca colocada de modo que seja possvel observar o crescimento no fundo dos orifcios sem erguer ou movimentar. Proceder primeiro uma leitura visual, sem o uso do indicador, comparando o crescimento nos orifcios (CCC) e o orifcio (CM). O crescimento vai aparecer como um boto ou turvao no fundo da microplaca. Registrar os resultados obtidos no formulrio especfico de resultados, de acordo com a micobactria testada. Proceder a revelao com o indicador escolhido. Revelao do teste Realizar esses procedimentos dentro da CSB Manter prximo CSB, em local visvel, o formulrio com esquema da microplaca que est sendo utilizada. Ao retirar o saco ou o filme plstico, evitar movimentos bruscos e cuidar para que a gua de condensao que poder estar na tampa da microplaca no caia sobre os orifcios do teste. Com Resazurina: adicionar 30 l da soluo de resazurina nos orifcios de controle: H1, controle de crescimento (CCC) e controle do meio (CM): Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps esse perodo, verificar se houve mudana de cor, de azul para rosa, no orifcio H1, indicando que houve crescimento bacteriano. O outro controle (CM) dever permanecer azul, indicando ausncia de crescimento bacteriano. Caso o H1 no apresente mudana de cor, incubar por mais 3 dias e repetir o procedimento.

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Se houve mudana de cor em H1, adicionar 30 l da soluo de resazurina em todos os orifcios onde foi inoculado a bactria e no 2 orifcios controle (CCC). Incubar por mais 24 horas. Com MTT: adicionar l0 l da soluo de MTT nos orifcios de controle: H1, controle de crescimento (CCC) e controle do meio (CM) e seguir o mesmos passos descritos para a resazurina. A mudana de cor que indica crescimento bacteriano de amarelo para roxo. Interpretao do teste Aps esse perodo verificar se houve mudana de cor nos orifcios do teste e se a cor apresentada comparvel cor do 2 orifcio controle (CCC). Se a condio acima foi atendida, o teste pode ser interpretado e determinada a CMI para cada droga. CMI = a menor concentrao da droga capaz de inibir o crescimento de 90% da cepa testada. Ou seja, a menor concentrao da droga capaz de impedir a mudana de cor de azul para rosa, quando usamos a resazurina como revelador e de amarelo para roxo quando usamos o MTT. Registrar os resultados obtidos no formulrio especfico de resultados, de acordo com a micobactria testada. Descartar todo o material utilizado seguindo as recomendaes da biossegurana no Captulo 3. ATENO: De acordo como CLSI/NCCLS16, os resultados da CMI so expressos como: sensvel, sensibilidade moderada e resistente . Estas categorias foram definidas aps estudos com nmero significativo de microrganismos, para cada classe de droga . As CMI foram analisadas em relao farmacocintica da droga em dosagens normais utilizadas e, sempre que possvel, os critrios interpretativos dos testes in vitro foram analisados em relao a estudos de eficcia clnica no tratamento do microrganismo especfico .

9 .9 Controle de qualidade interno


As recomendaes gerais quanto limpeza da vidraria, assim como a qualidade e conservao dos meios de cultura, j refernciadas em outros captulos, so descritos com detalhes no Captulo 7. Verificar se os Testes de Sensibilidade esto sendo realizados de amostras de pacientes que tenham algum fator de risco de resistncia drogas antituberculose, se-

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

guindo os critrios estabelecidos pelo PNCT. De outra forma, os resultados produzidos pelo laboratrio no tero utilidade. 9 .9 .1 CQI das drogas utilizadas Os cuidados com a qualidade, conservao, atividade e preciso na pesagem das drogas so fundamentais para assegurar resultados confiveis dos Testes de Sensibilidade16. Por esse motivo, conveniente que o LR se responsabilize pela compra centralizada, pesagem e distribuio dessas drogas. Esse laboratrio tambm ser responsvel por prover a rede de laboratrios com as instrues de preparao das diluies e incorporao destas aos meios de cultura15. Fonte da droga Para a aquisio comercial das drogas deve-se ter em conta a sua qualidade e confiabilidade. O fabricante deve fornecer impresso no rtulo o nome genrico da droga, sua potncia, data de validade, condies de conservao. Potncia da droga Potncia da droga o nmero de microgramas da droga ativa por miligrama de peso total do produto. Nem toda a droga apresentada em sua forma pura pelo fabricante e uma poro do seu peso pode ser devido a impurezas ou devido a algum radical que compe a molcula. A potncia de cada lote de fabricao da droga deve vir impressa no rtulo do produto ou no seu certificado de qualidade, e deve ser ajustada, se for o caso, cada vez que for adquirida. Conservao e manuseio da droga Observar estritamente as recomendaes do fabricante (no rtulo ou no certificado de qualidade) quanto s condies de conservao, pois algumas necessitam serem mantidas em freezer enquanto que outras sob refrigerao. Manter sempre a droga no frasco original e dentro de um dessecador para evitar a absoro de umidade. Quando descongelar as alquotas da soluo-me da droga, para preparar a soluo de uso, aps utilizar o volume necessrio, descartar o volume que sobrou. Nunca congelar novamente a droga depois de haver descongelado. Pesagem da droga As drogas devem ser pesadas em balanas analticas calibradas e com certificado de calibrao vlido.

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9 .9 .2 CQI dos meios LJ com drogas Para os meios de cultura com drogas se aplicam os mesmos controles detalhados no Captulo 7: aspectos macroscpicos: cor, consistncia textura e volume, controle de esterilidade e microbiolgico. importante observar que, se os meios de cultura com drogas no so bem conservados, as drogas incorporadas podem perder sua atividade. No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. Controle microbiolgico Para controlar a qualidade dos meios de cultura LJ com drogas, com relao ao desempenho em demonstrar a resistncia s drogas da micobactrias, cada lote produzido deve ser semeado com uma cepa de referncia sensvel a todas as drogas testadas e outra cepa resistente15. As cepas de referncia recomendadas para demonstrar sensibilidade so M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 e M tuberculosis H37Ra ATCC 25177, ambas so sensveis a todas as drogas testadas, sendo a cepa H37Ra considerada avirulenta16. Para monitorar possveis erros nos meios produzidos com drogas (por exemplo, excesso de droga), o que leva a resultados sensveis, importante o uso das cepas resistentes. Por outro lado, sabemos que o uso de cepa resistente na rotina do laboratrio aumenta o risco biolgico, no sendo recomendado o uso de uma cepa resistente a todas as drogas15. Sugerimos que seja utilizada uma combinao de cepas, cada uma resistente a uma das drogas testadas, principalmente INH e RMP. Os procedimentos para realizar este controle microbiolgico segue o descrito no Captulo 7. Para facilitar, sugerimos que o controle de cada lote do TS, seja preparado junto, no mesmo lote, com as amostras a serem testadas. Os registros dos resultados devem ser preenchidos de maneira clara e organizados em formulrios descritos no anexo deste captulo. Se for detectado resultados no esperados, recomenda-se anular os resultados de todo o lote e repeti-las com novo lote de meios. 9 .9 .3 CQI do processamento do TS Organizao de todo o material necessrio, antes de iniciar. A rea de trabalho na CSB no deve ter acmulo de materiais, j que a tcnica requer o uso de uma quantidade muito grande de materiais, ao mesmo tempo. Cultura primria: sempre que possvel dar preferncia para realizar o Teste de Sensibilidade a partir do crescimento primrio, desde que contenha 20 ou mais colnias. Para preparar o inculo raspar o maior nmero de colnias possvel.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

Nas culturas em que o nmero de colnias menor que 20, no recomendamos a realizao do Teste de Sensibilidade, pois essa amostra pode no ser representativa da populao bacilar na leso. Nesse caso, realizar um subcultivo do isolado bacteriano para aumentar o nmero de colnias, no significa melhorar as suas caractersticas e, portanto, no recomendado. Verificar se a cultura est pura, se as colnias tm a mesma morfologia e caso isso no ocorra, no realizar o Teste de Sensibilidade antes de tratar e descontaminar a cultura. No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze ou papel de filtro, estreis, para facilitar a absoro do inculo semeado. Qualidade do inculo: a preparao das diluies fundamental para assegurar que todos os tubos recebam o mesmo inculo e que os clculos da proporo de mutantes resistentes tenha significado. Para isso importante ter um bom padro de turvao (Escala McFarland), recm preparada, sem precipitaes. A suspenso deve ser homognea, deixando-a decantar durante alguns minutos para que os grumos se depositem e quando retirar a alquota no tocar no fundo do tubo. preciso assegurar a preciso da medida do volume inoculado, que deve ser sempre o mesmo em todos os tubos semeados e garantir a troca de pipetas durante as diluies seriadas. Verificar a completa absoro do inculo antes do fechamento das tampas. Nesse momento, havendo presena de contaminao, descartar o teste e repeti-lo.

9 .9 .4 CQI da leitura e resultados do TS No momento da primeira leitura (28 dias) de incubao, verificar se o inculo est adequado: Morfologia das colnias so caractersticas de M. tuberculosis. Colnias contveis nos tubos controles semeados com a diluio 10-5. Presena de pelo menos 100 colnias nos tubos controles semeados com a diluio 10-3. Quantidade de colnias com a diluio 10-5 de aproximadamente 100 vezes menor do que a obtida com a diluio 10-3. Se estas condies no so atendidas, repete-se o teste imediatamente. Se estiverem adequadas e se detectam resistncia a alguma droga, numa proporo acima de 1% em relao ao controle, deve-se informar imediatamente a resistncia detectada para agilizar a orientao de tratamento adequado. Se no aparece resistncia, aguarda-se at completar 42 dias de incubao. O resultado definitivo emitido aps a leitura do TS com 42 dias de incubao.

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Conciliar os resultados do teste de um paciente com resultados anteriores obtidos para o mesmo paciente. No caso de observar incoerncias ou discordncias entre os resultados, repetir o teste partindo, de preferncia, do isolamento primrio. 9 .9 .5 CQI do sistema automatizado MGIT Para se descartar uma possvel contaminao bacteriana ou fngica deve-se semear cada suspenso bacteriana a ser testada em um tubo de meio de cultura Tryptic Soy Agar (TSA). Incubar a 36 1C e realizar a leitura aps 48 horas de incubao. Utilizar uma cepa de referncia M. tuberculosis H37Rv a cada lote novo de drogas a serem testadas. Essa cepa controle sensvel a todas as drogas de primeira linha na concentrao utilizada na tcnica. 9 .9 .6 CQI DA CMI Somente realizar a CMI de cepas de micobactrias com a espcie identificada e que seja cultura pura. Seguir as mesma recomendaes descritas acima no que se refere aos cuidados de preparao das drogas, pesagem, qualidade e conservao. Utilizar uma cepa de referncia da mesma espcie que est sendo testada com a CMI e proceder s mesmas recomendaes, inoculando uma microplaca cada vez que utilizar um lote novo de meios e de drogas. De acordo com a CLSI/NCCLS16, as cepas de referncia utilizadas para a determinao da CMI so: M. avium (ATCC 700898) para o controle do Complexo M. avium; M. kansasii (ATCC12478) para o M. kansasii e M. peregrinum (ATCC 700686) para o controle das Micobactrias de Crescimento Rpido.

9 .10 Controle de qualidade externo


Desde 1994, a OMS criou uma Rede de Laboratrios Supranacionais (RLSN) que normaliza e coordena a superviso externa indireta do Teste de Sensibilidade no mundo33. Atualmente, o laboratrio coordenador da RLSN o Instituto de Medicina Tropical da Blgica. Essa rede est conformada por 20 laboratrios supranacionais e cresce medida que se detecta a necessidade de estabelecer um novo laboratrio em alguma regio. Todo laboratrio que realiza Teste de Sensibilidade s drogas antituberculose deve ser avaliado por LR seja nacional ou regional, e estes devem ser avaliados por um laboratrio supranacional. Em cada pas o laboratrio de referncia nacional deve coordenar um programa de controle de qualidade para os laboratrios da sua rede que realizam Teste de Sensibilidade.

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No Brasil, como foi descrito no Captulo 7 para o Controle de Qualidade Externo (CEQ) da Cultura, o laboratrio de referncia nacional deve executar esse programa em conjunto com os laboratrios de referncia regionais. O CQE consiste no envio de um painel de cepas com fentipo de resistncia selecionado para poder avaliar, em cada laboratrio, a preciso dos resultados do Teste de Sensibilidade frente s quatro drogas de primeira linha: isoniazida, rifampicina, etambutol e estreptomicina. O nmero de cepas que compe o painel duplicado e recebe um cdigo sorteado ao acaso, que, assim como os resultados dos testes, somente o laboratrio que est coordenando o programa conhece. O laboratrio coordenador realiza os Testes de Sensibilidade de cada cepa do painel e os repica, em nmero suficiente, para enviar aos laboratrios da rede que sero supervisionados. Os painis devem ser transportados com as medidas de biossegurana requeridas para esse tipo de material de risco biolgico. Os laboratrios supervisionados realizam os Testes de Sensibilidade s cegas, utilizando o mtodo recomendado e aplicado na rotina de trabalho. Os resultados informados de cada laboratrio so comparados com o resultado consenso (acordado pela maioria dos laboratrios supranacionais) e cada resultado classificado em: (a) verdadeiro resistente; (b) falso resistente; (c) falso sensvel; (d) verdadeiro sensvel. Para cada droga, calculada a sensibilidade, especificidade, eficincia e reprodutibilidade. A sensibilidade avalia o acerto na deteco da resistncia; a especificidade, o acerto na determinao da ausncia de resistncia; e a eficincia, o acerto no total de resultados. A reprodutibilidade avalia a consistncia dos resultados produzidos pelo laboratrio. As experincias dos LSN mostram que o monitoramento dessas sucessivas avaliaes pode incrementar a qualidade dos laboratrios. Como meta de desempenho para os laboratrios, espera-se uma eficincia de 92% para SM e EMB, de 97% para INH e de 99% para RMP. Os limites de aceitabilidade de eficincia estabelecidos classificam como no aceitveis, as eficincias menores que 80% para EMB e SM, que 89% para INH e que 95% para RMP33,34. Aps analise dos resultados, cada laboratrio participante deve ser informado dessa avaliao. No caso de serem observados resultados imprecisos, em especial INH e RMP, dever ser identificada a causa da impreciso, assim como sugestes para reverter essa situao. Como conseqncia pode ser oferecido treinamento, se for o caso e enviado novo painel ao laboratrio, desenhado especialmente de acordo com o problema detectado. At que se verifique que o laboratrio recuperou a qualidade do seu trabalho, os Teste de Sensibilidade da rotina do laboratrio devero ser realizado pelo laboratrio de referncia nacional.

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importante manter todos os registros de monitoramento da preciso alcanada pelos laboratrios em sucessivos controles.

9 .11 Referncias
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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

13. BRASIL. Ministrio da Sade. Fundao Nacional de Sade. Tuberculose. Guia de Vigilncia Epidemiolgica. 1 Edio. Assessoria de Comuniao e Educao em Sade (Ascom), Braslia, 100p. 2002. 14. SES-SP/Secretaria do Estado da Sade de So Paulo. CVE/Centro de Vigilncia Epidemiolgica Prof. Alexandre Vranjac. Diviso de Tuberculose. Manual de orientao para coleta de amostras de escarro e outros materiais para baciloscopia e cultura para diagnstico e controle da tuberculose. So Paulo, 26p. 2002. 15. Instituto Nacional de Enfermidades Infecciosas. ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn. Prueba de Sensibilidad. Luca Barrera. Documento no impresso. 16. CLSI/ Clinical and Laboratory Standards Institute. NCCLS/ The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes. Approved Standard. Document M24-A, 23(18):84p. Pensylvania,USA, 2003. 17. CANETTI, G.; FROMAN, S.; GROSSET, J.; HAUDURROY, P.; LANGEROVA, M.; MAHLER, H.T.; MEISSNER, G.; MITCHISON, D.A.; and SULA, L. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bulletin of the World Health Organization, 29:565-578, 1963. 18. CANETTI, G. Present aspects of bacterial resistance in tuberculosis. Am Rev Respir Dis, 92(5):687-703, 1965. 19. CANETTI, G.; FOX, W.; KHOMENKO, A.; MAHLER, H.T.; MENON, N.K.; MITCHISON, D.A.; RIST, N.; SMELEV, N.A. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes. Bulletion of the Word Health Organization, 4:21-43. 1969. 20. BRASIL. Ministrio da Sade. Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Procedimentos de Bacteriologia da Tuberculose do II Inqurito Nacional de Resistncia a Drogas em Tuberculose no Brasil, Braslia, 2005. 21. KENT, P.T. and KUBICA, G.P. Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta,USA. 1985. 22. SIDDIQI, S.H.; RSCH-GERDES, S. MGITTM Procedure Manual for BactecTM MGITTM TB System. Mycobacteria Growth Indicator Tube Culture and Drug Susceptibility Demonstration Project. Prepared for The Foundation for Innovation New Diagnostics (FIND), 2006. 23. BD/Beckton Dickinson. Bactec Mgit 960 Sire Kits For The Antimycobacterial Susceptibility Testing Of Mycobacterium Tuberculosis. Revised: 2002. 24. FALKINHAM J.O. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin Microbiol Rev,9:1777-215, 1996. 25. ATS/The American Thoracic Society. An Official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases. Am J Respir Crit Care Med, 175:367-416, 2007.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 Anexos do captulo


9 .12 .1 9 .12 .1 .1 Preparao dos Meios para TS e CMI Preparao do Meio LJ com INH
Preparao do meio LJ com isoniazida 0,2 mg/ml (a) Preparao da Soluo-me de isoniazida 10 .000 mg/ml Isoniazida (Isonicotinic acid hydrazide = Isonicotinic hydrazide) Sigma-Aldrich gua destilada estril 100 mg 10 ml

1) Pesar a isoniazida em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem, se necessrio; 2) Dissolver em gua destilada estril. 3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses. (b) Preparao da Soluo de uso de isoniazida Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga. 4) A partir da soluo-me (10.000 mg/ml) realizar uma diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de gua destilada estril. 5) A partir desta soluo (1.000 mg/ml) realizar outra diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de gua destilada estril (100 mg/ml). (c) Preparao do meio LJ com isoniazida 0,2 mg/ml 6) Adicionar 0,4 ml desta soluo (100 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no Captulo 7). 7) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos. Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. 8) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular. 9) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C. 10) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. 11) Desta maneira se obtm o meio de cultura com isoniazida na concentrao final de 0,2 mg/ml.

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9 .12 .1 .2

Preparao do Meio LJ com RMP


Preparao do meio LJ com rifampicina 40,0 mg/ml

(a) Preparao da Soluo-me de rifampicina 10 .000 mg/ml Rifampicina (3-[4-Methylpiperazinyliminomethyl]rifamycin SV= Rifamycin AMP = Rifampin) Sigma-Aldrich Metanol, Etilenoglicol ou N,N-dimetilformamida 100 mg 10 ml

1) Pesar a rifampicina em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem, se necessrio. 2) Dissolver em metanol, Etilenoglicol ou N,N-dimetilformamida. 3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses. (b) Preparao do meio LJ com rifampicina 40,0 mg/ml Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga. Obs.: a rifampicina no tem soluo de uso. 4) Adicionar 0,8 ml da soluo-me (10.00 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no Captulo 7). 5) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos. Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. 6) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular. 7) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C. 8) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. 9) Desta maneira se obtm o meio de cultura com rifampicina na concentrao final de 40,0 mg/ml.

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Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .1 .3

Preparao do Meio LJ com EMB


Preparao do meio LJ com etambutol a 2 mg/ml

(a) Preparao da Soluo-me de etambutol 10 .000 mg/ml Etambutol (2,2-[1,2-Ethanediyldiimino]bis-1-butanol dihydrochloride = Ethambutol dihydrochloride) Sigma-Aldrich gua destilada estril 100 mg 10 ml

1) Pesar o etambutol em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem, se necessrio; 2) Dissolver em gua destilada estril; 3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses; (b) Preparao da Soluo de uso de etambutol Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga; 4) A partir da soluo-me (10.000 mg/ml) realizar uma diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de gua destilada estril; (c) Preparao do meio LJ com etambutol 2 mg/ml 5) Adicionar 0,4 ml desta soluo (100 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no Captulo 7); 6) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos. Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. 7) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular; 8) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C; 9) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C; 10) Desta maneira se obtm o meio de cultura com etambutol na concentrao final de 2 mg/ml;

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9 .12 .1 .4

Preparao do Meio LJ com SM


Preparao do meio LJ com estreptomicina 4 mg/ml

(a) Preparao da Soluo-me de estreptomicina 10 .000 mg/ml Estreptomicina (Dihydrostreptomicyn sesquisulfate) Sigma-Aldrich gua destilada estril 100 mg 10 ml

1) Pesar a estreptomicina em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem, se necessrio. 2) Dissolver em gua destilada estril. 3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses. (b) Preparao da Soluo de uso de estreptomicina Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga. 4) A partir da soluo-me (10.000 mg/ml) realizar uma diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de gua destilada estril. (c) Preparao do meio LJ com estreptomicina 4 mg/ml 5) Adicionar 0,8 ml desta soluo (100 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no Captulo 7). 6) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos. Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. 7) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular. 8) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C. 9) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. 10) Desta maneira se obtm o meio de cultura com estreptomicina na concentrao final de 4 mg/ml.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 369

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .1 .5

Preparao do Meio LJ com TCH


Preparao do meio LJ com TCH 2 mg/ml

(a) Preparao da Soluo-me de TCH 10 .000 mg/ml Hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico (2-Thiophenecarboxylic acid hydrazide) Sigma-Aldrich gua destilada estril 100 mg 10 ml

1) Pesar a TCH em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem, se necessrio. 2) Dissolver em gua destilada estril. 3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses. (b) Preparao da Soluo de uso de TCH Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga. 4) A partir da soluo-me (10.000 mg/ml) realizar uma diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de gua destilada estril. (c) Preparao do meio LJ com TCH 2 mg/ml 5) Adicionar 0,4 ml desta soluo (100 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no Captulo 7). 6) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos. Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. 7) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular. 8) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C. 9) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. 10) Desta maneira se obtm o meio de cultura com TCH na concentrao final de 2 mg/ml.

370 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .1 .6

Preparao do Meio LJ com PNB


Preparao do meio LJ com PNB 500 mg/ml

(a) Preparao da Soluo-me de PNB 10 .000 mg/ml cido p-nitrobenzico (PNB) 4-Nitrobenzoic acid Aldrich Propilenoglicol ou Soluo de NaOH 1N 200 mg 10 ml

1) A soluo de PNB pode ser preparada utilizando propilenoglicol ao soluo de NaOH 1N, conforme descrito no item Anexos do Captulo 7. (b) Preparao do meio LJ com PNB 500 mg/ml 2) Adicionar 5,0 ml desta soluo (100 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no Captulo 7). Obs.: o PNB no tem soluo de uso. 3) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos. Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos. 4) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular. 5) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C. 6) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a contar a partir do momento que atingiu 85C. 7) Desta maneira se obtm o meio de cultura com PNB na concentrao final de 500 mg/ml.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 371

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .1 .7

Preparao do Meio Lquido Middlebrook 7H9 com OADC


Preparao do Meio Liquido 7H9 para CMI

(a) Preparao do Meio lquido 7H9 Base Base Middlebrook 7H9 gua destilada Glicerol 1) 2) 3) 4) Dissolver a base de Middlebrook 7H9 em gua destilada. Acrescentar o Glicerol. Autoclavar a 121 oC por 10 minutos. Manter em geladeira. Validade: 3 meses (antes de usar visualizar ausncia de contaminao). 4,7 g 900 ml 2 ml

(b) Preparao do Meio lquido 7H9 com OADC Meio Lquido 7H9 Base Middlebrook enriquecimento OADC 180 ml 20 ml

5) No momento do uso para o preparo das microplacas , medir 180 ml e adicionar 20 ml de enriquecimento OADC (cido oleico albumina dextrose catalase). 6) Validade do 7H9 com enriquecimento: 1 ms (antes de usar verificar se no h contaminao).

372 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .1 .8

Formulrio de Produo de Meios LJ com Drogas para Teste de Sensibilidade


Formulrio - Produo de Meios LJ com Drogas para Teste de Sensibilidade

Data de Preparao

Quantidade Produzida

Validade

Meio LJ com INH, RMP, EMB, SM, TCH e PNB

N Lote Produzido

Substncia
Fosfato Monopotssico Sulfato de Magnsio Citrato de Magnsio Glutamato de Sdio Asparagina Glicerol Verde Malaquita Ovos ou Meio Base LJ Comercial gua destilada

Frmula

Procedncia

NLote Fabricante

Validade

Pesagem/ Volume

Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Base Equipamento Temperatura Tempo Data Controle
Aprovado Reprovado
Observaes:

Responsvel

Incorporao das drogas e distribuio nos tubos identificados por droga Controlado em formulrio separado para cada droga Coagulao - Meio Completo + Droga Equipamento Temperatura Tempo Data Controle
Aprovado Reprovado
Observaes:

Responsvel

Aspectos Macroscpicos Cor


A
Observaes:

Consistncia
R A R

Volume
A R

Inclinao
A R

Textura
A
Data:

Responsvel
R

A = Aprovado = conforme esperado

R = Reprovado = em desacordo com o esperado

Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C at 48horas


Data: Estufa:

Aprovado = No Houve Crescimento de Microrganismos


Observaes:

Reprovado = Houve Crescimento de Microrganismos


Responsvel:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 373

9 .12 .1 .9
9.12.1.9 Formulrio - Leitura do TS pelo Mtodo das Propores em LJ
Responsvel : Responsvel pela Leitura: Superviso:

Formulrio - Leitura do TS pelo Mtodo das Propores em LJ

N do Lote:

Data da semeadura:

374 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

N Amostra 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias

LJ controle

INH

EMB

RMP

SM

PNB

TCH Observaes

Nome Paciente

Diluio

-3

-5

-6

DIAG

N Amostra 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias

LJ controle

INH

EMB

RMP

SM

PNB 28 dias 42 dias

TCH 28 dias 42 dias Observaes

Nome Paciente

Diluio

-3

-5

-6

DIAG

N Amostra 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias 28 dias 42 dias

LJ controle

INH

EMB

RMP 28 dias 42 dias

SM 28 dias 42 dias

PNB 28 dias 42 dias

TCH 28 dias 42 dias Observaes

Nome Paciente

Diluio

-3

-5

-6

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

DIAG

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .1 .10 Formulrio - Leitura do TS pelo Mtodo Automatizado MGIT


Formulrio - Leitura do TS pelo Mtodo Automatizado MGIT
N Isolado bacteriano ANTIBIOGRAMA Posio Resultado Dias TSA Posio PNB Resultado positivo data

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 375

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .1 .11 Formulrio - Determinao da CMI de Micobactrias de Crescimento Rpido (MCR)


Formulrio Determinao da CMI de Micobactrias de Crescimento Rpido (MCR)
Esquema da Microplaca com as Drogas e as Concentraes correspondentes para a CMI de Micobactrias de Crescimento Rpido

1 A B C D E F G H
128 64 32 16 8 4 2 CCC AK

2
32 16 8 4 2 1 0.5 CCC CLA

3
16 8 4 2 1 0.5 0.25 CCC CIP

4
16 8 4 2 1 0.5 0.25 CCC DX

5
64 32 16 8 4 2 1 CM CEF

6
32 16 8 4 2 1 0.5 CM IMI

7
64 32 16 8 4 2 1

8
128 64 32 16 8 4 2

9
32 16 8 4 2 1 0.5

10

11

12

LIN

SUL

TO

CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio CEF = cefoxitin, IMI = imipenem, LIN = linezolid, SUL = sulfamethoxazole, TO = tobramicina Sensvel Sensibilidade Moderada Resistente

Esquema da Microplaca para os resultados das CMI obtidos Identificao da Micobactria: Data do teste: Responsvel: Data da leitura: Observaes: N da cepa: Revelador:

1 A B C D E F G H
CCC AK

10

11

12

CCC CLA

CCC CIP

CCC DX

CM CEF

CM IMI LIN SUL TO

CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio CEF = cefoxitin, IMI = imipenem, LIN = linezolid, SUL = sulfamethoxazole, TO = tobramicina

376 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .1 .12 Formulrio - Determinao da CMI do Complexo M. avium

Formulrio - Determinao da CMI do Complexo M. avium


Esquema da Microplaca com as Drogas e as Concentraes correspondentes para a CMI do Complexo M. avium

1 A B C D E F G H
132 64 32 16 8 4 2 CCC CLA

2
512 256 128 64 32 16 8 CCC AZ

10

11

12

CCC

CM

CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio CLA = claritromicina, AZ = azitromicina Sensvel Sensibilidade Moderada Resistente

Esquema da Microplaca para os resultados das CMI obtidos Identificao da Micobactria: Data do teste: Responsvel: Data da leitura: Observaes: N da cepa: Revelador:

1 A B C D E F G H
CCC CLA

10

11

12

CCC AZ

CCC

CM

CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio CLA = claritromicina, AZ = azitromicina

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 377

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .1 .13 Formulrio - Determinao da CMI do M. kansasii

Formulrio - Determinao da CMI do M. kansasii


Esquema da Microplaca com as Drogas e as Concentraes correspondentes para a CMI do M. kansasii

1 A B C D E F G H
32 16 8 4 2 1 0,5 CCC SM

2
16 8 4 2 1 0,5 0,25 CCC INH

3
16 8 4 2 1 0,5 0,25 CCC EMB

4
8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 CCC RMP

5
4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 CM RB

6
16 8 4 2 1 0,5 0,25 CM CIP

7
32 16 8 4 2 1 0,5

8
32 16 8 4 2 1 0,5

10

11

12

AK

CLA

CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio SM = estreptomicina, INH = isoniazida, EMB = etambutol, RMP = rifampicina, RB = rifabutina, CIP = ciprofloxacin, AK = amikacina CLA = claritromicina Sensvel Sensibilidade Moderada Resistente

Esquema da Microplaca para os resultados das CMI obtidos Identificao da Micobactria: Data do teste: Responsvel: Data da leitura: Observaes: N da cepa: Revelador:

1 A B C D E F G H
CCC SM

10

11

12

CCC INH

CCC EMB

CCC RMP

CM RB

CM CIP AK CLA

CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio SM = estreptomicina, INH = isoniazida, EMB = etambutol, RMP = rifampicina, RB = rifabutina, CIP = ciprofloxacin, AK = amikacina CLA = claritromicina

378 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .2 9 .12 .2 .1

Figuras e Fluxogramas Figura 1 Fluxograma de Realizao do Mtodo das Propores em LJ teste indireto

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 379

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .2 .2

Figura 2 Fluxograma de Realizao do Mtodo das Propores em LJ teste direto

380 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .2 .3

Figura 3 Fluxograma de Leitura do Mtodo das Propores em LJ

Exemplo 1:

Leitura:
N de UFC observadas em Diluio Tubos controle sem droga INH RMP SM 1 0 EMB 0 0

10-3 10-6

Incontveis Incontveis Incontveis Incontveis 6 3 2 3

Critrios de resistncia do M. tuberculosis s drogas no meio LJ


Drogas Isoniazida (INH) Rifampicina (RFP) Estreptomicina (SM) Estambutol (EMB) Concentrao Crtica (mg/ml) 0,2 40 4 2 Proporo Crtica (%) 1 1 1 1

Interpretao: Controle 10-3 = incontveis e 10-5 = mdia (6+3)/2 de 4,5 UFC. Podemos inferir que na diluio 10-3 em 450 UFC. Tubo INH: 10-3 = incontveis e 10-5 = 2 colnias. Fazendo a proporo (regra de trs): se 4,5 UFC 100% ento 2 UFC 44%. Proporo crtica = 1%. Acima de 1% (44%) Resistente. Tubo RMP: 10-3 = incontveis e 10-5 = 3 colnias. Fazendo a proporo (regra de trs): se 4,5 UFC 100% ento 3 UFC 67%. Proporo crtica = 1%. Acima de 1% (44%) Resistente. Tubo SM: 10-3 = 1 colnias. Fazendo a proporo (regra de trs): se 450 UFC 100% ento 1 UFC 0,2%. Proporo crtica = 1%. Acima de 1% (0,2%) sensvel.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 381

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .2 .4

Figura 4 Fluxograma de Preparao do Inculo a partir de Meio Lquido para o Mtodo Automatizado MGIT

382 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .2 .5

Figura 5 Fluxograma de Preparao do Inoculo a partir de Meio Slido para o Mtodo Automatizado MGIT

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 383

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .2 .6 Figura 6 Fluxograma de Inoculao para o Mtodo Automatizado MGIT

384 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .3 9 .12 .3 .1

Formulrios do CQI do TS Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de INH


Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de INH

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia
Isoniazida

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

gua destilada estril

Nome qumico = Isonicotinic acid hydrazide = Isonicotinic hydrazide


Embalagem a original Foi fracionada
Quem enviou: Data do recebimento:

Rtulo possui as informaes necessrias


Conservao:

Certificado de qualidade do fabricante

Geladeira

Freezer

Ambiente

Em dessecador

Pesagem (g) / volume (ml) Substncia


Isoniazida

Quantidade

gua destilada Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Conservao da Soluo-Me
Alquotas em criotubos Freezer -20C
Observaes: Quantos criotubos:

Freezer -70C

Responsvel:

Data da execuo:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 385

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .3 .2

Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de RMP


Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de RMP

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia
Rifampicina

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

Nome qumico = (3-[4-Methylpiperazinyliminomethyl]rifamycin SV= Rifamycin AMP = Rifampin)


Embalagem a original Foi fracionada
Quem enviou: Data do recebimento:

Rtulo possui as informaes necessrias


Conservao:

Certificado de qualidade do fabricante

Geladeira

Freezer

Ambiente

Em dessecador

Pesagem (g) / volume (ml) Substncia


Isoniazida

Quantidade

gua destilada Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Conservao da Soluo-Me
Alquotas em criotubos Freezer -20C
Observaes: Quantos criotubos:

Freezer -70C

Responsvel:

Data da execuo:

386 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .3 .3

Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de EMB


Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de EMB

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia
Etambutol

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

gua destilada estril

Nome qumico = (2,2-[1,2-Ethanediyldiimino]bis-1-butanol dihydrochloride = Ethambutol dihydrochloride)


Embalagem a original Foi fracionada
Quem enviou: Data do recebimento:

Rtulo possui as informaes necessrias


Conservao:

Certificado de qualidade do fabricante

Geladeira

Freezer

Ambiente

Em dessecador

Pesagem (g) / volume (ml) Substncia


Isoniazida

Quantidade

gua destilada Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Conservao da Soluo-Me
Alquotas em criotubos Freezer -20C
Observaes: Quantos criotubos:

Freezer -70C

Responsvel:

Data da execuo:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 387

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .3 .4

Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de SM


Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de SM

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia
Estreptomicina

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

gua destilada estril

Nome qumico = (Dihydrostreptomicyn sesquisulfate)


Embalagem a original Foi fracionada
Quem enviou: Data do recebimento:

Rtulo possui as informaes necessrias


Conservao:

Certificado de qualidade do fabricante

Geladeira

Freezer

Ambiente

Em dessecador

Pesagem (g) / volume (ml) Substncia


Isoniazida

Quantidade

gua destilada Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Conservao da Soluo-Me
Alquotas em criotubos Freezer -20C
Observaes: Quantos criotubos:

Freezer -70C

Responsvel:

Data da execuo:

388 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .3 .5

Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de TCH


Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de TCH

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia
TCH

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

gua destilada estril

Nome qumico = Hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico (2-Thiophenecarboxylic acid hydrazide


Embalagem a original Foi fracionada
Quem enviou: Data do recebimento:

Rtulo possui as informaes necessrias


Conservao:

Certificado de qualidade do fabricante

Geladeira

Freezer

Ambiente

Em dessecador

Pesagem (g) / volume (ml) Substncia


Isoniazida

Quantidade

gua destilada Pesagem Balana - Marca:

Responsvel:

Conservao da Soluo-Me
Alquotas em criotubos Freezer -20C
Observaes: Quantos criotubos:

Freezer -70C

Responsvel:

Data da execuo:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 389

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias

9 .12 .3 .6

Formulrio Controle da Incorporao da Droga no Meio LJ


Formulrio Controle da Incorporao da Droga no Meio LJ

N Lote de TS =

Droga LJ + Droga Soluo-me Data produo Soluo de Uso 1 Diluio: diluente 2 Diluio: diluente

LJ Responsvel Volume pela Diluio:

Incorporao ao Meio LJ Distribuio tubos


Responsvel:

Coagulador:

Responsvel:

LJ + INH

Observaes:

Responsvel:

Responsvel:

LJ + RMP

Observaes:

Responsvel:

Responsvel:

LJ + EMB

Responsvel:

Responsvel:

LJ + SM

Observaes:

Responsvel:

Responsvel:

LJ + PNB

Observaes:

Responsvel:

Responsvel:

LJ + TCH

Observaes:

390 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

9 .12 .3 .7

Formulrio Controle da Preparao do Meio Lquido Middlebrook 7H9 com OADC


Formulrio Controle da Preparao do Meio Lquido Middlebrook 7H9 com OADC

Data da Preparao

Quantidade Produzida

Validade

N do Lote Produzido

Substncia
Middlebrook 7H9 gua destilada estril Glicerol OADC Bacto-Casitone

Procedncia

N do Lote Fabricante

Validade

Pesagem (g) / volume (ml) Substncia


Middlebrook 7H9 gua destilada estril Glicerol OADC Bacto-Casitone Pesagem Balana - Marca:

Quantidade

Responsvel:

Meio Lquido Base Esterilizao Autoclave - Equipamento Marca:


Temperatura Tempo Presso

Aprovado Reprovado

Responsvel:

Preparao Meio Lquido 7H9 com OADC Substncia


7H9 Base

Quantidade

OADC

Data:

Responsvel:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 391

CAPTULO 10

CONSERVAO DE MICOBACTRIAS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

10 .1 Descrio
A conservao de micobactrias nos laboratrios de micobacteriologia fundamental para a organizao de coleo de cepas desse microrganismo1. A criao dessas colees serve a vrios objetivos, como o de manter cepas viveis bioquimicamente representativas e caracterizadas com relao sua taxonomia, infectividade e virulncia2. Serve ainda como padro de referncia interno nos procedimentos de controle de qualidade de rotina diagnstica e de pesquisas relacionadas a estes microrganismos. Culturas de microrganismos so freqentemente mantidas em meios slidos sendo necessrio subcultivos peridicos. Esse tipo de conservao tem muitas desvantagens como excesso de trabalho, contaminaes e seleo de mutantes.Um bom mtodo de conservao deve apresentar baixo custo, manter as caractersticas genticas do microrganismo e principalmente a sua viabilidade. Os mtodos mais comumente utilizados para este propsito so: congelamento de cepas e isolados bacterianos em meio de lquido acrescido de um crioprotetor, tal como o glicerol3,4, e congelamento em miangas, ambos utilizando o congelador de temperatura -20C ou -70C para manuteno das cepas congeladas. Quanto mais baixa a temperatura de manuteno das cepas e/ou isolados bacterianos congelados, isto -70C ou -196C (temperatura do nitrognio lquido), mais longo seu tempo de sobrevivncia5.

10 .2 Mtodos de congelamento
10 .2 .1 Congelamento de culturas de micobactrias em meio lquido a 70C4, 5 Precaues A manipulao das culturas para o congelamento deve ser realizada em CSB. As cepas devem ser congeladas com 3 a 4 semanas de incubao. A manipulao incorreta dos congeladores a -20C ou -70C acarreta risco de queimaduras e ferimentos graves ao manipulador por isso utilize luvas para baixas temperaturas. Fazer o controle de qualidade da temperatura dos congeladores -20C ou -70C diariamente, para manter a viabilidade das cepas congeladas. Materiais Equipamentos CSB. Congelador/freezers a -20C ou a -70C.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 393

Captulo 10 Conservao de Micobactrias

Reagentes Meio de congelamento Meio lquido Middlebrook 7H9 com OADC e 10% de glicerol, o preparo do meio 7H9 est descrito no item 10.5.3.1 dos anexos deste Captulo. Insumos Criotubos de polipropileno de 2,0 ml (prprios para suportar temperaturas baixas) com tampa de rosca, estril, devidamente identificados com os nmeros das culturas a serem congeladas. Alas descartveis estreis. Suporte para criotubos. Caixas de poliestireno numeradas para armazenamento dos criotubos nos congeladores. Caneta indelvel, de retroprojetor escrita fina. Culturas puras de micobactrias em meio slido. Procedimentos A Preparo das cepas a serem congeladas Identificar os criotubos com os nmeros dos isolados bacterianos ou nome das cepas a serem congelados como demonstra a Figura 1. Colocar 1 ml de meio de congelamento em cada criotubo. Retirar 2 aladas bem cheias do crescimento micobacteriano de cada cultura em meio slido a serem congeladas.. Transferir para o criotubo contendo o meio de congelamento. Girar a ala dentro do meio para se certificar que todas as colnias foram transferidas para o meio. Fechar bem a tampa do criotubo. Acondicionar os criotubos nos poos da caixa de poliestireno, conforme descrito na Figura 2. Registrar no Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas o nmero de identificao do criotubo a ser congelado, no quadrado correspondente ao poo em que o mesmo ser colocado. O Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas apresentado no item 10.5.1 dos anexos deste Captulo.

394 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

Figura 1

Identificao do criotubo para congelamento de isolados bacterianos

N da cepa/isolado:

Figura 2

Identificao da caixa onde so acondicionados os criotubos

B Congelamento Registrar no Formulrio de Registro de Amostras Congeladas, o nmero da caixa, o nmero da amostra, o nmero do poo, o meio de cultura utilizado, o lote do meio de cultura e a data do congelamento de cada cepa a ser congelada, em cada coluna respectivamente. O Formulrio de Registro de Amostras Congeladas apresentado no item 10.5.2 dos anexos deste Captulo. Levar imediatamente as caixas contendo os criotubos com as cepas, devidamente registradas, para o congelador -70C. C Recuperao das cepas congeladas Localizar a cepa que se deseja descongelar no Formulrio de Registro de Amostras Congeladas. O Formulrio de Registro Registro de Amostras Congeladas apresentado no item 10.5.2 dos anexos deste captulo. Retirar o criotubo desejado do congelador e colocar a 36 1C para que descongele rapidamente. Guardar a caixa novamente no congelador o mais rpido possvel. Com o auxlio de uma pipeta Pasteur, retirar um pouco da suspenso bacteriana e inocular em um frasco contendo meio slido de LJ ou OK. Incubar a 36C 1 e acompanhar semanalmente o crescimento do subcultivo.

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Captulo 10 Conservao de Micobactrias

ATENO: 1. Verificar se as caractersticas das colnias so coincidentes com as esperadas para a espcie. 2. Verificar a ausncia de contaminantes realizando um esfregao da colnia conforme descrito no Captulo 8 e corando pelo mtodo de Ziehl-Neelsen conforme descrito no Captulo 6 deste manual. 3. Realizar a Identificao fenotpica ou molecular, conforme descrito no Captulo 8. Interpretao de resultados Cepa vivel: crescimento de colnias de micobactrias nos meios semeados. Cepa invivel: quando no h crescimento nos meios semeados. 10 .2 .2 Conservao de cepas/isolados bacterianos utilizando miangas . Precaues A manipulao das culturas para o congelamento deve ser realizada em CSB. As precaues da conservao de cepas utilizando miangas esto descritas no item 10.2.1 deste Captulo. Materiais Reagentes Meio de Sauton com 10% de glicerol, o preparo do meio de Sauton est descrito no item 10.5.3.2 dos Anexos deste captulo. Meio de Lwenstein-Jensen (LJ). Meio de Lwenstein-Jensen com piruvato de sdio (LJ-piruvato). Meio de Middlebrook 7H9 com OADC. Insumos Criotubo de polipropileno de 2 ml, com tampa de rosca, estril, descartvel. Miangas de vidro perfuradas, sem corantes, com aproximadamente 2 mm de dimetro. Ala descartvel estril. Pipeta Pasteur estril. Suporte para criotubos. Etiquetas auto-adesivas laminadas (redonda e retangular), resistente a congelamento. Caneta indelvel, de retroprojetor escrita fina.

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Preparo do criotubo Mergulhar as miangas em detergente neutro deixando-as imersas por um dia. Enxaguar muito bem com gua corrente. Secar na estufa. Colocar de 6 a 10 miangas em cada criotubo e acondicionar em frascos de vidro. Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 127C. Distribuir, assepticamente, 0,5 ml de meio de Sauton com 10% de glicerol nos criotubos. Identificar os criotubos utilizando uma etiqueta auto-adesiva laminada na lateral e outra na tampa, escrevendo de maneira bem legvel o nmero da cepa (utilizar uma caneta retroprojetor escrita fina permanente). Procedimento A Preparo das cepas a serem conservadas Com uma ala descartvel estril, colocar uma boa massa bacteriana no criotubo e homogeneizar no meio de Sauton. Com a prpria ala descartvel agitar, com cuidado, as miangas para que saia o ar e para que as miangas fiquem totalmente embebidas na suspenso de bacteriana. Fechar bem os criotubos. Deix-los em repouso por, no mnimo, 15 minutos. Retirar todo o meio lquido com o auxlio de uma pipeta Pasteur estril, utilizando uma pipeta para cada cepa/isolado bacteriano. Colocar os criotubos em caixas apropriadas e numeradas. Registrar no Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas a posio das cepas/isolados bacterianos nas caixas. Modelo de formulrio apresentado no item 10.5.1 dos anexos deste Captulo. B Congelamento Registrar o nmero da caixa, o nmero da amostra, o meio de cultura utilizado, o lote do meio de cultura e a data do congelamento de cada cepa a ser congelada, em cada coluna respectivamente no Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas, este apresentado no item 10.5.2 dos anexos deste captulo. Levar imediatamente as caixas contendo os criotubos com as cepas, devidamente registradas, para o congelador -70C.

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Captulo 10 Conservao de Micobactrias

C Recuperao de cepas a partir das miangas Localizar a cepa que se deseja descongelar no Formulrio de Registro Amostras Congeladas. Modelo deste formulrio est descrito no item 10.5.2 dos anexos deste Captulo. Retirar o criotubo desejado do congelador. Guardar a caixa novamente no congelador o mais rpido possvel. Com uma ala descartvel estril, retirar 1 a 2 miangas e colocar dentro do tubo com o meio de LJ ou 7H9. Em meio slido, esfregar as miangas sobre a superfcie, com auxlio da ala. Em meio lquido, colocar a mianga, fechar muito bem o tubo e agitar o tubo. Incubar o tubo a 36C 1 e acompanhar semanalmente o crescimento do repique. Devolver o criotubo sua caixa original, na mesma posio no freezer. Interpretao de resultados Cepa vivel: crescimento de colnias de micobactrias nos meios semeados. Cepa invivel: quando no h crescimento nos meios semeados.

10 .3 Manuteno de Cepas Padro ou Controles de Referncia


Para controlar a acurcia e preciso dos testes e exames laboratoriais preciso utilizar controles de referncia nos laboratrios. Os controles de referncia so utilizados para a verificao dos resultados obtidos de testes especficos, pois suas caractersticas fenotpicas so conhecidas, ou seja, sua identificao e seu perfil de sensibilidade a drogas j foram determinados. Os controles de referncia devem possuir origem confivel, vindo de um LR que realiza testes fenotpicos e moleculares para confirmar sua identificao e perfil de sensibilidade. Para que esses controles de referncia mantenham suas caractersticas fenotpicas, eles devem ser mantidos adequadamente nos laboratrios atravs da realizao de cultura estoque e cultura de trabalho, evitando-se assim um nmero exagerado de subcultivos. O termo cultura estoque6 utilizado para definir o subcultivo das cepas de referncia. Essa cultura deve ser armazenada no laboratrio de microbiologia em temperatura - 20C e deve ser descongelada anualmente. A cultura de trabalho6 o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque que ser mantida no laboratrio (temperatura ambiente) para realizao dos testes dirios ou semanais do CQI.

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Uma passagem6 a transferncia do microrganismo de uma cultura vivel para um novo meio de cultura, obtendo-se uma cultura vivel. A hidratao, ou o descongelamento, de um controle de referncia, proveniente do fornecedor, no considerada uma passagem ou subcultivo. A primeira passagem ser considerada o subcultivo do controle de referncia para a cultura estoque. A transferncia do microrganismo da cultura estoque para a cultura de trabalho ser a segunda passagem como mostra a Figura 3. Os controles de referncia no devem ser submetidos a um grande nmero de subcultivos, o nmero mximo ao qual podem ser submetidas de cinco passagens, a partir do controle de referncia original7. Um nmero indefinido de passagens pode comprometer principalmente a pureza da cultura e as caractersticas fenotpicas de algumas micobactrias. No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referncia devem ser mantidas em temperatura mais baixas, por exemplo, em congeladores/freezers a -70C ou em nitrognio lquido(-196C) em meio contendo o crioprotetor recomendado. Os controles padro ou controles de referncia so adquiridos comercialmente de fornecedores como o American Tissue Culture Collection (ATCC)8. Figura 3 Propagao do Controle de Referncia

Ampola contendo Cepa Referncia ATCC liofilizada

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Captulo 10 Conservao de Micobactrias

10 .3 .1 Hidratao da cepa referncia original liofilizada7 Procedimento Ressuspender o controle liofilizado, conforme as recomendaes do ATCC, adicionando 0,3 a 0,4 ml de meio de cultura lquido ampola que contm o controle de referncia. Homogeneizar bem o contedo do frasco. Semear o homogeneizado em trs frascos contendo meio de cultura slido especfico (LJ e OK descritos no Captulo 7 deste manual ou Middlebrook 7H10). Incubar por 3 a 4 semanas a 36C 1. Fazer um esfregao das colnias que cresceram no meio especfico e corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen, conforme descrito no Captulo 6 deste manual, para verificar a pureza da cultura. 10 .3 .2 Preparo das Culturas Estoque Primeira Passagem Se a cultura estiver sem contaminaes, fazer 5 subcultivos de cada um dos trs frascos de cultura. Identificar os 15 frascos com o nome do microrganismo, nmero do controle de referncia, a data do subcultivo e cultura estoque, 1a passagem. Incubar os 15 frascos de cultura estoque por 3 a 4 semanas a 36C 1. Aps o crescimento, fazer um esfregao das colnias e corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen para verificar a pureza da cultura. 10 .3 .3 Preparo das Culturas de Trabalho Segunda Passagem Se a cultura estiver sem contaminaes, utilizar parte das colnias dos 15 frascos de cultura estoque para fazer 5 subcultivos de cada um dos 15 frascos de culturas. Identificar os 75 frascos com o nome do microrganismo, nmero do controle de referncia, a data do subcultivo e cultura de trabalho, 2a passagem. Incubar os 75 frascos por 3 a 4 semanas a 36C 1. 10 .3 .4 Congelamento das Culturas Estoque Utilizar o restante das colnias dos 15 frascos de culturas estoque para fazer o congelamento. Etiquetar cinco criotubos estreis para cada um dos 15 frascos de cultura estoque, com o nome do microrganismo, nmero do controle de referncia e a data do armazenamento. Transferir duas ou trs alas do crescimento bacteriano para cada um dos setenta e cinco criotubos contendo 1 ml de meio de congelamento. Armazenar os 75 criotubos contendo as culturas estoque em congelador/freezer -70C.

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10 .3 .5 Congelamento das Culturas de Trabalho Aps as 3 ou 4 semanas de incubao, fazer esfregao das culturas de trabalho e corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen para verificar a pureza das cultura de trabalho (75 frascos). Se a cultura estiver sem contaminaes, armazenar o controle de referncia. Etiquetar cinco criotubos estreis para cada um dos 75 frascos de cultura de trabalho, com o nome do microrganismo, nmero do controle de referncia e a data do armazenamento. Transferir duas ou trs alas do crescimento bacteriano para cada um dos criotubos contendo 1 ml de meio de congelamento. Armazenar os 375 criotubos contendo as culturas de trabalho em congelador/ freezer -70C. Sempre que necessrio descongelar um criotubo de cultura de trabalho. Desta cultura poder ser feito apenas trs subcultivos, isto at a 5a passagem. Para o descongelamento de um frasco de cultura de trabalho siga os passos do procedimento Recuperao das Cepas Congeladas, descrito acima.

10 .4 Referncias
1. KIRSOP, B.E.; DOYLE, A. Maintenance of Microorganisms and cultured cells. A manual of laboratory methods. Second Edition. Academic Press Limited, London, 1991, 308p. World Federation for Culture Collection. Guidelines for the establishment and operation of collections of cultures of microorganisms. 2nd edition, June 1999, 24 p. GROVER, A.A.; KIM, H.K.; WIEGESHAUS, E.H.; SMITH, D.W. Host-Parasite Relationships in Experimental Airborne Tuberculosis II. Reproducible Infection by Means of an Inoculum Preserved at -70C. Journal of Bacteriology, vol 94(4) p 832-835, 1973. KIM, T. & KUBICA, G.P. Preservation of Mycobacteria:100% viability of Suspensions Stored at -70C. Applied Microbiology, vol 25(6), p 956-960. 1973. KUBICA, GP; FILHO, P.P.G. & KIM, T. Preservation of Mycobacteria at -70C: Persistence of Key Differential Features. Journal of Clinical Microbiology, vol 6(2), p. 149-153.1977. OPAS/Organizao Panamericana de Sade & MS/Ministrio da Sade. Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade. Controle Interno da Qualidade para Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos. Tecnologia em Servios de Sade. Maro 2006. Disponvel em http://www.anvisa. gov.br/servicosaude/manuais ATCC/American Tissue Culture Collection. ATCC Thechnical Bulletin n6. From ATCC Connection 23(2): 6-7, 2003.

2. 3.

4. 5.

6.

7.

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Captulo 10 Conservao de Micobactrias

8.

ATCC/American Tissue American Tissue Culture Collection. How to revive cultures. Disponvel em http://www.atcc.org/common/technicalInfo/HowToReviveCultures

10 .5 Anexos do captulo
10 .5 .1 Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas
Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas
Nmero da Caixa: Data do Congelamento:

1 10 19 28 37 46 55 64 73

2 11 20 29 38 47 56 65 74

3 12 21 30 39 48 57 66 75

4 13 22 31 40 49 58 67 76

5 14 23 32 41 50 59 68 77

6 15 24 33 42 51 60 69 78

7 16 25 34 43 52 61 70 79

8 17 26 35 44 53 62 71 80

9 18 27 36 45 54 63 72 81

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10 .5 .2 Formulrio de Registro de Amostras Congeladas


Formulrio de Registro de Amostras Congeladas
NMERO DA CAIXA NMERO DA AMOSTRA NMERO DO POO MEIO DE CULTURA UTILIZADO LOTE DO MEIO DE CULTURA DATA DO CONGELAMENTO

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Captulo 10 Conservao de Micobactrias

10 .5 .3 Meios de cultura 10 .5 .3 .1 Meio de Middlebrook 7H9 O meio de Middlebrook 7H9 preparado a partir de base disponvel comercialmente e suplementado com OADC aps a esterilizao da base. Para preparar 1.000 ml de meio dissolver 4,7 gramas do meio base em 800 ml de gua deionozada. Adicionar 100 ml de glicerol. Autoclavar por 15 minutos a 127C. Aguardar at que esfrie e adicionar 100 ml de OADC. Armazenar em geladeira. Colocar um rtulo contendo o nome do meio, n do lote, data do preparo e de validade. Dependendo da quantidade de cepas congeladas na rotina do laboratrio podese fazer este meio em menor volume ou fazer 5 alquotas de 200 ml. Isto evita a contaminao do meio. 10 .5 .3 .2
L-asparagina Sulfato de magnsio Fosfato bipotssico cido ctrico Citrato frrico amoniacal Glicerol gua destilada qsp

Meio de Sauton com 10% de Glicerol


4g 0,5 g 0,5 g 2g 0,05 g 100 ml 1000 ml

Preparo: Pesar os sais separadamente e dissolver os componentes em gua fervente. Acertar o pH para 7,2 com NaOH, filtrar em papel de filtro e autoclavar a 121C/15 min. Armazenar em geladeira. Colocar um rtulo contendo o nome do meio, n do lote, data do preparo e de validade.

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CAPTULO 11

USO E MONITORAMENTO DE EQUIPAMENTOS

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11 .1 Descrio
O uso correto e o monitoramento dos equipamentos presentes nos laboratrios que realizam o diagnstico da Tuberculose e de Micobacterioses so fundamentais para a qualidade dos exames realizados. O mau uso, a constante utilizao ou at mesmo o uso no peridico fazem com que o padro de desempenho seja perdido. Por esse motivo, muito importante o monitoramento dos equipamentos. Isso implica executar um conjunto de procedimentos que registrem o desempenho de um determinado equipamento. O profissional de laboratrio responsvel no s pela tcnica correta de uso, como tambm pelo monitoramento e a conservao de todos os equipamentos que fazem parte de sua rotina laboratorial. So recomendaes gerais para a instalao e uso dos equipamentos de laboratrio1. Realizar o aterramento da rede eltrica. Utilizar uma tomada para cada equipamento. Anotar a voltagem das tomadas e dos cabos de cada equipamento. Treinar os profissionais nos procedimentos de uso (POP Procedimento Operacional Padro) e limpeza dos equipamentos. Seguir as instrues de instalao contidas nos manuais. Manter em local acessvel o manual de cada equipamento. Evitar o uso de capas plsticas na proteo dos equipamentos, quando os mesmos esto fora de uso. Elas favorecem a condensao de umidade, resultando na oxidao dos componentes eltricos/eletrnicos, bem como o crescimento de fungos. As capas confeccionadas em tecidos que no soltam fibras so as indicadas para esse fim. Desligar os equipamentos da rede eltrica antes de qualquer procedimento de limpeza. Desinfetar os equipamentos antes de envi-los manuteno. Fazer contrato de assistncia tcnica sempre que possvel. Registrar todos os equipamentos no programa de manuteno preventiva do laboratrio. Conforme o mtodo de diagnstico, os equipamentos necessrios esto apresentados no Quadro 1.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Quadro 1

Equipamentos utilizados conforme mtodos de diagnstico de Tuberculose e Micobacterioses


BACILOSCOPIA Balana Microscpio CULTURA, IDENTIFICAO FENOTPICA E CONSERVAO DE CEPAS Capela de Exausto

Autoclave Destilador de gua

Autoclave Cabine de Segurana Biolgica Centrfuga Estufas bacteriolgicas Medidor de pH

Agitador mecnico Capela de Exausto Destilador de gua Geladeira e Freezer

Balana Coagulador de meio de cultura Dispensador de Meio de cultura Microscpio

IDENTIFICAO MOLECULAR Autoclave Banho-Maria Cuba e Fonte de Eletroforese Medidor de pH Termociclador INSTRUMENTO AUXILIAR DE MONITORAMENTO Termmetros Agitador mecnico Cabine de Segurana Biolgica Destilador de gua Micro-Centrifuga Balana Capela de Exausto Geladeira e Freezer Micropipetadores

11 .2 Equipamentos
11 .2 .1 Agitador mecnico Usado para promover a agitao e homogeneizao de solues em tubos (ensaio ou centrfuga) ou microtubos. Condutas Verificar sempre a presena de fissuras nos tubos de ensaio de vidro antes de efetuar a agitao. Verificar sempre as condies da borracha do receptculo de tubo. Uso Selecionar a chave de agitao contnua ou agitao peridica. No uso da contnua, regular a velocidade desejada girando o potencimetro e colocar o tubo ou frasco para agitao. Na peridica, o aparelho permanece desligado e

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para coloc-lo em funcionamento, basta pressionar o receptculo de borracha com o prprio tubo a ser agitado. Monitoramento Enviar para assistncia tcnica credenciada, anualmente, para realizao para aferio e ajuste. 11 .2 .2 Autoclave A autoclave um equipamento utilizado para esterilizao de materiais e, no caso de ser uma autoclave vertical, no deve estar dentro do laboratrio, mas deve estar o mais prximo possvel do mesmo2. O ideal para o laboratrio de tuberculose a instalao de uma autoclave horizontal (com duas portas), para que o material utilizado na rea contaminada seja colocado diretamente na autoclave e, depois de autoclavado, seja retirado pela outra porta para uma rea no contaminada. Para que o processo de esterilizao seja eficiente necessrio que todo ar residual seja eliminado do interior da autoclave e que o vapor mido penetre em todo material a ser autoclavado3. Por isso, importante que no seja colocado material em excesso. Os microrganismos patognicos so mortos mais rapidamente pelo calor mido (o vapor saturado desnatura as suas protenas) do que pelo calor seco3. A temperatura mnima deve ser de 121C e mantida por 15-20 minutos, mas alguns equipamentos automatizados operam a 134C por 3-5 minutos2. Condutas Utilizar pelo menos duas autoclaves, uma para esterilizar reagentes e meios de cultura e outra para o lixo infeccioso, antes do mesmo ser encaminhado para a coleta de lixo hospitalar/laboratorial2 ou para o local de reciclagem no caso de vidros. ATENO: Verificar periodicamente as borrachas de vedao e substitu-las, se necessrio, para assegurar a vedao hermtica e evitar o escape do vapor de gua . Instruir todos os usurios para o correto uso da autoclave. Manter sempre limpos o cesto e a cmara de autoclavao; lavar com esponja de ao e sabo, e retirar os resduos com bastante gua1. Trocar a gua da cmara de autoclavao pelo menos uma vez por semana.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Uso Verificar se a autoclave est desligada, com o manmetro zerado e sem indcio de produo de vapores. Abrir a tampa e verificar o nvel de gua. Se necessrio acrescentar gua at o nvel de trabalho, ou seja, a resistncia deve estar submersa. Distribuir os materiais no cesto de autoclavao, de forma que a circulao de vapor no seja prejudicada. Fechar a tampa. Encaixar e apertar as garras de fechamento firmemente. Ligar a chave do equipamento no mximo. Deixar a vlvula de exausto de vapor aberta. Aguardar a sada de vapor mido pela vlvula de exausto. Manter a vlvula de exausto aberta por pelo menos 5 minutos aps o incio da fervura da gua (garante a eliminao total do ar residual). Fechar a vlvula de exausto de vapor. Aguardar a autoclave atingir 121C. Mudar a chave para mdio ou mnimo para que seja mantida a temperatura de autoclavao. Marcar o tempo. Ao trmino do tempo, desligar a chave do equipamento e aguardar o seu esfriamento ou a queda total da presso interna. Abrir a vlvula de exausto para garantir a sada de toda presso interna. Desrosquear as garras de fechamento, abrir a tampa e retirar o material autoclavado. Deixar esfriar e fechar a tampa. Monitoramento A eficincia do processo de autoclavao pode ser avaliada por controle biolgico. Nas esterilizaes por vapor mido deve ser utilizada qualquer apresentao comercial de Bacillus stearothermophilus1. Essa submetida autoclavao e posteriormente seu contedo semeado em meio de cultura apropriado para verificao de desenvolvimento. Caso haja desenvolvimento do bacilo, deve-se solicitar calibrao por assistncia tcnica credenciada. Esse controle biolgico deve ser realizado pelo menos uma vez no ms, preferencialmente quando o equipamento estiver com a sua carga mxima de sua capacidade. O ajuste da autoclave deve ser realizado por assistncia tcnica credenciada pelo menos uma vez ao ano. 11 .2 .3 Balanas Podem ser mecnicas ou eletrnicas1 e so usadas para pesar as substncias que compem os reagentes e solues. Para quantidade mxima de 200 g deve ser utilizada balana analtica, com intervalo de leitura de 0,0001g. Acima dessa quantidade, devese utilizar balana semi-analtica, com intervalo de leitura de 0,1g, 0,01g ou 0,001g.

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As balanas devem ser ajustadas por uma empresa credenciada no local onde est ou ser instalada. Para instalao ou uso devem ser observados os seguintes critrios de: Condutas Instalar em bancadas de alvenaria com tampo de concreto, mrmore ou granito, longe de equipamentos que causem vibraes ou correntes de ar e no encostar em paredes1. Nivelar a balana antes do uso e da aferio. Limpar delicadamente a balana aps o uso, com auxlio de um pincel de cerdas macias. No fazer pesagens diretamente sobre o prato da balana. Usar papel ou recipientes prprios para pesagem4. Estes, no podem reagir com a substncia a ser pesada. Determinadas substncias requerem o uso de EPI para serem manipuladas durante a pesagem. Uso da balana mecnica1 Tarar (zerar) a balana. Pesar o papel ou recipiente de pesagem. Anotar o peso. Somar o peso do papel ao peso da substncia a ser pesada. O valor encontrado o total a ser pesado. Travar a balana, marcar ou adicionar o peso correspondente ao valor final. Destravar a balana e adicionar a substncia at que a escala da balana atinja o valor total determinado. Uso da balana eletrnica1 Ligar a balana e aguardar pelo menos 30 minutos para estabiliz-la. Colocar o papel ou recipiente de pesagem no prato da balana. Tarar a balana, descontando o peso do papel ou recipiente de pesagem. Adicionar a substncia a ser pesada at alcanar o valor desejado. Monitoramento Deve ser realizado pela pesagem de um peso padro objeto de aferio, com uma carga determinada e conhecida. As balanas que indicarem peso diferente ao do peso padro devem ser encaminhadas para ajuste em uma assistncia tcnica credenciada.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

11 .2 .4 Banho-maria Os banhos-maria so equipamentos utilizados em alguns testes bioqumicos de identificao de micobactrias. So projetados para trabalhar na temperatura requerida por determinada tcnica e possuem tampa para evitar a perda de calor e a evaporao excessiva da gua. Essas tampas devem ser inclinadas para que a gua da condensao no goteje sobre o que est sendo incubado3. Condutas No uso primrio ou aps limpeza encher o reservatrio com gua destilada. Desligar o banho-maria da tomada sempre que realizar a limpeza e nunca faz-la diretamente sob a gua corrente. Mensalmente ou sempre que houver depsitos ou incrustaes, lavar as partes metlicas com esponja de ao e sabo neutro enxaguando com bastante gua1. Ter cuidado com toques involuntrios durante a limpeza da bancada ou uso do prprio equipamento para no alterar a posio do termostato1. Uso Verificar se o nvel de gua est cobrindo a resistncia e o sensor do termmetro. Caso seja necessrio acrescentar gua destilada ou deionizada at o nvel de trabalho. Ajustar o termostato para a temperatura desejada, sempre observando o limite de temperatura de trabalho do equipamento. Utilizar o equipamento somente quando a temperatura estiver estabilizada. Manter sempre o banho-maria tampado durante o uso para evitar variao da temperatura e evaporao da gua. Monitoramento Durante o uso, verificar a temperatura antes e durante o processo de incubao, utilizando um termmetro de leitura pontual ou instantnea. Aps pernoite ligado e sem uso, medir a temperatura antes do processo de incubao e anotar o resultado no Formulrio de Monitoramento Banho-maria. O Formulrio de Monitoramento Banho-maria apresentado no item 11.4.1 nos anexos deste Captulo. 11 .2 .5 Cabine de Segurana Biolgica (CSB) o equipamento mais importante em um laboratrio que realiza o isolamento e a identificao do M. tuberculosis. As CSB foram projetadas para evitar a disperso de aerossis de materiais perigosos para o ambiente de trabalho. A CSB Classe II, tipos B2 ou B3 ideal para o uso em laboratrios de microbiologia - micobactrias, pois

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oferece proteo ao tcnico, ao ambiente e ao produto manipulado3. Nessa, o ar filtrado da rea de trabalho da CSB forma uma cortina ou barreira de ar na janela frontal, que impede a entrada de partculas contaminantes do ambiente do laboratrio e a disperso de aerossis de dentro da CBS para o ambiente do laboratrio2. Condutas Instalar a CSB em um local distante da entrada principal do laboratrio, j que o trnsito de pessoas prximas ao equipamento pode causar interferncia na cortina de ar da janela frontal. O mesmo pode ocorrer quando a CSB est prxima s janelas abertas ou equipamentos que podem proporcionar movimentao de ar3, exemplo: centrfugas. No utilizar bico de Bunsen no interior da CSB devido ao risco de interferncia no fluxo de ar interno e danos ao filtro HEPA. Uso Desinfetar as paredes internas e a superfcie da rea de trabalho com gaze, papeltoalha ou pano umedecido com Soluo de lcool a 70%. Cobrir a bancada com papel de filtro ou outro papel absorvente cuidando para no obstruir os orifcios do fluxo de ar. Colocar somente o material necessrio no interior da CSB. O excesso de material ou equipamento no interior da CSB pode causar interferncia no fluxo de ar ou contaminao cruzada. Ligar a CSB e a lmpada germicida UV pelo menos 20 minutos antes de iniciar seu uso. Desligar a lmpada UV e ligar a lmpada fluorescente. Introduzir as mos e antebraos na CSB, aguardar pelo menos 60 segundos e dar incio s manipulaes. Evitar a manipulao dos materiais com gestos bruscos para no alterar o fluxo de ar. Manter saco plstico autoclavvel no interior da CSB para o descarte de material contaminado. Ao trmino do trabalho, adicionar pequena quantidade de gua (para assegurar a gerao de calor mido durante a autoclavao) e fech-lo hermeticamente. Esperar 5 minutos aps o trmino das manipulaes para desligar a CSB e proceder aos passos seguintes. Abrir a janela de vidro frontal. Retirar todo o material. Desinfetar as paredes internas e a superfcie da rea de trabalho com gaze, papel-toalha ou pano umedecido com Soluo de lcool a 70%. Ligar a lmpada UV por 30 minutos.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Desligar a lmpada UV e registrar o uso da CSB. O Formulrio de Registro de Uso Cabine de Segurana Biolgica (CSB) apresentado no item 11.4.2 nos anexos deste Captulo. Monitoramento Deve ser executado pelo fabricante ou assistncia tcnica credenciada. Inclui testes de velocidade do ar, perda de presso dos filtros HEPA, contagem de partculas e eficincia dos filtros. A troca do filtro deve ser realizada quando houver o acionamento do alarme de saturao ou aps 18-24 meses de uso. Antes de qualquer procedimento da assistncia tcnica, realizar a desinfeco2. O procedimento consta em ferver formalina e gua para liberar formaldedo. A gua necessria para manter a umidade relativa em torno de 70%, na qual o gs tem o mximo efeito antimicrobiano. Proceder conforme a seguir: Usar EPI conforme descrito no Captulo 3. Colocar uma placa aquecedora no interior da CSB. Preparar em um copo de Becker 25 ml de formalina e 25 ml de gua. Coloclo sobre a placa aquecedora e ligar a mesma. Lacrar a abertura frontal com plstico ou outro material impermevel usando fita auto-adesiva para selar. Ligar a CSB por apenas 15 segundos quando metade da mistura evaporar para que o formaldedo seja aspirado e alcance o filtro HEPA. Desligar a placa aquecedora quando toda a mistura tiver evaporado e ligar a CSB novamente por 15 segundos. Esperar no mnimo 6 horas, descolar parcialmente o plstico que cobre a abertura frontal e ligar a CSB para exaurir o formaldedo. Remover totalmente a cobertura da janela frontal aps 5 minutos, mantendo-a ligada por mais 30 minutos para exaurir o formaldedo restante. ATENO: Esse procedimento seguro para as CSB que possuem exausto para o ambiente externo . Naquelas em que o ar recirculado para o prprio ambiente de trabalho, ser necessrio isolar/ selar a sala onde a CSB se encontra . 11 .2 .6 Capela de Exausto (CE) Usado para a manipulao segura de reagentes qumicos volteis protegendo o tcnico de vapores txicos. importante que a CE tenha uma exausto suficiente para a gerao de presso negativa em seu interior, no permitindo o escape de vapores txicos para o ambiente do laboratrio.

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Conduta Planejar e instalar a CE em local amplo e arejado. Evitar o armazenamento de produtos qumicos na CE, mesmo daqueles que so utilizados mais frequentemente. Uso Colocar somente o material necessrio e produtos qumicos no interior da CE. O excesso de material ou produtos em seu interior pode aumentar as chances de acidentes. Ligar a CE e a iluminao interna. Verificar a presena de presso negativa. Fechar a janela frontal deixando espao apenas para a introduo das mos e antebraos. Evitar a manipulao dos produtos qumicos com gestos bruscos. Manter a CE ligada por 5 minutos aps o trmino das manipulaes para que o equipamento remova todo resduo de vapor txico que porventura ainda esteja em suspenso. Abrir a janela de vidro frontal. Retirar todos os materiais e produtos qumicos. Desligar a CE e registrar o uso. O Formulrio de Registro de Uso Cabine de Exausto (CE) para registro apresentado no item 11.4.3 nos anexos deste Captulo). Limpar as paredes internas e a superfcie da rea de trabalho com gaze, papeltoalha ou pano umedecido com gua. Monitoramento Contatar o fabricante ou assistncia tcnica credenciada caso haja a perda da capacidade de exausto ou qualquer outra anormalidade observada em seu funcionamento. 11 .2 .7 Centrfuga e microcentrfuga So utilizadas principalmente para concentrar os bacilos ou seus ADN. recomendado que as centrfugas tenham rotor de ngulo fixo, o qual permite a centrifugao de tubos ou microtubos com uma pequena diferena de peso sem causar vibrao excessiva e a ruptura dos mesmos3. 11 .2 .7 .1 Centrfuga Para a cultura, a centrfuga deve, preferencialmente, ser refrigerada e capaz de atingir pelo menos 3000 x g, caso contrrio, muitas micobactrias permanecero em suspenso e sero descartadas junto com o sobrenadante3. imprescindvel que as centrfugas tenham caapas seladas, que evita a disperso de aerossol caso haja a que-

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

bra de algum tubo durante a centrifugao. Os equipamentos que possuem rotor de ngulo mvel requerem um balanceamento mais preciso dos tubos. ATENO: g a fora centrfuga relativa (FCR), o que diferente de rotaes por minuto (rpm) . Em alguns equipamentos pode-se selecionar diretamente a FCR desejada, de modo que a centrifugao tenha o mximo de rendimento. Entretanto, a maioria das centrfugas indica apenas as rpm que o equipamento alcana. Para calcular a rpm correspondente a 3000 x g utilizar a seguinte frmula:

rpm = 105 x

FCR 1,118xRmax (cm )

onde Rmax = o raio da centrfuga correspondendo a medida da distncia (em cm), em linha reta e perpendicular, do centro do rotor at o fundo do recipiente onde colocado o tubo de centrfuga. Por exemplo: se a centrfuga possui um raio (Rmax) de 15 cm e fornece a velocidade apenas em rpm e voc deseja saber quantas rpm so necessrias para obter uma FCR de 3000 x g, substitua na frmula os valores correspondentes:

rpm =

100.000 x 3000 100.000 x 3000 rpm = 1,118 x 15 16,77

rpm = 100.000 x178,89 rpm = 17.889.000 rpm = 4.229

ATENO: Em centrfugas com rotor de ngulo mvel, a medida do Rmax realizada com a centrfuga parada e levantando-se o recipiente de tubos at a posio horizontal . Condutas Lubrificar as partes mveis da centrfuga de acordo com o manual de instrues. Lavar as caapas das centrfugas semanalmente com gua e sabo, quando for possvel separ-las do rotor.

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Desinfetar, mensalmente, a parte interna da centrfuga e o rotor com um pano umedecido com Soluo de lcool a 70%. Em alguns modelos de centrfuga, o equipamento indica automaticamente o momento de se realizar a desinfeco do rotor e das caapas que podem ser, inclusive, autoclavados. Uso Balancear, dentro da CSB, os tubos a serem centrifugados, ou seja, deix-los com o mesmo volume. Se possvel, utilizar uma balana para tarar tubos. Encaixar, dentro da CSB, os tubos nas caapas, de modo que aqueles que possuem o mesmo volume fiquem em posio diametralmente oposta. Selar as caapas com as tampas anti-aerossol. Acondicionar as caapas seladas no rotor, fechar a tampa da centrfuga. Selecionar a FCR ou as rpm desejadas, o tempo de centrifugao e a temperatura5 aconselhada de 4 a 7C. Esperar a parada completa da centrfuga para abrir a sua tampa. Retirar as caapas e lev-las para o interior da CSB. Abrir as caapas, retirar os tubos de centrfuga e coloc-los em suporte adequado. Monitoramento: Pelo menos uma vez ao ano ou aps qualquer servio de manuteno, enviar para assistncia tcnica credenciada. Nas centrfugas no refrigeradas deve ser feita a aferio da rotao, do temporizador e do tacmetro (se houver). Nas centrfugas refrigeradas, alm dos itens citados deve ser feita tambm a aferio do termmetro. 11 .2 .7 .2 Microcentrfuga utilizada para os testes moleculares de identificao. Pode ou no ser refrigerada, porm deve ter um rotor de ngulo fixo devido elevada fora centrfuga relativa (FCR), que pode alcanar acima de 12000 x g. Como na centrfuga convencional, em alguns modelos pode-se selecionar diretamente a FCR desejada e nas que indicam apenas rpm a mesma pode ser calculada de acordo com a frmula apresentada no item 11.2.7.1 Condutas Lubrificar as partes mveis da microcentrfuga de acordo com o manual de instrues. Desinfetar, mensalmente, a parte interna do equipamento e o rotor com um pano umedecido com Soluo de lcool a 70%. A preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de lcool 70% esto descritos no captulo

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

3. Em alguns modelos de microcentrfuga, h indicao automtica para a realizao da desinfeco do rotor que pode ser, inclusive, autoclavado. Deixar sempre a tampa do rotor rosqueada ou travada. Isso evitar danos ao rotor se o mesmo for acionado acidentalmente. Uso Ligar a microcentrfuga. Se for refrigerada, lig-la pelo menos 15 minutos antes da primeira centrifugao, selecionando a temperatura desejada. Balancear os microtubos a serem centrifugados, ou seja, deix-los com o mesmo volume. Acondicionar os microtubos no rotor, de modo que aqueles que possuem o mesmo volume fiquem em posio diametralmente oposta. Tampar o rotor. Fechar a tampa da microcentrfuga. Selecionar a FCR e o tempo de centrifugao. Acionar o rotor. Esperar a parada completa da microcentrfuga para abrir a tampa e retirar os microtubos. Fechar a tampa da microcentrfuga e deslig-la. Se for refrigerada, deixar a tampa aberta at que ocorra o derretimento do gelo e a evaporao da gua acumulada na cmara interna. Monitoramento Pelo menos uma vez ao ano ou aps qualquer servio de manuteno, enviar para assistncia tcnica credenciada, para ser feita a aferio da rotao, do temporizador, do termmetro e do tacmetro (se houver). 11 .2 .8 Coagulador de meio de cultura Utilizado na preparao de meios de cultura base de ovo, deve alcanar e manter um calor mido constante de 80-85C por 45 minutos. As prateleiras para acomodao dos tubos devem permitir a livre circulao de calor, bem como a inclinao dos tubos no ngulo correto (entre 5 e 10). Conduta Instalar o coagulador em local prximo rede hidrulica e de esgoto, que servir para o abastecimento da caldeira de vapor e drenagem da mesma, respectivamente. Acertar a inclinao correta das prateleiras ou racks com auxlio de um tubo de cultura contendo gua no mesmo volume de meio de cultivo, antes de ligar o coagulador.

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Retirar todas as prateleiras ou racks onde sero acomodados os tubos antes de ligar o equipamento. Uso Certificar que todos os interruptores do coagulador estejam desligados. Verificar o nvel de gua da caldeira de vapor. Se necessrio acrescente gua at o nvel de trabalho. Ligar o interruptor Geral do equipamento. Os mostradores de Temperatura e Set Point entraro em funcionamento. Ligar o interruptor Circulao de Ar. Se o mesmo estiver desligado no haver aquecimento. Ligar o interruptor Temperatura Interna. Ligar o interruptor Temperatura Vapor. Aguarde a estabilizao das temperaturas para colocao das prateleiras ou racks contendo os tubos com meio de cultura j distribudo. Monitoramento Buscar a presena de vazamentos tanto na alimentao de gua quanto na drenagem da caldeira de vapor. Verificar a estabilidade das temperaturas interna e do vapor. Solicitar assistncia tcnica credenciada para aferio dos termostatos e seus sensores sempre que necessrio ou anualmente. Realizar o Controle de Qualidade Interno e Externo dos meios produzidos conforme descrito no captulo 7. 11 .2 .9 Cuba e fonte de eletroforese A cuba e a fonte de eletroforese so utilizadas para a separao eletrofortica de cidos nuclicos em um gel de agarose submerso. Por questes de segurana, a indicada aquela em que a conexo dos fios da fonte a cuba de eletroforese s possvel se a mesma estiver com a tampa fechada. Dessa forma, quando a fonte estiver ligada, o operador no corre o risco de entrar em contato com o tampo de corrida da cuba e sofrer um choque eltrico. Os conectores da cuba devem ser compatveis com a fonte e vice-versa, porm, caso no sejam, podem ser utilizados adaptadores para os diferentes conectores. Por serem utilizadas de forma acoplada, as condutas, uso e monitoramento so descritos conjuntamente. Condutas Utilizar uma tomada aterrada para cada equipamento.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Instalar e sempre manter a cuba e a fonte de eletroforese em rea de ps-PCR para evitar a disperso de produtos amplificados. Lavar todos os componentes da cuba com detergente neutro e uma esponja (de espuma) antes de iniciar e ao trmino da eletroforese. Enxaguar com gua destilada e deixar secar a temperatura ambiente. Nunca usar esponja de ao, acetona, steres, lcool (acima de 30%) ou cidos (acima de 25%) para limpeza da cuba, para no riscar ou tornar o acrlico opaco. Nunca autoclavar ou aquecer acima de 50C qualquer componente da cuba. Ajustar o nivelamento da cuba. Uso Posicionar a bandeja com a agarose solidificada na cuba de eletroforese. O volume de gel de agarose e a concentrao so dependentes da metodologia utilizada. Aplicar as amostras. Fechar a tampa da cuba, conectar os fios da mesma fonte de eletroforese e programar os parmetros da corrida eletrofortica. Certificar se as conexes dos plos entre a cuba e a fonte de eletroforese esto corretas antes de ligar a fonte. A inverso dos plos far com que as amostras aplicadas migrem para o plo incorreto. Ligar o interruptor geral da fonte da eletroforese. Ligar o interruptor da corrida eletrofortica e observar nos minutos iniciais da eletroforese se a migrao das amostras de ADN est na direo do plo correto. Deixar ocorrer a migrao das amostras, conforme tempo previsto na tcnica. Desligar o interruptor da eletroforese aps tempo previsto. Desligar o interruptor geral da fonte e desconectar os fios entre a fonte e a cuba. Abrir a tampa e retirar o suporte com a agarose. Monitoramento Procurar a presena de fissuras no acrlico, incrustaes nos plugues (eletrodos) ou rompimento do fio de platina antes de cada uso ou se a eletroforese no proceder de modo esperado. Encaminhar a cuba e/ou a fonte de eletroforese para assistncia tcnica se esta necessitar de substituies de componentes como plugues, fios de platina ou de conteno de vazamentos. 11 .2 .10 Destilador de gua No destilador, a gua sofre uma ebulio, vaporizao e condensao que, teoricamente, torna-a isenta de qualquer impureza. O equipamento deve possuir desligamento automtico na falta de fornecimento de gua.

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Condutas Instalar o destilador em local prximo rede hidrulica e eltrica. Mensalmente ou sempre que houver depsitos ou incrustaes, lavar com esponja de ao, gua e sabo neutro o recipiente de evaporao e a resistncia. Enxaguar com bastante gua para retirar o resduo de sabo. Uso Confirmar se h fornecimento de gua e ligar a torneira que abastece de gua o destilador. Aguardar a sada de gua pelo dreno de resfriamento do condensador. Ligar a chave eltrica geral do equipamento e aguardar a sada da gua destilada pelo respectivo dreno. Acondicionar a gua destilada em recipiente apropriado. Desligar a chave eltrica geral do destilador ao trmino do processo. Deixar a torneira que abastece o destilador aberta at o resfriamento do condensador. Desligar o fornecimento de gua. Monitoramento A cada uso, verificar a presena de obstruo ou vazamentos no circuito de abastecimento de gua. Verificar sempre as condies das instalaes eltricas. 11 .2 .11 Estufas bacteriolgicas aconselhvel que tenha o maior tamanho possvel j que os modelos pequenos sofrem maior variao de temperatura quando a porta aberta. Quando a temperatura de incubao menor que a temperatura ambiente, por exemplo, na incubao de provas bioqumicas, deve ser utilizada uma estufa bacteriolgica com sistema refrigerado incluso2. Conduta Evitar sobrecarregar o interior da estufa para assegurar a circulao de ar e a manuteno da temperatura interna. Abrir a porta somente o necessrio. Instalar as estufas em locais bem ventilados, distantes de fonte de calor e de gua. Uso Organizar todo material a ser incubado para abrir a estufa uma nica vez.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Distribuir os materiais nos diversos compartimentos e fechar corretamente a porta. Verificar se a porta ficou devidamente fechada. Realizar os mesmos passos ao retirar o material incubado. Monitoramento1 Deve ser realizado diariamente, ao incio da rotina do laboratrio, com duas leituras de temperatura: uma utilizando um termmetro de leitura pontual e outra com o termmetro de mxima e mnima. Realizar outra leitura no horrio de maior uso do equipamento, com termmetro de leitura pontual. Registrar os dados de cada leitura no Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica. O Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica apresentado no item 11.4.4 nos anexos deste Captulo. 11 .2 .12 Freezer e refrigerador O freezer vertical proporciona um melhor aproveitamento do espao do laboratrio do que o horizontal e a sua temperatura ideal de -20C. A temperatura ideal de uso do refrigerador de 4C, com variao aceitvel de 2 a 8C. ATENO: Os equipamentos que no formam gelo (frost free) provocam evaporao excessiva de lquidos em frascos no fechados hermeticamente . Condutas Instalar o refrigerador e freezer em locais bem ventilados ou distantes de fonte de calor, deixando a distncia mnima de 10 cm entre cada equipamento ou da parede. Uso Evitar o acondicionamento de excesso de material e no forrar as prateleiras para no interferir na refrigerao interna1. Organizar todo material a ser armazenado para abrir a porta uma nica vez. Monitoramento Fazer uma verificao peridica das borrachas de vedao. Descongelar mensalmente. Inicialmente transferir todo contedo para outra geladeira ou freezer. Desligar e aps o degelo desinfetar internamente com um pano umedecido com Soluo de lcool a 70% e depois com gua e detergente

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neutro. A preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de lcool 70% esto descritos no Captulo 3. Realizar diariamente controle de temperatura1 sendo. Ao incio da rotina do laboratrio, com duas leituras de temperatura: uma utilizando um termmetro de leitura pontual (bulbo de mercrio, lcool ou eletrnico) e outra com o termmetro de mxima e mnima, exclusivo para cada equipamento. No horrio de maior uso do equipamento com termmetro de leitura pontual. Registrar os dados de cada leitura no Formulrio de Monitoramento Refrigerador e Freezer. O Formulrio de Monitoramento Refrigerador e Freezer apresentado no item 11.4.5 nos anexos deste Captulo. ATENO: No uso de termmetro eletrnico, o mostrador deve ser fixado externamente, j que a simples abertura da porta pode alterar a leitura da temperatura . 11 .2 .13 Medidor de pH Equipamento utilizado para determinao de pH, atravs do mtodo eletromagntico, com compensao automtica de temperatura. Conduta Antes de ligar, verificar se o equipamento e a rede eltrica esto na mesma voltagem. Ao trmino de cada medio ou calibrao manter a chave seletora em (Standby), repouso. Uso Para ligar o aparelho acionar a chave geral liga-desliga. Manter o aparelho ligado por, no mnimo, 30 minutos, para aquecer e estabilizar os componentes eletrnicos. Conectar bem o eletrodo e o sensor de temperatura ao aparelho. Lavar bem o eletrodo com gua destilada, secar com papel absorvente macio sem esfregar a membrana. Mergulhar o eletrodo e o sensor de temperatura na soluo tampo de valor pH 6.86 25C e ajustar com o potencimetro Potencimetro de ajuste do tampo pH 7 e do potencial mV relativo Calibrao. Medir a temperatura da soluo, ver na tabela pH/t inscrita no frasco da soluo tampo que acompanha o aparelho e ajustar o valor exato do pH de acordo com a temperatura.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Retirar o eletrodo e o sensor afixados no suporte da soluo. Enxaguar ambos com gua destilada, secar com papel absorvente e macio. Para medir na faixa cida, mergulhar o eletrodo e o sensor de temperatura na soluo tampo pH 4.01, ajustar com o potencimetro Potencimetro de ajuste do (SLOPE), declive, ou do tampo diferente de pH 7, para exatamente o valor da soluo tampo de acordo com a temperatura da soluo, da mesma forma de como foi descrito para ajustar tampo pH 7. Para as medies de rotina na faixa alcalina realizar o mesmo procedimento, porm, com a soluo tampo de valor pH 9,18 ou pH 10,01. Ao terminar esses procedimentos o pHmetro est calibrado e pronto para ser usado nas medies de rotina. Retirar o eletrodo e o sensor da ltima soluo tampo usada. Lavar com gua destilada, secar com papel absorvente macio para no arranhar a membrana de vidro gelatinoso, antes de introduzi-los na amostra a ser medida. Mergulhar o eletrodo e o sensor na amostra. O valor que aparecer no visor o pH da amostra. Para desligar, lavar o eletrodo com gua destilada e seguir as instrues para manuteno e conservao dos eletrodos descritas abaixo. Desligar a chave geral liga-desliga e a tomada do sensor de temperatura. Monitoramento Depois de usar o eletrodo, lavar e colocar a proteo da membrana com soluo de repouso (soluo de KCl 3M), para manter este mido. Quando o eletrodo de referncia no estiver em uso, deve ficar imerso na soluo de repouso. Caso o eletrodo secar ou ficar parado por um longo perodo, deixar imerso em soluo repouso por 6 horas. A umidade e agentes corrosivos danificam o aparelho, caso o pHmetro apresentar leituras instveis, limpar o (Plug), conector, do eletrodo e a tomada do aparelho, com lcool etlico ou acetona. ATENO: Quando o pH da gua destilada for medido e o aparelho indicar o valor na faixa cida e essa leitura ficar instvel para fazer esse tipo de medio, necessrio utilizar um par combinado de eletrodo especial que tenha a juno tipo luva e devero ser adicionadas, na gua, algumas gotas de KCl para aumentar a condutividade . Aguardar 24 horas para fazer a medio .

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Preparao da soluo KCl 3M: pesar 223,68g de KCl, dissolver em 1 litro de gua destilada e deionizada. Armazenar em frasco de polietileno de 2 a 8C. Estabilidade: 6 meses. 11 .2 .14 Micropipetadores So instrumentos utilizados para medir e transferir lquidos em microvolumes utilizando conjuntamente ponteiras. As micropipetas podem ser de volume fixo ou varivel, monocanal ou multicanal dependendo da metodologia a ser empregada. Conduta1 Utilizar preferencialmente ponteiras com barreira ou filtro anti-aerossol. Evitar a reutilizao de ponteiras, j que os procedimentos de lavagem no garantem a remoo completa dos resduos. Manter as micropipetas sempre na posio vertical. Limpar externamente a micropipeta com Soluo de lcool a 70%, antes e aps o uso. A preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de lcool a 70% esto descritos no Captulo 3. Uso

Selecionar a micropipeta e o volume de acordo com as solues a serem pipetadas. Acoplar a ponteira micropipeta. Pressionar o mbolo da micropipeta at o primeiro estgio. Introduzir a ponteira abaixo da superfcie do lquido, aproximadamente 5 mm. Soltar o mbolo gradativamente, aspirando ao lquido. Dispensar o lquido, pressionando o mbolo at o segundo estgio. Soltar o mbolo lentamente at a sua posio original. Descartar as ponteiras em recipiente contendo hipoclorito de sdio 2% ou em saco plstico autoclavvel.

Monitoramento Verificar a presena de algum componente quebrado, dificuldade no acionamento do mbolo ou vazamento no sistema. Realizar o teste hidrosttico1 para detectar vazamento no sistema. Proceder conforme descrito a seguir: fixar a ponteira na micropipeta. aspirar gua destilada at o primeiro estgio. tampar a extremidade inferior da ponteira com um dedo. pressionar o mbolo at o segundo estgio, permanecendo assim por 20 segundos em micropipetas de at 1 ml. Para micropipetas de mais de 1 ml:

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

pressionar o mbolo at o ponto mdio entre os dois estgios da micropipeta. liberar o mbolo lentamente at a posio original. retirar o dedo da extremidade da ponteira e verificar se h deslocamento da gua. Se houver, a micropipeta deve ser encaminhada para manuteno e ajuste. os micropipetadores devem fazer parte do programa de manuteno preventiva sistemtica do laboratrio e sua preciso deve ser verificada peridicamente pelo mtodo gravimtrico. 11 .2 .15 Microscpio O microscpio deve ser binocular, possuir um bom conjunto ptico, ser ergonmico e possuir objetiva de imerso planocromtica. Condutas Instalar longe de equipamentos que causem vibraes, de reagentes qumicos ou da rede hidrulica, em sala limpa, bem ventilada ou que tenha ar-condicionado para evitar a proliferao de fungos no sistema ptico1, 4. Evitar que o microscpio fique sem as objetivas ou oculares para impedir a entrada de poeira. Coibir a desmontagem do microscpio para no desalinhar o conjunto ptico. Carregar sempre com as duas mos, uma segurando firmemente o brao do microscpio e a outra a base4. Uso Impedir o uso de papel-toalha comum ou gaze para evitar riscos nas lentes. Nunca use detergente, xilol, etanol 96% ou outro solvente para limpeza das lentes. Esses produtos podem retirar a cola que fixa as lentes aos corpos das objetivas e oculares1. Verificar os procedimentos de uso do microscpio no Captulo 6, deste manual. Monitoramento Efetuar mensalmente a limpeza geral do microscpio1, executando os seguintes passos. Retirar a poeira agregada aos mecanismos de movimentao da platina, do condensador e do ajuste de foco com um pincel de cerdas macias. Realizar a limpeza geral com um pano limpo umedecido com Soluo de lcool a 70%, com exceo do conjunto ptico (objetivas e oculares). A

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preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de lcool a 70% esto descritos no Captulo 3. Executar a limpeza das objetivas e oculares com papel absorvente macio umedecido em uma soluo contendo 60% de etanol e 40% de ter etlico. A limpeza da objetiva de imerso dever ser feita com um papel absorvente macio para retirada do excesso de leo, seguida da aplicao da soluo de lcool-ter. 11 .2 .16 Termociclador O termociclador utilizado nas tcnicas moleculares para amplificar cidos nucleicos. Existem diversos modelos que podem ser escolhidos de acordo com a rotina do laboratrio de biologia molecular e da metodologia a ser utilizada, sendo que cada modelo apresenta sua particularidade de uso e monitoramento que devem ser consultados nos respectivos manuais. De modo geral, as condutas, uso e monitoramento so a seguir apresentados. Condutas Instalar os termocicladores em sala isolada ou distante das reas de pr-PCR e ps-PCR. Utilizar uma tomada aterrada e, se possvel, conectar o termociclador a um nobreak. Evitar o funcionamento durante o perodo noturno sempre que possvel para incrementar a vida til do equipamento, especialmente em regies onde ocorre interrupo no fornecimento de energia eltrica. Uso Ligar o termociclador. Inserir o programa de PCR a ser utilizado. Caso j esteja inserido, selecion-lo dentre os programas armazenados. Colocar os microtubos no bloco de amostras. Fechar a tampa do equipamento. Iniciar o programa escolhido. Verificar periodicamente o andamento do programa. Monitoramento Limpar o bloco de amostras e a tampa do termociclador pelo menos uma vez por ms ou sempre que necessrio. Usar uma haste de algodo ou swab embebida com lcool isoproplico.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Realizar mensalmente o auto teste ou teste de desempenho do sistema, para verificar a necessidade ou no de encaminhar o equipamento para manuteno. Encaminhar anualmente para a assistncia tcnica credenciada para realizar a manuteno geral do equipamento. 11 .2 .17 Termmetros Nos laboratrios, os termmetros so instrumentos imprescindveis para o controle da temperatura em vrios ensaios, na conservao de substncias e microrganismos, no prprio ambiente de trabalho e no monitoramento de alguns equipamentos. Os mais utilizados so os termmetros de mxima e mnima e os de leitura pontual ou instantnea1. Os termmetros de leitura pontual ou instantnea so usados para medir a temperatura em um momento ou para o monitoramento de equipamentos. Eles podem ser de bulbo (mercrio ou lcool) ou eletrnico e possuem as resolues padres de 0,5C e 0,1C, respectivamente1. Os termmetros de mxima e mnima mostram as temperaturas extremas ocorridas durante um determinado perodo. Possuem duas colunas de mercrio, sendo uma para indicar a temperatura mnima e outra para a mxima. So utilizados para o monitoramento de equipamentos como freezer, geladeiras e estufas, alm do controle da temperatura ambiente do laboratrio. Eles acusam se houve a interrupo temporria de fornecimento de energia eltrica ou o mau funcionamento de um equipamento1. Condutas Guardar o termmetro em sua embalagem original para evitar a quebra do bulbo, quando no estiver em uso. No termmetro eletrnico, retirar a bateria do seu compartimento e ter sempre uma sobressalente. Evitar a utilizao de termmetros com descontinuidades na coluna de mercrio ou de lcool. Posicionar os termmetros de modo que os bulbos ou sensores fiquem localizados medianamente no espao interno do equipamento. No posicion-los muito prximos s resistncias de estufa, banho-maria ou da ventilao interna da geladeira e do freezer, sob o risco de realizar uma leitura equivocada. Uso do termmetro de leitura pontual Colocar os bulbos ou sensores dos termmetros de leitura pontual em um frasco contendo uma soluo de glicerol a 10% em gua, para manter a temperatura estvel1. Lacrar o frasco e acondicion-lo no compartimento interno do equipa-

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mento a ser controlado. Aguardar pelo menos um pernoite para realizar a primeira leitura. Leitura Termmetro de bulbo: abrir a porta do equipamento e, imediatamente, verificar a temperatura pontual sem retirar o termmetro do interior do equipamento, anotando-a no respectivo mapa de controle. Termmetro eletrnico: ler a temperatura indicada no mostrador externo e anot-la no respectivo mapa de controle. Uso do termmetro de mxima e mnima Posicionar os indicadores internos (barras de metal) nos limites das colunas de mercrio acionando o boto especfico ou com auxlio de um im apropriado, (conforme o modelo de termmetro) (veja Figura 1). Colocar o termmetro no compartimento interno do equipamento a ser controlado. Aguardar pelo menos um pernoite para realizar a primeira leitura. Abrir a porta do equipamento e, imediatamente, verificar as temperaturas mxima e mnima, anotando-as no respectivo mapa de controle (veja Figura 2). Posicionar novamente os indicadores internos junto coluna de mercrio, de acordo com a instruo anterior e recolocar o termmetro no interior do equipamento. Monitoramento Averiguar a presena de descontinuidades na coluna de mercrio ou de lcool dos termmetros. Verificar se os termmetros utilizados no laboratrio exibem a mesma leitura de um termmetro de referncia certificado e validado pelo Inmetro.

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Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

Fonte:

Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

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Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

11 .3 Referncias
1. BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB, 1998, 76 p. COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M.; YATES, M.D. Tuberculosis bacteriology Organization and Pratice. Butterworth-Heinemann, 139p, 1997. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture. Geneva, 96p, 1998. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part II: Microscopy. Geneva, 62p, 1998. SELVAKUMAR, N.; GOVINDAN, D.; CHANDU, N.A.; FRIEDEN, T.R.; NARAYANAN, P.R. Processing sputum specimens in a refrigerated centrifuge does not increase the rate of isolation of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 41:469-471, 2003.

2. 3. 4. 5.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 429

Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

11 .4 Anexos do captulo
11 .4 .1 Formulrio de Monitoramento Banho-maria
Formulrio de Monitoramento Banho-maria
Marca: N Patrimnio: Ms: Modelo: Sala: Ano:

Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Temperatura

Depsitos e Contaminaes

Nvel de gua

Interveno

Depsitos e Contaminaes: S Sim N No Nvel de gua: 1 Adequado 2 Baixo Irregularidades/Ocorrncias: Aes corretivas ou preventivas:

Intervenes: 1 Limpeza 2 Manuteno 3 Acrscimo de gua 4 Ajuste do termostato 5 Outros (Indicar)

Fonte:

Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

430 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

11 .4 .2

Formulrio de Registro de Uso Cabine de Segurana Biolgica (CSB)


Formulrio de Registro de Uso Cabine de Segurana Biolgica (CSB)

Marca: N Patrimnio: Ms:

Modelo: Sala: Ano:

Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Hora Incial de uso

Pr-uso Lmpada UV (20-30 minutos)

Ps-uso Lmpada UV (20-30minutos)

Hora Final de uso

Usurio

Irregularidades/Ocorrncias:

Aes corretivas ou preventivas:

Desinfeco Mensal:

Data: _____/_____/_____

Tcnico:

Fonte:

Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 431

Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

11 .4 .3

Formulrio de Registro de Uso Cabine Exausto (CE)


Formulrio de Registro de Uso Cabine Exausto (CE)

Marca: N Patrimnio: Ms:

Modelo: Sala: Ano:

Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Hora Incial de uso

Substncia qumica manipulada

Hora Final de uso

Usurio

Observao

Irregularidades/Ocorrncias:

Aes corretivas ou preventivas:

Desinfeco Mensal:

Data: _____/_____/_____

Tcnico:

Fonte:

Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

432 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias

11 .4 .4

Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica


Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica

Marca: N Patrimnio: Ms:

Modelo: Sala: Ano:

Primeira LeituraA Dia


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 A Hora de incio da rotina Irregularidades/Ocorrncias:

Segunda LeituraB Hora Temperatura Pontual Hora Observaes

Temperatura Mnima

Temperatura Mxima

Temperatura Pontual

B Hora de maior uso do equipamento

Aes corretivas ou preventivas:

Desinfeco Mensal:

Data: _____/_____/_____

Tcnico:

Fonte:

Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 433

Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos

11 .4 .5

Formulrio de Monitoramento Refrigerador e Freezer


Formulrio de Monitoramento Refrigerador e Freezer

Marca: N Patrimnio: Ms:

Modelo: Sala: Ano:

Primeira LeituraA Dia


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 A Hora de incio da rotina Irregularidades/Ocorrncias:

Segunda LeituraB Hora Temperatura Pontual Hora Observaes

Temperatura Mnima

Temperatura Mxima

Temperatura Pontual

B Hora de maior uso do equipamento

Aes corretivas ou preventivas:

Desinfeco Mensal:

Data: _____/_____/_____

Tcnico:

Fonte:

Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

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