RECUPERACION DE PRODUCTOS

(downstream processing)
(CONCENTRACION Y PURIFICACION)
Dr. Blgo. Carlos Villanueva Aguilar Microbiologa Industrial y Biotecnologa Microbiana

I. INTRODUCCION:
La comercializacin de nuevos productos obtenidos a travs del empleo de la biotecnologa, requiere de un coordinado acople de operaciones unitarias a fin de desarrollar un proceso eficiente El objetivo general de este proceso es convertir

materia prima relativamente de bajo costo en

productos de mayor valor comercial.

En este sentido la biotecnologa se puede definir como la coleccin de procesos industriales que involucran el uso de sistemas biolgicos. Un esquema general de un proceso biotecnolgico se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Esquema general de un proceso biotecnolgico

El punto central de este proceso es el biorreactor . En esta unidad de operacin se utilizan catalizadores biolgicos (microorganismos, clulas vegetales animales, enzimas, virus, etc.) para la produccin de sustancias, alimentos, agentes teraputicos, etc. de inters. No obstante, el biorreactor no existe aislado, sino que la eficiencia y xito de la operacin depende de un adecuado upstream processing (procesado previo) que incluye desde el diseo del medio de cultivo hasta la esterilizacin del mismo. Por otro lado, la recuperacin del producto final requiere una serie de operaciones referidas colectivamente como downstream processing (SP). Estas operaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo, una vez finalizado, para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas

RECUPERACIN: (downstream processing):

(CONCENTRACION Y PURIFICACION)

La recuperacin del producto, es un trmino colectivo, til para todas las etapas que se requieren a fin de recuperar o separar los productos tiles de cualquier tipo de proceso industrial. Se debe distinguir los conceptos de concentracin y purificacin. Una etapa de recuperacin cambia la concentracin y/o la pureza de un metabolito. En el proceso ideal de recuperacin se optimizan ambos parmetros.

TCNICAS UTILIZADAS EN LA RECUPERACIN DE PRODUCTOS

En tiempos INICIALES de la Microbiologa Industrial las tcnicas utilizadas (extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin, precipitacin, desecacin) se tomaron directamente de la Ingeniera Qumica con un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biolgicos.

Para materiales biolgicos, haba que perfeccionar procesos especficos de purificacin ya que los bioproductos son frecuentemente compuestos muy lbiles. Sus estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo condiciones definidas y limitadas de pH, temperatura, fuerza inica, etc.

No existe una operacin nica, ideal o universal, ni secuencias de operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma ms adecuada para cada problema particular.

Figura 3. Metodologas utilizadas en los procesos de SP

ETAPAS DE RECUPERACION A. Separacin de las partculas (SEPARACIN DE SLIDOS DEL LQUIDO)

En muchos casos, es la etapa inicial al final de una fermentacin. Es la primera etapa en la recuperacin del producto. Se separa la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante del cultivo El producto final deseado puede ser el propio microorganismo, sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que est presente extra o intracelularmente.

Metabolitos extracelulares: aminocidos, cido ctrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas y proteasas) y la mayor parte de antibiticos (penicilina, estreptomicina). Metabolitos intracelulares: cidos nucleicos, vitaminas, enzimas y ciertos antibiticos (griseofulvina). Si el metabolito a aislar es intracelular, debe ser liberado de las clulas antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las clulas, la seleccin de etapas adicionales de purificacin depender del producto deseado.

Metabolitos en las clulas y en el filtrado del cultivo: encuentran (Ej. vitamina B12).

En pocos casos se

Existen varios mtodos: floculacin, flotacin, filtracin y centrifugacin.

1.

Floculacin y flotacin

En la floculacin se producen grandes agregados que sedimentan mucho ms rpidamente ya que la velocidad de sedimentacin de una partcula aumenta con su dimetro (ley de Stokes). Aplicacin: para clulas aisladas en el rango de tamao de 1 a 10 m que sedimentan solo muy lentamente y son difciles de precipitar incluso con la centrfuga. En la mayor parte de los casos se aade un agente floculante, sal inorgnica, polielectrolitos orgnicos o hidrocoloides minerales. La floculacin depende tanto del agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las clulas, de los constituyentes inicos as como su concentracin. La floculacin puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la clula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las clulas, puentes de molculas polimricas cargadas. Se utilizar la flotacin si no se forma un flculo suficientemente denso, y es el proceso reverso a la floculacin. La flotacin se consigue introduciendo gas en el lquido. Las pequeas burbujas de gas adsorben y atrapan a las clulas y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.

2.

Filtracin

Algn tipo de proceso de filtracin es lo mas frecuente se lleve a cabo en la primera etapa en el proceso de recuperacin. Los dos principales tipos de filtros son los filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos casos la fuerza motriz es la presin, sea creada por sobrepresin o por vaco. Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de vidrio o papel de filtro, llevndose a cabo el proceso de filtracin debido a que las partculas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partculas que van a ser filtradas son frecuentemente ms pequeas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a travs de los intersticios retorcidos del filtro.

Los filtros en superficie son membranas en las que el tamao de los poros es ms pequeo que las partculas que van a ser filtradas. Las partculas son, por consiguiente, separadas sobre las superficies de los filtros.

Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a travs de filtros profundos. Por su parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en superficie. En cualquier caso, la velocidad de filtracin, es decir el volumen de filtrado que puede ser recogido en un tiempo determinado, est influenciada por numerosos factores, como el tamao de los microorganismos, su morfologa, la viscosidad del fluido, temperatura, etc. Uno de los inconvenientes de la filtracin en superficie es la colmatacin. Debido a que este proceso de filtracin depende estrictamente del tamao de los poros y del tamao de las partculas, a medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma una capa que reduce la velocidad de filtracin.

Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por filtracin en contracorriente, en la cual los slidos que no pasen a travs del filtro son mantenidos en suspensin mediante un flujo turbulento a travs de la membrana o ajustando palas mviles o mediante un impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a travs de la membrana y la biomasa

se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene. Con el mtodo de contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en comparacin con la filtracin esttica. Dependiendo del tamao de las partculas que sean filtradas se reconocen tres tipos principales de procesos de filtracin: Osmosis reversa, para partculas de 0,0001 a 0,001 m Ultrafiltracin, para partculas de 0,001 a 0,1 m Microfiltracin, para partculas de 0,1 a 10 m

Las posibilidades de los procesos de ultrafiltracin y smosis reversa se dan generalmente en trminos del peso molecular del tamao de corte. La smosis reversa implica generalmente a sustancias de pesos moleculares menores de 1.000 daltons y la ultrafiltracin a sustancias de pesos moleculares mayores de 1.000 daltons. El proceso de microfiltracin concierne principalmente a la separacin de clulas o de fracciones celulares. Se utilizan membranas fabricadas con steres de celulosa, polivinilfluoruros, policarbonatos, polisulfonas y celulosa.

En los procesos clsicos de purificacin utilizados en la industria de antibiticos (micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se separa del filtrado del cultivo sobre un filtro de tambor rotatorio a vaco que consiste en un tambor rotatorio en cuya parte exterior se enrolla un pao y el vaco se produce desde el interior del tambor. Para aumentar la eficiencia del proceso de filtracin, se utiliza una ayuda filtrante como tierra de diatomeas. Para mantener la eficiencia de filtracin, se utiliza una cuchilla automtica para raspar continuamente del filtro la biomasa junto con una fina capa del material de ayuda de filtracin. Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser lavada a medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vaco son especialmente buenos para suspensiones que contengan una alta concentracin de slidos (20-60% de volumen de micelio).

3. Centrifugacin
Las bacterias son normalmente demasiado pequeas para ser separadas con filtros sencillos. Su separacin por centrifugacin tambin es difcil debido a las pequeas diferencias en densidad entre las partculas y la suspensin.

La centrifugacin no slo se utiliza para separar partculas slidas de la fase lquida sino tambin para la separacin de fluido/fluido. Si bien la separacin fluido/partcula es de la mayor importancia, la separacin fluido/fluido tambin es importante como es el caso en la produccin de penicilina para la separacin del solvente que extrae el antibitico de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de amilo o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0.

La separacin eficiente de las clulas por centrifugacin se ve favorecida por un tamao grande de las partculas, una gran diferencia entre la densidad de las partculas y el lquido, una baja viscosidad del lquido, un radio elevado del rotor de la centrfuga y una alta velocidad angular. Tanto el tamao de las partculas, su densidad as como la viscosidad del lquido normalmente no se pueden controlar. Adems, el radio del rotor de la centrfuga no puede incrementarse indefinidamente ya que el estrs mecnico incrementa con el cuadrado del radio por lo que los lmites de seguridad se alcanzan fcilmente. Por todo esto y cuando se trabaja con grandes volmenes se debe recurrir a centrfugas de flujo continuo. En este tipo de centrfugas la separacin de partculas es ms eficiente cuanto ms lento sea el flujo de la suspensin a clarificar ya que se incrementa el tiempo que cada partcula est expuesta a la fuerza centrfuga. Algunos tipos de rotores: cmara tubular, recipiente de cmara mltiple y centrfuga de rotor de discos. Todos los diseos tienen desventajas individuales a las que deben ser aadidas las generales del coste (incluyendo el mantenimiento), consumo de energa y (exceptuando las que incorporan refrigeracin) elevacin de la temperatura.

B.

Desintegracin de los microorganismos (RUPTURA CELULAR)

Etapa en que los microorganismos son fragmentados por procedimientos qumicos, fsicos o biolgicos, en los casos que se requiera para la recuperacin del producto. La seleccin del mtodo depende principalmente de la naturaleza de las clulas. Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes celulares varan ampliamente a la rotura.

Las bacterias Gram + y hongos son mucho ms difciles de romper que las bacterias Gdebido a la composicin de la pared celular. Incluso dentro de un mismo microorganismo las clulas varan significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo de su estado fisiolgico.

La desintegracin no debe destruir el producto de inters. Por ejemplo, pueden utilizarse cidos para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el producto es lbil a los cidos.

1. Mtodos qumicos
Incluyen tratamiento con lcalis o cidos, solventes orgnicos y detergentes.

La lisis bacteriana con lcalis puede realizarse a gran escala y bajo costeo siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por ejemplo, la hormona de crecimiento humano recombinante se libera fcilmente de Escherichia coli por tratamiento con hidrxido sdico a pH: 11.

El tratamiento con solventes orgnicos es un tratamiento sencillo y barato utilizado en el aislamiento de enzimas en levaduras. No obstante, existe el riesgo que el tratamiento desnaturalice las protenas por lo que se debe chequear con antelacin.

Los detergentes permeabilizan las clulas bacterianas al solubilizar las membranas celulares. Asi se originan agujeros por donde salen al exterior protenas y otras molculas. Sin embargo los detergentes son caros, desnaturalizan la mayora de las protenas y a menudo aparecen como contaminantes en el proceso subsecuente de purificacin.

Para la extraccin de clulas de levadura se utiliza la plasmlisis que se consigue mediante la adicin de una concentracin alta de cloruro sdico.

2. Mtodos biolgicos
Se utiliza la lisis enzimtica. Por ejemplo:

La pared celular de las bacterias Gram + se hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA. La pared celular de las levaduras se hidroliza con una combinacin de uno o ms de los enzimas (1,3)-glucanasa, (1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa.

Los tratamientos enzimticos son muy especficos y las condiciones para la lisis son suaves. En la actualidad, los costes limitan el uso de los enzimas como agentes lticos celulares en la industria. Una variante que se utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los enzimas autolticos endgenos de las levaduras llevan a cabo la destruccin de su propia pared celular. La adicin de cloruro sdico, acetato de etilo o cloroformo y la incubacin durante 24h a 45C aumenta la velocidad del proceso autoltico.

3.- Mtodos fsicos

La desintegracin por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Otro mtodo fsico incluye repetidos ciclos de congelacin y descongelacin pero en este caso muchas de las clulas permanecen intactas. Industrialmente los mtodos fsicos ms empleados de desintegracin celular suponen la accin mecnica.

Los molinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las clulas mediante la accin de bolas de vidrio. Las clulas y las bolas de vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de reaccin. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una clula contra las paredes de la vasija. Con este mtodo se consigue una velocidad mxima de ruptura de aproximadamente el 80% de las clulas.

Otro enfoque es el uso de homogeneizadores. En tales artilugios el material biolgico se coloca bajo una fuerte presin hidrosttica (alrededor de 500 atmsferas) y la presin se libera bruscamente permitiendo que el lquido salga por una vlvula, lo que ocasiona la lisis celular.

C. Mtodos de aislamiento (SEPARACIN DE RESTOS CELULARES)

Una vez lisadas las clulas, los restos celulares se retiran por centrifugacin de gran capacidad a baja velocidad o por filtracin en membrana. Al final obtenemos un lquido libre de clulas que es el que sufre los tratamientos posteriores para aislamiento y en su caso purificacin del producto de inters.

D. Concentracin y Purificacin del producto 1. Cromatografa

El uso de mtodos cromatogrficos implican unas de las etapas ms caras en la recuperacin del producto Tales mtodos son de especial valor para la purificacin de materiales biolgicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparacin de materiales farmacuticos, reactivos de diagnstico y reactivos para investigacin. Los distintos mtodos cromatogrficos que existen segn su mecanismo de separacin son: filtracin en gel (peso molecular), cromatografa de adsorcin (interacciones hidrofbicas), cromatografa de intercambio inico (carga), cromatografa de afinidad (actividad biolgica) y electroenfoque (punto isoelctrico).

2. Extraccin
Cuando se aplica a los bioproductos, tiene funcin de separacin y concentracin. El caldo acuoso de fermentacin que contiene el producto deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se disuelva preferentemente y del que pueda ser ms fcil y especficamente recuperado. Una vez se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado. La extraccin con solventes ha sido utilizada ampliamente en la industria de antibiticos (penicilina) utilizando solventes (acetato de amilo o de butilo). Para la separacin de enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgnicos pero s pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase mltiple preparados en una solucin de

sales con polmeros hidroflicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el agua es el componente principal, pero ambas fases no son miscibles por lo que los enzimas pueden separarse fcilmente sin prdida de actividad.

3. Precipitacin, Cristalizacin y/o Desecacin: Ultimas etapas: Cristalizacin y precipitacin

La cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de purificacin. Se utiliza principalmente para la purificacin de compuestos de bajo peso molecular (antibiticos). Por ejemplo, la Penicilina G es generalmente extrada del caldo de fermentacin con acetato de butilo y cristalizada por adicin de acetato potsico en solucin etanlica.

Desecacin
Secado del material biolgico. Es en muchos casos el mtodo final. Los productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento. La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biolgicos significa que los nicos mtodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminacin de agua con elevacin mnima de la temperatura.

La termoestabilidad de los productos (enzimas o preparaciones farmacuticas) en algunos casos, es mejorada por la adicin de azcares u otros estabilizantes inertes. La liofilizacin es el mtodo de desecacin ms suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos productos farmacuticos son liofilizados (vacunas, fracciones de plasma, hormonas y preparaciones de enzimas, as como ingredientes muy lbiles y caros para diagnosis). Tambin se liofiliza cultivos microbianos vivos (cultivos para inoculacin en las industrias lcteas).

E. Rendimiento
Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso y del nmero de etapas de purificacin. El promedio de prdidas atribuidas a la purificacin est en torno al 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. El rendimiento final es solamente un factor, ya que el coste de los productos qumicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en el clculo global. Los productos que resultan de los proceso biotecnolgicos pueden ser muy variados. La variedad estar dada por:

a. La naturaleza qumica del mismo: sustancias simples (alcoholes, cidos orgnicos);

protenas, sustancias con actividad teraputica (antibiticos, hormonas) etc.

b. El volumen de produccin y la concentracin del producto en el caldo de fermentacin:

los llamados commodities (etanol, cido ctrico, etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton./ao y en altas concentraciones en la fermentacin. Mientras que los agentes teraputicos de ltima generacin (hormonas, factores de coagulacin, etc.) se producen slo algunos kg/ao y su concentracin en la produccin es baja. Esto determina la escala de produccin.

c. Los requerimientos de pureza del producto final. Las molculas a ser utilizadas en salud
humana requerirn una pureza final muy diferente a las enzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar de un acidulante para alimentos. Con estos criterios podemos agrupar a los productos tal como se muestra en la Tabla 1 Tabla 1. Caractersticas de algunos productos biotecnolgicos

En la Tabla 2 vemos los volmenes de produccin de ciertos productos. Tabla 2. Produccin mundial aproximada de algunos productos biotecnolgicos

En la Tabla 3 vemos las concentraciones de productos en los caldos luego de la etapa de produccin. Tabla 3. Concentraciones tpicas de algunos productos Biotecnolgicos a la salida del Biorreactor

En la Fig. 2 vemos como tanto volumen (2.a) como concentracin (2.b) inciden en los precios finales de estos productos. Por supuesto la ubicacin de un producto en este grfico no es fija. El mejor ejemplo son los antibiticos. La concentracin de los mismos en los caldos fue incrementndose a medida que se conoca ms del producto, se mejoraba la productividad de las cepas, se desarrollaban nuevas metodologas de produccin y as fue aumentndose el volumen y bajando los precios.

Lo mismo puede ocurrir con los agentes teraputicos de ltima generacin.

Por ello hablar de SP (downstream processing) en Biotecnologa no es referirnos a algo invariable. Las etapas y metodologas a emplear estn determinadas por todo lo dicho, pero de cualquier manera se puede trazar un esquema general que sea aplicable a cualquier proceso. El esquema puede simplificarse como se muestra en la Figura 3

Estrategias de diseo de procesos de SP Para todos aquellos productos de la Biotecnologa tradicional hay un gran conocimiento tecnolgico y de las propiedades bsicas de las molculas a purificar tanto como del entorno en que se encuentran luego de la etapa de produccin. No ocurre lo mismo con los productos de ltima generacin ya que, por las necesidades comerciales para aprovechar la baja competencia, el elevado precio, y dada la baja escala actual de produccin, la estrategia es llegar rpido con el producto al mercado con la tecnologa de SP que se posea (por lo general la desarrollada a escala de laboratorio). Esta estrategia posibilita un buen posicionamiento en el mercado que permite, posteriormente, el desarrollo de nuevas tecnologas de cambio de escala y SP. Otra vez el ejemplo de este tipo de evolucin son los antibiticos. Las estrategias de diseo de procesos de SP para los productos conocidos pueden resumirse en:

1.

Conocer las propiedades fsicas y qumicas bsicas del principio activo y caractersticas del producto final (por ejemplo definir pureza requerida). El uso determina la pureza. Para agentes teraputicos se requiere un alto grado de pureza del principio activo. Se tolera un mximo de 100 ppm de impurezas de 10 pg/dosis, adems de estar libre de pirgenos.

2.

Definir perfectamente el material de partida. En la Tabla 4 se muestra un ejemplo de caracterizacin de material de partida para la purificacin de un producto. Muchas veces la metodologa de SP condiciona etapas de produccin. Por ejemplo, pueden existir componentes del medio de cultivo (por lo general subproductos como agua de hidrolizado de maz, extracto de malta, sueros animales, albmina otros) que posean sustancias muy similares al producto final que, por lo tanto, interfieren en la purificacin del mismo. En este caso se debe eliminar ese componente del medio de cultivo. Tabla 4. Caractersticas generales del material de partida para realizar SP

3. piloto.

Trazar diferentes esquemas tentativos de SP y llevarlos a etapas de laboratorio y

Algunas reglas que se siguen para ello son:

a.

Elegir en etapas sucesivas procesos basados en diferentes propiedades fisicoqumicas. Por ejemplo si una primera etapa es cromatografa de intercambio inico (propiedad: carga) se puede seguir con una cromatografa de filtracin por geles (propiedad: tamao).

b.

Separar las impurezas que estn en mayor proporcin en las primeras etapas. Por esta causa la etapa de separacin siempre finaliza en una concentracin, ya que el agua es por lo general la impureza mayoritaria (mayor del 90% en cualquier proceso fermentativo).

c.

Luego de la concentracin usar en las primeras etapas de purificacin propiamente dicha un mtodo de alta resolucin (por ejemplo cromatografa de afinidad). Estos mtodos poseen un alto rendimiento aunque no brinden la mayor pureza. En cierta medida lo que se hace es seguir concentrando para reducir la cantidad de muestra a tratar en las etapas posteriores.

d.

Dejar el proceso ms complejo (y por lo general ms caro) para el final. Se usan estos mtodos cuando tenemos la sustancia a purificar concentrada y pre-purificada. Volviendo al diagrama original de SP en la Figura 3 podemos ver algunos mtodos usados en cada una de esas etapas. Figura 3 . Metodologas utilizadas en los procesos de SP

Como podemos observar, la economa de los procesos biotecnolgicos depende en gran medida de las operaciones de bioseparacin que involucran, de tal manera que la correcta seleccin de estas operaciones tiene un fuerte impacto en el xito del proceso.

Referencias bibliogrficas

1. Biotecnologa - Bioprocesos II. Introduccin a los procesos biotecnolgicos Separacin y

purificacin en Biotecnologa (Downstream processing)