GENETICA

DNA CODIFICANTE
Dos 20% que tm alguma funo temos ainda 3 grupos. a) GENES NICOS Cpias nicas em todo o genoma, codificando determinadas enzimas e protenas especializadas. Quando se diz cpias nicas estamos a falar do genoma haplide, considerando apenas metade ou se quisermos os cromossomas que constituem o par de cromossomas homlogos, ou ainda, o genoma haplide o que est contido nos gmetas. Alelo 1 Alelo 1 (par de cromossomas homlogos) Este tipo de gene nico acaba por ter 2 voltas. Tomam os dois a designao de alelo 1, pois se pusermos um alelo 1 e outro alelo 1 ou B, queria isso dizer que so sequncias de DNA diferentes. Um alelo a designao da forma reduzida (?) de um gene. Um determinado gene que codifica a cor de um pigmento, se ele tem 2 alelos, um para pigmento preto e outro para pigmento amarelo, esses dois alelos formam uma alternativa do mesmo gene que controla a cor do pigmento. No esquecer que estamos a falar de genes nicos, enzimas e protenas especializadas que se quiserem codificar o alelo 1,ou B, sobre a parte .....que so duas formas diferentes, so 2 sequncias diferentes que controlam esta caracterstica. Os genes nicos so genes sem polimorfismo e codificam a mesma enzima sem variaes. (H excepes. Pode ocorrer uma situao em que um gene um gene nico, pode sofrer uma mutao num alelo d origem a um alelo diferente que d uma protena diferente. No necessariamente obrigatrio que exista s um alelo para esse gene.)

b) GENES DUPLICADOS 1. 50% dos genes codificantes 2. similares mas no idnticos 3. famlias multignicas: actinas, algumas histonas, queratinas, tubulinas, globinas, imunoglobulinas, genes do MHC 4. pseudogenes no funcionais (muitas destas famlias, pensa-se que por degenerao, ou qualquer erro da replicao do DNA originaram copias no funcionais dos genes, que se vo mantendo no genoma apesar de no funcionais) Ao contrrio dos genes nicos, existem vrias cpias, e estamos aqui a falar conforme o tipo de genes que vo desde algumas cpias at genes que tm situaes de genes que tm mais de um milhar de cpias espalhadas eventualmente pelo genoma.

E portanto, e diferente dos genes nicos, estes genes duplicados so similares e no idnticos. Isto , so suficientemente similares para ns podermos englob-los naquilo a que chamamos famlias multignicas (exemplo, genes do complexo de histocompatiblidade, so genes mais ligados resposta imunitria - protenas codificadas nestes genes eram as responsveis pela rejeio dos transplantes da o estudo deste genes.) H um conjunto de genes do MHC que todos eles tm uma estrutura similar em termos de sequncia de nucletidos, mas h diferenas entre os pares de genes do MHC que permitem formar uma famlia de genes dentro do MHC (classe 1, classe 2...)

c) GENES EM TANDEN 1. 2. 3. 4. 5. 6. dispostos em fila sequencialmente idnticos ou muito similares entre si necessidade de grandes quantidades de produto gnico RNAt ~ 1300 RNAr 5S ~2000 algumas histonas ~50-500

A diferena destes em relao aos genes duplicados a seguinte: so essencialmente cpias idnticas uns dos outros. Ou muito similares. Por outro lado esto dispostos em fila e sequencialmente. H uma regio dos cromossomas chamada de NORs que vem da abreviatura organizadora globular e que so as regies do cromossoma onde possvel cor-las especificamente dando origem a regies bem determinadas do cromossoma. Estas regies no so mais do que regies de RNA ribossomais. Cada gene apresenta n cpias Funo: quando necessrio grande quantidade de uma determinada protena a maneira que o organismo encontrou foi transcrever o mesmo gene n vezes porque mais fcil e mais rpido. Alm dos RNA ribossomais, os RNA de transferncia utilizados no processo de traduo so tambm exemplos de DNA que se encontram expostos desta forma e tambm algumas histonas fazem parte desta classificao de DNA com genes em tanden.

Existem trs classes de DNA codificante. DNA no codificante, ou seja, o DNA que no d origem a protenas nem a RNAs. o DNA repetitivo ou no codificante. Este DNA caracterizado pela existncia de unidade de repetio, repetidas em Tandem. A Repeties em Tandem As unidades de repetio so pequenos oligonucletidos ... 2 pares que se repetem a seguir umas s outras e que podem ir at 500 pares de bases. AGC GCC TCG CGG , unidade de repetio que se repete n vezes umas a seguir outras no mesmo local do cromossoma Repetidos em Tandem Estes DNAs foram descobertos quando se comeou a fazer manipulaes ou ultra - manipulaes no DNA total da clula e verificou-se que no microtubo, aps a centrifugao apareciam duas bandas: uma banda principal que continha a maioria do DNA e outras bandas, bandas satlites. E da a designao destes DNAs com repeties em Tandem como DNA satlite. S mais tarde se analisou a composio deste DNA satlite ... e que este era composto na maioria dos casos por repeties da mesma sequncia a seguir uma s outras. Verificou-se tambm que o nmero de repeties tambm variava e da ter-se feito uma classificao de acordo com o tamanho dessas unidades em DNA satlite, original e a partir da verificou-se o DNA mini satlite e DNA micro satlite. A diferena entre eles o tamanho das unidades de repetio (e n de repeties). 1. DNA satlite - unidade de repetio 5 - 500 pares de bases; - n. de repeties 1000 50 000; - grandes extenses (105 a 106). Estes DNAs satlites so encontrados... a mesma unidade encontrada no mesmo cromossoma, em cromossomas diferentes, e o mesmo se pode dizer para uma unidade diferente em que a frequncia da unidade de repetio diferente (e em nmero tambm , mais pequena) e portanto pode repetir da mesma maneira em vrios locais. 2. DNA mini - satlite - mais frequentes nas regies telomtricas e hot spots de recombinao; - unidade de repetio 10 - 100 pares de bases; - n. de repeties 20 - 50; - pequenas extenses (102 a 103). Ao contrrio do primeiro a sua distribuio no universal, isto , ele encontrase geralmente nos telmeros ( a extremidade do brao do cromossoma) dos cromossomas e tambm em regies onde a recombinao (crossing over) muito frequente. Dizem que a recombinao um processo aleatrio que pode ocorrer em qualquer parte do genoma e isso tem vantagens porque digamos a troca dos genes

entre os cromossomas homlogos de origem materna e paterna vantajosa, isto , misturam-se caractersticas e desta maneira o indivduo diferente dos pais mas esse caracter aleatrio no total porque h locais onde o crossing over ocorre preferencialmente. Isto tambm sucede porque se o crossing over fosse completamente aleatrio seria possvel ocorrer no meio de um determinado gene. Esse gene ia ficar afectado... h que evitar isso. Eventualmente esse ser o mecanismo, isto , arranjar sequncias que mesmo sendo... 3. DNA micro - satlite - distribuio ubqua: em intres ou regies flanqueadoras 5 ou 3 dos genes; - unidade de repetio 1 - 5 pb; - n. de repeties <30. Este DNA da mesma maneira que o DNA satlite tem uma distribuio universal ubqua. Ele pode ser encontrado quer dentro dos prprios genes ao nvel dos intres e tambm ao nvel das regies a montante e a jusante desta, as regies flanqueadoras 5 3. As unidades de repetio so as mais pequenas de todas, 1 a 5 pares de bases e o nmero de repeties geralmente so inferiores a 30. H unidades de repetio de DNA microsatlite que ocorrem apenas em 2 bases. Os DNAs micro e minisatlites vo ser falados mais uma vez mais l para a frente. Os minisatlite ligados a uma tcnica chamada DNA Fingerprints e os microsatlites como marcadores genticos. Marcador tem de obedecer s Leis de Mendel (tem de ser passado pais para filhos utilizando as leis de Mendel comportando-se como um gene). O marcador para se til precisa de ser polimrfico, isto , se olharmos para uma determinada populao h variao na sequncia de bases entre indivduos. Se no houver variao diz-se que invariante ou monomrfico, ou seja, a sequncia de bases igual em todos os indivduos e que, portanto, no serve para marcador gentico. O marcador tem de ser ainda facilmente identificvel (como por exemplo o fentipo, pelagem) Outros marcadores: marcadores bioqumicos sanguneos, por exemplo, sob a forma de enzimas, ABO, AB (nos gatos). Estes marcadores ... tm vindo a ser substitudos por marcadores moleculares que vo sendo descobertos com a determinao ... Marcador sequncia de bases, sequncias nucleticas O DNA micro-satlite detectado geralmente por PCRs amplificando aquela regio determinando o tamanho... B Elementos genticos mveis TGE
-

As terminaes so repeties invertidas (IR) Panlindromas, nas enzimas de restrio; Formao de loops importantes no mecanismo de exciso dos TGE; Movimentao no mesmo ou para outro cromossoma; Tranposio de TGEs com ou sem cpia;

Mutaes por insero: disrupo gnica ou alterao da expresso gnica 5 3 AGCC.............GGCT 3 TCGG.............CCGA 5

Estes elementos genticos mveis so, como o prprio nome indica, sequncias de DNA que se movem no genoma do indivduo o que pe um pouco de lado a ideia de imortalidade (imobilidade) do genoma, isto , alm da... que provoca as variaes da sequncia do genoma h outras fontes de variao, nomeadamente estas sequncias que ... quer no mesmo cromossoma quer em cromossomas diferentes e que so caracterizadas pela existncia de repeties invertidas nas extremidades. Uma sequncia de um elemento gentico mvel tem digamos uma srie de pares a nvel da ... central e depois geralmente tem repeties invertidas que so lidas numa direco (AGCC) e que quando lidas na direco contrria na cadeia complementar tm a mesma sequncia (AGCC). Portanto, isto constitui sequncias panlindrmicas. Estas sequncias vo ser importantes no mecanismo de exciso dos elementos genticos mveis, isto , quando eles abandonam o local do DNA geralmente fazem-no pela ansa... Como j disse, a movimentaes podem ser feitas ou no no mesmo cromossoma e h situaes em que os TGEs abandonam o local deixando uma cpia (transposio replicativa?) ou, pelo contrrio, abandonam esse local sem deixar uma cpia (transposio conservativas?). A importncia destes TGEs ter eventualmente a ver com uma evoluo mais rpida do genoma. A mutao algo que faz evoluir o genoma de uma espcie mas de uma forma lenta e com este sistema possvel que determinadas alteraes se tornem vantajosas para um indivduo visto que se alteram, de uma s vez e subitamente, regies bastante grandes mais rpido. E tambm pode ter o efeito contrrio, isto , as alteres podem no ser vlidas podendo causar assim, a morte do indivduo (h sequncias que se movem podendo ter consequncias graves uma vez que,
se um destes elementos moveis se vai inserir dentro de um gene, pode levar a uma alterao tal que o gene deixa de ser funcional). De uma maneira ou de outra, possvel

que os TGEs sejam importantes na evoluo das espcies. Existem dois tipos de elementos gentico mveis os transposes e os retroposes. Transposes a movimentao do TGE faz-se usando a prpria sequncia de DNA TGE TGE

TGE A sequncia de DNA removida de um determinado local e ela prpria que se move inserindo-se noutra posio do genoma mantendo-se na mesma a sua caracterstica de dupla hlice de DNA. Pelo o contrrio o retroposes movimentam-se no genoma atravs de cDNA existindo o intermdio de uma molcula de mRNA. Portanto, o que acontece que a RNA polimerase l o retroposo, sintetiza o mRNA complementar que vais ser depois lida pela enzima transcriptase reversa (existente nos retrovrus) que vai sintetizar uma cpia de DNA, o cDNA a partir deste mRNA. Isto

porque o genoma do retrovrus o RNA. este cDNA (de cadeia dupla) que vai inserir noutro local do genoma completando a movimentao.

Retroposes movimentam-se atravs de cDNA e por intermdio de mRNA

TGE sintese mRNA cDNA ou DNA complementar TGE

transcriptase reversa C Repeties dispersas (diferentes das Tandem porque s se repetem uma nica vez - a unidade de repetio s se encontra numa copia nica em cada local do
genoma, ou seja, as unidades tb se repetem mas esto localizadas em zonas distintas, no existindo na msm zona unidades repetidas, mas sim, em zonas longe dentro do msm cromossoma)

constitui 20% do DNA dos mamferos

H muitas cpias da transcriptase reversa que no esto activas; sequncias no funcionais sem intres (cDNAs . pseudogenes no funcionais) 1. LINES Long interspersed elements - cDNAs. pseudogenes no funcionais; - unidade de repetio >1000pb; - n. total no genoma 10 000. 2. SINES Short interspersed elements - cDNAs. genes no funcionais para tRNA; - unidade de repetio <500pb; - n. total no genoma 100 000.

DNA no-codificante de cpia nica

DNA de conexo no classificado situado entre as unidade de transcrio.

Tecnologias de Gentica molecular. Metodologias moleculares de deteco do polimorfismo Variaes do PCR: O PCR foi inicialmente utilizado como tcnica de amplificao de determinadas sequncias.

Existem diferentes tipos de PCR:

PCR multiplex Utilizao simultnea de vrio pares de primers com vista a amplificar diferentes sequncias. Assim, no mesmo tubo vo-se usar diferentes pares de primers e o que se pretende a amplificao de diferentes regies de DNA. RAPD usam-se primers aleatrios (as suas sequncias so ao acaso), logo no saberemos qual ser o resultado. O que se pretende testar esses primers em diferentes indivduos para procurar variaes individuais. Assim, ou nada amplificado ou testam-se pares de primers at que haja amplificao. Uma vez que isso acontece, ou o primer utilizado d origem a um produto igual em todos os indivduos (igual significa que tem o mesmo tamanho) o que no a situao desejada ou, pelo contrrio, obtm-se regies de diferentes tamanhos o que evidencia o polimorfismo. Pode ser considerado como um marcador gentico pois baseado na sequncia nucleotdica e transmitido de pais para filhos. RT-PCR- est relacionado com a transcrio reversa do DNA pela enzima transcriptase reversa. Esta enzima capaz de sintetizar o DNA a partir de RNAm. Isolando-se RNAm das clulas, a enzima sintetiza cDNA. Uma das vantagens desta tcnica o estudo dos genes activos na clula num determinado momento. O cDNA uma verso simplificada uma vez que j no contm intres nem as sequncias reguladoras que os genes possuem. Outra vantagem a utilizao desta tcnica para sequenciao de nucletidos (seq. Cclica).

Tcnicas utilizadas em gentica molecular A sequenciao cclica baseia-se, numa fase inicial, na realizao de um PCR dito assimtrico em que um dos primers est em grande quantidade e o outro em baixa concentrao. Numa primeira fase decorre de forma normal, a partir de determinada altura ou ciclo um dos primers esgota-se, o que significa que s uma das cadeias vai ser amplificada DNA de cadeia simples. A vantagem que a tcnica de sequenciao necessita de DNA de cadeia simples para que a DNA polimerase se possa ligar. A vantagem deste mtodo que se pode partir de pequenas quantidades de DNA inicial, pois no necessrio clonar o DNA (a seq. Clssica necessita de grandes quantidades). Outro tipo de Biblioteca a do DNAc que correspondem ao isolamento dos RNAm da clula com posterior transformao pela transcritase reversa. Vantagem das blibliotecas de cDNA que elas representam todos os genes que se expressam. Sequenciao de DNA Mtodo de Sanger (introduo bioqumica) Anlise de Southern Blot consiste na anlise de hibridao de DNA com sondas marcadas. Mas antes da hibridao necessrio seguir uma srie de passos: separao por electroforese do DNA; fragmentos ficam retidos na agarose ( necessrio retirar as bandas da agarose mas de maneira que elas mantenham as mesmas posies relativas);

transferncia do DNA para uma membrana de nylon ou nitrocelulose que so substncias que no deixam passar o DNA e o fixam. Para esta passagem pode ser realizada uma electroforese vertical ou ento, recorrendo aos fenmenos de capilaridade as bandas so arrastadas. Obtm-se assim uma fotocpia do gel malevel; desnaturao de DNA (para que as cadeias fiiquem sobre a forma de uma hlice simples e se permita a ligao de uma sonda); adiciona-se a sonda que pode estar marcada com um istopo radioactivo ou com produtos que quando incididos com luz emitem uma fluorescncia visvel que ir impressionar a pelcula de raio x; Lavar o excesso (permanece apenas a sonda complementar banda em causa) e secar; realizao da autoradiografia.

Variao da Tcnica de Southern Esta tcnica no implica electroforese. O DNA total colocado sob a forma de um ponto sobre uma tira e sobre essa tira colocada a sonda para hibridao. Se houver hibridao h impresso da chapa de raio x (ponto escuro). Outra das variaes a utilizao de sondas ASO (Allele Specific Oligonucleotides). Estas so especficas de alelos e so capazes de hibridar apenas com uma das formas allicas de um determinados gene. Coloca-se um ponto de DNA sobre a tira, a sonda actua, revela-se a chapa. A utilizao destas sondas permite a genotipagem, o problema que no h sondas para a maioria dos genes. Para se produzir uma sonda destas necessrio conhecer toda a sequncia do gene e as vrias variaes allicas. Biblioteca genmica define-se como um conjunto de clones de DNA recombinante que representam todo, ou quase todo o genoma de uma espcie. Se fosse possvel unir todo o genoma de uma espcie em vez de estar definido em cromossomas. O primeiro passo cortar o genoma em diferentes fragmentos, o que tanto pode ser efectuado atravs de meios fsicos (ultra sons) ou qumicos (enzimas de restrio) cada um desses fragmentos vai ser clonado por um vector apropriado. s vezes numa biblioteca genmica h pequenos fragmentos, h sempre pequenas regies que no se conseguem obter. O conjunto dos vrios clones de bactrias (plasmdeos recombinantes) constitui uma biblioteca genmica. H um tipo de biblioteca genmica especial, designada por contig. A diferena que cada um dos fragmentos se sobrepe ao restante, o que facilita o ordenamento dos vrios clones. Tcnicas para deteco do polimofismo O polimorfismo fundamental em todas as espcies porque seno no havia variao gentica e a evoluo no seria possvel. RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorf) Fragmentos de restrio so os fragmentos gerados pelas enzimas de restrio. Com uma mesma enzima de restrio, na mesma regio, mas em indivduos diferentes se houver polimorfismo na regio de reconhecimento da enzima so obtidos

fragmentos de diferentes tamanhos. O fragmento de restrio configura uma situao de marcador gentico na medida em que baseado na sequncia de DNA, facilmente identificvel com a enzima de restrio e transmitido de pais a filhos. Como detectar um RFLP? Atravs do PCR ou Southern Blot (ver esquema de Gentica Veterinria) Southern Blot - Aps extraco de DNA de um indivduo, adiciona-se a enzima. possvel distinguir indivduo heterozigtico (metade do DNA cortado e outra metade no) e homozigtico para uma mutao (no h corte). Realiza-se electroforese, adiciona-se sonda para hibridao. PCR o procedimento similar. necessrio a existncia de primers que se liguem volta da regio de reconhecimento e depois d-se a amplificao. Utilizando a tcnica de PCR aparecem todas as bandas (uma nada por fragmento), enquanto que com Southern depende da sonda que se utilizar.

- ANLISE DE LIGAO GNICA LINKAGE; LIGAO FACTORIAL (ENTRE DOIS GENES) Linkage, em termos simples, trata-se do facto de alelos de genes diferentes, quando esto prximos num cromossoma, tm tendncia a ser herdados em conjunto. Quer isto dizer, se tivermos um cromossoma ou um par homlogo com o gene A e os seus dois alelos A e a e o gene B com os dois alelos B e b, sempre que os homlogos A e B estiverem prximos um do outro ento, os alelos A e B tero tendncia a ser herdados em conjunto e os alelos a e b a mesma coisa. A B a b

Primeiro vamos rever o que se passa a nvel da meiose para explicar o fenmeno da segregao gnica, por uma das leis de Mendel, e que explica quais so os gmetas produzidos por um indivduo que vamos admitir no ser atpico. Vamos tambm admitir que existem dois cromossomas. Portanto, o gentipo deste indivduo, duplamente heterozigtico. A a B b

Par 10

Par 14

So quatro tipos diferentes de gmetas que este indivduo produz sendo eles: AB, Ab, aB e ab. Face aos gmetas produzidos pelo outro indivduo que se ia acasalar

com este, determinava-se o gentipo da descendncia. Espera-se ter 25% de probabilidade de obter cada um dos quatro gmetas diferentes. A razo disto est na tal lei de Mendel (lei da segregao independente- transmisso independente?) que refere que os cromossomas so repartidos de forma aleatria pelos gmetas. Ou seja, durante a meiose, cada um dos membros do par 10 vai ser separado de forma aleatria para cada um dos gmetas, isto , um dos membros do par vai para um gmeta e o outro vai para outro gmeta e o mesmo acontece para o cromossoma 14. Esta separao vai originar os tais quatro tipos diferentes de gmetas. A proporo esperada de 25% de cada um deles resulta dos acontecimentos da meiose, isto , da separao dos homlogos e, por outro lado, da migrao aleatria de cada um dos membros do par de homlogos para os gmetas. Relembrar que cada gmeta tem de ter sempre um representante de todos os pares de cromossomas que a espcie possui. Voltando agora ao incio, vamos imaginar que os genes A e B esto no mesmo cromossoma. Quais so os gmetas produzidos por este indivduo? Este indivduo vai produzir igualmente os quatro tipos de gmetas referidos anteriormente pois durante a meiose ocorrem fenmenos de crossing-over que se encarregam de trocar e baralhar os alelos entre membros do mesmo par de homlogos. Quando ocorre o fenmeno de crossing-over, os cromossomas j passaram pela fase de sntese do DNA e, portanto, aparecem com dois cromatdeos finos.

A B

A B

a b

a b

A B

A a b B

a b

Crossing-over O crossing-over vai estabelecer pontes entre dois cromatdeos finos, promovendo a troca de segmentos. No fim da meiose (quando os cromossomas homlogos se separam e vai o cromossoma de origem materna para um lado e o de origem paterna para o outro) e ainda a seguir, na segunda mitose da meiose (quando ocorre a separao dos cromatdeos finos) o resultado final vai ser: um cromatdeo filho igual ao do progenitor (AB); um outro cromatdeo filho exactamente igual ao do progenitor e que tem (ab), e cada um destes vai para um gmeta diferente; temos ainda outro cromatdeo (Ab) e o outro que vai ter (aB). Lembrando que cada um deles migrou para uma clula diferente, neste caso um gmeta diferente, temos que as possibilidades de formao de gmetas so exactamente aquelas que tnhamos referido h pouco. O nmero de crossing-overs por par de homlogos varivel conforme a espcie e conforme o sexo. Podem ser 3; 4; 5; 6; 7(no limite) no mesmo par de homlogos. Por outro lado, o local do acontecimento do crossing-over aleatrio, ou seja, pode ocorrer em qualquer ponto do cromossoma e pode afectar qualquer um dos quatro cromatdeos envolvidos, ocorrendo sempre entre cromatdeos que pertencem a cromossomas de origem diferente. Quando o nmero de crossing-overs par no gera os chamados gmetas trocados ou recombinantes. Quando falamos em grandes nmeros (formao de gmetas) vai existir um equilbrio entre as situaes de no

crossing-over, e formao de gmetas iguais aos progenitores, e, por outro lado, o nmero de gmetas recombinantes resultantes do crossing-over. No se pode afirmar que o crossing-over s afecta dois dos cromatdeos filhos nem que s h um crossing-over entre quaisquer genes que consideremos, pois podem haver mais e, se forem pares, anula-se o efeito de crossing-over. Dizemos que os genes so independentes quando esto localizados em cromossomas diferentes ou quando esto suficientemente afastados para que entre eles ocorra crossing-over, neste caso a produzem, ao nvel dos gmetas, todas as combinaes possveis em propores iguais. Existem, no entanto, situaes em que os genes esto localizados muito prximos, tendo tendncia para serem herdados em conjunto. Se tivermos um cromossoma com o gene A numa ponta e o gene B na outra ponta, em qualquer local que ocorra um crossing-over, suficiente para gerar os tais gmetas recombinantes. Mas se os genes estiverem colados um ao outro, a probabilidade do crossing-over ocorrer exactamente entre a e B mnima. Neste caso formar-se-o somente gmetas (AB) e (ab) que denominar-se-o de gmetas no recombinantes. Esta situao pode ser quantificada por uma frmula que nos d a frequncia de recombinao (Fr): Fr = Proporo de gmetas recombinantes N total de gmetas Fr- medida de distncia em mapas gnicos. UNIDADE: cM (centimorgan) ou u.m. (unidade de mapa) 1 cM- distncia entre dois genes cuja Fr 1% 1 cM 1 Mb (1000 Kb, 1.000.000 pb) A frequncia de recombinao pode ser calculada quer para gmetas quer para indivduos e em qualquer dos casos, o que esta determina, a probabilidade ou a proporo de crossing-overs entre os genes considerados. No caso anterior, em que os genes se encontravam muito prximos, no ocorrendo crossing-overs entre eles, Fr seria igual a zero. Se Fr for de 1% (em 100 meioses apenas numa delas ocorrer um crossing-over entre A e B), vamos ter 1% de gmetas do tipo recombinante e 99% de gmetas no recombinantes. A Fr pode ser dada em percentagem e como ela reflecte a distncia entre genes pode ser aproveitada para o clculo da distncia entre genes num cromossoma. Se ao analisarmos o n de recombinantes verificamos que ele est abaixo do n que espervamos obter se os genes fossem independentes, ento podemos afirmar que quanto menor for Fr mais prximos os genes esto. Esta relao entre a distncia dos genes e a frequncia de recombinao originou uma unidade de distncia em mapas gnicos (u. m. unidades de mapa). Fr igual a zero quando, teoricamente, nunca h crossing-over entre dois genes, embora na prtica no seja possvel pois pode sempre ocorrer crossing-over entre dois genes mesmo que eles estejam colados um ao outro. Fr igual a 100 um valor impossvel pois significa que naquela frmula todos os genes so recombinantes, seria verdade se em todos os quatro cromatdeos envolvidos na meiose tivesse ocorrido um crossing-over, gerando somente gmetas recombinantes. Mas falando em milhares de gmetas produzidos isso impossvel. O valor mximo para a frequncia de recombinao de 50.

Quando a frequncia de recombinao se aproxima do valor limite em que se consideram os genes independentes (50%), no possvel fazer uma extrapolao entre Fr e a distncia gnica. Somente quando o valor para Fr se apresenta entre 20%-30% possvel fazer uma equivalncia directa para a distncia gnica, em cM. Acima de 30% j nos estamos a aproximar do valor limite de 50%. Mapas de ligao 25 50 75 100 125 150 Mb Genoma haplide cM / 125cM 20 30 30 20 25

ANLISE DE LIGAO GENTICA Ligao factorial = ligao gentica Frequncia de recombinao vai-nos dizer o que ocorreu na meiose (crossingover). Serve para genes no mesmo cromossoma ou mesmo em cromossomas diferentes. __n de indivduos recombinantes__ n total de indivduos Ligao gnica estreita quando os dois genes esto muito prximos e raramente so separados pelo crossing-over. Freq de recombinao nunca acima de 10%. Teoricamente no ocorre crossing-over entre dois genes colados um ao outro, embora na prtica isto possa acontecer, mesmo estando os dois juntos. Na prtica h sempre uma probabilidade de mesmo que a distncia entre dois genes seja nula ocorrer crossing-over, apesar de neste caso a frequncia de recombinao ser 0. Valor mximo para a frequncia de recombinao 100%.
A B a b

Cis (coupling, acoplamento) quando dois alelos de dois genes em ligao se encontram no mesmo cromossoma de um par de homlogos. A,B e a,b

Trans (repulsion) quando dois alelos de dois genes se encontram em cromossomas homlogos opostos. A,b e a,B Estes dois conceitos permitem-nos dizer que: quando h uma ligao estreita entre genes os alelos que se encontram em posio cis tendem a manter-se de gerao em gerao.

Cruzamento de prova (test - cross) o ideal para calcular a frequncia de recombinao, consiste do cruzamento entre um indivduo heterozigtico com um homozigtico recessivo. Mtodo: so recolhidos progenitores homozigticos (gerao paterna) que geram um indivduo (gerao F1) que heterozigtico para todos os genes considerados. Depois vem o cruzamento de prova em que se cruza este indivduo duplamente heterozigtico com outro homozigtico recessivo para os genes considerados. Se quando se faz o cruzamento de prova nunca aparecem indivduos recombinantes, isto , todos eles tm o gentipo correspondente aos progenitores F1. mais fcil olhar para estes resultados uma vez que o resultados s vai depender dos gmetas do F1 heterozigtico, pois a contribuio do outro sempre a mesma. Numa famlia pequena pode-se esperar que no haja resultados recombinantes mas numa descendncia de 1000 indivduos (por exemplo) se no houver indivduos recombinantes pode-se afirmar que existe uma ligao gnica completa. Tambm importante na elaborao de cruzamentos de prova determinar se os indivduos so ou no recombinantes, depende do hapltipo do indivduo F1. Hapltipo a designao de todos os alelos ( que estamos a considerar) pertencentes a um determinado cromossoma de um par de homlogos. Constituio allica dum cromossoma de um par de homlogos. Qualquer indivduo tem sempre dois hapltipos, um para cada cromossoma homlogo.

A d B

a D B

Quando se olha para o fentipo dos descendentes como intuito de descobrir quais os recombinantes, procura-se os que apresentam apenas a caracterstica A ou a caracterstica B, no primeiro caso e os que apresentam as duas ou nenhuma no segundo caso. Estas so situaes extremas em que a frequncia de recombinao de 50%. Encontram-se muito frequentemente valores intermdios entre estes 50% e os 0% no caso de ligao gnica completa. O grande problema para este tipo de estudo o n de descendentes que necessrio obter. Por isso usa-se a drosfila e os ratinhos, o que em homens e animais domsticos difcil, apesar de com inseminao artificial se conseguir grande n de descendentes em vacas leiteiras e touros, no geral no fcil. ANLISE DE LOD-SCORES Mtodo estatstico para averiguar da existncia de ligao entre genes (ou entre um gene e um marcador), extraindo informao de pequenas famlias. Baseia-se no clculo da probabilidade relativa de determinada descendncia resultar de um par de genes ligados, versus resultar da segregao ao acaso.

ODDS RATIO razo de probabilidades para uma determinada famlia. Ou seja, calcular a probabilidade de uma descendncia ser resultante da ligao entre os genes ou, pelo contrrio, ser resultante de uma segregao ao acaso desses genes. A frequncia de recombinao deriva de uma fraco recombinante ou do nmero total de descendentes no recombinantes e recombinantes e esta fraco de hbridos recombinantes designada por ou fraco recombinante. Se: Fr = 10%, ento = 0,1 Se: Fr = 20%, ento = 0,2 Ou seja, h uma equivalncia entre os 2 conceitos. Fr diz respeito fraco de hbridos recombinantes numa determinada famlia. r Fr = -----n+r ( r=)

Este mtodo tenta extrair informao de pequenas famlias mas h condicionantes: pelo menos um dos progenitores ter de ser heterozigtico para o marcador, porque essa a nica forma de, a nvel da descendncia, verificarmos se h ou no recombinao entre o hbrido e o marcador. Temos de encontrar uma co-relao positiva entre um dos alelos dos marcadores e a presena do alelo para a doena. Assim, nem todas as famlias servem para este tipo de anlise. Numa famlia com 4 descendentes: -------------------------------------------------------- A A a a B B b b

------------------------------ A a a a B b b b

a a b b

A a B b sem recombinao

a a b b

A a b b recombinao

RAZO DE PROBABILIDADES DADA PELA FRMULA: odds ratio = (1 - )n r ___________ ( )n+r n= n de filhos no recombinantes r= nr de filhos recombinantes n+r= nr total de filhos do casal A probabilidade de 2 acontecimentos independentes igual ao produto das suas probabilidades. Filho recombinante porque o pai era AB e ele Ab. A fmea homozigtica recessiva podemos esquecer ou negligenciar a sua contribuio. 3 Descendentes no recombinantes porque um ab (igual ao tipo paterno), outro AB e outro ab. Se a segregao for ao acaso qual ser a probabilidade de nascer 1 filho recombinante e um filho no recombinante? A B a b

Casos: A A a a B b B b (1) (1) os que resultam do crossing-over no h ligao entre estes dois genes e a FR 50% e a probabilidade de nascer um filho recombinante 50%. r=0,5 n=0,5 por exemplo, se o nr de filhos for T para calcular as probabilidades de nascimento para as diferentes combinaes de filhos recombinantes e no recombinantes a partir da seguinte equao: T (r+n)t Para T=2 o binmio ser: r2 + 2rn + n2 cada um destes factores corresponde probabilidade de um determinado conjunto de eventos ocorrentes simultaneamente:

P(r2)=probabilidade de nascimento de 2 filhos recombinates=0,52 P(n2)=probabilidade de nascerem dois filhos no recombinantes=0,52 P(rn)=probabilidade de nascer 1 recombinante e 1 no recombinante=2x0,5x0,5 Como a nica coisa que difere o facto de nascer 0, 1 ou 2 filhos recombinantes/no recombinantes, vamos utilizar estes 2 termos de binmio e chegar concluso que 0,5/n+r o mesmo que calcular a probabilidade de: (0,5)r x (0,5)n = (0,5)n+r = probabilidade de nascer n+r filhos (T) em que a probabilidade de nascer um recombinante 0,5 e a P de nascer um no recombinante tambm 0,5. Exemplo: Fr=10% Para 4 descendentes odds ratio = 0,93 x 0,11 ___________ (0,5)4 A probabilidade de nascerem 4 filhos, sendo 3 no recombinantes e 1 recombinante vai ser igual a 0,54. Esta a prob. deste casal ter esta descendncia admitindo que no h ligao entre os genes. Se houver ligao entre os genes: Como no sabemos qual o valor da Fr o mtodo de lod-scores baseia-se na atribuio sucessiva de diferentes valores para desde 0 at 0,5, isto , o mtodo assume que a Fr , por exemplo, 0,1 e faz os clculos e determina qual o valor da Prob de 4 descendentes, sendo 1 recombinante e 3 no recombinantes se a Fr fosse 0,1. Corre todos os valores de uma Fr de 0 at 50%. Se a Fr=50% o = 0, 5 e o numerador vai ser igual a (0,5) 4 porque assume que os genes vo ser independentes e assim o valor vai ser igual ao valor que aceitmos quando dissemos que os genes no estavam ligados. Da relao entre as probabilidades de um acontecimento ligado a um determinado valor de e a prob. associada independncia entre 2 genes resulta o valor da razo de probabilidades e este valor que nos diz se h uma tendncia para a ligao (numerador > denominador) ou para a independncia dos 2 genes uma vez que o valor do denominador vai ser maior que o do numerador. A probabilidade de ligao ligeiramente maior que a probabilidade de se tratar de genes com segregao independente.

Para = 0 Odds ratio = 0 Para = 0,5 ( dizer que os genes so independentes) Para 0<<0,5

Odds ratio = 1

O valor de odds ratio depende do tamanho da famlia e do nr de indivduos recombinantes e no recombinantes. Mesmo que os genes sejam independentes a famlia pode no ter filhos recombinantes. O mtodo determina a razo de Ps desde = 0 at 0,5 e determina vrios valores para esta P. Por outro lado, faz isto para todas as famlias que ns dispunhamos, isto , se tivssemos 5 ou 10 famlias amos calcular a razo de Ps para cada famlia e dentro dessas famlias fazer o clculo para todos os valores de . No fim, combinando esses dados todos obtemos no fim o chamado lod score (log das probs e que corresponde ao do log das razes das probs calculadas para cada valor de .) (A soma de log ao produto desses log) possvel traar um grfico de valores de razes de probabilidades. Logs das razes de probabilidades calculados para os diferentes valores de . Somam-se todos estes logs e esse valor total ( dos logs da razo de probabilidades) o lod-score ou seja, a pontuao total que se obtm para cada um dos valores de . Olhando para todos os valores de , determinamos qual o que tem o valor de lod-score mais elevado. Existe ligao gnica quando o valor de lod-score a 3 O que equivale a uma razo de probabilidades (odds ratio) 1000/1 estamos a favorecer que quem prevalece nesta razo de probs a explicao dos dados serem devidos ligao. Pelo contrrio: Independncia gnica para lod-scores -2 Odds ratio 1/100 Favorece o denominador ou seja, a prob daquele caso resultar devido independncia dos 2 genes.

Se o lod-score 3 ento o valor + provvel para a Fr, que o que queramos saber, 1 determinmos que h ligao entre os 2 genes e que a Fr cerca de 0,1.. ou seja, estes genes estaro a cerca de 10centimorgans ou 10 milhes de pares de bases e existe ligao gnica entre eles. LIMITAES DO MTODO

1. Heterogeneidade gentica Termo que se aplica quando um determinado fentipo para uma doena ou uma determinada caracterstica, pode resultar de genes diferentes. Ex. osteogenenis imperfecta pode resultar de mutaes de 2 genes diferentes Podem ser de tipo I (gene COL1A1) ou tipo II (gene COL2A2) e como no sabemos, imaginando que estamos no inicio da investigao , vamos encontrar marcadores que estejam associados por lig. Gnica doena, ao local do gene que ainda desconheo qual . Imaginando um grupo de famlias que resultam de um tipo de mutao do gene COL1A1 e outro do gene COL2A2. Faz-se uma analise lod-score entre diferentes marcadores que se localizam espalhados por todo o genoma. Extrai-se o DNA determinam-se os marcadores e todos eles espalham-se ao longo do genoma e feita uma anlise matemtica tentando encontrar lod-scores positivos, ou seja, ligaes entre a doena e os tais marcadores. Se tivermos famlias misturadas, a(s) famlia(s) em que acontece isto, quando fizermos uma anlise lod-score com o marcador X (do gene COL1A1) vai darnos um valor menor que 2 pq no h relaco entre o gene e o marcador q estou a estudar. Quando chego ao fim os valores anulam-se e n se tiram concluses. FACTORES DE DESTABILIZAO NUMA ANLISE LOAD SCORE:
1.

Heterogeneidade gentica ex: osteogenesis imperfeita tipo I gene COLIA I, osteogenesis imperfeita tipo II- gene COLIA II

2. Desconhecimento da fase cis ou trans entre o marcador e um alelo para uma doena recessiva Numa anlise load score em que no se conhea a posio correcta entre o marcador e o gene para a doena faz-se o estudo para as duas posies (a cis e a trans) e depois calcula-se a mdia do resultado e a partir da vemos se h uma tendncia para se considerar que h ligao entre o marcador e o gene ou no, se provavelmente eles so independentes. SE o resultado obtido for 2 no h ligao entre o gene da doena e o marcador que estou a estudar SE o resultado obtido for > 3 ento h ligao 3. Recombinao gentica O crossing-over (recombinao gentica) um factor de destabilizao do mtodo de load score

Neste caso o marcador e o gene para a doena esto em posio cis. Note-se que a presena de A est associado doena no entanto observa-se na gerao F2 um indivduo aa portador da doena, isto deve-se precisamente recombinao gentica, ou seja deu-se crossing-over O rigor do diagnstico nos dado por 1- No caso anterior o risco da doena para indivduos que herdem o gene A 1-0,03 = 0,97 = 97%, J o risco da doena para indivduos que no herdem o gene A 0,03 = 3%

Limitaes s tcnicas de Lod-score

I Aa aa

II Aa Aa aa

O alelo para a doena pode estar em posio cis (no mesmo cromossoma) para o alelo dominante, ou em posio trans. b- alelo para a doena A b a ou B B b A a

Os recombinantes sero diferentes se se considerarem os cis ou trans. Podemos considerar a mdia dos dois. - heterozigtico - normal - recessivo para o alelo da doena I aa II III Aa aa Aa aa Aa Aa AA aa

Rigor de diagonstico (a partir do valor de ) = 1 - Anlise de lod score determina o valor mais provvel de (a frequncia de recombinao entre dois loci) Se = 3% (3 cM), o risco de doena 1 0.03= 0.97% A probabilidade de Ter a doena era de 3%. Quanto mais prximos os marcadores estiverem do gene da doena, menor o risco de receber a doena. Todas estas anlises de ligao fazem-se quando ainda no se sabe qual o gene da doena. Se soubessemos usavam-se sondas para determinar. B doena A B Descendncias futuras: Doena AB Doena aB a b A b a B

o marcador A no serve para fazer o diagnstico da doena.

Equilbrio de ligao associao aleatria em cis de alelos de loci em ligao Desequilbrios de ligao quando frequncia de haplotipos por associao em cis de alelos de loci em ligao superior esperada pelo acaso. ....fundador ocorre em raas cridas pelo Homem; a frequncia muito alta ao longo da progresso de raa. (ex: Barros, Boxer)

Tempo necessrio para se atingir o equilbrio. Vantagem selectiva para um dado haplotipo mesmo que a distncia entre os loci fosse muito grande a frequncia enorme vantagem selectiva para o indivduo que a possui. Mapa fsico indica localizao ou posio de caractersticas de enzimas de restrio no cromossoma. Genmica uma parte da gentica cujo o objecto a anlise do genoma das vrias espcies. um conceito relativamente recente, inicia-se com os programas de sequnciao dos genomas de algumas espcies, nomeadamente o Homem, bovinos, porco e co. Pretende-se analisar o genoma luz da gentica molecular, isto , fazer uma caracterizao molecular do genoma essencialmente ao nvel da sequncia do DNA. Estudo de ferramentas ligadas manipulao e anlise de grandes quantidades de DNA. A finalidade destes estudos obter uma sequnciao completa do genoma, isto , determinar toda a sequncia de nucletidos do genoma da espcie. - funo e interaes gnicas; - organizao e evoluo dos genomas. Genoma todo o material gentico de uma espcie. A anlise do genoma pode ser feita a vrios nveis, da mesma maneira que quando se faz um mapa de um pas este pode ser mais grosseiro ou mais detalhados. A primeira fase da anlise imputao genes e marcadores a um cromossoma especfico, isto , determinar qual o cromossoma onde se encontra um determinado gene. Elaborao de mapas cromossmicos e fsicos. - mapas cromossmicos (determinam a posio e distncias de genes ou marcadores no cromossoma) - mapa fsico (localizao de um fragmento clonado no cromossoma; so determinaes fsicas para caratersticas que no so genes) Sequnciao de nucletidos do genoma da espcie (nvel mais baixo de resoluo). Anlise de ligao para determinao de genes no cromossoma Hibridao in stu utilizar sondas marcadas, tpicas de uma determinada sequncia de DNA e ver em que zona que ela se liga. PFGE (electroforese para grandes fragmentos de DNA) Hibridao de clulas somticas Mapeamento cromossmico pode ser feito com uma anlise de recombinao ou com hbridos de clulas somticas irradiados.

O mapa fsico pode ser a posio num cromossoma de determinados locais de restrio. ... Contigues (fragmentos de DNA clonados) bibliotecas genmicas em que os fragmentos clonados se sobrepem; permite a determinao sequencial dos vrios clones. Como que se imputam determinados genes e marcadores a um deteminado cromossoma? - Ligao gnica - Hibridao in stu: - hibridao de sonda a uma regio especfica de um cromossoma (j desnaturado), por complementariedade de bases - FISH (fluorescent in stu hybridation)- os marcadores so fluorescentes - rearranjos cromossmicos correlao entre a inactivao gnica por quebras cromossmicas e o cromossoma afectado. - PGFE (pulsed field gel electrophoresis) electroforese em campo verstil. Separao electrofortica de cromossomas inteiros (depende do tamanho do cromossoma) Alternncia de variaes elctricas no campo (campos elctricos ortogonais). O DNA (com grande carga negativa) sofre alterao de carga elctrica; quanto maior o tamanho da partcula mais dificuldade tem em recuperar das alteraes. A separao tambm feita tendo em conta o seu tamanho. Hibridao de sondas aps de Southern plot
-

hbridos de clulas somticas (fuso de clulas na presena de vrus) clulas prximas, como o vrus pequeno, quando actua liga-se a receptores de uma clula e clulas vizinhas; isto aproxima as paredes celulares, as membranas citoplasmticas fundem-se, tal como os seus ncleos. perda progressiva de cromossomas seleco de clones com representantes de todo o complemeto cromossmico correlao entre o fentipo de um marcador e a presena ou ausncia de determinados cromossomas

Anlise genmica nveis de resoluo - imputar genes e marcadores a um cromossoma especfico - mapas cromossmicos posio e distncias de genes e marcadores no cromossoma - mapa fsico determinar a posio no cromossoma de clones - sequenciao do genoma (nesta aula analisa-se o segundo ponto)

Os mapeamentos analisados so todos baseados na anlise por ligao. Com a descoberta dos marcadores moleculares com polimorfismos elevados e facilidade de identificao do fentipo os mapas de ligao evoluram bastante em termos de preciso, o que possibilitou a elaborao de mapas com resoluo at 1 CM. No entanto, isso no era suficiente, visto que, em algumas espcies, 1 CM equivale a 1 milho de pares de bases. Mapeamento por RFLPs A primeira tcnica baseada na ligao o mapeamento por RFLPs (polimorfismo dos fragmentos de restrio), isto , a existncia ou no de um local de restrio de uma enzima leva a que o padro de restrio seja alterado o que pode constituir um marcador. Inconvenientes do mapeamento por RFLPs: - polimorfismo limitado (geralmente s existem dois alelos) - baixa pecentagem de heterozigotia (relativamente a estes locus) Mapeamento por SSLPs marcadores por alterao do nmero de sequncias em tandem repetidas (polimorfismo no comprimento das sequncias). Quando se consideram DNAs repetitivos consideram-se os mini e microsatlites. Em ambos os tipos possvel que diferentes indivduos possuam um nmero diferente de repeties em tandem, o que pode configurar a existncia de um marcador polimrfico. - DNA fingerprints anlise de DNA minisatlite por Southern Blot - VNTRs anlise de DNA microsatlite por PCRs O que se pretende em ambos os casos , a partir de um marcador j conhecido, tentar fazer um mapeamento por ligao de caractersticas a genes cuja localizao desconhecida. Mapeamento por SST: baseia-se na determinao de um gentipo de um espermatozide por anlise de PCR do seu DNA. Quando se calculam as frequncias relativas de cada um dos tipos de espermatozides possvel calcular a frequncia de recombinao e determinar se essa frequncia indica a existncia de ligao gnica. Permite calcular, sem ter de recorrer a cruzamentos, a frequncia de recombinao e a determinao de mapas de ligao de diferentes marcadores ou genes. Anlise de Homozigotia: quando se fazem cruzamentos consanguneos pode acontecer o seguinte caso. Uma progenitora heterozigtica (sem doena) acasala com um macho homozigtico dominante e nascem duas fmeas ambas heterozigticas. Pode acontecer que os seus filhos herdem o gene recessivo. Neste caso, estes alelos em que possvel traar a sua origem a um progenitor comum dizem-se alelos idnticos por descendncia. Se existir, a presena simultnea do alelo recessivo e do marcador, provavelmente esto em ligao factorial.

Uma ligao entre um alelo recessivo e um marcador molecular indica provavelmente uma ligao gnica. Anlise de RAPDs: DNAs amplificados por PCRs baseado em primers sintetizados ao acaso. Amplifica-se o genoma de todo o indivduo com base nesse primer.

Outro tipo de elaborao de mapas cromossmicos baseado nos hbridos de clulas somticas. Nomeadamente: - Chromossome mediated gene transfer: neste caso isolam-se cromossomas por citometria de fluxo FACS - suspenso de cromossomas metafsicos de tal maneira que cada gota contm apenas um cromossoma. Antes os cromossomas foram marcados com um corante para AT e GC. Logo, o padro de colorao depende da riqueza de bases. Esses cromossomas isolados podem ser fundidos hbridos de clulas somticas. Correlao entre o fentipo de determinados marcadores e o cromossoma presente. Quanto maior a proximidade de dois marcadores num cromossoma, maior a frequncia com que so transferidos juntos. - Hbridos irradiados (raios x): quebra de cromossomas por irradiao fuso de clulas irradiadas com clulas de ratinho integrao dos fragmentos painel de hbridos resoluo dos mapas: 0,1 CM de densidade mistura de cromossomas irradiados com os do rato Anlise: - clculo da frequncia de reteno de marcadores nos hbridos - clculo da frequncia de correteno de pares de marcadores - marcadores ligados menor a probabilidade de quebras por irradiao entre eles. Frequncia de correteno maior que a frequncia de reteno individual (marcadores ligados no mesmo cromossoma). Aumento da resoluo dos mapas porque os fragmentos so muito pequenos. ANLISE GENMICA Mapas fsicos determinar a posio no cromossoma de clones O conjunto de tcnicas que vamos abordar vai procurar a correspondncia entre um determinado clone, de uma biblioteca, e a sua posio no genoma da espcie.

- Mapeamento de contigs: Contig biblioteca genmica em que os fragmentos clonados esto sobrepostos uns aos outros.

Todos estes clones representam o genoma de uma determinada espcie

O objectivo alinhar os clones de tal maneira que seja possvel obter uma sequncia completa do genoma. Na biblioteca genmica os clones no esto ordenados. medida que se vo fazendo estas bibliotecas de contigs vamos reduzindo o seu nmero at termos o nmero igual ao nmero de cromossomas da espcie. Como se faz o alinhamento dos clones para uni-los formando os contigs1, 2, 3... ? A partir do momento em que temos os clones alinhados podemos depois fazer anlise de procura de genes ou, sabendo onde est um determinado marcador (ligado a um gene), fazer a sequncia desse gene. CLONE FINGERPRINTS Identificao de padres de restrio mltipla especficos de cada clone.

Para cada um dos clones obter o padro de restrio (elaborar o mapa de restrio cortar cada clone com diferentes enzimas de restrio e elaborar o mapa). Se houver sobreposio entre os clones vo-se obter no mapa os mesmos padres de restrio alinhamento dos clones. Se dois clones diferentes partilham, pelo menos parcialmente, o padro de restrio porque eles so contnuos uns aos outros. STS Sequence Tagged Sites (sequncias nicas amplificadas por PCR)

So regies dos clones, geralmente nas extremidades, que so identificadas pelo PCR e que s existem naquele local, em todo o genoma. Existe um par de primers que amplifica uma determinada regio do genoma, e apenas essa, e com base nisso possvel proceder identificao do STS (marcador STS). Isto , se um clone tem numa extremidade um marcador STS 1 e ao lado um STS 44, e um outro tenha o STS 1 e o STS 44 provvel que seja a mesma regio que est clonada e que, portanto, haja continuidade entre os dois clones. Clonagem Shotgun Fragmentao mecnica do genoma Clonagem shotgun Sequenciao das extremidades Alinhamento dos clones

Tem esta designao porque uma clonagem feita ao acaso, baseada na fragmentao mecnica do genoma (geralmente com banho de ultra-sons). Estes fragmentos so ento clonados aleatoriamente em vectores apropriados, dependendo do tamanho. Uma das formas de os alinhar fazendo a sequenciao das extremidades de cada um dos fragmentos. (100 ou 200pb). O processo o mesmo, isto , se tivermos sequncias comuns em clones diferentes estes vo ser, provavelmente, contguos. Clonagem insero do fragmento num vector de sequncia conhecida. O sangue uma das fontes mais utilizada para a extraco de DNA.
-

Chips de DNA Matrizes alinhadas de clones Hibridao com clones especficos Mapeamento fsico

Estes chips tm alguma analogia com os chips electrnicos de silcio pelo facto de se basearem na produo de matrizes alinhadas de todos os clones que possumos da espcie, isto , numa membrana adequada coloca-se o DNA de cada clone, tipo DOT BLOT ( colocado num nico ponto), fixa-se, ficando com um filtro que contm toda a representao dos clones dessa espcie. Esta tcnica tambm utilizada para fazer uma anlise funcional sobre quais os genes que esto a ser expressos numa determinada clula, em cada momento. A vantagem desta tcnica permitir uma anlise simultnea de milhares de sequncias de cidos nucleicos, tornando-se muito mais rpida do que, por exemplo, uma anlise de Southern. - Clonagem posicional Clonagem gnica baseada na determinao, o mais aproximada possvel da sua posio Partindo de marcadores (j mapeados em ligao gnica) Pesquisa de sequncias codificantes

Com estas tcnicas vamos tentar descobrir a posio de determinados genes no genoma da espcie. O termo clonagem posicional vem do facto de se pretender a clonagem de um determinado gene (desconhecido) baseada na obteno da posio desse gene. A anlise parte da determinao do mapa de ligao de um determinado gene com um conjunto de marcadores j identificados, isto , a sua posio nos vrios clones da espcie conhecida. 2 tcnicas: - Chromossome Walking - Chromossome Jumping A clonagem em si no nos diz qual o gene, isto , o que ns temos so s sequncias de pares de letras. A maior parte do genoma no codificante.

Chromossome Walking Vamos determinar, progressivamente, a sequncia nos vrios clones. Conjunto de clones que correspondem a uma determinada zona do genoma. O que se faz , partir de uma sequncia conhecida, geralmente um marcador, uma hibridao procurando dentro de uma biblioteca genmica... A partir de um clone isolar um pequeno fragmento, proceder sua subclonagem para pesquisar no resto da biblioteca genmica. O ideal ter dois marcadores ligados aos genes, um de cada lado. Chromossome Jumping reas dificilmente clonveis (DNA repetitivo) Digesto com enzimas de restrio Circularizao dos fragmentos Corte e clonagem das extremidades Jumping library A ideia a mesma e surge pelo facto de determinadas zonas do genoma no serem facilmente clonveis, ou mesmo impossvel de o ser. H regies de DNA repetitivo que no se conseguem clonar, isto , a partir de um fragmento, cortado de forma mecnica ou com enzimas de restrio, impossvel fazer a ligao a um vector j aberto, pois pode haver recombinaes e perde-se o fragmento. No se faz clonagem de toda a sequncia do genoma, mas corta-se, com enzimas de restrio, fragmentos de tamanho razovel (grandes) que contm as zonas que so dificilmente clonveis e circularizar (promover o fecho da sequncia de DNA). Seguidamente, corta-se a sequncia eliminando toda a regio no clonada, e o pequeno fragmento resultante, por ter menor tamanho e no conter DNA repetitivo, vai ser clonado num vector apropriado.

O subclone vai ser utilizado como veculo de hibridao, isto , o seu DNA vai ser utilizado para hibridar com uma segunda regio dos tais fragmentos de restrio quando a sequncia foi cortada, permitindo identificar um segundo ponto de salto para continuar a aproximar do tal gene que interessa estudar. O fragmento de restrio, que se inicia com este segundo ponto de salto, vai ser circularizada, e assim sucessivamente, at nos aproximarmos dos genes. Sequnciao do genoma: - manual - automtica

MUTAO

MUTAO PONTUAL alteraes a nvel da sequncia do DNA que no so corrigidas, ao contrrio do que j se disse em relao aos cromossomas que so as aberraes cromossmicas. So de 2 tipos:
1.

transverso no so as mais frequentes. Ocorre a substituio de uma base prica por uma base pirimdica ou vice-versa. Ex: GC TA

O processo de mutao no afecta simultaneamente os 2 nucletidos. O que pode ocorrer, neste exemplo, o G sofre uma transverso e substitudo por uma timina (pirimidina) e passa a no ocorrer emparelhamento entre o T e o C e, na replicao do DNA seguinte, quando h separao das cadeias o T que estava com a A vai ser complementado por uma A. A mutao tambm pode ocorrer com a citosina que tinha sido substituda originalmente por uma adenina e portanto ficava um par GA e na replicao seguinte que o G era substitudo pela T.
2.

transio mais frequentes. Substituio de uma base prica por outra prica ou substituio de uma pirimidina por outra pirimidina. Ex.: GC AT

Tanto poderia ter sido a guanina a sofrer a mutao e ter sido substituda por uma adenina ficando AC e depois na replicao seguinte a C substituda pela T ou tambm podia ter sido a citosina a ser substituda pela timina. Sempre dentro das purinas ou das pirimidinas. 3. Adies ou deleces nucleotdicas Em vez da substituio de um nucletido pode aparecer uma base extra ou vrias; ou a deleco de uma ou vrias bases. Ex.: 211delG deleco de uma guanina na posio 211 da sequncia nucleotdica.

MUTAO NONSENSE

Qualquer tipo das mutaes referidas anteriormente pode originar este tipo de mutao. Alterao de um tripleto funcional para um codo stop. (tripleto = sequncia de bases na cadeia do DNA e codo = sequncia de tripletos de bases no RNA mensageiro. ) ex.: TAT - Tyr TAA - stop

MUTAO MISSENCE

Ocorre a substituio do aminocido que est codificado. Ex.: y358C ou Tyr358Cys na posio 358 encontrava-se inicialmente uma tirosina que vai ser substituda por uma cistena. As posies so j da protena e no da sequncia nucleotdica uma vez que estamos a falar de aminocidos. Muitas vezes os codes stop so abreviados por um * ex.: Tyr358* Quer isto dizer que o codo que codificava a tirosina deu origem a um codo stop (na posio 358). MUTAES SILENCIOSAS

So a designao dada a qualquer tipo de alterao da seq. Nucleotdica que no provoca a alterao do aminocido codificado. So consequncia da redundncia do cd. Gentico. A redundncia manifesta-se no facto de vrios codes poderem codificar o mesmo aminocido. Geralmente esta redundncia ocorre a nvel da 3a posio do tripleto. Exemplo: 5 GAT 3 - Asp 5 GAC 3 - Asp MUTAO FRAMESHIFT

- Qualquer alterao que altera a grelha de leitura aberta (ORF) Geralmente provoca mutaes missence e/ou nonsense. Quando se altera a grelha de leitura os tripletos a partir de determinado momento ficam alterados e por isso, ou se codificam aminocidos diferentes ou aparece o codo stop prematuro. Uma mutao que d origem a um codo stop mas que no origine uma alterao da grelha de leitura no pode ser considerada mutao frameshift. MUTAO SOMTICA

Que ocorre em clulas somticas - so todas as clulas que no so clulas germinativas (clulas da linhagem dos gmetas) No transmitida descendncia. Dependendo do momento em que ocorre, pode afectar um n. varivel de clulas. Se a mutao for muito precoce no desenvolvimento embrionrio pode afectar um orgo inteiro ou uma grande parte das clulas desse ser; se a mutao ocorrer depois do nascimento afecta um nr restrito de clulas. So responsveis por tumores ou pelo aparecimento de doenas de uma fase mais tardia da vida dos indivduos. MUTAO GERMINAL

Que ocorre nas linhagens celulares gamticas Eventualmente transmitida descendncia Relacionado com estes 2 tipos de mutao: Mutao Perda da Heterozigotia (LOH) Etiologia gentica de doenas recessivas em que herdado 1 alelo mutante germinal a partir daqui heterozigtico (1 alelo normal e 1 mutante) no manifesta a doena

A doena ocorre (manifesta-se) por um evento de mutao somtica no alelo normal, perdendo-se assim a heterozigotia protectora. Ocorre qdo um dos pais portador da doena ou quando tem mesmo a doena e o outro pai no . CITOGENTICA a rea da gentica que estuda os cromossomas 1.Morfologia dos cromossomas 2.Caritipo normal 3.Aberraes cromossmicas (qualquer alterao verificada a nvel da estrutura ou da morfologia dos cromossomas) 1. Morfologia dos cromossomas Em Citogentica normal trabalhar com cromossomas metafsicos (com 2 cromtides ou cromatdeos) onde cada cromossoma constitudo por 2 cpias exactamente iguais, em termos genticos. Num cromossoma metafsico, como em qualquer outro cromossoma, possvel definir 3 zonas: telmeros (extremidades dos cromossomas), centrmero e braos (longo e curto). Telmero Brao curto (p) Centrmero Brao longo (q) p - pettit

2 cromtides telmeros importantes para a manuteno da integridade dos cromossomas (envelhecimento); no contm informao codificante. centrmeros regio onde o cromossoma reduz o seu dimetro (constrio primria, na medida em que, podem existir outras constries secundrias que no so centrmeros) e regio que se liga s fibras do fuso acromtico, permitindo a migrao dos cromossomas para os plos da clula durante o ciclo celular. Quando os telmeros dos cromossomas quebram, devido a doenas genticas, estes tm tendncia a juntarem-se topo a topo a outros que tambm no tm proteco a nvel das extremidades sticky chromossomes. Um cromossoma sem centrmero (acntrico) perde-se na mitose pois no tem capacidade de migrar para os plos da clula, na medida em que no se liga s fibras do fuso acromtico.

Parmetro de distino entre o brao longo e curto: tamanho. Nos cromossomas acrocntricos (centrmero na extremidade) no faz sentido a distino em braos p e q. Regies e Bandas Bandas tcnicas de colorao diferentes que do origem a padres da bandas especficas. Cada cromossoma tem o seu padro de bandas definido. Regies - so ordenadas a partir do centrmero em direco ao telmero e, para cada, regio est definida um padro de bandas especfico. Xp 13 - cromossoma X, brao curto (p), regio 1 e banda 3. (nomenclatura nos cromossomas sub-metacntricos) 133 - cromossoma 1, regio 3, banda 3 (nomenclatura nos cromossomas acrocntricos) O padro de bandas diferente consoante o tipo de colorao utilizado. Tipos de cromossomas
-

cromossomas sexuais (que definem o sexo dos indivduos) - mamferos X e Y ( - XX - XY) - aves ZeW ( - ZW - ZZ) - sexo homogamtico - cromossomas sexuais iguais - sexo heterogamtico cromossomas sexuais diferentes autossomas (no sexuais) - agrupados em pares homlogos (similares na morfologia e no padro de bandas)

A classificao homo/heterogamtico faz-se quanto ao tipo de gmetas formados no indivduo. Por exemplo, a gata homogamtica na medida em que forma apenas gmetas X, j a galinha heterozigtica porque forma gmetas Z e W. O cromossoma Z equivalente ao cromossoma X, quer em tamanho quer em composio gentica. J o cromossoma Y tem como equivalente nas aves o cromossoma W. Morfologia dos cromossomas: baseia-se, fundamentalmente, na posio do centrmero nos cromossomas - metacntricos: centrmero a meio do cromossoma, sendo os braos de tamanho praticamente igual (ex.: cromossomas 7 e 12 dos equinos)
- sub-metacntricos: centrmero deslocado, dando origem a um brao curto e a um longo (ex.: cromossomas 3 e 4 dos equinos)

- acrocntricos: centrmero est localizado praticamente numa das extremidades do cromossoma (ex.: cromossomas 15 e 21 dos equinos e a maioria dos cromossomas dos bovinos) - telocntricos: centrmero na extremidade do cromossoma

- microssomas (aves) A diferena entre os cromossomas acrocntricos e telocntricos est na existncia ou no de material gentico para alm do centrmero, respectivamente. No entanto, como a distino entre eles muito difcil, convencionou-se atribuir a terminologia acrocntricos para classific-los. Os metacntricos englobam os cromossomas com centrmeros centrais ou perto do centro, pois h ocasies em que se torna difcil a classificao da posio do centrmero (central ou no). Nos sub-metacntricos o centrmero ocupa uma posio mais prxima de uma das extremidades. Microssomas so autossomas de pequenas dimenses caractersticos das aves onde impossvel visualizar as bandas. No se consegue fazer a distino entre eles mas o seu nmero total conhecido. Caritipo representao fotogrfica dos cromossomas metafsicos de um indivduo, ordenados e numerados de acordo com o seu tamanho e morfologicamente de acordo com base em convenes internacionais. O nmero total de cromossomas designado 2n, em que n igual ao nmero de pares de cromossomas. Cada espcie tem um nmero caracterstico de cromossomas 2n. No gato os cromossomas esto ordenados em 6 grupos (de A a F); 2n = 38 Grupo A - 3 cromossomas sub-metacntricos Grupo B - 4 cromossomas sub-metacntricos Grupo C - 2 cromossomas metacntricos Grupo D - 4 cromossomas metacntricos Grupo E - 3 cromossomas metacntricos Grupo F - 2 cromossomas acrocntricos X sub-metacntrico Y metacntrico Em todos os caritipos os cromossomas X e Y, Z e W, esto colocados parte. Em algumas espcies, como no caso do Homem e do gato, os cromossomas podem ser classificados ainda em grupos, noutras os cromossomas so apenas numerados sem mais algum tipo de agrupamento (ex.: bovinos, 2n=60; e porcos) Ideograma representao grfica do padro de bandas caracterstico de cada par de cromossomas corados de acordo com tcnicas especficas tcnica de colorao em bandas. Tcnica de colorao em bandas As bandas resultam de vrias tcnicas de colorao. Revelam um padro de regies coradas claras e escuras (negativas e positivas, respectivamente).

Bandas de baixa, mdia e alta resoluo - cromossomas profsicos para a colorao (em vez de cromossomas metafsicos) - agentes inibidores da condensao da cromatina (agentes intercalantes como o Brometo de Etdeo). Estes agentes intercalam-se na molcula de DNA, entre as bases, impedindo o seu enrolamento e, consequente, a sua condensao. - baixa resoluo: difcil a identificao das bandas.

A razo do aparecimento destas bandas no est ainda muito bem esclarecida, mas parece resultar das interaces entre as protenas e o DNA, nomeadamente o tipo de condensao que ocorre numa regio especfica do cromossoma. A ligao do DNA a protenas histnicas e no histnicas vai resultar em padres de condensao mais ou menos fortes e, por consequncia, em padres de colorao diferentes. Por outro lado, o prprio contedo nucleotdico da sequncia de DNA tambm se ... de alguma importncia para o padro de bandas obtidos (bandas positivas ou negativas), isto , uma zona mais rica em Adenina e Timina ou Guanina e Citosina parece refletir no padro de bandas obtido. So utilizados cromossomas profsicos porque estes se encontram menos condensados sendo assim mais fcil a visualizao das bandas. O brometo de etdeo um dos agentes mais utilizados nos gis de agarose, pois permite a visualizao dos fragmentos de DNA que, medida que migram no gel, o captam. Esses fragmentos adquirem ento a capacidade de fluorescncia quando expostos radiao UV. Colorao em Bandas Q Quimacrina corante fluorescente aos UV Bandas de fluorescncia intensa em regies de AT e de fluorescncia reduzida em regies ricas em GC. Bandas intensas correspondem s bandas G positivas. Colorao em Bandas G (mais frequente) Giemsa aps tratamento proteoltico (tratamento onde se tenta remover a ligao do DNA s protenas na cromatina Bandas positivas cromatina mais condensada ricas em AT, poucos genes expressos. Bandas negativas ricas em GC, muitos genes expressos Bandas GTG (variao da tcnica das bandas G) tripsina (tratamento proteoltico), Giemsa (colorao). O padro obtido nas bandas Q igual ao das bandas G, a diferena reside no tipo de mtodo utilizado para a sua visualizao, UV ou o corante Giemsa. Tcnicas de colorao de bandas (cont.) As bandas podem ser positivas ou negativas, de baixa ou alta resoluo.

Bandas Q baseadas na emisso de uma fluorescncia quinacrina. Tm uma correspondncia com as Bandas G que so mais frequentes no estudo dos caritipos Acaba por haver um paralelismo entre bandas G e Q geralmente so coincidentes. Bandas G relao entre as bandas positivas (escuras) e regies onde geralmente os genes so pouco expressos (eventualmente porque h poucos genes nessas regies) ao contrrio das bandas claras (negativas) que so zonas de maior expresso gnica (h relao com A-T e G-C). Ex de bandas G em galinha: a determinao das bandas com base nos ideogramas fcil mas quando se passa para a anlise dos cromossomas complicado. necessria uma anlise de cromossomas mais ou menos condensados , cromossomas pr-metafsicos ou metafsicos, nos quais o padro de bandas mais perceptvel. Bandas R - Padro de bandas inverso comparado com as bandas G e Q - Bandas RBG: bromodeoxiuridina, Giemsa. Tcnicas para obteno de bandas R : uma delas d origem s bandas RBG e depois colorao tambm com o Giemsa. teis para determinar as extremidades dos cromossomas porque se num cromossoma a ltima banda do telmero uma banda negativa por vezes no fcil determinar a terminao para saber por exemplo se se trata de um cromossoma acrocntrico ou sub-metacntrico. Portanto, se fizermos uma tcnica de colorao por bandas R, essa banda negativa tornar-se- positiva e d-nos uma melhor ideia da terminao do telmero do cromossoma. Bandas T Coram essencialmente os telmeros. til tambm para a distino entre cromossomas acrocntricos e sub-metacntricos. Bandas C - Coram os centrmeros (heterocromatina). - Heterocromatina- designao dada s regies de cromatina altamente condensada - Tratamento energtico com extraco de DNA e protenas As regies onde no h colorao ou a colorao mais fraca so designadas de eucromatina (regies onde a cromatina n to condensada). Regies de eucromatina nas pores abertas do cromossoma e regies de heterocromatina nas regies fechadas do cromossoma. H dois tipos de heterocromatina

facultativa aquela que em determinados momentos do ciclo da clula se encontra sob a forma de heterocromatina mas em determinas alturas passa a eucromatina. Ou seja, so regies dos cromossomas que podem estar activas ou inactivas e portanto a sua designao de heterocromatina facultativa vem desse motivo. Constitutiva geralmente mantm-se assim por toda a vida da clula, so regies que se encontram sempre condensadas e uma delas a regio dos centrmeros. Quando se faz uma colorao com bandas C cora-se a heterocromatina essencialmente a nvel dos centrmeros.

Este tratamento de bandas C baseia-se essencialmente numa extraco muito forte de DNA e de protenas e portanto ficamos apenas com a colorao dos centrmeros facilitando a distino entre os vrios tipos morfolgicos de cromossomas. Bandas N ou NOR ou AgNOR - Coram as regies dos organizadores nucleolares; local de produo do nuclolo; onde so montados os ribossomas. - Ricos em genes por rRNA - Colorao com Giemsa e prata. Tm inmeras cpias de genes para RNA ribossomais. Constituem o local de produo do nuclolo estrutura relativamente grande a nvel do ncleo. Pode haver mais do que um por ncleo. So os organitos celulares onde se produzem os ribossomas que depois passam para o citoplasma. A produo do nuclolo est a cargo de regies do cromossoma ricas em rRNA que se chamam NOR. H assim uma cadeia: os organizadores nuclolares (NORs) produzem nuclolos que por sua vez so o local de montagem dos ribossomas. Ao nuclolo chegam no s os RNA ribossomais (rRNA) produzidos a nvel dos organizadores nucleolares (NORs) como tambm protenas que so importantes para a montagem do ribossoma. Designao de AgNORs vem da tcnica de colorao que se baseia essencialmente da colorao com prata e depois utilizando tambm o Giemsa. (AgNORs nos cromossomas no cavalos encontram-se no cromossoma 1, 25 e 30, por exemplo.) A tcnica de colorao de AgNORs til tambm em patologia nomeadamente porque revela no caso dos tumores malignos um erro derivado ao tumor, muitas vezes pela acumulao em excesso de AgNORs, isto , estas bandas que tm um nr determinado e fixo podem parecer mais se a clula um clula tumoral essencialmente devido a erros e portanto acumulao de pares extra de cromossomas etc. O mesmo se passa em nuclolos onde clulas tumorais tm uma maior carga de nuclolos do que uma clula normal. Caritipos normais Espcie Cromossomas Meta e submetacntricos 0 6 12 0 3 0 Cromossomas acrocntricos

Co 78 Gato 38 Porco 38 Cabra 60 Ovinos 54 Bovino 60

38 2 6 29 23 29

Cavalo 64 Burro 62 Coelho 44 Galinha 78 (30 microcromossomas)

13 24 19 7

18 6 2 1

Co exemplo tem 38 pares de cromossomas acrocntricos e estes so s os autossomas. Tem mais um par de cromossomas sexuais. Tem no total 39 pares. Os microcromossomas das aves no so distinguveis entre si. Mula = (cavalo x burra) ou (gua x burro) A mula tem 63 cromossomas (burro/a n=31 e cavalo/gua n=32, logo 31+32= 63 hbridos viveis.) Os cromossomas so ordenados de forma sequencial no h grupos, por tamanho decrescente e depois colocar parte os sexuais. Os cromossomas sexuais so geralmente metacntricos ou sub-metacntricos. No caso do co o cromossoma X sub metacentrico e o Y tambm mas os braos so praticamente iguais, aparentando assim ser um cromossoma metacentrico. Caritipo do gato Em termos de regras de elaborao de caritipos das nossas espcies aquela que tem as regras mais complexas, isto , so definidos conjuntos de grupos que no essencial dividem cromossomas morfologicamente similares. Grupo F, por exemplo, engloba os 2 pares de acrossomas . Grupo E so metacentricos pequenos Grupo D so sub metacentricos que relativamente ao grupo B que tb composto por sub metacentricos mas so de menor tamanho Grupo A so sub metacentricos mas o brao p ligeiramente maior Grupo C so cromossomas metacentricos. Cromossoma x um cromossoma sub metacentrico e o Y metacntrico. Porco 12 Sub metac ou metac e 6 cromossomas acrocentricos Os cromossomas sexuais so ambos sub metacentricos Bovino Todos acrossomas, so tambm numerados sem interrupo de 1 a 29 e por tamanhos. Do par 1 acrocentrico maior ao par 29 que o mais pequeno. Cromossomas sexuais so sub metacentricos para o X e metacentricos para o cromossoma Y. Aberrao frequente: fuso de um cromossoma 29 com um cromossoma 1 e portanto d origem a um cromossoma sub metacentrico. Caprinos Idntico ao do bovino Todos ordenados Ovinos

3 Pares metacentricos ou sub metac Restantes todos acrocentricos Cavalo 2 Grandes grupos, os primeiros 13 pares so submetac ou metac e os restantes pares so acrocentricos Cromossomas sexuais so sub metacentricos Burro Numerao sequencial Pares metacentricos e acrocentricos No caso da Mula no existe emparelhamento entre muitos dos cromossomas, nomeadamente, porque lhes falta um cromossoma homlogo, ocorrendo assim problemas na meiose o que leva infertilidade dos indivduos. Coelho e galinha? ABERRAES CROMOSSMICAS NUMERICAS Aberraes cromossmicas numricas (alteraes do caritipo)

Euploidia variao por mltiplos de nmero haplide (n) de cromossomas.

Aqui todo o caritipo sofre aumento ou diminuio por conjunto completo de cromossomas. Isto causa de morte embrionria, visto no ser compatvel com a vida.

1. Haploidia alterao do n de cromossomas: reduo do n normal. As haploidias apenas so normais no caso dos gmetas. 2. Poliploidia alterao do n de cromossomas: aumento de n.
Triploidia Tetraploidia Pentaploidia

No caso da Galinha temos a situao normal de diploidia com 78,ZW Em haploidia temos 39,ZO em que cada um dos pares de homlogos tem apenas um representante (afecta os cromossomas sexuais). Em triploidia temos 117,ZZW ou117,ZWW (afecta tambm os cromossomas sexuais) Em tetraploidia temos 156,ZZWW (afecta tb os cromossomas sexuias) As situaes de poliploidia so incompatveis com vida nos mamferos. Frmula cariotpica descrio simblica do caritipo das espcies (indica-nos o que se passa a nvel desse caritipo) A frmula cariotpica normal tem sempre o n total de cromossomas do indivduo e, separados por uma vrgula, os cromossomas sexuais. (NOTA: o n total de cromossomas inclui os cromossomas sexuais)

Por exemplo o Gato tem a frmula cariotpica 38,XY e o Bovino 60,XX (vaca, neste caso). As euploidias referem sempre o n alterado de cromossomas. Os cromossomas sexuais quando esto a mais ou a menos so representados por extenso. As euploidias geralmente so incompatveis com a vida, mas h 2 excepes: - A Galinha que pode ter indivduos triploides viveis (que atingem a idade adulta); a mortalidade elevada nestas linhas triploides- no vantajoso para os animais. - Peixes em que temos poliploidia induzida por choque trmico (calor ou frio): no ocorre disjuno na meiose. Os indivduos resultantes so triploides, so estreis (no conjugao dos pares cromossmicos) mas viveis e com boa produo ao nvel do desenvolvimento corporal. No gastam energia com a reproduo sendo utilizada exclusivamente no crescimento. Podemos tb obter indivduos tetraploides, estes so frteis, com gmetas diploides, O cruzamento destes com animais diploides origina indivduos triploides que so os mais produtivos, e que nos interessam. Em mamferos isto no acontece em todas as clulas mas pode ocorrer em clulas tumorais. Aneuploidias variao no nmero de cromossomas mas no por mltiplos do n haploide (n). por n inferior a n. Aumento ou diminuio do n de cromossomas restrito a um pequeno n de pares de cromossomas. Estas alteraes no so completas do conjunto de cromossomas. So importantes causas de morte embrionria visto serem incompatveis com a vida. Aps reabsoro do feto a fmea volta a entrar no cio, sendo a produtividade destas fmeas geralmente mais baixa. Tipos de aneuploidias:

1. Nulissomia ausncia completa de ambos os membros do par de

cromossomas. 2. Monossomia no par s est presente um cromossoma (ausente um dos membros do par) 3. Polissomia aumento do n de cromossomas do par. Morfologicamente so iguais (geneticamente talvez no) mas podem emparelhar entre si na meiose. - Trissomia (3 cromossomas num par) - Tetrassomia (4 cromossomas num par) Por exemplo no Gato, podemos ter a situao de nulissomia no par 3 (este no apresenta cromossomas). Podemos tb ter nulissomias nos cromossomas sexuais. Naturalmente que no h nulissomias compatveis com a vida. As monossomia dos cromossomas sexuais so representadas por um O. No caso do Gato teramos 37,XO Na espcie humana esta situao de ausncia de um cromossoma X chamada de Sndroma de Turner tendo consequncias graves como atraso mental. Nos animais habitualmente apenas temos problemas de infertilidade. Isto ocorre apenas nas fmeas.

As monossomias, so letais excepto se for no cromossoma X. As polissomias mais frequentes so as trissomias. Por exemplo, na gua, uma situao de trissomia no cromossoma X seria: 65,XXX As trissomias dos cromossomas sexuais so compatveis com a vida, no tendo estes animais graves problemas fenotpicos, sendo inclusivamente frteis. Para alm da elaborao do caritipo podemos detectar as trissomias se olharmos para os corpsculos de Barr condensaes da cromatina encostada parede nuclear, corresponde ao cromossoma X inactivo. Trissomia do cromossoma X so habitualmente frteis, animais com trissomia nos X e Y no so. Como j se disse em aulas anteriores apenas um dos cromossomas X das fmeas permanea activo, o que inactivado aparece sob a forma de cromatina sexual ou corpsculos de Barr. Na trissomia encontramos 2 corpsculos de Barr, em vez de um, que seria normal. Na tretassomia encontramos 3 corpsculos de Barr, e assim sucessivamente. Cada clula s pode ter um cromossoma X activo aparecendo o outro sob a forma de corpsculo de Barr (ou vrios corpsculos no caso de polissomia) A trissomia nos cromossomas sexuais no homem tem a designao de Sndroma de Klinefelter sendo os indivduos altos e com atraso mental. Fenotipicamente so machos. Nos animais leva infertilidade mas sem outros problemas. No caso dos Gatos ( 39,XXY ) podem apresentar pelagem tartaruga (caractersticas das fmeas) devido existncia do alelo para a cor laranja num cromossoma X e para a cor preta no outro X. Qualquer macho que ostente esta pelagem apresenta certamente trissomia nos cromossomas sexuais. Estas situaes podem apresentar-se sob a forma de 2 populaes celulares com caritipos diferentes- com origem no mesmo zigoto que sofreu erros na mitose (a disjuno mal feita) mosaicismo. Trissomia nos autossomas so menos frequentes que as sexuais. No caso da espcie humana a mais famosa a do Sndroma de Down ou trissomia 21, que provoca um fentipo caracterstico. Sempre que h trissomia nos autossomas ela ocorre sempre em cromossomas de pequeno tamanho (caso do 21 do homem). Em cromossomas grandes tornam-se letais. Por exemplo temos nos Bovinos temos +18,+23,etc; nos Equinos temos +23,+28,+30,etc. Provocam alteraes graves ao nvel do fentipo. . Trissomias - aneuplidias dos cromossomas sexuais: relacionadas com o facto da inactivao do cromossoma X (existncia de mais ou menos cromossomas X, como no caso do sndrome de Turner); so compatveis com a vida, ao contrrio das aneuplidias dos autossomas (no so viveis e os indivduos no nascem). A maioria das alteraes fenotpicas ligadas s transformaes dos cromossomas sexuais esto relacionadas com perturbaes a nvel da evoluo sexual ou do fentipo sexual dos indivduos. Nomeadamente com situaes de hipoplasia testicular ou ovrica, isto , ovrios ou testiculos mais pequenos que o normal; geralmente com situaes de infertilidade e,

nalguns casos, situaes de intersexualidade, isto , indivduos que, em termos fenotpicos, no pertencem ao padro de um determinado sexo, apresentando caractersticas de um e de outro sexo com maior ou menor grau de incidncia. O criptorquidismo em si no seria muito grave pois um testculo suficiente para que o animal tenha uma fertilidade praticamente normal mas a temperatura mais elevada a que est sujeito o testculo que fica interabdominal geralmente leva ao aparecimento de tumores nesse testculo e portanto implica uma cirurgia. Tambm se podem ver no quadro muitas situaes de mosaicismo, ou seja, uma srie de indivduos que apresentam vrias povoaes com caritipos diferentes. -Aberraes cromossmicas numricas Causas: no-disjuno meitica (muitas destas aberraes cromossmicas numricas devem-se a problemas de separao dos cromossomas homlogos durante a meiose, resultando quase sempre na formao de gmetas desequilibrados; se os dois cromossomas, que deviam segregar para gmetas diferentes, vo para o mesmo lado, ficam um dos gmetas com um cromossoma a mais e o outro sem nenhum dos cromossomas daquele par. A maioria das vezes a infertilidade resulta destas aberraes cromossmicas por parte de alguns dos gmetas dos indivduos no serem completos em termos dos cromossomas.) -meiose I -meiose II - Fmeas: resultado XX/O (Se a no-disjuno ocorre ou na meiose I ou na meiose II formam-se sempre dois tipos de gmetas vulos que no recebem nenhum dos cromossomas X e vulos que recebem os dois cromossomas X) - Machos: a situao pode ser mais complicada e existem vrias possibilidades dependendo da fase em que ocorre a no-disjuno. Meiose I
2 espermatozides sexual sem nenhum cromossoma

Meiose II

2 espermatozides com trissomia nos do cromossoma X) Espermatozides XX (pode gerar Trissomiacromossomas sexuais Ou Espermatozides YY (geralmente no compatveis com a vida)

Espermatozides normais

Polispermia (fecundao de um vulo por dois ou mais cromossomas, originando situaes de poliploidia) Fuso de zigotos (origina situaes de quimerismo com euploidia) No-disjuno mittica (o indivduo pode no ser vivel, se ocorrer quando o embrio pequeno, ou sofrer de um problema localizado que detectado posteriormente quando se faz uma anlise de caritipo por mosaicismo, isto , encontram-se linhas de clulas com caritopos diferentes provenientes dos erros que ocorreram nalgumas clulas durante a mitose, se a no disjuno mittica ocorrer depois do embrio estar formado). Os tumores geralmente so situaes de mosaicismo, ou seja, o resto do corpo tem caritipo normal e a nvel do tumor encontramos umas linhas regulares com alteraes mais ou menos graves geralmente resultado de alteraes a nvel da mitose no s na disjuno.

ABERRAES CROMOSSMICAS ESTRUTURAIS Causas: Translocao recproca (trcp) - troca de segmentos entre cromossomas no-homlogos (geralmente os indivduos tm um fentipo normal porque no ocorre perda de material gentico) Nem sempre estas translocaes recprocas so pacficas pois existem a nvel do controle da transcrio gnica mecanismos de posio e que levam a que, quando um gene sai do seu ambiente (da sua posio normal) e se integra noutro local do cromossoma, haja desregulao da transcrio desse gene. Em todas as sequncias reguladoras existem promotores fortes e fracos e isso pode levar a que um gene, que geralmente est ligado a uma regio de regulao com uma determinada caracterstica, passe para outra posio passando a estar sob a influncia de sequncias reguladoras por exemplo mais fortes, o que leva a que esse gene se expresse mais do que devia e ocorram problemas apesar de no haver perdas de material gentico e, portanto, nem sempre o fentipo normal. A este propsito a Trissomia 21, no caso da espcie humana, pensa-se que quase no h perda do material gentico, antes pelo contrrio, um cromossoma 21 que est a mais, e uma das teorias para explicar o fentipo desses indivduos o facto de existir um excesso de determinados genes que deveriam expressar-se de uma forma limitada e, pelo facto de existirem mais cpias que o normal, vo expressar-se mais e os efeitos da expresso de alguns desses genes que sero responsveis pelo fentipo dos indivduos com Sndrome de Down.

- Um outro conceito ainda na translocao recproca e que se aplica a muitas destas aberraes cromossmicas o de translocao heterozigtica ou homozigtica e que refere o facto destas aberraes cromossmicas poderem afectar ambos os membros dos pares de homlogos translocao homozigtica- ou afectarem apenas um dos membros dos pares de homlogos translocao heterozigtica -. Nas translocaes recprocas homozigticas no existem problemas na fertilidade pois ambos os cromossomas passam a formar dois cromossomas novos, com bocados de um e de outro e, portanto, a nvel da meiose, a segregao desses cromossomas no tem problemas. Nas heterozigticas h uma reduo significativa da fertilidade dos indivduos resultante da tentativa dos cromossomas emparelharem entre si na meiose e geralmente o que acontece a formao do cromossoma chamado quadrivalente (resulta do emparelhamento entre os cromossomas translocados com os cromossomas normais que no sofreram translocao, por homologia de regies). Os problemas surgem na altura da segregao, existindo trs alternativas com designaes diferentes:
-

Segregao alternada entre centrmeros homlogos e no homlogos, dando origem produo de gmetas equilibrados porque um dos gmetas recebe dois cromossoma e o outro gmeta recebe dois cromossoma aberrantes mas que contm todos os genes que esto envolvidos nesta translocao. Segregao adjacente 1 afecta centrmeros homlogos e o resultado a formao de gmetas desequilibrados. Os gmetas no

possuem todos os genes que deveriam e o indivduo no ser vivel pois faltar-lhe-o uma quantidade de genes importantes. Segregao adjacente 2 afecta cetrmeros no-homlogos e o resultado tambm a formao de gmetas desequilibrados.

1 translocaes robertsoniana ou fuso cntrica (trob) . Fuso centromtrica de 2 cromossomas acrocntricas produzindo 1 metacntrico. . Translocao heterozigtica ou homozigtica. Reduo do nr total de cromossomas (-1 trob heterozigtica, -2 trob homozigtica). . Fentipo normal. Exemplo: dois cromossomas acrocntricos, a fuso dos centrmeros origina um cromossoma submetacntrico. Geralmente no h perda de material gentico mas pode ocorrer com perda da parte do centrmero (como no exemplo). Tambm pode ocorrer perda de um dos centrmeros. Da mesma maneira que a translocao cclica utiliza os termos translocao heterozigtica e homozigtica, indicando no primeiro caso, quando s um dos membros dos dois pares de cromossomas que est afectado e que sofreu a translocao, e a translocao diz-se homozigtica quando ambos os membros dos pares de homlogos sofreram essa aberrao cromossmica. O resultado que quer num caso quer noutro h sempre uma reduo do nr total de cromossomas se a translocao heterozigtica h menos um cromossoma, se homozigtica h menos 2 cromossomas. O fentipo dos indivduos normal. H uma reduo da fertilidade. Um tipo de translocao mto frequente em bovinos a 1-29 e que corresponde fuso de um cromossoma do par 29 com um cromossoma do par 1. o resultado um cromossoma sub metacntrico. H reduo da fertilidade tudo acontece a nvel do emparelhamento meitico entre o cromossoma translocado e os cromossomas normais 1 e 29, isto no caso da translocao heterozigtica, e quando h um emparelhamento destes cromossomas translocados com os normais forma-se um trivalente. Exemplo: Caprino com translocao nos cromossomas 9 e 12 Podem ocorrer 2 situaes : ou a segregao se faz de tal maneira que para um gmeta vai o translocado e para o gmeta os cromossomas normais formao de gmetas equilibrados possuem uma cpia de cada um, sem consequncias para a fertilidade. No entanto, mtas vezes ocorrem segregaes aberrantes de tal maneira que o cromossoma translocado no se separa do que est emparelhado com ele formam-se 2 gmetas desequilibrados. Quando houver fecundao com um gmeta normal d-se origem a uma trissomia ou, no outro gmeta, d origem a uma monossomia. Com raras excepes as trissomias e as monossomias so incompatveis com a vida e o resultado que estes embries morrem, so inviveis. Translocao robertsoniana . Reduo da fertilidade . Gmetas desiquilibrados por segregao meitica aberrantes de trivalente trissomia/monossomais

2 Fisso Cntrica . Separao pelo centrmero de um cromossoma metacntrico, produzindo 2 acrocntricos . No se trata de trissomia Corresponde separao transversal do centrmero de um cromossoma geralmente metacntrico produzindo 2 acrocntricos. a situao inversa translocao robertsoniana. O indivduo tem um fentipo normal, no h perda de material gentico. Tem uma outra designao: Isocromossomas (i) Quebra transversal do centrmero de um metacntrico ; Produo de 2 isocromossomas. Geralmente 1 perde-se por diviso desigual do centrmero.

3 Inverso (inv) Quebra do cromossoma em 2 locais e rotao 180 do fragmento (volta a integrarse no cromossoma)
-

inverso pericntrica o fragmento inclui o centrmero inverso paracntrica o fragmento no inclui o centrmero, por exemplo, abrange apenas uma parte do brao longo do cromossoma.

A deteco de inverses s possvel com base na colorao de cromossomas em bandas. Consequncias das inverses: . gmetas desequilibrados . emparelhamento meitico com formao de ansa para haver emparelhamento de regies homlogas nos cromossomas em questo. Problema do emparelhamento: se houver crossing over, um segundo emparelhamento, na regio da ansa, os resultados so a formao de 2 gmetas normais(que contm todas as regies do cromossoma, no h perdas de material) mas existem outros 2 tipos de gmetas com duplicaes e por outro lado deleces. Resultado: gmetas desequilibrados, problemas na meiose. Na inverso paracntrica o fragmento n abrange o centrmero. O resultado, qdo ocorre o crossing over dentro da ansa temos os cromossomas emparelhados com a ansa o resultado um cromossoma com 2 centrmeros (dicntrico) e um outro cromossoma que no tem centrmero (acntrico). Nas inverses pericntricas duplicao e deleces parciais, por sobrecruzamento na regio do loop. Nas inverses paracntricas produo de cromossomas acntricos (ace) e dicntricos com deleces, por sobrecruzamentos na regio do loop.

Os cromossomas acntricos no se ligam s fibras do fuso acromtico e portanto n sofrem a migrao para os plos das clulas filhas e por outro lado quer num caso quer noutro h grandes regies do cromossoma que so delectadas e os indivduos no viveis os que resultarem da reproduo com estes gmetas desequilibrados. 4 Deleco (del) Quebra de cromossomas e perda do fragmento . Deleco intersticial quebra em 2 locais do cromossoma e perda do fragmento . Deleco terminal apenas 1 local de quebra Diagnstico colorao em bandas e muitas xs bandas de alta resoluo para os cromossomas que esto pouco condensados 5 Duplicao (dup) Duplicao de uma regio do cromossoma uma a seguir outra Possvel origem: sobrecruzamento em ansa de cromossomas com inverso pericntrica. 6 - Cromossoma em anel (ring) Quebra do cromossoma, perda das extremidades (neste caso os telmeros e os centrmeros) e o fragmento resultante tem tendncia a voltar a unir-se anel Os telmeros so partes mto importantes nos cromossomas uma x que cuidam da manuteno da integridade do cromossoma. Sempre que h quebra dos telmeros o cromossoma passa a ser pegajoso e tem tendncia a unir-se a outro cromossoma que tenha sofrido o mesmo - cromossoma em anel . SITIOS FRGEIS Consistem em constries secundrias (a primria geralmente o centrero, da ser secundria) de um cromossoma com separao parcial desta regio e que ocorrem em locais especficos de cromossomas especficos. Separaes parciais em locais especficos de alguns cromossomas. Geralmente no h separao total. S so visveis se se fizer uma cultura das clulas antes de se elaborar o caritipo em meios que provocam a depleco de alguns tipos de nucletidos como o caso da timina. Tornadas visveis pela depleco ou inibio de percurssores de nucletidos (fluorodioxiuridina). No meio de cultura das clulas utilizadas para elaborar o caritipo. O cromossoma X mto susceptvel ao aparecimento destes stios frgeis. Os stios frgeis: - Herdados de forma mendeliana; um indivduo que tenha um stio frgil transmite-o descendncia - Locais com maior frequncia de quebras e unies entre cromossomas (?); - Co Xp22; Xq21; Xq 21.2; homologo no homem - X-frgil: expanso de repeties trinucleotdicas instveis intragnicas.

Herdados de forma mendeliana porque estes locais frgeis so locais de expanso de regies trinucleotdicas a nvel de um determinado gene. Estado de pr-mutao instabilidade da regio na meiose, eventualemnte afectando a descendncia. Estado de mutao provoca uma metilao, consequente inactivao gnica e 1 fentipo patolgico. Cromossoma X inactivo das fmeas um cromossoma praticamente todo metilado. No homem nem todos os stios frgeis provocam um fentipo anormal. CROMOSSOMA Y E X. DETERMINAO DO SEXO. TEORIA DE COMPENSAO DE DOSAGEM DO SEX0 Cromossoma Y O cromossoma Y constitudo por: - duas regies pseudo-autossmicas (PAR), localizadas nas extremidades, e que so designadas por PAR 1 e PAR 2 (ficam prximas das regies telomricas, promovendo o emparelhamento homlogo com o cromossoma X); - e uma regio no-recombinante (NRY), que corresponde regio intermdia.

Cromossoma Y Genes O cromossoma Y um cromossoma com poucos genes. O que alguns autores admitem que ter existido um cromossoma antepassado comum ao X e ao Y; com o decorrer da evoluo, o cromossoma Y ter perdido alguns genes, ao contrrio do cromossoma X, que os manteve. Dentro dos genes que constituem o cromossoma Y, podemos falar de dois grandes grupos: - os genes homlogos de X, que, como o nome indica, so genes que possuem um alelo homlogo; - e os genes no homlogos de X. Genes Homlogos de X Os genes homlogos esto localizados nas duas regies pseudoautossmicas. No entanto, existem muitos outros genes na regio NRY.

O macho, sendo portador de um cromossoma X e de um cromossoma Y, possui genes que ora esto localizados num, ora esto presentes no outro; se esta situao no fosse controlada, iria originar um desequilbrio em termos de carga gentica, ou seja, no macho existiriam genes com duas cpias, uma no X e outra no Y, e na fmea, caso o fenmeno de inactivao fosse completo, s haveria um dos alelos a funcionar. Admite-se que todos estes genes que so homlogos de X, no caso da fmea, vo escapar inactivao gnica que ocorre no cromossoma X. E desta forma que se estabelece a igualdade entre sexos: estes genes esto presentes em cpia dupla, ou mais precisamente, com dois alelos funcionais, quer na fmea (um no cromossoma X activo e outro, apesar de ser no cromossoma X inactivo, a funcionar), quer no macho (um alelo a funcionar no cromossoma Y e o outro a funcionar no cromossoma X). Estes genes homlogos de X esto presentes em cpia nica, isto , em todo o cromossoma Y s existe uma cpia para estes genes homlogos; a sua expresso universal (ubqua), querendo isto dizer que estes genes se expressam em todos os tecidos e em todos os rgos, no havendo, portanto, uma expresso restrita a um tecido ou a um rgo. Esta expresso ubqua porque a maioria deles, ou, pelo menos, a maioria daqueles que so conhecidos, tm funes ditas de housekeeping, e que esto relacionadas com o facto destes genes se encarregarem de manter o metabolismo normal das clulas. No tm funes especficas relativamente a um determinado tecido, mas tm que estar presentes em todas as clulas porque so indispensveis ao seu metabolismo normal. Assim se explica, com estas funes, que eles se expressem em todos os tecidos sem especificidade. Genes No Homlogos de X Estes genes existem apenas no cromossoma Y, sob a forma de cpias mltiplas. Existe uma excepo que o gene SRY, que se apresenta como cpia nica apesar de ser no homlogo de X; todos os outros no homlogos de X, geralmente, tm vrias cpias no mesmo gene, localizadas no cromossoma Y. A sua expresso no universal, pois est restrita ao tecido testicular. Estes genes s se expressam a nvel do testculo e a maioria deles, mais uma vez, a maioria daqueles que se conhecem, tm funes especializadas, ligadas determinao do sexo (um exemplo o SRY), espermatognese e tambm fertilidade masculina. A ttulo de curiosidade, no caso da espcie humana, a presena de plos no bordo superior da orelha, uma caracterstica ligada a um gene localizado no cromossoma Y, ao contrrio do que acontece se os plos se encontrarem no interior do canal auditivo (esta caracterstica no est ligada ao cromossoma Y). H ainda uma outra caracterstica que tambm ocorre devido ao gene situado neste cromossoma; trata-se da presena de membranas entre os dedos - membranas interdigitais. Estes genes localizados no cromossoma Y e que apresentam uma expresso exclusiva do macho so designados genes holndricos (expresso restrita ao sexo masculino). Gene SRY (Sex Determining Region) Est ligado determinao do sexo. A sua localizao na maioria das espcies em que conhecida no brao curto (p) do cromossoma Y. Apesar de existirem algumas dvidas relativamente aos mecanismos moleculares de determinao do sexo, admite-se que o gene SRY , talvez, o principal

responsvel pelo desenvolvimento e diferenciao das gnadas indiferenciadas; ele contribui para que estas sigam um rumo que levar, posteriormente, formao das caractersticas sexuais secundrias e sexuais primrias masculinas. A gnada indiferenciada, com todas as potencialidades, que ir dar origem s gnadas e determinar o sexo, pode seguir duas vias: 1- Se no houver nada em contrrio, a evoluo para o sexo feminino (por omisso, ou em ingls, default). Desenvolvem-se os chamados ductos de Mller; a partir destas estruturas anatmicas embriolgicas descritas por Mller, surgem depois todas as estruturas ligadas ao sexo feminino, nomeadamente, as trompas de Falpio, o tero, a vagina, etc. 2- A evoluo no sentido do sexo masculino necessita de uma interveno activa e que est a cargo do gene SRY. Originam-se os canais de Wolff, estruturas embriolgicas, ainda muito primitivas, que vo dar origem aos testculos, ao epiddimo, s vesculas seminais, etc.
Gnada indiferenciada

ducto Mller

ductode de Wolff

O gene SRY no funciona sozinho, uma vez que existe um conjunto de outros tipos de genes envolvidos neste fenmeno de diferenciao sexual, no sentido da formao dos testculos; alguns exemplos so: WT-1, SOX-9, SF-1, etc. Existem muitos genes porque se trata de um processo bastante complexo, o que alis se percebe uma vez que durante o desenvolvimento embrionrio, a espermatognese sempre um fenmeno algo complexo, envolvendo muitos genes, uns activos num determinado momento, outros activos noutro. Actualmente, admite-se que o prprio gene WT-1, e no o gene SRY, que controla todo o processo depois da diferenciao, concluda a formao do testculo. Mas como isso ainda no est bem definido, continua-se a acreditar que o gene SRY um dos principais, seno o principal, apesar de tambm estarem envolvidos outros genes neste processo de diferenciao. Quando se fez uma anlise a nvel molecular protena produzida ou codificada pelo gene SRY, encontrou-se um domnio conservado de ligao ao DNA, o que pressupe que este gene no actuar directamente sobre as estruturas. Ele faz, antes, o controle da regulao gnica de outros genes, estes sim directamente ligados com o fenmeno da manipulao destas estruturas embriolgicas. Este domnio conservado pertence a uma famlia de factores de transcrio, pertencente ao grupo HMG (High Mobility Group). O facto de ele ter um domnio ligado ou presente num conjunto de famlias de factores de transcrio (factores de transcrio so genes ou protenas codificadas por genes que controlam uma transcrio gnica) e o facto deste gene ser um domnio importante na ligao ao DNA atribui ao gene SRY e sua protena uma funo de regulao da expresso gnica de outros genes. De uma forma directa ou indirecta, um dos acontecimentos importantes do que ocorre a seguir a expresso do factor MIS (Mllerian Inhibiting Substance) pelas clulas de Sertoli. Quando se fala em directa ou indirectamente porque ainda no se conhece muito bem, e poder ser a prpria protena e a regulao gnica de outros

genes feita de uma forma directa com o gene SRY, ou sero eventualmente outros genes que regulados por esse SRY iro fazer o controlo do que se passa posteriormente. Como descrito anteriormente, os primrdios embriolgicos que do origem s estruturas sexuais femininas partem dos ductos de Mller; o que o factor MIS vai fazer inibir a diferenciao deste ducto, impedindo que as clulas da gnada indiferenciada sigam o seu caminho para originar clulas de estruturas sexuais femininas. D-se uma atrofia do ducto de Mller e todas as estruturas que ele ia desenvolver (trompas de Falpio, tero e parte da vagina) vo ser impedidas de progredir. Um segundo factor que determinado, mais uma vez, directa ou indirectamente, pelo gene SRY a produo de testosterona pelas clulas de Leydig (quer as clulas de Sertoli quer as clulas de Leydig so clulas do testculo); esta produo de testosterona vai provocar uma diferenciao positiva estimulando a diferenciao do ducto de Wolff. Por um lado existe a inibio da diferenciao do ducto de Mller e, por outro, h um estmulo para a diferenciao dos canais de Wolff, que vo dar origem s vesculas seminais, ao ducto deferente e ao epiddimo, portanto estruturas do testculo. Estes dois factos vo originar a produo de caractersticas sexuais primrias. A testosterona (hormona sexual masculina), para alm de provocar esta diferenciao dos canais de Wolff, tambm responsvel pela masculinizao da genitlia externa, ou seja, as caractersticas sexuais secundrias so determinadas pela sua formao. S que para a testosterona poder actuar necessita de, antes de poder influenciar as clulas, se ligar a receptores de andrognios, receptores esses que so codificados por um gene que est localizado no cromossoma X. Nota: qualquer mutao a nvel deste gene, nos receptores de andrognios, provoca o Sndrome de Masculinizao Testicular. Apesar de o indivduo ter gentipo XY, ter o gene SRY, impedir a produo das estruturas sexuais femininas e produzir testosterona, normalmente no consegue fazer a masculinizao da genitlia externa. O resultado que este indivduo sofre uma diferenciao dos ductos de Mller, produzindo estruturas sexuais femininas, sendo, fenotipicamente, do sexo feminino. Inactivao do Cromossoma X Mary Lyon colocou, em 1961, a hiptese de inactivao do cromossoma X com base em vrios aspectos. Basicamente, o que a teoria diz que dos dois cromossomas X da fmea, um deles sofre o processo de inactivao. Com algumas excepes, esta teoria mantm-se vlida; no fundo ela explica porque que machos e fmeas mantm diferenas fenotpicas to grandes, tendo em conta que a carga gentica difere muito, devido existncia de dois cromossomas X na fmea e s um no macho. Esta teoria tambm chamada Teoria da Condensao de Dosagem do Sexo, uma vez que procura evidenciar porque que a nvel dos dois sexos existe uma compensao, acabando por existir a mesma carga gentica em termos de expresso dos genes. Os principais aspectos da teoria fundamentam que: 1- A inactivao do cromossoma X ocorre numa altura muito precoce do desenvolvimento embrionrio. Geralmente, o perodo em que ocorre a sua inactivao um pouco antes das clulas se converterem no sentido da diferenciao para um determinado tecido ou rgo. Enquanto elas mantm toda a sua potencialidade

gentica de evoluir num sentido ou noutro no h inactivao; um pouco antes desse conjunto de clulas se iniciar em diferenciao para um determinado tecido ou rgo que ocorre a inactivao do cromossoma X. 2- O processo de inactivao aleatrio, isto , tanto pode ser um cromossoma X de origem materna como um cromossoma X de origem paterna a sofrer a inactivao. H excepes: no caso do canguru e de alguns marsupiais sempre o cromossoma X paterno que inactivado, mas esta excepo s serve para confirmar a regra de que o processo de inactivao aleatrio. 3- O cromossoma X inactivo vai aparecer como uma estrutura a nvel do ncleo das clulas chamada corpsculo de Barr. Murray Barr encontrou-o pela primeira vez em neurnios de gatas, surgindo como uma estrutura plano-convexa de cromatina mais condensada junto parede nuclear. Os neurnios de gatos no possem esta estrutura nuclear. Se por acaso existir uma situao de aberrao cromossmica com mais de um cromossoma X, so inactivados todos os cromossomas X (assim, encontram-se vrios corpsculos de Barr, cada um correspondendo a um dos cromossomas X inactivados). 4- O padro de inactivao estvel e irreversvel; isto , depois de ocorrer a inactivao no cromossoma X todas as clulas descendentes daquelas vo manter o mesmo padro de inactivao. Por esse motivo, formam-se clones, ou seja, a partir do momento em ocorre inactivao numa clula, todas as clulas filhas descendentes dessa mantm o mesmo padro de inactivao, originando um clone. Por outro lado, pode-se dizer que as fmeas constituem um mosaico relativamente inactivao dos cromossomas X; numas temos inactivao do X materno, noutras do X paterno, o que provoca algo deste gnero:

A partir da clula totipotente, antes de existir a diferenciao celular, ocorre a inactivao do X paterno, dando origem a um clone de clulas em que o X paterno que fica inactivo; noutro caso, o X materno a ser inactivado, dando origem a um clone de clulas com X materno inactivo, e assim sucessivamente. Sendo o processo aleatrio admite-se que, em mdia, 50% das clulas tm o X materno activo e os outros 50% o X paterno activo (as percentagens podem variar). Um dos efeitos visveis desta inactivao representado pelas gatas com pelagem tartaruga. Esta pelagem caracteriza-se pela existncia de manchas laranja e manchas pretas simultneas, que no podem ser encontradas num macho. O macho ou expressa o laranja (amarelo) ou o preto, mas nunca as duas cores simultaneamente.

O tipo de manchas varia com as gatas. A predominncia de uma cor relativamente outra depende de como se deu a inactivao. As clulas que migram para a hipoderme e depois do origem aos melancitos, dependendo de qual foi o cromossoma X que sofreu inactivao e da percentagem de cada uma delas, que vo originar maiores extenses de manchas pretas ou maiores extenses de manchas laranja. 5- A inactivao determinada pelo gene XIST, e portanto este gene q responsvel pela inactivao do cromossoma X de tal maneira q s se expressa no cromossoma X inactivo, e portanto acaba por constituir uma excepo inactivao do cromossoma X, isto , o cromossoma X est inactivo ; existem genes q se expressam mesma, um deles este X q responsvel pela manuteno deste estado de inactivao, mas existem outros, vimos h pouco qd falmos das regies pseudo-autossmicas e de alguns outros genes tb situados na regio no recombinante do cromossoma Y, so homlogos entre o cromossoma Y e o cromossoma X, e dissmos q por uma questo de compensao de dosagem, fazia sentido pensar q na fmea alguns destes genes escaparo inactivao, e portanto mantm-se activos mesmo estando presentes no corpsculo de Barr do cromossoma inactivo. A expresso do gene XIST no uma protena mas sim um tipo especial de RNA, chamado RNA XIST. Quando se faz uma anlise deste RNA XIST s se verifica a sua existncia dentro ou em cima do cromossoma X inactivo; assim sendo, o produto do gene XIST (este RNA), vai-se acumular no cromossoma X inactivo, constituindo no fundo a razo da sua inactivao. a presena deste RNA que determina ou mantm o estado de inactivao do cromossoma X. 6- As sequncias reguladoras do gene XIST no cromossoma X activo esto metiladas e por isso a sua transcrio descontnua. Como a manuteno da inactivao do cromossoma X depende da expresso do gene XIST, ento lgico pensar que ele no se pode expressar no cromossoma X activo, porque caso isso acontecesse provocava a sua inactivao. Dessa forma, as sequncias reguladoras esto metiladas no cromossoma X activo, permitindo que ele permanea nesse estado (a metilao de sequncias uma das maneiras q as clulas tm de inactivar um gene, neste caso o gene XIST). 7- A inactivao resulta da metilao que ocorre, principalmente, nos resduos de citosina, presentes em alguns dinucletidos muito frequentes nas regies 5 de muitos genes e que so designados por ilhas CpG (ilhas citosina guanina). esta citosina destes dinucletidos que faz, geralmente, a ligao do grupo metilo; consequentemente, a metilao afecta, principalmente, estas ilhas CpG. Como so frequentes nas regies 5 de alguns genes promovem a sua inactivao, fazendo com que o gene seja incapaz de se transcrever. 8- Porque que, uma vez inactivo o cromossoma X, todas as clulas filhas vo manifestar o mesmo padro de inactivao? Isto est relacionado com a enzima responsvel pela metilao da citosina. O que acontece que durante a replicao do DNA, como se trata de um processo semi-conservativo, passam a existir duas cadeias velhas, contendo o padro de inactivao dado, ou seja, as suas ilhas CpG encontram-se metiladas. As cadeias recm sintetizadas no vo estar metiladas; a DNA polimerase quando acrescenta nucletidos no metila as citosinas. Tem de haver, pois, um processo que faa com que o DNA das cadeias recm sintetizadas seja tambm metilado nestas posies. A enzima responsvel pela metilao, quando reconhece uma das cadeias velhas, vai metilar os nucletidos da respectiva cadeia complementar.

Replicao do DNA
B

Metilao

A- Cadeia de DNA com as ilhas CpG metiladas na citosina. B- Quando ocorre a replicao do DNA num processo semi-conservativo, uma das cadeias permanece metilada mas a cadeia recm sintetizada no herda ou no recebe essa metilao. C- Quando a enzima responsvel pela metilao encontra um grupo metilo na cadeia velha acrescenta uma metilao no nucletido da cadeia complementar. As duas clulas filhas vo apresentar o mesmo padro de inactivao em termos de metilao das citosinas, mantendo, dessa forma, os genes inactivos. Os genes tanto podem estar numa cadeia como na outra (numa direco ou na outra). Se a metilao s preenchesse uma das cadeias, os genes que estivessem na cadeia no metilada poderiam dispersar-se. O que se pretende que todo o cromossoma X fique inactivo, portanto, o organismo encarrega-se de proceder metilao de ambas as cadeias por deteco da metilao na cadeia velha. CITOGENTICA; TELMEROS, IMPRINTING GENMICO, FREEMARTINISMO Telmeros - a sua quebra leva formao de terminaes sticky instveis ( essencial a conservao destas pores dos cromossomas) Os telmeros so constitudos por sequncias repetidas ao longo de extenses relativamente grandes (sequncias de oligonucletidos repetidas em tandem. ex GGGTTA)

Manuteno do telmero ao longo da diviso das clulas A DNA polimerase tem dificuldade em fazer a replicao at ao fim da cadeia. Se este mecanismo no existisse, em cada ciclo os telmeros iam encurtando. Na replicao de DNA a extremidade 3 estendida por uma DNA polimerase, dependente de RNA, tendo como molde uma sequncia complementar de RNA (CCCAAU) presente numa enzima telomerase. Essa enzima possui uma sequncia complementar e funciona como molde. A DNA polimerase que faz a sntese d origem sequncia do telmero. O telmero 5 depois sintetizado por uma DNA polimerase standard baseada na cadeia 3 recm sintetizada.

(Cadeia 3 geralmente mais extensa)

Uma diminuio da actividade da telomerase estar relacionada com a acumulao de aberraes cromossmicas que acompanham a senescncia celular (morte por envelhecimento) e tumorignese (quando um telmero desaparece verificam-se translocaes, etc o que leva ao aparecimento de tumores nesses tecidos). (Ainda no se conseguiu controlar o envelhecimento com este mecanismo, i.e., evitando o encurtamento dos telmeros. Ex - Doly) Imprinting genmico Para determinados genes ocorre uma expresso preferencial dos alelos de origem materna ou paterna (ex - quando se verifica imprinting materno expressa-se sempre o gene proveniente da me). (O mecanismo no est ainda bem conhecido. A existncia de imprinting dificulta a anlise genealgica) Na gametognese o imprinting reset (posto a zeros) para que na gerao seguinte a cpia activa do gene seja dependente do progenitor de origem e no do seu estado de inactivao prvio num dos pais. A metilao est ligada ao processo de inactivao estando os alelos inactivos por vezes metilados nas ilhas CpG (p ligao fosfato entre a citosina e a guanina; dinucletidos CG).
Como aqui se verifica no imprinting materno o gene proveniente da me que se mostra activo independentemente de o ser anteriormente ou no

Ex de imprinting materno (ateno F2) Freemartinismo - ocorre em 90% dos partos gemelares em bovinos. - raro noutras espcies: caprinos, sunos, ovinos (1%). - nos equinos no tem consequncias (as anastomoses acontecem mas os indivduos no so afectados) Fmeas estreis freemartins resultantes de um parto gemelar (gmeos) em que o irmo do sexo masculino. Resulta da formao de anastomoses vasculares ao nvel da placenta de ambos os fetos e consequente troca de clulas hematopoiticas (eritrcitos e leuccitos). Os freemartins (tanto o gmeo masculino como o feminino) so quimeras porque possuem populaes celulares com origem em dois zigotos diferentes. O quimerismo visvel ao nvel dos grupos sanguneos, manifestando-se tambm nos leuccitos que so quimeras (XX/XY). No h quimerismo ao nvel das restantes clulas do macho e da fmea. Consequncias na fmea: (perturbao tanto maior quanto mais precoce a anastomose) - existncia de vrios estados de intersexualidade (mistura de caractersticas masculinas e femininas em graus variveis) - gnadas com tecido ovrico e testicular (ovatestes) - ovrios normais testculos intra-abdominais (este extremo verificase caso a anastomose seja muito precoce) - genitlia externa essencialmente normal e clitris hipertrofiado - tendncia para a regresso dos derivados do ducto de Muller (estruturas sexuais femininas) e sobredesenvolvimento dos derivados do ducto de Wolf - tero, crvix, vagina normais vesculas seminais, ducto deferente e vagina em fundo de saco. Consequncias no macho: (pouco significativas) - ligeira reduo da fertilidade em consequncia da diminuio da motilidade dos espermatozides e da concentrao destes no esperma - caractersticas sexuais normais Para verificar se determinado indivduo freemartin efectua-se um enxerto de pele do seu gmeo. Caso tenha havido anastomose, o sistema imunitrio reconhece as clulas.

MODELO MULTIFACTORIAL Este modelo aplicado a caractersticas determinadas pelo efeito combinado de muitos factores, quer genticos, quer ambientais. Em gentica, tudo o que no gentico designa-se ambiental. 2 Parmetros: - Susceptibilidade (liability) varivel contnua que quantifica o efeito combinado dos factores genticos e ambientais, que conferem a um indivduos uma maior ou menor propenso para o desenvolvimento de uma caracterstica. - Limiar (threshold) nvel de susceptibilidade acima do qual todos os animais desenvolvem uma dada doena e abaixo do qual so todos normais. As caractersticas podem ser geneticamente explicadas pelos conceito de: Penetrncia gentica incompleta proporo de indivduos com um dado gentipo que mostram o fentipo esperado (ex apenas 90% demostram o fentipo prprio) Expressividade varivel variao no grau de expresso fenotpico ex - displasia, monognica recessiva os monozigticos recessivos apresentariam a doena, mas isso no acontece em todos (penetrncia incompleta). Ainda assim, os que possuem podem ter displasia mais ou menos severa (expressividade varivel). Estas doenas so melhor enquadradas num modelo multifactorial. Uma estimativa da importncia relativa dos factores genticos e ambientais num modelo multifactorial dado pela heritabilidade (h2 ) e no hereditabilidade. Heritabilidade neste contexto, a proporo da variao total da caracterstica atribuda variao dos factores genticos. Se conseguirmos quantificar o que gentico e o que ambiental estamos a analisar heritabilidade. Heritabilidade de susceptibilidade proporo das diferenas de susceptibilidade atribuvel s diferenas genticas entre os animais. Animais geneticamente iguais - h2 = 0 (clones). Se os indviduos so geneticamente iguais e tm susceptibilidades diferentes, a componente gentica nula (devido a factores ambientais). Ambiente igual - h2 =1. Geneticamente diferentes mas todos sujeitos ao mesmo ambiente. A toda a variao se deve a factores ambientais.