UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CINCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

Cultivo de microalgas do gnero Botryococcus visando a produo de biodiesel

Joo Evandro Brando Tavares

Mestrado em Biologia Celular e Biotecnologia

2009

UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CINCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

Cultivo de microalgas do gnero Botryococcus visando a produo de biodiesel

Joo Evandro Brando Tavares

Dissertao orientada pelo Professor Doutor Ricardo Alexandre Perdiz de Melo e co-orientada pelo Engenheiro Tiago Pardal

Mestrado em Biologia Celular e Biotecnologia

2009

Resumo
O mundo encontra-se presentemente confrontado com dupla crise, a escassez das limitadas fontes de combustveis fsseis e a degradao ambiental. Enquanto a economia mundial demanda cada vez mais por combustveis a baixo custo para os sistemas industriais e de transportes, existe uma tremenda necessidade de combater as causas e os j existentes efeitos das alteraes climticas por estes causados. Todavia, quando parecia imprescindvel o desenvolvimento de combustveis renovveis neutras em emisses nocivas, tornou-se claro que a primeira gerao de biocombustveis no atinge os limites da demanda e tampouco contribui para a mitigao das alteraes climticas. Da o interesse no desenvolvimento de uma segunda gerao de biocombustveis produzidos de fontes no alimentares, tais como as microalgas, as quais apresentam grandes perspectivas a longo prazo. Ao contrrio das plantas terrestres, as microalgas crescem extremamente rpido em qualquer lado e algumas espcies so ricas em leo, potencial que representa uma grande vantagem. A microalga verde Botryococcus braunii, com vasta distribuio por todos os continentes, caracterizada pela sua organizao colonial e pela sua espantosa habilidade de produzir lpidos e hidrocarbonetos de cadeia longa que podem atingir de 15% a 75% do peso seco o que tem atrado cada vez maior ateno nas ltimas duas dcadas no sentido de explorao desta espcie visando a produo de biodiesel. Esta tese foi desenvolvida no sentido de investigar a potencialidade do uso de estirpes locais (portuguesas) desta espcie como substrato para o biodiesel. Pelos resultados obtidos nas experincias realizadas, a taxa mxima de crescimento conseguida durante a fase exponencial foi de 61 mg/L*dia (peso seco). Constatou-se que crescimento e a produo lipdica das estirpes cultivadas so influenciados pelas condies de cultura da a necessidade de optimiz-las. Todavia, estas estirpes mostram-se capazes de crescer, produzir leos e absorver nutrientes em culturas em guas residuais. A percentagem mxima obtida para o extracto lipdico foi de 36% da biomassa seca o que est de acordo com vrios resultados que permitiram considerar esta espcie como potencial substrato para o biodiesel. Este facto tambm apoiado pela predominncia do cido oleico (C18:1, 42% a 66%) e do cido palmtico (C16:0, 8% a 18%) no extracto lipdico dado que os metil steres desses cidos gordos (FAME) so os ideais para a produo de biodiesel. Em suma, apesar de estas estirpes de B. braunii apresentarem crescimento relativamente lento, produzem contedo e constituio lipdica considervel que no mnimo justifica mais investimento num melhor estudo da sua biologia. Palavras-chave: Renovveis, Hidrocarbonetos e Biodiesel.

Microalga,

Botryococcus

braunii,

FAME,

ii

Abstract
The world is presently confronted with twin crises, depletion of the finite reserves of fossil fuel and environmental degradation. While the global economy increasingly demands for low-cost fuels for industrial and transportation systems, there is a tremendous need to combat the causes and effects of existing climate change caused by them. However, when it seemed essential to develop renewable fuels neutral in harmful emissions, it became clear that the first generation of biofuels does not reach the limits of demand, nor contribute to the climate change mitigation. Hence the interest in developing a second generation biofuels produced from non-food feedstocks such as microalgae, which potentially offer greatest opportunities in the longer term. Unlike other oil crops, microalgae grow extremely rapidly in any anywhere and many are exceedingly rich in oil, potential that represents a great advantage. The green microalga Botryococcus braunii (Chlorophyceae), which is widely distributed on all continents, is characterized by an original organization of colonies and an unusual capacity to produce unsaturated long-chain hydrocarbons, reaching contents ranging from 15% to 75% of its dry weight. This characteristic has attracted increasingly more attention in the last two decades in attempts to exploit this species for renewable biodiesel. This thesis was developed to investigate the potential of the local strains of this species as a substrate for biodiesel. From the results obtained in experiments carried out the maximum growth rate achieved was 61 mg/L*day (dry weight). We found that growth and lipid production of cultivated strains are influenced by culture conditions hence the need to optimize them. However, these strains appear to be able to grow, produce oil and absorb nutrients in wastewater cultures. The maximum lipid extract obtained was 36% of dry matter which is in agreement with several results that allow considering this species as a potential substrate for biodiesel. This is also supported by the predominance of oleic acid (C18:1, 42% to 63%) and palmitic acid (C16:0, 8 to 18%) in the lipid extract as the methyl esters of these fatty acids (FAME) are ideal for the production of biodiesel. In short, although these strains of B. braunii present relatively slow growth, they produce considerable lipid content that at least warrants further investment in a better study of its biology. Keywords: Microalga, Botryococcus braunii, FAME, Hydrocarbons and Biodiesel.

iii

Agradecimentos
Quero aqui prestar o meu reconhecido agradecimento a algumas pessoas e instituies cujo contributo foi muito importante para a realizao deste trabalho. Agradeo em primeiro lugar ao meu orientador, Professor Doutor Ricardo Alexandre Perdiz de Melo, pela confiana, pela amizade e pela oportunidade de realizar esta dissertao. Agradeo ao Engenheiro Tiago Pardal, meu co-orientador, e a todo o pessoal da empresa Omnidea, pelo apoio prestado e por toda disponibilidade demonstrada. Ao IPAD pela concesso da bolsa de estudo sem a qual seria impossvel a realizao deste mestrado. Aos estimados Professores, Doutor Lus Manuel Gaspar Pedro e Doutora Ana Cristina da Silva Figueiredo, pelo impecvel apoio que me deram durante toda a realizao deste mestrado. A todos os companheiros do laboratrio de Botnica Marinha do Instituto de Oceanografia, em especial Tnia, Bernardo, Bruno, Maria Joo, Ana, Slvia, Paulo e Loureno pela companhia, pela ajuda, pelos bons momentos e principalmente pelos mais difceis de ultrapassar. Vera Veloso pelo apoio, correces e puxes de orelha". A todos os meus colegas e amigos da FCUL, em particular, Osvaldo, Flu, Adilson, Silvino, Tavi, Sofia, Rben, Indira, enfim a todos, pelo companheirismo, amizade e camaradagem. Em especial minha estimada amiga Ana Lina Cabral pela pacincia, compreenso e pelas palavras de fora mesmo em horas de maior desnimo.

Dedicatrias: Aos meus adorveis pais e irmos e Ftima por ter sido sempre minha companheira leal em todos os momentos.

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ndice
Resumo ..........................................................................................................................................i . Abstract.........................................................................................................................................ii Agradecimentos...........................................................................................................................iii ListadasFiguras...........................................................................................................................vi ListadasTabelas...........................................................................................................................vi 1Introduo...............................................................................................................................1 1.1Objectivos..........................................................................................................................2 2Revisodaliteratura...............................................................................................................3 2.1Problemascomasfontesconvencionaisdecombustveis...............................................3 2.2Extinodoscombustveisfsseis ...................................................................................4 . 2.3Degradaoambiental.....................................................................................................6 2.4FontesrenovveisdeenergiaBiocombustveis............................................................8 2.5EtanolversusBiodiesel...................................................................................................10 2.6Biocombustveis:benefcioseinconvenientes ..............................................................11 . 2.7Biodieselcomoalternativaaodieselconvencional.......................................................13 2.8Microalgascomomatriaprimaparaobiodiesel.........................................................16 2.9Produodebiomassademicroalgas............................................................................19 2.10Colheita,processamentoeconversodabiomassaembiocombustvel....................20 2.11Botryococcusbraunii....................................................................................................21 3MateriaiseMtodos.............................................................................................................23 3.1Espcie/estirpe...............................................................................................................23 3.2Preparaodoinculo ...................................................................................................23 . 3.3Condiesdecultura......................................................................................................23 3.4Determinaodocrescimento.......................................................................................24 3.4.1Mtododopesoseco..............................................................................................24 3.4.2Mtodoespectrofotomtrico.................................................................................24 3.5Planeamentoexperimental............................................................................................25 3.5.1Comparaodocrescimentoeprodutividadeembiomassaemdiferentesmeios decultura............................................................................................................................25 3.5.2Determinaodocrescimento,produtividadeembiomassaecontedolipdico (hidrocarbonetos)emculturasindoors...........................................................................25 3.5.3Determinaodocrescimento,produtividadeembiomassaemculturas outdoors ..........................................................................................................................26 .

v 3.5.4Anlisedenutrientes..............................................................................................26 3.6Determinaodocontedolipdicodasculturas ..........................................................26 . 3.7Extracodelpidostotais..............................................................................................27 3.8Anlisedafracolipdica..............................................................................................28 4.Resultados............................................................................................................................29 4.1CaractersticasdabiomassadeBotryococcusbraunii....................................................29 4.2CrescimentodaBiomassa..............................................................................................29 4.2.1Primeirafasedeculturas.........................................................................................29 4.2.2Segundafasedeculturas ........................................................................................32 . 4.2.2.1Anlisedaabsorodenutrientesemguasresiduais.......................................35 4.2.2.2Crescimentodocontedolipdico.......................................................................36 4.2.3Terceirafasedeculturas.........................................................................................37 4.4Contedoemlpidos......................................................................................................40 4.5Composiodoextractolipdico....................................................................................42 5.Discussodosresultados .....................................................................................................43 . 5.1CrescimentodeBotryococcusbraunii............................................................................43 5.1.1Comparaodocrescimentoeprodutividadeembiomassaemdiferentesmeios decultura............................................................................................................................44 5.1.2Determinaodocrescimento,produtividadeembiomassaecontedolipdico (hidrocarbonetos)emculturasindoors...........................................................................44 5.1.3Determinao do crescimento, produtividade em biomassa em culturas outdoorss .............................................................................................................................................45 5.1.4Crescimentoeabsorodenitratosefosfatosnasculturasemguaresidualpr tratada.................................................................................................................................46 5.2Crescimentodocontedolipdico..................................................................................47 5.2.1Crescimentodelpidosehidrocarbonetosemguaresidual.................................48 5.3Extracodocontedolipdico......................................................................................49 5.4Anlisedosmetilsteresdecidosgordos(FAME).......................................................50 6.Concluses............................................................................................................................51 Bibliografia..................................................................................................................................52 Anexos.........................................................................................................................................58

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ListadasFiguras
Figura1:Progressodoconsumoenergticomundialsegundoasfontes(Skov,2003) .............4 . Figura2:Reservasdepetrleoporpases(OilandGasJournal2005,2445)..............................5 Figura3:ConcentraodeCO2atmosfricovsemissoantropognica(NEIC,2009).................7 Figura4:Fracorelativadeenergiasrenovveisnoconsumoglobal(REN21,2007).................8 Figura5:EsquemarepresentativodareacodetransesterificaoondeR1,R2eR3 representamascadeiasdoscidosgordos(adaptadodeFerrarietal.,2005)..........................14 Figura11:Anlisedocrescimentolipdicorelativosegundafasedeculturasdasduasestirpes deB.brauniipelomtodovermelhodoNilo..............................................................................37 Figura12:CurvasdecrescimentodasduasestirpesdeB.brauniirelativosterceirafasede culturas........................................................................................................................................39 Figura13:Produtividadeembiomassa(pesoseco)dasduasestirpesdeB.brauniiemculturas outdoors......................................................................................................................................39 Figura14:EstruturamontadaoutdoorsparaseefectuaraterceirafasedeculturasdeB. braunii(asfotosforamtiradas,A,12dias,B,20dias,C,28dias,D,36diaseE,44dias,F,52 diasapsoinciodasculturas) ...................................................................................................40 . Figura15:Comparaodoscontedosemlpidosobtidosdasextracesdasculturasda segundafase................................................................................................................................41 Figura16:CorrelaoentreocontedolipdicoeafluorescnciadovermelhodeNilonas culturasindoorsdasestirpesB.brauniiIO9801eIO9802......................................................42

ListadasTabelas
TabelaI:Produtividadesdealgumasfontesdebiodiesel(Chisti,2007;GouveiaeOliveira, 2009)...........................................................................................................................................17 TabelaII:Contedolipdicodealgumasespciesdemicroalgas(Chisti,2007).........................18 TabelaIII:Desenhoexperimentalseguidonasexperinciasparadeterminaodocrescimento, produtividadeembiomassaecontedolipdicoindoorseoutdoors.................................26 TabelaIV:Concentraesiniciaisefinaisdosnutrientesfosfatos,nitratosenitritoseamniae asrespectivaspercentagensderemoocorrespondentessegundafasedeculturasdasduas estirpesdeB.brauniiemguasresiduais(ETAR).......................................................................36 TabelaV:Comparaodoscontedosemlpidosrelativossextracesdaprimeiraeda segundafasedeculturas.............................................................................................................40 TabelaVI:Comparaodocontedolipdicodeterminadopelomtodogravimtricoea respectivafluorescnciarelativareferentesegundafasedeculturas.....................................41 TabelaVII:PerfillipdicodasestirpesIO9801eIO9802deB.brauniirelativosdeculturas dasegundafase(nd,nodetectado)..........................................................................................42

1Introduo
H cerca de dois sculos que o petrleo tido como uma ddiva dos deuses. Actualmente, desempenha um papel fundamental no desenvolvimento industrial, nos transportes, no sector da agricultura e na satisfao das necessidades bsicas do homem (Basha et al., 2009). Contudo, os impactos negativos do aquecimento global, associados intensificao do uso do petrleo e de outros combustveis fsseis, so aceites como um srio problema para a humanidade. Este fenmeno, tem vindo a ser observado h vrias dcadas e parece claramente intensificar-se a cada ano que passa. As necessidades energticas mundiais aumentam continuamente, impulsionadas tanto pelo aumento da industrializao como tambm pelo aumento populacional, sendo a grande parte dessas necessidades ainda suprida por combustveis fsseis derivados de fontes no renovveis e portanto limitados s reservas existentes (Shahid e Jamal, 2008). Na verdade, os combustveis fsseis constituem 80,3% da energia consumida no mundo sendo que 57,7% desta quantia usada no sector dos transportes (IEA, 2006). Assim, associados ao uso, cada vez mais intenso, dos combustveis fsseis esto dois grandes problemas: o primeiro prende-se com as emisses de gases (CO2, HC, NOx, SOx) poluentes e com efeito de estufa que acarretam impactos ambientais incalculveis, efeitos catastrficos na sade humana e danos com tendncias irreversveis na biodiversidade, o que pode, em certa medida e a mdio ou longo prazo, pr em risco a prpria vida no planeta; o segundo tem a ver com o esgotamento das reservas existentes o que conduz crise energtica e ao aumento dos preos dos combustveis que tm grande impacto na segurana energtica e na vida das sociedades (Amin, 2009). Desta forma, largamente aceite que insustentvel ambiental e economicamente assegurar o desenvolvimento industrial e social na dependncia dos combustveis fsseis. Portanto, para ser sustentvel ambiental e economicamente o processo de produo de combustveis no s requer fontes renovveis mas tambm fontes capazes de contribuir para diminuio dos actuais nveis de gases poluentes que contribuem para o aquecimento global (Sheehan et al., 1998a). Isso implica que as novas fontes de produo de combustveis possuam um potencial de captao de CO2 atmosfrico capaz de neutralizar as emisses resultantes da combusto dos mesmos, ou seja, a soluo encontra-se no desenvolvimento de fontes com taxas neutras ou negativas de emisso de CO2 e outros gases com efeito de estufa. Portanto, numa era de eminente escassez dos

combustveis e de grandes preocupaes ambientais, os biocombustveis, entre todas as fontes de energias renovveis, tm sido apresentados como a melhor alternativa (Gielen e Unander, 2005; Huber et al., 2006). Os primeiros biocombustveis obtidos de plantas e cultivares terrestres j so uma realidade e de entre eles, o bioetanol obtido atravs da fermentao da cana-de-acar e do milho, e o biodiesel obtido de sementes oleaginosas, tais como soja e palma, dominam o mercado dos biocombustveis embora tambm se encontra em desenvolvimento vrios outros tipos de biocombustveis promissores. A produo desses biocombustveis da primeira gerao tem sido causa de vrios inconvenientes pelo que tem-se emergido uma necessidade urgente de desenvolvimento de uma nova gerao de biocombustveis capaz de super-los. A segunda gerao prope a produo de biocombustveis a partir de toda a espcie de biomassa e matria orgnica residual contornando assim a competio pela terra arvel e com a produo de bens alimentares (Escobar et al., 2009). No sentido de obter biomassa a custos economicamente sustentveis, a produo de algas, em especial as microalgas, tem sido proposta, por diversos investigadores, como uma potencial fonte de substrato para a produo de biocombustveis (Chisti, 2007; Gouveia e Oliveira, 2009; Mata et al., 2009). Os custos de produo proibitivos e as limitaes a nvel de bioprospeco de espcies, sistemas de cultivo e processamento da biomassa, tm desencorajado a produo comercial de biocombustveis a partir de microalgas (Li et al., 2008). Assim, os principais desafios actuais tm a ver com o isolamento, seleco e caracterizao morfo-fisiolgica de espcies nativas promissoras por acumularem um contedo lipdico significativo; optimizao dos parmetros relevantes para o cultivo de cada espcie ou estirpe; desenvolvimento de sistemas de cultivo e de tecnologias de colheita e processamento que asseguram a viabilidade de produo de biocombustveis.

1.1Objectivos
Este trabalho de tese de mestrado investiga a hiptese de estirpes portuguesas da espcie de microalgas Botryococcus braunii possuir potencial como fonte de biomassa para a produo de biodiesel. Para apurar esta hiptese definiu-se os objectivos no sentido de responder s seguintes questes de investigao: - Quais as taxas de crescimento das estirpes de B. braunii utilizando os parmetros de cultivo referenciados na literatura como ptimos para a espcie? - Como varia o crescimento destas estirpes em diferentes meios de cultura?

- Como varia a acumulao de lpidos e qual a percentagem do contedo lipdico das duas estirpes nos diferentes meios de cultura utilizados? - Como varia o crescimento e a acumulao de lpidos nestas microalgas quando cultivadas em guas residuais? - O crescimento destas estirpes afectado quando so cultivadas no exterior utilizando a luz solar e sujeitas s variaes das condies ambientais? - O comportamento destas microalgas justifica o seu cultivo visando a produo de biodiesel?

2Revisodaliteratura
2.1Problemascomasfontesconvencionaisdecombustveis
Combustveis fsseis so o carvo, o petrleo e o gs natural. Durante centena de milhes de anos a biomassa morta de algas, plantas e animais foi sendo soterrada e a sua decomposio foi dando origem aos depsitos de combustveis fsseis. Esses combustveis no foram, praticamente, usados pelas sociedades humanas at o sculo XVIII, quando comeou a revoluo industrial. Assim, durante milhares de anos as civilizaes humanas supriram as suas necessidades energticas atravs da energia solar, do vento e da biomassa. At essa data a fora de trabalho foi essencialmente muscular, tanto humana como de animais ao servio do homem (Veziroglu e Sahin, 2008). Com o incio da revoluo industrial os combustveis fsseis passaram a desempenhar uma funo essencial no desenvolvimento e no crescimento econmico uma vez que as exigncias e necessidades humanas a nvel de satisfao bsica e de fornecimento de bens e servios foram sendo cada vez maiores. Inicialmente o carvo foi largamente utilizado para esse fim e foi substituindo gradualmente a madeira como o combustvel mais comummente usado. Com a inveno do motor de combusto interna deu-se um grande crescimento na utilizao de combustveis lquidos derivados do petrleo que veio a se tornar a maior fonte de energia utilizada at hoje. A melhoria das condies de vida permitiu um grande avano civilizacional que por sua vez levou a um aumento exponencial do consumo energtico. No ano 2000 a populao mundial consumiu 5 vezes mais combustveis que em 1950 e 13 vezes mais que em 1900. A

Figura 1 ilustra o consumo mundial de combustveis fsseis nos ltimos sculos (Skov, 2003).

Figura1:Progressodoconsumoenergticomundialsegundoasfontes(Skov,2003)

Os combustveis fsseis, que alimentaram o extraordinrio crescimento econmico e social dos ltimos dois sculos, representaram a cura para a privao humana na sociedade em industrializao, todavia, foi um remdio no testado que se releva hoje entorpecente e que tem levado a uma dependncia cada vez maior e com consequncias graves. De facto, nunca a humanidade teve um nvel de vida to elevado mas isso conseguiu-se custa de uma demanda energtica cada vez maior e um consumo de combustveis fsseis cada vez mais desenfreado, ou seja, actualmente usa-se tanto combustvel como nunca antes visto (Veziroglu e Sahin, 2008). Assim, o mundo encontra-se presentemente confrontado com um duplo e grande problema: a crise energtica derivada da depleo das fontes de combustveis fsseis e a degradao ambiental causada pelos produtos da combusto desses combustveis (Agarwal, 2007).

2.2Extinodoscombustveisfsseis
As reservas mundiais de combustveis fsseis so, obviamente, limitadas. De acordo com estimativas, sob o actual cenrio mundial, existem reservas de carvo para mais 218 anos, de petrleo para mais 41 anos e de gs natural para mais 63 anos (Puppn, 2002; Agarwal, 2007). Dado que a demanda energtica mundial continua a aumentar, apesar de todos os esforos em contrrio, essas reservas podem se tornar escassas mais cedo que o previsto. Essa maior demanda e o risco de escassez devem-se essencialmente a dois factores: o contnuo aumento da populao mundial e a crescente demanda dos pases emergentes pelo aumento do nvel de vida (Veziroglu e Sahin, 2008). Por um lado, o enorme crescimento populacional exige desenvolvimento, principalmente a nvel dos transportes, a nvel industrial e a nvel de produo agrcola o que assegurado por combustveis fsseis, por outro lado, a globalizao cultural e de mercados e a

assimilao de costumes de pases ricos pelos emergentes provoca uma forte presso de consumo energtico, que sentida com maior intensidade nos pases emergentes. E nesses pases que continuar a ocorrer o maior crescimento demogrfico, ao longo do sculo XXI e consequentemente cada vez maior a demanda energtica. O eminente perigo da escassez de fontes de combustveis fsseis ameaa a economia mundial e a vida tal como a conhecemos, como tal, de grande importncia saber onde residem as reservas. A Figura 2 ilustra as principais reservas de petrleo actualmente conhecidas.

Figura2:Reservasdepetrleoporpases(OilandGasJournal2005,2445)

Dependncia de combustveis fsseis por parte de pases sem reservas significa necessidade de recorrer a pases com reservas para se abastecer desses recursos. Isso contribui para uma maior vulnerabilidade econmica dado que as principais reservas encontram-se em regies ou pases muitas vezes com elevada instabilidade poltica ou at em situaes de conflito o que cria potencial para o aumento dos preos e escassez em casos de ruptura de abastecimento (Roberts, 2004; Oil and Gas Journal, 2005). O Mdio Oriente concentra cerca de 65% das reservas mundiais enquanto a Europa e a Eursia 11,7%, frica 9,5%, Amrica Central e do Sul 8,6% Amrica do Norte 5% e sia e Pacfico 3,4% (BP, 2007).

2.3Degradaoambiental
Para os ambientalistas um dos maiores problemas com que a humanidade se depara actualmente o impacto dos combustveis fsseis e dos seus produtos da combusto sobre o meio ambiente. Desses impactos se destacam o aquecimento global e alteraes climticas, a poluio (do ar, da gua e da terra) e os efeitos adversos sobre a sade. A extraco, o transporte, a armazenagem do petrleo, do carvo e do gs natural, o descarte de resduos e os derrames so as grandes causas de poluio, todavia, os maiores danos ambientais so causados pelo uso final dos combustveis nos processos de aquecimento, na produo de electricidade e na gerao de fora motriz das instalaes industriais e dos transportes (Veziroglu e Sahin, 2008). O uso intensivo dos combustveis fsseis leva emisso de diversos gases (COx, SOx, NOx, CH) e compostos poluentes (fuligem, cinzas, alcatro e outros compostos orgnicos) com efeitos catastrficos na sade humana, nos animais, nas florestas, na visibilidade, nos edifcios, etc. Os NOx, CO, HC e as partculas so os poluentes regulados enquanto formaldedo, aldedo, benzeno, tolueno, xileno, metano, SO2, CO2 so os poluentes no regulados. Os regulados so aqueles para os quais as legislaes ambientais estabelecem limites enquanto para os no regulados no existem legislao ou quando ela existe no subscrita por todos os pases. Todavia, tanto os regulados como os no regulados contribuem para efeitos prejudiciais de curto a longo prazo. Os poluentes regulados geralmente causam efeitos a curto prazo, por exemplo, o CO fatal em alta dosagem, agrava problemas cardacos, afecta o sistema nervoso central; o NOx provoca desordens respiratrias; os HCs causam irritaes oculares e cutneas, fadiga e sonolncia. As partculas de fuligem causam efeitos muito graves a longo prazo no sistema respiratrio, como a induo de tumores, especialmente quando esto associadas com hidrocarbonetos aromticos (Hosseinpoor et al., 2005). Alguns dos produtos derivados dos combustveis fsseis quando emitidos para a atmosfera so sujeitos aos raios solares, gua e a outros compostos atmosfricos ocorrendo reaces qumicas que resultam em poluentes secundrios como o caso do ozono, aerossis e vrios cidos. Os SOx e os NOx, alm das desordens respiratrias que lhes esto associadas, formam cido sulfrico e ntrico, respectivamente, originando as chuvas cidas o que tem sido responsvel por grande devastao nos ecossistemas (Shahid e Jamal, 2008). O CO2, que o principal produto derivado dos combustveis fsseis, juntamente com outros chamados gases com efeito de estufa, contribui para absoro e aprisionamento

dos raios infravermelhos na atmosfera levando ao aumento da temperatura da terra. Esse aumento da temperatura responsvel pelo degelo das calotes polares, pelo aumento do nvel dos oceanos e pelas alteraes climticas o que inclui ondas de calor, longas secas, enormes furaes, chuvas torrenciais, inundaes, etc. (Kesse, 2000; Ramanathan e Feng, 2009). A concentrao atmosfrica de CO2 vem aumentando a um ritmo acelerado aps a revoluo industrial. Os ecossistemas terrestres contribuem para o ciclo natural do carbono, todavia, as actividades humanas produzem mais carbono do que aquilo que o ecossistema terrestre capaz de sequestrar da atmosfera por meios naturais. Assim, a concentrao atmosfrica de CO2 passou de 280 ppm na era prindustrial para 385 ppm actualmente (Agarwal, 2007; Hansen et al., 2008). A Figura 3 ilustra o aumento do dixido de carbono de origem antropognica versus a concentrao atmosfrica desse gs.

Figura3:ConcentraodeCO2atmosfricovsemissoantropognica(NEIC,2009)

Muita tecnologia tem vindo a ser desenvolvida para reduzir ou eliminar a emisses prejudiciais para a atmosfera, todavia, tecnologia para a reduo de CO2 so raras. Assim, h uma grande necessidade de desenvolvimento de tecnologias e prticas a fim evitar que as consequncias das emisses sejam irreversveis. As opes para a reduo de CO2 incluem o aumento da eficincia energtica, reduo da desflorestao, substituio por combustveis menos poluentes, promoo de energias renovveis e substituio para uma economia no baseada em combustveis fsseis. Todavia, uma das melhores alternativas o desenvolvimento de fontes de energias inteiramente renovveis (van Harmelen e Oonk, 2006).

2.4FontesrenovveisdeenergiaBiocombustveis
A eminente escassez de reservas de combustveis fsseis, a consequente diminuio de produo e a crescente necessidade de salvaguardar o meio ambiente para geraes futuras impe urgncia no desenvolvimento de fontes alternativas de energia, nomeadamente solar, elica, hidroelctrica, geotrmica, hidrognio e biocombustveis, para assegurar o ritmo de desenvolvimento global. Todavia, de acordo com o relatrio da REN21 (2007), apenas cerca de 18% da energia global consumida derivada de fontes renovveis, sendo que a tradicional biomassa, utilizada no aquecimento e na cozinha, representa 13% e a outra fatia corresponde energia hidroelctrica que representa 3% e s novas fontes renovveis (geotrmica, elica, solar e biocombustveis) que representam no seu conjunto apenas 2,4% (Figura 4). As energias renovveis podem, de facto, substituir as energias fsseis nos 4 principais sectores, nomeadamente, produo de electricidade, aquecimento, transportes e abastecimento energtico das zonas rurais, contudo, a substituio total no acontecer enquanto houver energia fssil a preos relativamente acessveis, dado que isso atrasa os investimentos em energias renovveis. Todavia, a capacidade global de energias renovveis tem aumentado 15-30% ao ano desde o ano 2000. Entre esses aumentos destacam-se os aumentos na produo da energia fotovoltaica (60%) e elica (28%) e dos biocombustveis (40%) (REN21, 2007).

Figura4:Fracorelativadeenergiasrenovveisnoconsumoglobal(REN21,2007)

De acordo com muitos autores, de todas as alternativas renovveis, o hidrognio e os biocombustveis so as que apresentam as maiores potencialidade de substituir os

combustveis fsseis e ao mesmo tempo cumprir os desafios da era moderna, ou seja, combinar a segurana energtica com os objectivos referentes reduo/mitigao das emisses de gases nocivos e com efeito de estufa e preservao da biodiversidade (Gielen e Unander, 2005; Fernando et al., 2006; Huber et al., 2006). O hidrognio, produzido de fontes renovveis, como combustvel muito eficiente e limpa dado que no produz quaisquer gases que contribuam para o aquecimento global ou nocivo para o ambiente. Veziroglu e Sahin (2008) consideram at que o desenvolvimento deste combustvel a partir de fontes renovveis (solar) tem o potencial de resultar num sistema energtico permanente que jamais ter necessidade de ser mudado. Contudo, existem grandes barreiras ao desenvolvimento do combustvel hidrognio, isto , toda a infra-estrutura associada est por ser desenvolvida e muitos desafios tcnicos que incluem a produo, a armazenagem e os custos de produo, dificultam a sua efectiva implementao. Assim, a maneira mais realstica de satisfazer a crescente procura por combustveis para assegurar o crescimento e garantir a viabilidade econmica e ambiental na era ps combustveis fsseis atravs do desenvolvimento dos biocombustveis (Puppn, 2002; Fernando et al., 2006; Hill et al., 2006). Contudo, para ser uma alternativa vivel os biocombustveis devem garantir ganho energtico, benefcios ambientais, competitividade econmica e potencial de ser produzido em grandes quantidades sem ameaar a produo de bens alimentares (Hill et al., 2006). O termo biocombustvel refere-se aos combustveis lquidos, gasosos ou slidos, produzido predominantemente a partir de fontes naturais, a biomassa (Demirbas, 2006). A biomassa pode ser convertida atravs de processos mecnicos, termoqumicos e biolgicos originando vrias formas de combustveis, tais como etanol, metanol, biodiesel, metano, hidrognio, etc. Assim, a biomassa a mais promissora das fontes renovveis de energia na medida em que est disponvel naturalmente, pode ser produzida em grandes quantidades e permite a produo de combustveis lquidos, gasosos ou slidos com potencial de abastecer vrios sectores. Alm disso e acima de tudo, um recurso capaz de ser inteiramente renovvel e ambiental, social e economicamente sustentvel (Demirbas, 2008b). Desta forma, dadas as crescentes preocupaes quanto ao futuro da oferta global de petrleo e a de outras opes de combustvel disponveis para os sectores dos transportes, agrcolas e industriais, os biocombustveis representam a melhor das opes de uso da energia de biomassa. O recente interesse na energia da biomassa tem dado maior nfase em aplicaes que produzem combustveis lquidos para o sector de transportes. Este sector o que

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consome a maior fatia da energia utilizada no mundo. Em 2006, este sector consumiu 51% do total dos combustveis lquidos utilizados e as estimativas indicam que esta percentagem tende a aumentar (EIA, 2009). Contudo, os combustveis lquidos desempenham tambm um papel fundamental nos sectores industriais e agrcolas, cruciais no desenvolvimento econmico. Dos vrios biocombustveis potencialmente disponveis os mais considerados a nvel global so os lcoois (principalmente bioetanol) e o biodiesel (Puppn, 2002; Mata et al., 2009). Estes so conhecidos como biocombustveis de primeira gerao e j so uma realidade, esto presentes em praticamente todos os importantes mercados de combustveis lquidos. So produzidos geralmente a partir de cultivares terrestres antes dedicados produo de alimentos. O bioetanol produzido principalmente a partir de cana-de-acar, do milho, da beterraba, da batata, do sorgo e do trigo enquanto o biodiesel produzido principalmente via transesterificao de leos vegetais, em especial, leos de palma, de colza, de soja e de girassol. Outras opes correntes na produo do biodiesel tm sido o uso de leos vegetais usados e de gordura animal. Actualmente, uma segunda gerao de biocombustveis encontra-se em desenvolvimento e esta difere da primeira gerao na medida em que prope outras fontes de matria-prima para a produo dos principais biocombustveis, ou seja, prope a produo de biocombustveis a partir de biomassa que no tradicionalmente usada na alimentao humana ou animal. Esta segunda gerao inclui, por um lado, o bioetanol produzido a partir da fermentao de toda a biomassa linho-celulsica constituda pelos subprodutos e resduos agro-industriais, e por outro lado, outros biocombustveis derivados da liquefaco ou da gaseificao de toda a espcie de biomassa ou matria orgnica. Em geral, estes processos envolvem a produo de bioleo e de gs sinttico, respectivamente, que podem ento ser usados para alimentar turbinas de alta eficincia ou como matria-prima para a produo de uma variedade de combustveis, tais como biodiesel, biometano e biohidrognio, e de vrios produtos qumicos sintticos (EPEA, 2007; van der Laaka et al., 2007; Hoekman, 2009).

2.5EtanolversusBiodiesel
Tem-se emergido no meio cientfico um debate silencioso constantemente aceso acerca de qual ser o combustvel do futuro: etanol ou biodiesel? Quais so os reais benefcios de cada um? Estes dois so apontados como os mais provveis substitutos para os combustveis lquidos de origem fssil. Ambos contribuem para diminuir a dependncia

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dos combustveis tradicionais e tambm para reduo das emisses nocivas. At data, o bioetanol a maior, seno nica, aposta como substituto da gasolina enquanto o biodiesel apontado como o provvel substituto do diesel convencional representando 82% de toda a produo de Biocombustveis na Europa (Kim e Dale, 2005; Agarwal, 2007; Demirbas, 2007; Bozbas, 2008). O biodiesel contm 87% de energia por litro comparado como diesel enquanto o bioetanol possui apenas 67% comparado com a gasolina (Fulton et al., 2004). O biodiesel, de acordo com um estudo de Hill e colaboradores (2006), consegue prover at 93% mais energia do que requerida na sua produo enquanto o etanol rende apenas 25% mais energia que a requerida na sua produo, ou seja, os custos de produo so muito mais elevados para o etanol. Quanto s emisses de gases com efeito de estufa e em comparao com os combustveis convencionais, o biodiesel consegue uma reduo de 41% e o etanol uma reduo de apenas 12%. O biodiesel produz ainda menos gases poluentes que o etanol por unidade de energia ganha. Sob a perspectiva da eficincia agrcola e eficincia no uso de terra arvel o potencial de produo de etanol por unidade de terra cultivada muito superior ao do biodiesel (Kim e Dale, 2005), principalmente se for considerado o potencial de utilizao de toda a biomassa linho-celulsica que aparenta ser mais promissora, tanto em termos de minimizao dos potenciais conflitos entre produo de bens alimentares e produo energtica como tambm em termos de maximizao dos benefcios ambientais. Apesar dos diferentes benefcios entre estes dois principais biocombustveis, a maioria dos autores desta rea de investigao considera que a corrida contra a dependncia de combustveis fsseis no ser certamente vencida por uma simples alternativa. Esta batalha, de certo, requerer a combinao de todas as alternativas viveis, nomeadamente, etanol, biodiesel, butanol ou qualquer outro que venha a ser desenvolvido.

2.6Biocombustveis:benefcioseinconvenientes
Biocombustveis tm sido encarados como a forma limpa e sustentvel de satisfazer as necessidades energticas, em especial no sector dos transportes. A no toxicidade e biodegradabilidade so as principais caractersticas que os tornam como alternativa amiga do ambiente. Os seus benefcios se manifestam especialmente durante o seu uso final em que as emisses de gases poluentes so bastante baixas em relao aos combustveis convencionais e, sobretudo, as emisses de CO2 correspondem quantidade sequestrada atravs da fotossntese durante o crescimento da biomassa

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resultando num ciclo fechado de carbono. Alm dos benefcios ambientais relacionados com a reduo dos gases poluentes que propiciam as alteraes climticas, esto tambm associados aos biocombustveis outros benefcios tais como desenvolvimento da agricultura tradicional e melhoramento das condies econmicas das populaes do meio rural, diminuio da dependncia em relao aos combustveis fsseis e segurana energtica. Todavia, s vantagens que caracterizam o uso dos biocombustveis esto ligados srios impactos ambientais associados produo tais como consumo de grandes quantidades de gua e de fertilizantes, desflorestao e degradao do solo, reduo na produo de bens alimentares e, indirectamente, acentuao da pobreza (Puppn, 2002; Escobar et al., 2009). Embora os biocombustveis paream ser a alternativa mais apropriada e o seu desenvolvimento parea ser uma necessidade urgente existem muitas questes e controvrsias em relao retrica amigo do ambiente (Henke et al., 2005; Patzek et al., 2005). Em primeiro lugar, no est claro se a energia utilizada na prtica agrcola e em todo o processo de produo superada pela energia do biocombustvel final. Alm dessa dvida quanto ao real rendimento energtico h que somar todos os outros impactos causados pela produo e aplicao de fertilizantes, pesticidas e herbicidas envolvidos na produo da biomassa. Segundo Patzek et al. (2005), estes constrangimentos anulam completamente ou quase por completo as vantagens associadas ao uso final dos biocombustveis, especialmente para os biocombustveis da primeira gerao. Estes j mostraram que os custos de produo e os recursos requeridos os tornam pouco sustentveis e quase to poluentes quanto os combustveis fsseis (Henke et al., 2005). Apesar de alguns benefcios socioeconmicos apontados quanto ao uso dos biocombustveis (Ryan et al., 2006), o aumento da demanda contribui, em grande medida, para degradao ambiental e acentuao da misria nos pases em vias de desenvolvimento. Maior demanda implica maior necessidade de terreno agrcola para a produo de matria-prima o que conduz, por um lado, desflorestao, degradao do solo e eroso e devastao da biodiversidade, por outro lado, ao agravamento da fome e da pobreza nos pases em desenvolvimento, uma vez que, os terrenos arveis antes dedicados ao cultivo de bens alimentares sero destinados produo de matria-prima para a produo de biocombustveis para alimentar os mercados dos pases desenvolvidos (Runge e Senauer, 2007).

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2.7Biodieselcomoalternativaaodieselconvencional
Com a escassez das reservas de combustveis fsseis e o agravamento dos problemas ambientais, o biodiesel vem ganhando cada vez maior importncia como uma alternativa atractiva capaz de substituir total ou parcialmente os combustveis lquidos de origem fssil, principalmente no sector dos transportes, e contribuir com vrios benefcios ambientais e socioeconmicos. Todavia, a histria de utilizao de leos vegetais no nova. Em 1900, o inventor alemo Rudolph Diesel levou exposio internacional de Paris um motor com novo sistema de funcionamento, chamado de ciclo Diesel. O motor era movido com leo de amendoim e, nas primeiras dcadas do sc. XX, foram utilizados leos de vrias outras espcies vegetais para seu funcionamento. Porm, o alto custo de produo de sementes desde aquela poca foi uma dificuldade para utilizao do motor Diesel. A abundncia de petrleo no incio do sc. XX e o baixo custo para refino de seu leo fez com que os leos vegetais fossem substitudos pelo leo refinado de petrleo, que ento foi chamado de leo diesel. Nas dcadas de 30 e 40 do sc. XX, leos vegetais eram utilizados apenas em caso de emergncia (Knothe et al., 1997; Ma e Hanna, 1999; Demirbas, 2003). Os leos vegetais, tambm conhecidos por triglicridos (98%) (ou triglecerdeos) embora contenham tambm pequenas percentagens de mono e diglicridos, possuem a estrutura qumica representada na Figura 5 e so constitudos por steres de cidos gordos e glicerol. A estrutura qumica pode conter oxignio e duplas ligaes em vrias propores, caractersticas que diferenciam os vrios tipos de leos vegetais (Balat, 2007). Constatou-se, porm, que a aplicao directa dos leos vegetais nos motores limitada por algumas propriedades fsicas dos mesmos, principalmente sua alta viscosidade, sua baixa volatilidade e seu carcter poliinsaturado, que implicam alguns problemas nos motores, bem como uma combusto incompleta (Knothe et al., 1997; Demirbas, 2003, 2005). Assim, visando reduzir a viscosidade dos leos vegetais, diferentes alternativas tm sido consideradas, tais como diluio, microemulso com metanol ou etanol, craqueamento cataltico e reaco de transesterificao com etanol ou metanol. Entre essas alternativas, a transesterificao (Figura 5) tem-se apresentado como a melhor opo visto que o processo relativamente simples promovendo a obteno de um combustvel, denominado biodiesel, cujas propriedades so similares s do diesel convencional (Balat e Balat 2008, Basha et al., 2009). A produo do biodiesel a partir da converso de diversos tipos de leos atravs desse processo de

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transesterificao tem sido largamente explorada por um grande nmero autores, conforme revisto por Basha e colaboradores (2009), sendo que a maioria dos estudos visaram o incremento da eficincia da converso e da qualidade do biodiesel derivado. O processo de transesterificao (Figura 5) em si mantm-se como o mais amplamente utilizado na produo desse biocombustvel dado as suas vantagens e envolve a reaco do leo vegetal com um lcool, usualmente o lcool metlico ou o etlico, utilizando um catalisador que geralmente a soda custica. O produto dessa reaco um ster, o biodiesel, e o seu principal subproduto a glicerina ou glicerol. De um modo geral, biodiesel foi definido pela National Biodiesel Board dos Estados Unidos como o derivado mono-alquil ster de cidos gordos de cadeia longa, proveniente de fontes renovveis como leos vegetais ou gordura animal, cuja utilizao est associada substituio de combustveis fsseis em motores de ignio por compresso (motores do ciclo Diesel) (Knothe et al., 1997). Segundo as normas ambientais internacionais, pode ser utilizado como combustvel e como aditivo para combustveis, isto , pode ser usado puro a 100% (B100), em mistura com o diesel convencional (B20), ou numa proporo baixa como aditivo de 1 a 5% (Shahid e Jamal, 2008; Balat e Balat 2008).

Figura5:EsquemarepresentativodareacodetransesterificaoondeR1,R2eR3representamascadeiasdos cidosgordos(adaptadodeFerrarietal.,2005).

Sendo biodiesel possuidor de carcter no txico, biodegradvel e proveniente de fontes renovveis, a sua grande vantagem prende-se com o facto de a sua utilizao eliminar ou atenuar vrias formas de agresso ao meio ambiente, que so inevitveis com o uso de combustveis convencionais. Em primeiro lugar, evita-se utilizar um combustvel fssil, com reservas limitadas. Em segundo lugar, reduz-se a emisso de diversas substncias prejudiciais, normalmente encontradas nas emisses, como dixido de carbono, o monxido de carbono, hidrocarbonetos diversos, xidos de enxofre e fuligem. Os inconvenientes do biodiesel em relao aos combustveis convencionais so

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a sua maior viscosidade, menor contedo energtico, alto ponto de inflamao, combusto mais pobre e, consequentemente, menores fora e velocidade, e o aumento das emisses de NOx. Como desvantagens operacionais em motores diesel pode-se citar o problema de arranque a baixas temperaturas, os problemas de injeco devido viscosidade, e o fraco contedo energtico que levam a um aumento do consumo em relao ao diesel convencional (Demirbas, 2007; Basha et al., 2009). De acordo com revises efectuadas por Demirbas (2006, 2007 e 2009), os estudos da sustentabilidade econmica do biodiesel indicam que os principais factores a ter em considerao so os custos de capital associados a cada espcie utilizada, a capacidade operacional de produo, o processo tecnolgico requerido e os custos da matriaprima. Contudo, o mais importante destes factores a considerar o custo da produo da matria-prima que ocupa 75 80% dos custos operacionais. Os custos de produo do biodiesel derivado do leo de palma, que a espcie com o maior rendimento, e do leo de soja, que a espcie mais cultivada actualmente para esse fim, so cerca de 1,5 a 3 vezes mais elevados quando comparado com o custo de produo do diesel convencional (Demirbas, 2007), facto que faz com que o preo ao consumidor tenda a ser mais elevado e seja produzida em menor quantidade relativamente a outros renovveis como o etanol. Recentemente, tem-se verificado uma acentuada taxa de aumento na indstria do biodiesel o que se deve no s ao desenvolvimento de novas espcies de oleaginosas mas tambm ao aumento das exploraes o que se espera vir a reflectir no preo da matria-prima. Contudo, a sustentabilidade desta industria tem dependido muito de subsdios ao sector agrcola e dos incentivos fiscais (Henke et al., 2005; European Commission, 2007). A sustentabilidade e a competitividade desta indstria s se conseguem quando o preo de venda do biodiesel cobrir todos os custos de produo e de distribuio sem ultrapassar o preo de venda do diesel convencional ao consumidor final. Nas condies actuais, considera-se que o biodiesel no competitivo e s o ser com fontes de matria-prima cada vez menos dispendiosas e uma tecnologia de converso que permita a utilizao mais eficaz da biomassa. O maior passo neste sentido envolve o desenvolvimento e a diversificao fontes de matria-prima capazes de serem produzidas em vasta quantidade a baixo custo e de contornar o problema da sazonalidade (Eriksen, 2008).

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2.8Microalgascomomatriaprimaparaobiodiesel
A indstria do biodiesel um dos sectores com uma das mais rpidas taxas de expanso a nvel global mas que se depara actualmente com um grande dilema: fonte de matriaprima capaz de satisfazer a crescente demanda e capaz de ser social, ambiental e economicamente sustentvel (Henke et al., 2005; Schenk et al., 2008). Ao contrrio de todas as fontes de matria-prima usadas at hoje na produo do biodiesel, as algas so largamente encaradas como a forma mais eficiente de gerao desse biocombustvel e parecem representar a nica fonte verdadeiramente renovvel com o potencial de satisfazer a demanda global por combustveis lquidos sem comprometer a produo de bens alimentares (Schenk et al., 2008, Chisti, 2007, 2008, Dismukes et al., 2008). As algas constituem um grupo muito diverso de organismos fotossintticos em geral presentes em quase todos os meios aquticos, doce ou salino. Sob essa designao, embora sem valor taxonmico, esto includas as macroalgas e as microalgas. Macroalgas so organismos eucariticos, multicelulares e macroscpicos que podem atingir dimenses desde poucos milmetros at mais de 60 metros de comprimento em certas espcies. As microalgas, pelo contrrio, so organismos microscpicos, unicelulares ou coloniais, que podem ser procariticos ou eucariticos (Hoek et al. 1995; McHugh, 2003). Comparativamente s plantas terrestres, as algas, em especial as microalgas, apresentam muitas vantagens que se devem a vrios aspectos fisiolgicos e bioqumicos: eficincia de converso fotossinttica da luz solar (~10%) cerca de 6 a 12 vezes superior que garante maiores rendimentos em termos de produtividade (Falkowski e Raven 1997; Zhu et al., 2008; Packer, 2009); ausncia de estrutura de suporte constituda por polmeros como a lenhina o que elimina a necessidade de prtratamento cido, reduz os custos industriais e aumenta a eficincia de converso da biomassa em biocombustveis (Lynd et al., 2008); enorme diversidade ecolgica, especfica, morfolgica, gentica e metablica o que permite a seleco de espcimen mais adequados a determinadas condies, locais de cultivo e sistemas de colheita (Dismukes et al., 2008); possibilidade de suas vias biossintticas serem manipuladas e direccionadas, atravs da alterao das condies de cultivo e stress ambientais, para a produo e acumulao substancial dos compostos desejveis para a produo de biocombustveis (Hu et al., 2008). Ademais, a possibilidade de cultivo da biomassa de algas em ambientes marinhos, costeiros e terrenos desertos no arveis elimina a competio por reas correntemente utilizadas para a agricultura e produo de bens alimentares (Patil et al., 2008, Li et al., 2008).

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No nova a ideia do cultivo de algas e aproveitamento da biomassa para a produo de biocombustveis. Uma das primeiras sugestes a esse respeito encontrada no trabalho de Meier de 1955. No decurso das dcadas seguintes do sc. XX inmeros trabalhos foram levados a cabo no sentido de explorar o potencial e a viabilidade econmica do uso da biomassa de algas para a gerao de biocombustveis sendo a maioria desses trabalhos focados na possibilidade de utilizao do CO2 derivados da utilizao de combustveis fsseis para potenciar o crescimento das algas (Packer, 2009). Neste sentido, uma das primeiras culturas de microalgas a larga escala foi realizada no Japo no incio da dcada de 1960 com o gnero Chlorella (Spolaore et al., 2006). Todavia a mais extensa pesquisa foi levada a cabo pela Aquatic Species Program (ASP) da National Renewable Energy Laboratory (NREL) dos Estados Unidos de Amrica que durou de 1978 a 1996 e coleccionou mais de 3000 espcies de microalgas das quais cerca de 300 foram consideradas como potencial fonte de matria-prima para a produo do biodiesel. Todavia a ASP concluiu no final da sua actuao que o custo de produo torna a ideia de biodiesel a partir da biomassa de microalgas proibitiva a menos que se desenvolva toda a tecnologia associada e se adapte o cultivo de algas integrado ao tratamento de guas residuais ricas em nutrientes tais como nitratos e fosfatos (Sheehan et al., 1998b). Matria-prima Milho Soja Canola Jatropha Coco Palma Microalgas (70% leo na biomassa seca) Microalgas (30% leo na biomassa seca) Rendimento em leo (litros/hectare) 172 446 1190 1892 2689 5950 136900 58700

TabelaI:Produtividadesdealgumasfontesdebiodiesel(Chisti,2007;GouveiaeOliveira,2009).

As algas microscpicas, microalgas, tm sido apontadas como a mais promissora fonte de biomassa para a produo de biodiesel por serem os mais eficientes organismos fotossintticos no planeta permitindo produtividades em leo muito superiores s outras espcies terrestres utilizadas na produo desse biocombustvel (Tabela I). A superioridade desses microrganismos em relao s outras fontes de biomassa deve-se sua natureza unicelular, estrutura simples e ao seu cultivo em meio lquido que permite melhor acesso aos nutrientes (Patil et al., 2008). De facto, muitas pesquisas recentes mostram o forte potencial das microalgas como fonte de biomassa para a produo de

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biodiesel. Do ponto de vista prtico, as microalgas so relativamente fceis de cultivar, necessitando de pouca ateno e podendo ser cultivadas em guas residuais imprprias para o consumo humano donde extraem os nutrientes, tais como nitratos e fosfatos, necessrios ao crescimento contribuindo para o tratamento dessas guas e minimizao da eutrofizao (Mata et al., 2009). Para alm de poderem crescer em quase qualquer stio, as microalgas crescem extremamente rpido duplicando habitualmente a biomassa em cerca de 24 horas e em algumas espcies, durante a fase exponencial, a duplicao ocorre em cerca de trs horas e meia (Chisti, 2007). A sua alta taxa de crescimento permite uma produtividade estimada 50 vezes maior que a das gramneas do gnero Panicum que so as plantas terrestres com a maior taxa de crescimento (Demirbas, 2009). Segundo Chisti (2007), com base no contedo lipdico (Tabela II) de algumas espcies, as microalgas podem produzir 100 vezes mais leo que a soja por unidade de terra cultivada.

TabelaII:Contedolipdicodealgumasespciesdemicroalgas(Chisti,2007).

As microalgas, alm do potencial de fornecer substrato para diferentes tipos de combustveis renovveis, tais como biodiesel, bioetanol, biometano, biohidrognio, entre outros, podem ao mesmo tempo servir outros propsitos, nomeadamente, a biofixao de CO2 derivado do funcionamento de instalaes industriais contribuindo para a reduo das emisses de gases com efeito de estufa, tratamento de guas residuais atravs da remoo de contaminantes como amnia, nitratos e fosfatos, aproveitamento da biomassa residual para alimentao animal, como fertilizantes orgnicos, na gerao de electricidade atravs da incinerao (Wang et al., 2008) ou para a recuperao de

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compostos com valor comercial tais como pigmentos, antioxidantes, polissacridos e certos compostos bioactivos com aplicaes nas reas farmacutica, nutracutica e cosmtica (Raja et al., 2008).

2.9Produodebiomassademicroalgas
A produo de biodiesel capaz de suprir a demanda requer grande quantidade de leo o que por sua vez requer a habilidade de produzir a baixo custo grande quantidade de biomassa. A chave para a produo sustentvel de biodiesel a partir de biomassa de microalgas depende de diversos factores que se resumem em trs grandes grupos: o cultivo, a colheita e o processamento da biomassa. A produtividade em leo, que a massa do leo produzido por unidade de volume de microalgas por dia, depende da taxa de crescimento e do contedo lipdico, pelo que, para a produo de biodiesel, imprescindvel a pesquisa, seleco e optimizao de espcies de microalgas com elevada produtividade. O cultivo e produo da biomassa de microalgas requerem luz, dixido de carbono, gua, sais inorgnicos e temperatura entre os 20 e 30C para a maioria das espcies (Chisti, 2007; Patil et al., 2008). At a data, os sistemas de cultivo de microalgas praticveis a larga escala so os raceways ou lagoas a cu aberto e os fotobiorreactores tubulares fechados embora exista uma srie de outros sistemas, conforme revisto por Eriksen (2008), que j foram desenvolvidos, testados e optimizados escala laboratorial e piloto. Os sistemas (raceways) a cu aberto desde 1950 que tm vindo a ser utilizados e so, actualmente, os mais utilizados na produo comercial de microalgas o que se deve ao seu baixo custo de construo e operao em relao aos fotobiorreactores. Todavia, esses sistemas apresentam alguns inconvenientes, tais como, evaporao acentuada, flutuao das condies de cultivo (temperatura, iluminao, salinidade, pH, etc.) com a variao das condies ambientais, baixa eficincia no uso de CO2, grande possibilidade de contaminao por microrganismos indesejveis e agitao deficiente, o que faz com que a produtividade seja muito inferior em relao aos sistemas fechados. Nos fotobiorreactores fechados, ao contrrio dos raceways, possvel controlar as condies de cultivo requeridas por uma variabilidade de espcies, manter uma cultura mono-especfica sem contaminaes, ajustar, consoante o objectivo, os factores que potenciam o crescimento e acumulao de bioprodutos, o que permite uma maior produtividade em biomassa e uma maior concentrao volumtrica. Apesar desta vantagem, os elevados custos de construo, operao e manuteno tm constitudo grandes limitaes aplicao destes sistemas a

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cultivos em larga escala, sendo utilizado apenas no cultivo de espcies com elevado valor comercial, em geral, destinados aos mercados farmacutico, nutracutico e cosmtico (Eriksen, 2008; Schenk et al., 2008).

2.10Colheita,processamentoeconversodabiomassaem biocombustvel
A colheita da biomassa do meio de cultura uma das etapas mais dispendiosas de todo o processo de produo de microalgas e envolve um custo que pode rondar os 20 a 30% de todo o custo produo (Molina Grima et al., 2003). Contudo, o custo de colheita nos fotobiorreactores apenas uma fraco desse mesmo custo nos raceways dado que a concentrao da biomassa cerca de 30 vezes superior nos fotobiorreactores (Packer, 2009). Vrios mtodos de colheita so praticados, conforme revisto por Molina Grima e colaboradores (2003), mas a centrifugao, a filtrao e a floculao so os mais aplicados a grande escala embora apresentem algumas limitaes e nem sempre sejam os menos dispendiosos. Qualquer que seja a tcnica de colheita requer uma elevada relao custo/eficincia na desidratao da biomassa de microalgas que essencialmente constituda por gua. Neste sentido a floculao espontnea ou biofloculao, presente em algumas espcies de microalgas, a melhor das alternativas e pode ser potenciada com o ajuste do pH (Schenk et al., 2008, Packer, 2009). O processamento subsequente da biomassa de microalgas envolve vrios mtodos e a produo de diversos biocombustveis, todavia, o biodiesel, o bioetanol, o biometano e o biohidrognio so as principais opes considerados pela mais vasta pesquisa do ramo conduzida pela Aquatic Species Program (ASP) (Sheehan et al., 1998b). Os mtodos de processamento e converso da biomassa de microalgas, em geral, so bioqumicos e termoqumicos. A converso bioqumica abarca tanto a fermentao, a digesto anaerbia e outros processos envolvendo microrganismos como tambm a transesterificao do leo obtido atravs de vrios processos de extraco. A converso termoqumica compreende a gaseificao, a liquefaco, a pirlise e a hidrogenao (Goyal et al., 2008; Amin, 2009; Saxena et al., 2009). A produo do biodiesel atravs da transesterificao implica a extraco do leo da biomassa de microalgas o que feito atravs de vrios processos, tais como, prensagem mecnica, extraco por solventes, extraco por choque osmtico, extraco por ultrasom, extraco supercrtica com CO2, entre outros. Todos estes mtodos requerem o

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pr-tratamento de desidratao que a nvel laboratorial tem sido tradicionalmente a liofilizao que , porm, um processo moroso e muito dispendioso. Contudo, no existe um mtodo completamente estabelecido como o mais eficaz para as microalgas e esta etapa de extraco, devido ao seu custo, pode determinar a sustentabilidade econmica de todo processo. (Amin, 2009; Lee et al., 2009). Para a produo de biodiesel, os ensaios de extraco de lpidos tm sido, em geral, efectuados com solventes orgnicos por serem relativamente rpidos e eficazes. Vrios solventes tem sido utilizados, em especial hexano, etanol, clorofrmio e metanol, puros ou em misturas, permitindo eficincias de extraco superiores a 96%. De entre todos os solventes usados, o hexano por ser menos dispendioso, selectivo e biocompatvel tem sido o solvente de eleio nas aplicaes a grande escala (Mata et al., 2009). No sentido de eliminar as etapas dispendiosas no processo de converso da biomassa de microalgas em biocombustveis e obter um combustvel competitivo em relao aos combustveis fsseis tem-se desenvolvido e testado vrios processos de converso termoqumicos em que no seja necessria a desidratao completa da biomassa. Todavia, esses processos, que incluem a gaseificao, a liquefaco, a pirlise e a hidrogenao da biomassa de microalgas, encontram-se em desenvolvimento e necessitam de maiores avanos tecnolgicos no sentido de conseguir um rendimento energtico positivo e sustentabilidade econmica (Amin, 2009).

2.11Botryococcusbraunii
Botryococcus braunii uma espcie de microalgas verdes (Chlorophyceae) que cresce formando colnias irregulares, com 30 a 500m, constitudas por clulas elpticas embebidas numa matriz mucilaginosa. No ambiente natural e em guas paradas esta espcie forma colnias flutuantes, divido acumulao de leos, apresentando colorao verde, laranja, vermelha ou castanha. Tem uma vasta distribuio em corpos de gua continentais e lagos de gua doce ou salobra em zonas temperadas, alpinas e tropicais (Wolf, 1983; Li e Qin, 2005; Metzger e Largeau, 2005). Esta espcie apresenta o potencial de sintetizar e armazenar um elevado contedo em hidrocarbonetos que pode ultrapassar 80% da sua biomassa seca (Metzger et al., 1985; Sawayama et al., 1994). Devido a esta notvel habilidade para produzir hidrocarbonetos, esta espcie tem sido investigada sob diversas condies e tem sido considerada, com base em vrios estudos, como uma potencial fonte renovvel de combustveis para o futuro (Casadevall et al., 1985; Metzger e Largeau, 2005; Dayananda et al., 2005, 2007). Dependendo do

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tipo de hidrocarbonetos sintetizado, esta espcie pode ser classificada em trs raas diferentes: a raa A produz hidrocarbonetos C23 a C33 que podem constituir at 61% da biomassa seca das colnias; a raa L produz apenas hidrocarbonetos tetraterpenoides (C40) podendo estes constituir de 2 a 8% da biomassa seca; e a raa B produz hidrocarbonetos polinsaturados ramificados, C30 a C37, designados correntemente por Botryococenos. Estes ltimos compostos so considerados promissores como fontes renovveis de energia dado que so acumulados de 26 a 86% da biomassa seca. Curioso que para todas as raas foi demonstrada que a produo ptima de hidrocarbonetos acontece durante a fase exponencial pelo que a produo desses compostos parece ser a caracterstica normal da espcie B. braunii (Metzger et al., 1985; Metzger e Largeau, 2005; Dayananda et al., 2007). Alm dos hidrocarbonetos, B. braunii tambm conhecido por produzir exopolissacridos, superior a 250 g/m3 nas raas A e B e superior a 1 kg/m3 na raa L (Banerjee et al., 2002). Muitas estirpes de B. braunii crescem numa larga variedade de condies e a produo de lpidos varia no s entre as estirpes mas tambm de acordo com as condies ambientais ou de cultivo (Pal et al., 1998). Os mais importantes factores que influenciam o crescimento e a produo lipdica so a temperatura, a intensidade luminosa, o fotoperodo, a salinidade e a concentrao de nutrientes como nitratos e fosfatos (Qin, 2005; Li e Qin, 2005; Rao et al., 2007a e b). Nos estudos experimentais clssicos, vrias modificaes do meio de cultura CHU 13 foram usados a fim de determinar o comportamento de B. braunii quanto produo de hidrocarbonetos e exopolissacridos (Brown et al., 1969; Casadevall et al., 1985). Todavia, nos dias que correm em que se quer um uso bem sucedido da espcie, a larga escala, como fonte alternativa de energia imprescindvel incrementar alguns parmetros como a taxa de crescimento em termos de biomassa, a produtividade em termos de hidrocarbonetos e a eficincia do biocombustvel resultante. Assim, vrios meios e condies de cultura e diversas combinaes de factores ambientais tm sido estudados no sentido de determinar as condies ptimas para o cultivo de B. braunii e produo de hidrocarbonetos visando a obteno de biodiesel (Qin, 2005; Li e Qin, 2005; Rao et al., 2007a e b; Dayananda et al., 2005, 2007).

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3MateriaiseMtodos
3.1Espcie/estirpe
Duas estirpes da espcie Botryococcus braunii Ktzing (Chlorophyta; Chlorophyceae; Botryococcaceae) foram utilizadas neste trabalho. Os inculos iniciais foram adquiridos Algoteca do Departamento de Botnica da Universidade de Coimbra (ACOI Coimbra Collection of Algae - http://acoi.ci.uc.pt), sob as designaes ACOI 58, oriunda do Porto da Castanheira, Poo dos Baslios, colhida em 1975, e ACOI 1257, colhida em 1997 na barragem da erva da fome, na Serra de Estrela. As estirpes ACOI 58 e ACOI 1257 foram integradas na coleco de microalgas da Algoteca do Instituto de Oceanografia (IO) da FCUL (ALISU) e apelidadas de IO 98-01 e IO 98-02, respectivamente. Doravante neste trabalho ser utilizada esta nova designao para identificar cada uma das estirpes, ou simplesmente estirpe 01 e estirpe 02 respectivamente.

3.2Preparaodoinculo
Culturas das duas estirpes foram mantidas numa cmara de culturas Fitoclima 750 E (Aralab) na Algoteca do IO, em meio artificial BBM (ver Anexo), em erlenmeyers de 100 ml de volume contendo 50 ml de cultura, e foram repicadas mensalmente. Cerca de um tero de cada uma das culturas foi usada para repicar e os volumes restantes foram utilizados para criar culturas inculo. Assim, foram transferidas para a sala de culturas do Departamento de Biologia Vegetal da FCUL Edif. C2-Piso 1, doravante referida como DBV-FCUL onde foram aclimatadas s condies da cultura experimental. A expanso do inculo efectuou-se duplicando o volume das culturas a cada 15 dias atravs da repartio por novos erlenmeyers e adio de meio de cultura BBM. Estas culturas inculo foram mantidas a uma temperatura de 23C 1 e luminosidade constante de 100 a 110 mol.s-1.m-2, medida com um radimetro LI-250A equipado com um sensor Li-192S (Li-Cor Biosciences).

3.3Condiesdecultura
Para todos os cultivos experimentais realizados no decurso deste trabalho foram usadas mangas de polietileno transparente com dimetro de 12,5 cm, contendo 2 litros do meio de cultura. Foi construda na sala de culturas do DBV-FCUL uma estrutura de madeira em que as mangas, contendo as culturas, eram penduradas numa orientao que favorecia a exposio s fontes luminosas. A temperatura na sala de cultivo foi mantida

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constante a 23C 1 e a iluminao fornecida por lmpadas fluorescentes (Philips TLD 36W/35-535 SLV) com um fotoperodo de 14/10, luz/escurido. A intensidade luminosa tambm foi, ao longo de cada fase de cultivo, mantida constante. O arejamento das mangas foi efectuado utilizando bombas de aqurio fornecendo 1,5 l/min atravs de tubos de polietileno. Foram utilizados dois meios artificiais, BBM e CHU, e gua residual pr-tratada (ETAR) (ver Anexo). Todas a culturas foram mantidas uni-algais atravs do uso de materiais e meios de cultura esterilizados. Os meios de cultura foram autoclavados a 121C e 1 bar por 20 minutos (pbi-international). As mangas de polietileno foram sujeitas a radiao UV durante 20 minutos antes de serem usadas numa cmara de fluxo laminar (ESI, FluFrance). Todos os materiais de vidro utilizados nas pr-culturas foram esterilizados com calor seco a 180C em estufa (Selecta, modelo 209) durante uma hora. Todas as inoculaes e preparao das mangas com as culturas foram realizadas numa cmara de fluxo laminar (ESI, Flufrance).

3.4Determinaodocrescimento
3.4.1Mtododopesoseco

Foi retirada de cada cultura experimental uma alquotas de 15 ml, de quatro em quatro dias, aproximadamente no mesmo horrio. De cada alquota, uma sub-amostra de 10 ml foi filtrada a vcuo (usando o kitassato, funil de Buchner e trompa de gua) atravs de filtros de microfibra de vidro (Fisher, 47 mm, poros 1.2 m) previamente secos em estufa (80 por 16 horas) e pesados (Shen et al., 2009). Aps a filtrao, os filtros foram de novo secos em estufa (80 por 16 horas) e depois mantidos no excicador sob vcuo at peso constante. O peso seco da biomassa foi obtido subtraindo ao peso final o peso do filtro.
3.4.2Mtodoespectrofotomtrico

O crescimento foi tambm estudado pelo mtodo espectrofotomtrico atravs da absorvncia a 680 m dado ser relatado por vrios autores existir uma correlao directa entre a densidade ptica e o peso seco, a partir de determinados valores (Sim et al., 2001; An et al., 2003). Foi medida a absorvncia das culturas a partir de 1 ml da suspenso de algas usando o meio de cultura como branco num espectrofotmetro UV/visvel (UV-1603, Shimadzu).

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3.5Planeamentoexperimental
No decorrer do perodo de trabalhos laboratoriais foram efectuados trs conjuntos de experincias como a seguir se descreve.
3.5.1Comparaodocrescimentoeprodutividadeembiomassaemdiferentes meiosdecultura

Realizaram-se trs culturas, estirpe IO 98-01 em meio BBM e CHU e estirpe IO 98-02 em meio CHU. Pretendia-se tambm comparar os mtodos do peso seco e espectrofotomtrico para determinao do crescimento (ver 3.4). Estas primeiras culturas, que tiveram incio a 20 de Fevereiro de 2009, foram realizadas na sala de culturas do DBV-FCUL, mantidas a uma temperatura constante de 23C 1, uma intensidade luminosa de 110-120 mol.s-1.m-2, medida com um radimetro LI-250A equipado com um sensor Li-192S (Li-Cor Biosciences), e um fotoperodo de 14/10 luz/escurido, durante 50 dias, sendo as amostragens realizadas de 4 em 4 dias. No final do perodo de cultivo toda a biomassa foi colhida por centrifugao a 8000 rpm, 16C, 10 minutos (Rotina 35R, Hettich) e congelada a -80C para tratamento posterior (ver 3.7).
3.5.2 Determinao do crescimento, produtividade em biomassa e contedo lipdico(hidrocarbonetos)emculturasindoors

Nesta segunda fase de culturas, que teve incio a 23 de Abril de 2009, alm dos dois meios de cultura artificiais j utilizados, foi tambm utilizada gua residual pr-tratada cedida pela ETAR de Chelas em Lisboa (SIMTEJO, S.A.), daqui em diante designada por ETAR (ver Anexo). Com o uso da gua de ETAR pretendia-se estudar o crescimento em biomassa e a acumulao de lpidos como forma de testar a possibilidade do uso dessas guas residuais, com menores custos adicionais, no cultivo das microalgas. Foram feitas 6 culturas das duas estirpes nos meios mencionados, conforme a Tabela III. As condies de cultura foram idnticas s da experincia anterior (ver 3.5.1) com excepo da iluminao que foi na ordem dos 220 mol.s-1.m-2. Foi usada a mesma periodicidade de amostragem, de 4 em 4 dias, e no final dos 50 dias de cultivo toda a biomassa foi colhida por centrifugao a 8000 rpm, 16C, 10 minutos (Rotina 35R, Hettich) e congelada a -80C para anlises posteriores (ver 3.7).

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Id. 1 2 3 4 5 6

Estirpe IO 98-01 IO 98-01 IO 98-01 IO 98-02 IO 98-02 IO 98-02

Meio de cultura CHU BBM ETAR CHU BBM ETAR

TabelaIII:Desenhoexperimentalseguidonasexperinciasparadeterminaodocrescimento,produtividadeem biomassaecontedolipdicoindoorseoutdoors

3.5.3Determinaodocrescimento,produtividadeembiomassaemculturas

outdoors Nesta ltima fase de culturas, iniciada a 16 de Julho de 2009, usaram-se os mesmos meios de cultura da experincia anterior (ver 3.5.2), na mesma disposio descrita na Tabela III, mas as culturas experimentais foram realizadas no exterior, luz natural do sol e sem controlo dos factores ambientais. As culturas foram realizadas nas mangas de polietileno j descritas, desta vez suspensas numa estrutura metlica de andaime, adquirida no comrcio, conforme se pode ver na Figura 14. A estrutura de suporte das culturas foi disposta numa orientao nascente-poente de modo a permitir a exposio mxima luz solar das mangas de cultura. As amostragens efectuaram-se de forma similar s outras fases de cultura.
3.5.4Anlisedenutrientes

Para a quantificao dos nitratos (NO3-), nitritos (NO2-) e fosfatos (PO43-) as amostras foram filtradas atravs de filtros de fibra de vidro (Fisher) e de seguida congeladas at as anlises que foram realizadas usando um Tecator FIAstar 5020 Analyser equipado com um espectrofotmetro Hitachi U-3200. As concentraes de nitratos e nitritos foram determinadas de acordo com o mtodo de Grasshoff (1976) e o mtodo de Bendschneider e Robison (1952) respectivamente. A quantificao dos fosfatos foi pelo mtodo de Murphy e Riley (1962). A determinao da concentrao da amnia foi realizada com amostras filtradas de acordo com o mtodo de Koroleff (1969) usando um espectrofotmetro UV/visvel (UV-1603, Shimadzu). Estes testes foram realizados a amostras das culturas em gua residuais (ETAR) no incio e no fim das culturas com o intuito de analisar a capacidade das duas estirpes de microalgas de remover nutrientes.

3.6Determinaodocontedolipdicodasculturas
A determinao da variao do contedo lipdico ao longo do perodo de cultivo experimental das microalgas foi realizada pelo mtodo do vermelho do Nilo (Lee et al.,

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1998). Para tal, foram retiradas alquotas de 10 ml de cada cultura, quantidade suficiente para trs replicados de 3 ml. A cada replicado foram adicionados 50 l da soluo do corante/fluorforo vermelho do Nilo em acetona (0,25 g/ml) (Carman et al., 1991, Elsey et al., 2007). A mistura foi vigorosamente agitada num vortex (Reax 2000, Heidolph) e incubada no escuro. A leitura dos valores de fluorescncia foi efectuada cerca de 10 a 15 minutos aps a adio do fluorforo, num leitor de microplacas (SpectraMax Gemini EM Fluorescence Microplate reader, Molecular Device) com os comprimentos de onda de excitao a 490 m e de emisso a 585 m. Os valores relativos de fluorescncia foram obtidos depois da subtraco das autofluorescncias da suspenso de algas e da soluo do vermelho do Nilo no meio de cultura.

3.7Extracodelpidostotais
No final das culturas experimentais, a biomassa total de microalgas foi colhida atravs de centrifugao (Rotina 35R, Hettich) durante 10 minutos, a 8000 rpm e 16C sendo de seguida congelada a -80C e liofilizada (Cryodos, Telstar) durante 48h. A fraco lipdica foi obtida por extraco de cada amostra com solventes orgnicos utilizando uma adaptao do mtodo de Bligh e Dyer (1959). Cada amostra foi triturada num almofariz e depois pesada (Mettler AE 160) e transferida para um tubo de centrfuga (Falcon) de 50 ml ao qual foi adicionado, por cada grama de amostra introduzida, 5 ml de clorofrmio e 10 ml de metanol. A mistura foi sujeita a ultra-sons por 10 minutos, de seguida foram adicionados mais 5 ml de clorofrmio e 9 ml de gua destilada, seguindo-se ultra-sons por mais 5 minutos. Aps serem deixadas a extrair por duas horas as amostram foram agitadas no vortex por 30 segundos e centrifugadas durante 10 minutos, a 5000 rpm e 16C para separao de fases (orgnica inferior, aquosa superior). A fase orgnica foi cuidadosamente recolhida para um balo de vidro de fundo redondo, previamente seco e tarado, e repetiu-se ento o processo de extraco com a adio amostra de mais 10 ml de clorofrmio. A fraco lipdica recolhida na fase orgnica para o balo foi seca num evaporador rotativo (Yamato Hi Tec RE-51, Water Bath BM-51) para eliminar o solvente e depois pesada. De seguida, cada amostra, i.e., cada um dos extractos secos, foi novamente dissolvida em 3 ml de hexano, transferida para frascos de vidro (GC vial) e armazenada no frigorfico at anlise.

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3.8Anlisedafracolipdica
Para determinao dos cidos gordos presentes nos extractos obtidos em 3.7 foram utilizados os procedimentos descritos por Nyberg (1986) e Indarti et al. (2005) com ligeiras adaptaes, no laboratrio do Centro de Biotecnologia Vegetal do DBV-FCUL. Sumariamente, em tubos de vidro foram introduzidos 3 ml de cada um dos extractos e 5 ml de uma soluo de metanol/benzeno/cido sulfrico (20/1/1). A mistura foi aquecida a 80C por duas horas num banho-maria (UNIVEBA, Selecta) para o processo de metanlise. Aps o arrefecimento foram adicionados 5 ml de gua destilada a cada um dos tubos e a mistura foi vigorosamente agitada no vortex. Os metil-steres resultantes da reaco de metanlise foram extrados 3 vezes com 1 ml de hexano e, aps concentrao sob fluxo de azoto, submetidos cromatografia em coluna de slica sendo os cidos gordos esterificados eludos com 5 ml de pentano. A amostra foi concentrada sob um fluxo de azoto para a evaporao do solvente e armazenada para a anlise. As anlises para a identificao dos cidos gordos presentes no extracto foram realizadas por cromatografia gs-lquido de alta resoluo (CGL) e cromatografia gs-lquido de alta resoluo associada espectrometria de massa (CGL/EM). As anlises de CGL foram realizadas num cromatgrafo Perkin Elmer Autosystem XL equipado com dois detectores de ionizao de chama, um sistema de tratamento de dados e um injector no qual foram instaladas duas colunas capilares de polaridade diferente: uma coluna DB-1 de slica fundida, de fase imobilizada de metilsilicone, (30 m x 0,25 mm d.i., espessura de filme 0,25m J & W Scientific Inc.) e a outra DB-l7HT de slica fundida (30m x0,25mm d.i., espessura de filme 0,15m; J & W Scientific Inc.). A temperatura do forno foi programada de 50C a 300C, com incrementos de 5C.min-1. Atingidos os 300C, a temperatura foi mantida isotrmica durante 10 minutos. Temperatura do injector e dos detectores, 290C e 300C, respectivamente. Gs de arrastamento, hidrognio, ajustado para uma velocidade linear de 30cm.s-1. Relao de repartio de fluxo, 1:50. A composio percentual dos compostos foi determinada pela integrao das reas dos picos sem utilizao de factores de correco. Nas anlises de CGL/EM utilizou-se um cromatgrafo Perkin Elmer Autosystem XL equipado com uma coluna de slica fundida DB-1 (30 m x 0,25 mm d.i., espessura de filme 0,25m; J & W Scientific Inc.) ligado a um Perkin-Elmer Turbomass (verso de programa 4.1). A temperatura do forno foi programada como para as anlises de CGL; temperatura da linha de transferncia, 280C; temperatura da cmara de ionizao, 220C; gs de arrastamento, hlio, ajustado para uma velocidade linear de 30 cm.s-1; relao de

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repartio de fluxo, 1:40; energia de ionizao, 70 ev; corrente de ionizao, 60 A; gama de massas, 40-600 u; tempo de varrimento, 1 s. A identidade dos compostos foi determinada por comparao dos seus tempos de reteno e dos seus espectros de massa, com os de padres comerciais e compostos de referncia presentes em amostras existentes no laboratrio e por comparao com uma biblioteca de espectros de massa desenvolvida no laboratrio.

4.Resultados
4.1CaractersticasdabiomassadeBotryococcusbraunii
Do ponto de vista macroscpico a principal alterao visvel nas culturas realizadas a mudana de colorao. As culturas da primeira e da segunda fase realizadas indoors foram gradualmente adquirindo uma colorao verde intensa passando para uma tonalidade verde acastanhada no final das culturas. Quanto s culturas da terceira fase, realizadas outdoors, foi muito mais notvel a mudana da colorao tornando-se muito evidente a presena de pigmentos com colorao laranja intensa ao longo do perodo de cultivo. Pelas observaes microscpicas realizadas notou-se que das duas estirpes de B. braunii cultivadas, a IO 98-01 forma colnias de pequenas dimenses facilmente desagregadas com a agitao, enquanto a estirpe IO 98-02 forma colnias relativamente maiores e mais consistentes e resistentes agitao. Para nenhuma das estirpes se verificou flutuabilidade das colnias devido acumulao de lpidos, algo que apenas se notou em culturas sem agitao. A segunda estirpe ao longo do tempo de cultura foi adquirindo um aspecto viscoso e espesso o que tornou muito demorado o processo de filtrao para determinao do peso seco. Ainda para a colheita desta segunda estirpe por centrifugao, foi necessria uma maior velocidade de rotao e mais tempo, apesar do que as clulas no formaram um pellet consistente. A biomassa liofilizada da primeira estirpe aparentava-se como um p verde ou verde alaranjado e a da segunda estirpe formava uma massa pegajosa verde acastanhada.

4.2CrescimentodaBiomassa
4.2.1Primeirafasedeculturas

Na primeira cultura dois mtodos de anlise da biomassa foram usados, o mtodo gravimtrico e o mtodo espectrofotomtrico. As figuras 6 A, B e C mostram a relao

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linear estabelecida entre o peso seco determinado gravimetricamente e os valores de absorvncias correspondentes para as estirpes IO 98-01 no meio BBM, IO 98-01 no meio CHU e IO 98-02 no meio CHU, respectivamente. Os valores de R2 foram 0.9348, 0.967 e 0,8634 para IO 98-01 BBM, IO 98-01 CHU e IO 98-02 CHU, respectivamente. Dado que dentro da amplitude dos valores de peso seco no se verificou uma linearidade robusta, no se aplicou a relao para a estimativa do peso seco e, portanto, para as anlises do crescimento em biomassa passou-se a considerar apenas as determinaes do peso seco realizadas pelo mtodo gravimtrico. Na primeira cultura levada a cabo a fim de investigar o crescimento das duas estirpes de B. braunii os resultados mostram que embora o crescimento fosse contnuo ao longo do perodo de cultivo, para ambas as estirpes, o crescimento foi bastante lento (Figura 7A e 7B). A estirpe IO 98-01, que foi, nesta fase, cultivada nos dois meios artificiais (Figura 7A), BBM e CHU, revelou a existncia de diferenas apreciveis no crescimento. No meio BBM o crescimento inicial desta estirpe foi relativamente inferior ao verificado no meio CHU mas a partir do vigsimo dia de cultura o crescimento tornou-se bastante mais rpido no meio BBM e atenuou-se no meio CHU. Em relao aparncia macroscpica, verificou-se que a cultura no meio CHU cedo comeou a ficar muito verde mas a cor passou gradualmente a ficar acastanhada ao longo do tempo de cultivo, camuflando a cor verde. Em relao cultura da estirpe IO 98-01no meio BBM, ela manteve-se verde at o final do tempo de cultivo em que se efectuou a colheita total. H a notar tambm que a densidade em biomassa da cultura desta estirpe no meio BBM ultrapassou o dobro da mesma densidade na cultura no meio CHU sendo as concentraes da biomassa no final do perodo de cultivo de 1.86 e 0.88 g/L (peso seco), respectivamente. A estirpe IO 98-02 foi cultivada nesta primeira fase apenas no meio CHU dado insuficiente quantidade de inculo. A cultura teve um crescimento contnuo, embora relativamente lento, durante os 36 dias de cultivo e quando foi colhida no tinha ainda atingido a fase estacionria. A concentrao da biomassa na altura em que a cultura foi colhida era de 1.1g/L (peso seco), valor este superior concentrao de biomassa da estirpe 01 em meio CHU com os mesmos dias de cultivo (Figura 7 B).

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2 1,5 Biomassa(g/L) 1 0,5 0 0 0,5 0,5 Absovncia IO9801BBM 1 y=2,2362x 0,315 R=0,9348

2 y=1,8249x 0,1447 R=0,967 Biomassa(g/L) 1,5 1 0,5

IO9801CHU 0 0 0,5 Absovncia y=1,5506x 0,1617 R=0,8634 1

2 1,5 Biomassa(g/L) 1 0,5

IO9802CHU 0 0 0,5 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Absovncia

Figura6:Correlaoentreabiomassa(pesoseco)eaabsorvnciaa680m

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IO9801
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Biomassa(g/L)

BBM CHU

DiasdeCultivo

IO9802
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Biomassa(g/L)

CHU

DiasdeCultivo

Figura7:CurvasdecrescimentodasduasestirpesdeB.brauniirelativosprimeirafasedeculturas

4.2.2Segundafasedeculturas

Nesta fase, as condies de cultivo das duas estirpes nos diferentes meios de cultura mantiveram-se em relao primeira fase, com a excepo da iluminao que foi alterada (ver 3.5.2). A estirpe IO 98-01, nestas condies, apresentou um crescimento contnuo ao longo do tempo de cultivo mas com diminuio da taxa de crescimento na parte final indicando a proximidade da fase estacionria (Figura 8A). Apesar de as taxas de crescimento nos dois meios sintticos terem sido relativamente semelhantes notou-se que a biomassa manteve-se ligeiramente mais elevada no meio CHU durante maior parte do tempo de cultivo. As concentraes de biomassa atingidas para esta estirpe na altura da colheita final foram 0.71, 0.76 e 0.29 g/L (peso seco) nos meios CHU, BBM e ETAR, respectivamente. O crescimento desta estirpe na gua residual utilizada como

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meio de cultura (ETAR) foi bastante mais lento que nos meios de cultura sintticos utilizados, atingindo no final uma concentrao de biomassa inferior metade da conseguida nos meios sintticos. A estirpe IO 98-02, assim como a IO 98-01, apresentou crescimento contnuo em todos os meios utilizados ao longo do perodo de cultivo. Todavia, foram notadas significantes diferenas em relao estirpe 01 principalmente a nvel da aparncia morfolgica. Ao contrrio da estirpe 01, a IO 98-02 apresentou-se muito mais espessa e viscosa. Quando observada ao microscpio, as colnias so significativamente maiores, com clulas gradualmente mais acastanhadas ao longo do perodo de cultivo. Interessa salientar aqui que o crescimento desta estirpe diferente nos dois meios sintticos ao longo do perodo de cultivo. Conforme se verifica na Figura 8 B, o crescimento inicial mais acentuado no meio CHU, sendo, porm, atingida a fase estacionria mais cedo do que no meio BBM. Alis, no meio BBM, o crescimento continua por mais tempo levando a uma maior concentrao de biomassa. Para a estirpe IO 98-02 as concentraes de biomassa obtidas no final do perodo de cultivo foram de 0.76, 0.96 e 0.53 g/L (peso seco) nos meios CHU, BBM e ETAR, respectivamente. De comum nas culturas que para o meio ETAR o crescimento de ambas as estirpes no geral bastante mais lento que nos meios sintticos (figuras 8A e 8B), embora nas duas primeiras semanas o da estirpe IO 98-02 tenha sido maior que no meio BBM. As tendncias de crescimento das duas estirpes no meio ETAR, conforme mostrado na figura 9, so diferentes. A estirpe IO 98-02 cresceu melhor neste meio e atingiu perto do dobro da concentrao da biomassa atingida pela estirpe IO 98-01.

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IO9801
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 4 8 12 16 20 23 27 30 33 36 40 44 47 50 DiasdeCultivo

Biomassa(g/L)

CHU BBM ETAR

IO9802
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 4 8 12 16 20 23 27 30 33 36 40 44 47 50 DiasdeCultivo

Biomassa(g/L)

CHU BBM ETAR

Figura8:CurvasdecrescimentodasduasestirpesdeB.brauniirelativossegundafasedeculturas

35

0,6 0,5 Biomassa(g/L) 0,4 0,3 0,2 0,1 0

ETAR
y=0,0255x+0,157 R=0,9203

y=0,0165x+0,0387 R=0,9687

0 4 8 12 16 20 23 27 30 33 36 40 44 47 50 DiasdeCultivo

IO9801 IO9802

Figura9:ComparaodadinmicadecrescimentodasduasestirpesdeB.brauniicultivadasemguasresiduais

Considerando a produtividade em biomassa conseguida nesta segunda fase de culturas verificou-se que foi superior no meio BBM para ambas as estirpes (Figura 10). A estirpe IO 98-02 foi mais produtiva nos trs meios de cultura experimentados. No meio CHU registou-se a menor diferena de produtividade entre as duas estirpes enquanto esta diferena foi maior no meio ETAR.
1 0,9 0,8 Biomassafinal(g/L) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 IO9801 IO9802

CHU

BBM

ETAR

Figura10:Representaodaprodutividadeembiomassa(pesoseco)dasduasestirpesdeB.brauniirelativa segundafasedeculturas

4.2.2.1Anlisedaabsorodenutrientesemguasresiduais

A remoo de nutrientes nas culturas de B. braunii usando guas residuais pr-tratadas (ETAR) foi determinada atravs da comparao das concentraes de nitratos e nitritos,

36

de amnia e de fosfatos no meio de cultura no incio e no final das culturas. Os resultados obtidos demonstraram uma absoro quase completa desses nutrientes durante o perodo de cultura. A absoro de fosfatos foi de 79,8% e 89,1 % para as estirpes IO 98-01 e IO 98-02, respectivamente, enquanto a absoro dos compostos de azoto foi acima de 99% para ambas as estirpes (tabela IV).
IO9801 IO9802 Inicial Final %Remoo Inicial Final %Remoo 488,54 9,20 0,17 79,8 99,7 99,7 2419,70 263,51 3001,46 1,83 64,05 0,09 89,1 99,9 99,9

TotalFosfatos(g/L) 2419,70 Nitratos+Nitritos(g/L) 3001,46 Amnia(mol/L) 64,05

TabelaIV:Concentraesiniciaisefinaisdosnutrientesfosfatos,nitratosenitritoseamniaeasrespectivas percentagensderemoocorrespondentessegundafasedeculturasdasduasestirpesdeB.brauniiemguas residuais(ETAR)

4.2.2.2Crescimentodocontedolipdico

O crescimento do contedo lipdico foi analisado atravs da fluorescncia in vivo pelo mtodo do vermelho do Nilo e os resultados foram mostrados nas figuras 11A e 11B. De notar que ambas as estirpes, quando cultivadas no meio sinttico CHU atingiram maior acumulao de lpidos em comparao com as culturas nos outros dois meios, todavia, a tendncia de crescimento lipdico maior na estirpe IO 98-02. No geral, o contedo lipdico, nas culturas no meio BBM, no atingiu a metade do equivalente contedo obtido nas culturas no meio CHU. As culturas das duas estirpes no meio BBM, embora tenham atingido um crescimento em biomassa relativamente prximo das culturas no meio CHU (Figura 8A e 8B), no que diz respeito ao crescimento lipdico foi bastante inferior. No entanto esse crescimento na estirpe IO 98-02 foi maior que na primeira estirpe no mesmo meio o que, de resto, foi tambm verificado nos resultados das extraces lipdicas mostrados na tabela V. A acumulao de lpidos nas culturas no meio ETAR difere nas duas estirpes, sendo que para a estirpe IO 98-02 essa acumulao relativamente semelhante cultura no meio CHU enquanto para a estirpe IO 98-01 bastante inferior. De uma forma geral a estirpe IO 98-02 produz mais lpidos que a estirpe IO 98-01.

37

IO9801
700,00 Fluorescncia(fsu) 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 16 20 23 27 30 33 36 40 44 47 50

CHU BBM ETAR

Diasdecultivo

IO9802
700,00 Fluorescncia(fsu) 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 20 23 27 30 33 36 40 44 47 50

CHU BBM ETAR

Diasdecultivo

Figura6:AnlisedocrescimentolipdicorelativosegundafasedeculturasdasduasestirpesdeB.brauniipelo mtodovermelhodoNilo

4.2.3Terceirafasedeculturas

Nesta fase, as duas estirpes, IO 98-01 e IO 98-02, foram cultivadas durante 52 dias nos mesmos meios de cultura usados para as culturas da segunda fase, ou seja, BBM, CHU e ETAR com a diferena que neste caso o cultivo foi feito no exterior com as culturas expostas luz natural e sujeitas s variaes dos factores climticos. O que se verificou partida para todas as culturas foi um longo perodo de adaptao, sendo que a cultura da estirpe IO 98-02 no meio ETAR acabou por se perder totalmente. Conforme se pode ver na Figura 12 A e B as culturas no meio CHU foram as que melhor se conseguiram adaptar e crescer embora para a estirpe IO 98-02 a adaptao tenha demorado muito mais tempo que para a estirpe IO 98-01. Para esta ltima todas as

38

culturas acabaram por se desenvolver. As culturas no meio CHU e ETAR no final do perodo de cultivo j se encontravam na fase estacionria enquanto a cultura no meio BBM estava ainda a crescer. As concentraes de biomassa atingidas no final do perodo de cultivo pela estirpe IO 98-01 nos meios CHU, BBM e ETAR foram de 1.0, 0.58 e 0.57 g/L (peso seco), respectivamente. Para a estirpe IO 98-02 o desenvolvimento foi tardio em todas as culturas. A cultura no meio CHU, contudo, cresceu e atingiu a densidade de 0,8 g/L (peso seco) no final do perodo de cultivo enquanto a cultura no meio BBM cresceu pouco no ultrapassando a densidade de 0,2 g/L (peso seco) (Figura 13). A cultura desta estirpe no meio ETAR deteriorou-se, facto pelo qual a sua amostragem foi suspensa a partir do 24 dia de cultivo. Como se pode ver nas fotografias da Figura 14 tiradas de 8 em 8 dias a partir de 12 dias de cultivo, houve uma evidente alterao na colorao das culturas. de notar pela colorao, o comportamento diferencial das duas estirpes nos trs meios de culturas experimentados em cultivos outdoors. Pode-se verificar que a cultura da estirpe IO 9801 no meio CHU foi a primeira a apresentar a colorao verde que indica o incio do estado de desenvolvimento exponencial desta microalga. Portanto, v-se na Figura 14 B que as trs primeiras culturas correspondentes estirpe IO 98-01 iniciaram o desenvolvimento mais cedo que as da estirpe IO 98-02. No geral, a colorao de todas as culturas desenvolveu-se, passando de verde na fase inicial, para um tom vermelho ou alaranjado ao longo do perodo de cultivo, o que se nota com maior evidncia nas culturas de ambas as estirpes no meio CHU, representadas pela primeira e quarta mangas, da esquerda para direita (Figura 14).

39

IO9801
1,2 1 Biomassa(g/L) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 DiasdeCultivo

CHU BBM ETAR

IO9802
1,2 1 Biomassa(g/L) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 DiasdeCultivo

CHU BBM ETAR

Figura7:CurvasdecrescimentodasduasestirpesdeB.brauniirelativosterceirafasedeculturas

BiomassaFinal(g/L)
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 CHU BBM ETAR IO9801 IO9802

Figura8:Produtividadeembiomassa(pesoseco)dasduasestirpesdeB.brauniiemculturasoutdoors

40

Figura9:EstruturamontadaoutdoorsparaseefectuaraterceirafasedeculturasdeB.braunii(asfotosforam tiradas,A,12dias,B,20dias,C,28dias,D,36diaseE,44dias,F,52diasapsoinciodasculturas)

4.4Contedoemlpidos
A Tabela V mostra os resultados da extraco dos lpidos, utilizando a biomassa seca das culturas da primeira e segunda fase colhida no final do perodo de cultivo. Os valores de percentagem do extracto lipdico representam a mdia de trs extraces qual se associa o respectivo desvio padro. A percentagem mxima do contedo lipdico de 36% foi obtida para a cultura da estirpe IO 98-02 no meio CHU. Alis, ambas as estirpes produzem maior percentagem do contedo lipdico quando cultivadas no meio CHU (Figura 15). Todavia, nota-se que a estirpe IO 98-02 em termos de contedo lipdico mais produtiva que a estirpe IO 98-01 em todos os trs meios de cultura experimentados. No meio ETAR a estirpe IO 98-02, alm de crescer melhor como indicado na Figura 9, produz uma maior percentagem de contedo lipdico que a estirpe IO 98-01. As variaes de contedo lipdico, com a influncia dos diferentes meios de cultura, so menos marcantes para a estirpe IO 98-01 (Figura 15). Nota-se ainda que o contedo lipdico da estirpe IO 98-01 diminuiu da primeira para a segunda fase de culturas tanto no meio CHU como tambm no meio BBM (tabela V).
CHU IO9801 IO9802 BBM IO9801 IO9802 ETAR IO9801 IO9802

1Cultura(%ext.) 27,940,4 35,430,14 25,840,32

2Cultura(%ext.)18,383,66 36,050,23 13,192,28 18,712,31 17,121,21 28,910,14

TabelaV:Comparaodoscontedosemlpidosrelativossextracesdaprimeiraedasegundafasedeculturas

41
40 35 ContedoLipdico(%ps) 30 25 20 15 10 5 0 CHU BBM ETAR IO9801 IO9802

Figura10:Comparaodoscontedosemlpidosobtidosdasextracesdasculturasdasegundafase

Como se pode verificar na Tabela VI, os resultados do contedo lipdico obtidos nas extraces relativas s culturas da segunda fase quando comparadas com as respectivas fluorescncias relativas revelaram diferenas tais que impossibilitaram o estabelecimento de uma correlao linear usando os resultados das duas estirpes. Contudo, foi possvel estabelecer, como se observa na Figura 16, uma relao linear dos resultados obtidos pelos dois mtodos dentro da mesma estirpe. Foram utilizados os resultados correspondentes aos trs meios de cultura e pode-se notar que embora haja diferenas na produo lipdica de meio para meio, a relao linear indica que para cada uma destas estirpes pode-se usar o mtodo de fluorescncia com vermelho do Nilo para estimar o contedo lipdico mas no se pode, neste caso, extrapolar a estimativa para o conjunto das duas estirpes.
Contedo lipdico(%) 18,383,66 13,192,28 17,121,21 36,050,23 18,712,31 28,910,14 Fluorescncia relativa(fsu) 476,1 153,6 301,05 635,41 281,56 528,3

IO9801CHU IO9801BBM IO9801ETAR IO9802CHU IO9802BBM IO9802ETAR

TabelaVI:Comparaodocontedolipdicodeterminadopelomtodogravimtricoearespectivafluorescncia relativareferentesegundafasedeculturas

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700 600 Fluorescncia(fsu) 500 400 300 200 100 0 10 15 20 25 30 35 40 yIO9801=56,263x 602,9 R=0,89 yIO9802=20,664x 94,654 R=0,9853

Contedolipdico(%)

Figura11:CorrelaoentreocontedolipdicoeafluorescnciadovermelhodeNilonasculturas indoorsdasestirpesB.brauniiIO9801eIO9802

4.5Composiodoextractolipdico
O perfil de cidos gordos das duas estirpes de B. braunii foi estudado em todas as culturas da segunda fase e os resultados esto apresentados na Tabela VII. Para ambas as estirpes e em todos os meios de cultura experimentados o cido oleico (C18:1) o maior constituinte dos cidos gordos apresentando percentagem relativa entre 42% e 66%. O segundo cido gordo mais dominante o palmtico (C16:0) com percentagem relativa entre 8% e 18%. Registaram-se algumas variaes no perfil de cidos gordos das duas estirpes sob influncia dos diferentes meios de cultura experimentados, especialmente C18:2, C18:1e C28:1.
Metilsteresdecidosgordos(%relativa) c.Gordos (16:1) (16:0) (18:2) (18:1) (18:0) (20:1) (22:1) (24:1) (26:1) (28:1) CHU IO9801 IO9802 0,5 11,8 19,8 49,8 1,9 3,9 2,6 nd 0,6 nd 2,9 1,3 9,8 2,6 62,9 0,4 6,7 0,6 2,6 nd 10,2 BBM IO9801 IO9802 4,1 11,8 7,0 43,3 2,8 0,6 4,2 5,7 nd 7,0 2,8 18,1 17,8 42,3 4,0 2,0 2,4 0,6 nd 1,7 ETAR IO9801 IO9802 1,1 12,9 5,0 65,8 1,9 nd 3,4 2,8 0,5 nd 2,8 2,7 8,2 1,8 43,3 8,0 10,9 6,7 8,7

TabelaVII:PerfillipdicodasestirpesIO9801eIO9802deB.brauniirelativosdeculturasdasegundafase(nd, nodetectado)

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5.Discussodosresultados
5.1CrescimentodeBotryococcusbraunii
A microalga B. braunii est bastante referenciada como portadora de capacidade de produzir uma elevada percentagem de contedo lipdico sendo assim considerada muito promissora como fonte de substrato para a produo de biodiesel (Wolf, 1983; Li e Qin, 2005; Metzger e Largeau, 2005; Chisti, 2007). Contudo, esta espcie tem sido encarada como aberrante a nvel de estrutura, comportamento e metabolismo de tal maneira que parece no ter paralelo em qualquer outro grupo de microalgas (Belcher, 1968). O que se verifica pelos resultados apresentados (figuras 8 e 12) que esta espcie possui um crescimento muitssimo lento resultando numa baixa produtividade em biomassa (figuras 10 e 13). Esse fraco crescimento tem sido explicado por autores clssicos, que se dedicaram ao estudo desta espcie, como consequncia da prpria morfologia das colnias formadas pelas microalgas embebidas na matriz extra-celular o que limitada a difuso do CO2 e sais minerais junto das clulas. Um outro factor considerado causa do fraco crescimento a elevada sntese e acumulao de diversos compostos lipdicos e hidrocarbonetos que parecem no estar disponveis como compostos de reserva e como tal consomem grande parte da energia fotossinttica assimilada em detrimento do crescimento (Belcher, 1968; Wolf, 1983). Os resultados de crescimento apresentados neste trabalho (figuras 8 e 12) dizem respeito a determinaes de biomassa seca por unidade de volume. Foi dada preferncia a este mtodo por ser extremamente difcil a contagem directa das clulas devido s formas e tamanhos irregulares das colnias de B. braunii. Alm disso, para esta espcie, o aumento da biomassa seca no reflecte o aumento linear do nmero de clulas. Os trabalhos de Belcher (1968) e Bailliez et al. (1985) mostraram bem que o fim a multiplicao algal nesta espcie no coincide com o fim do aumento da biomassa. Estes autores demonstraram que a partir de determinada fase (entre 20 e 30 dias) as culturas de B. braunii deixam de aumentar em nmero de colnias ou de clulas mas o aumento da biomassa continua at os meios de cultura se esgotarem. Os resultados obtidos neste trabalho indicam bem esta mesma tendncia, embora se note atenuao no aumento da biomassa a partir da sexta semana de cultivo (Figura 8).

44 5.1.1Comparaodocrescimentoeprodutividadeembiomassaemdiferentes meiosdecultura

A comparao dos resultados relativos ao crescimento e produtividade da estirpe IO 9801 nos meios de cultura BBM e CHU indicaram diferenas considerveis como se pode ver na figura 7A. Todavia, a dinmica de crescimento dessas culturas realizadas em condies controladas (indoors), foi muito semelhante a vrios resultados anteriormente obtidos para a mesma espcie em condies controladas (Dayananda et al., 2006; Rao et al., 2007b; rpez et al., 2009). Sendo que foram realizadas culturas batch (cultura em descontnuo), o facto de se ter obtido crescimento e produtividades diferentes para a mesma estirpe nos dois meios diferentes est relacionado com um esgotamento mais rpido dos nutrientes minerais no meio CHU que um meio de cultura mais pobre que o BBM. Nota-se, pelos resultados mostrados na Figura 7 A, que nos primeiros 20 dias o crescimento da cultura no meio CHU foi ligeiramente superior mas com o esgotamento dos nutrientes o crescimento abranda-se enquanto a cultura no meio BBM continua o crescimento exponencial at 40 dias de cultivo. No se pode fazer a mesma anlise para a estirpe IO 98-02 dado que apenas se efectuou uma cultura em meio CHU (Figura 7 B). Contudo, pelas taxas de crescimento (16 e 29 mg/L.dia para as estirpes IO 98-01 e IO 98-02, respectivamente) e pelas concentraes finais de biomassa (figura 7A e 7B) verificou-se que o crescimento foi maior na estirpe 02 quando ambas so cultivadas no meio CHU o que sugere desde j uma maior habilidade de produo de biomassa.
5.1.2 Determinao do crescimento, produtividade em biomassa e contedo lipdico(hidrocarbonetos)emculturasindoors

Tal como verificado nas primeiras culturas (5.1.1), existe tambm similaridades entre os resultados obtidos nestas experincias e os resultados anteriormente obtidos por alguns autores (Dayananda et al., 2006; Rao et al., 2007b; rpez et al., 2009). As culturas realizadas nesta fase foram sujeitas a uma maior intensidade luminosa (ver 3.5.2) da que foi utilizada na primeira fase de culturas e os resultados mostraram que para ambas as estirpes o crescimento e a produtividade foram afectados levando a menor crescimento e produtividade em biomassa (figuras 7 e 8). Alis, como evidenciado por vrios autores (Qin, 2005; Li e Qin, 2005; Rao et al., 2007a e b) a intensidade luminosa, a par da temperatura e dos nutrientes nitratos e fosfatos, um dos principais factores que afectam o crescimento e a produo lipdica da espcie B. braunii. A ttulo de exemplo, pode-se ver nas figuras 7 A e 8 A que a concentrao da biomassa para a cultura da

45

estirpe IO 98-01 no meio BBM foi menor que a metade do que se tinha obtido na primeira fase. Embora menos marcantes, as concentraes de biomassa das culturas das duas estirpes cultivadas no meio CHU tambm foram inferiores em relao aos resultados da primeira fase de cultivo. De uma forma geral, pode-se dizer que a alterao de um nico parmetro de cultivo foi suficiente para afectar de forma considervel a produtividade de ambas as estirpes de B. braunii utilizadas. Comparando entre si as culturas da segunda fase (Figura 8 A e B) verificou-se que as do meio CHU apresentaram inicialmente um crescimento ligeiramente mais acentuado que as do meio BBM. Porm, a fase estacionria foi antecipada nas culturas do meio CHU resultando numa menor concentrao de biomassa no final do perodo de cultivo. Mais uma vez a explicao poder ser o esgotamento precoce dos nutrientes dado o meio CHU ser mais pobre que o meio BBM. A confrontao das concentraes de biomassa obtidas para as duas estirpes nesta segunda fase de cultivo (Figura 10) mostra que para ambos os meios de cultura, CHU e BBM, a estirpe IO 98-02 apresenta maior produtividade, o que indica comportamentos diferentes das duas estirpes perante condies similares. Isto confirma mais uma vez o que j foi verificado por vrios autores (Belcher, 1968; Li e Qin, 2005), ou seja, estirpes de B. braunii de locais diferente comportam-se de formas diferentes perante as mesmas condies de cultura. Belcher (1968) j tinha notado que estirpes de B. braunii oriundas de provenincias diferentes quando cultivadas em condies laboratoriais similares apresentam diferentes dinmicas de crescimento e produo de lpidos e carotenides pelo que ele considerou indispensvel a investigao de novas estirpes no sentido de explorar o potencial desta espcie. Li e Qin (2005) tambm mostraram esse comportamento ao verificarem que o crescimento da biomassa e a produtividade lipdica so especficos de cada estirpe e variam de estirpe para estirpe independentemente das condies de cultivo.
5.1.3 Determinao do crescimento, produtividade em biomassa em culturas

outdoorss Para as culturas da terceira fase a caracterstica macroscpica mais notvel foi a alterao da colorao notada principalmente nas culturas no meio CHU de ambas as estirpes. A colorao comeou por ser verde no incio do desenvolvimento das culturas e foi se tornando cada vez mais vermelha ou alaranjada ao longo do tempo de cultivo conforme se v na Figura 14. Com base no trabalho de Belcher (1968), a colorao inicial verde conferida pelas clorofilas a e b enquanto a cor vermelha ou alaranjada diz

46

respeito acumulao de carotenides, principalmente -caroteno. A maior parte deste pigmento encontra-se dissolvido nos leos que esto impregnados na matriz que sustem as colnias camuflando deste modo a cor verde das clorofilas. A referida alterao na colorao verificada nas culturas outdoors, o que no se verificou de forma to evidente nas culturas indoors mantidas em condies consideradas ptimas, deve-se certamente s condies climticas que se fizeram sentir durante o tempo de cultivo, em pleno vero, principalmente a temperatura e a intensidade luminosa elevadas. Estes dois factores foram demonstrados como tento uma relao directa com a acumulao de carotenides nas culturas de B. braunii (Belcher, 1968). Sendo a acumulao de carotenides e consequente alterao na colorao uma estratgia de resistncia/sobrevivncia em condies adversas, as culturas realizadas outdoors no ocorreram em condies ptimas para o crescimento de B. braunii. Este facto reflectiu claramente no crescimento de todas as culturas da terceira fase (Figura 12) quando comparadas com as culturas realizadas indoors (figuras 7 e 8). O que se verificou nas culturas da terceira fase foi um longo perodo de adaptao que antecedeu o incio de desenvolvimento. Embora as culturas tenham acabado por se adaptar e iniciar o desenvolvimento, a concentrao da biomassa atingida no final do tempo de cultivo (Figura 13) foi inferior atingida nas culturas efectuadas indoors (Figura 10). O maior crescimento e maior concentrao de biomassa no final do perodo de cultivo obtidos nas culturas de ambas as estirpes no meio CHU parecem indicar que esse meio o mais apropriado nas condies outdoors experimentadas o que pode dever-se prpria constituio mineral desse meio (ver anexo). As culturas de ambas as estirpes no meio BBM, ao contrrio do que aconteceu nas culturas indoors, tiveram um desenvolvimento sempre inferior s culturas no meio CHU ao longo de todo o perodo de cultivo, embora se notasse (Figura 12 A) que devido ao longo perodo de adaptao a cultura da estirpe IO 98-01 no meio BBM no tinha atingido a fase estacionria no final do tempo de cultivo.
5.1.4Crescimentoeabsorodenitratosefosfatosnasculturasemguaresidual prtratada

O crescimento em gua residual (meio ETAR) foi claramente afectado em ambas as estirpes tanto nas culturas da segunda fase (indoors) como nas da terceira fase (outdoors). Todavia, esse efeito negativo sobre o crescimento foi mais pronunciado nas culturas outdoors o que est associado tambm s influncias das condies climticas

47

que nesse caso foram extremas, abarcando dias muito quentes dos meses de Julho e Agosto com temperaturas mximas em geral superiores a 30C, o que tambm afecta o crescimento de B. braunii (Li e Qin, 2005). Comparando os resultados da biomassa mxima atingida no final do tempo de cultivo (0,29 g/L para a estirpe IO 98-01 e 0,53 g/L para IO 98-02) para as culturas indoors no meio ETAR verificou-se que a produtividade em biomassa foi quase o dobro na estirpe 02. As culturas outdoors equivalentes tiveram desenvolvimentos diferentes, comeando com um perodo de adaptao muito longo para ambas as estirpes, ou alis, umas das estirpes, a IO 98-02, nem chegou a se adaptar s condies acabando por se deteriorar completamente aps 16 dias de cultivo. Nessas culturas, a estirpe IO 98-01 atingiu a biomassa mxima de 0,57 g/L, perto do dobro do que a mesma estirpe atingiu nas culturas indoors, o que indica uma menor susceptibilidade desta estirpe s condies adversas que se verificaram durante as culturas outdoors. Os resultados obtidos nestas experincias esto de acordo com os escassos dados experimentais em que se realiza cultivo da espcie B. braunii em guas residuais como o caso dos trabalhos de Sawayama et al. (1992, 1994), An et al. (2003) e rpez et al. (2009), ou seja, constata-se a habilidade desta espcie crescer em guas residuais pr-tratadas e atingir uma produtividade considervel. Dado a possibilidade de a gua pr-tratada ser obtida sem custos adicionais existe a oportunidade de associar o crescimento desta espcie ao tratamento tercirio das guas residuais conseguindo assim, por um lado, a obteno a baixo custo de biomassa com aprecivel contedo lipdico e, por outro lado, o tratamento dessas guas, que so ricas em nutrientes como fosfatos e nitratos, que no caso de descargas para os meios aquticos contribuiriam para a poluio e eutrofizao desses ecossistemas.

5.2Crescimentodocontedolipdico
Toda a ateno que a microalga B. braunii tem merecido por parte dos investigadores se deve sua particularidade de produzir elevada percentagem de hidrocarbonetos. De acordo com Sawayama et al. (1994) a fraco de hidrocarbonetos (lpidos neutros) pode constituir at 75% da biomassa seca desta microalga. Neste trabalho foi utilizado o mtodo de fluorescncia com vermelho do Nilo para seguir a dinmica de crescimento dos hidrocarbonetos em todas as culturas da segunda fase (indoors). Usou-se este mtodo pelo facto de ser muito mais simples, rpido e barato em comparao com os mtodos gravimtrico e espectrofotomtrico tradicionalmente usados. Alm disso,

48

segundo Cooksey et al. (1987), este mtodo possui uma elevada selectividade para os hidrocarbonetos (lpidos neutros) que correspondem principal constituinte lipdica de B. braunii. Pelos resultados obtidos verificou-se que a estirpe IO 98-02 possua um maior contedo lipdico que a estirpe IO 98-01 independentemente do meio em que foram cultivadas o que est de acordo com o as concluses de Li e Qin (2005), de que a produtividade lipdica mais uma especificidade de cada estirpe de B. braunii. Todavia, existiram diferenas importantes de contedo em lpidos neutros para a mesma estirpe quando cultivada em meios diferentes. Segundo os resultados obtidos, o meio CHU proporcionou maior contedo lipdico para ambas as estirpes. As culturas das duas estirpes no meio BBM, apesar de terem apresentado crescimentos em biomassa relativamente similares s culturas no meio CHU (Figura 8), apresentaram contedos lipdicos inferiores. Estes resultados confirmam que possvel potenciar a produo desses lpidos nesta espcie com base na escolha de um meio de cultura apropriado. Verificou-se com relativa clareza que houve uma tendncia de crescimento do contedo lipdico para todas as culturas ao longo do tempo de cultivo. Comparando a dinmica de crescimento em biomassa de todas as culturas (Figura 8) com a respectiva dinmica de crescimento lipdico (Figura 11) nota-se que o maior crescimento lipdico ocorre durante a fase exponencial de crescimento da biomassa. Este facto est de acordo com os resultados obtidos por Kojima e Zhang (1999) em que o maior crescimento no contedo lipdico ocorreu durante a fase exponencial e na parte final do crescimento linear. Outros trabalhos experimentais anteriores j haviam demonstrado este comportamento, para as trs raas (A, B e L) desta espcie (Largeau et aI., 1980; Metzger et al., 1985). Uma vez que tudo indica que a produo lipdica proporcional ao crescimento em biomassa, adoptar a utilizao de meios e condies de cultura que potenciam o crescimento da biomassa nesta espcie seria fundamental para a produo de lpidos, visando potencialmente a produo de biodiesel.
5.2.1Crescimentodelpidosehidrocarbonetosemguaresidual

Tal como em vrios outros trabalhos precedentes (Sawayama et al., 1992; An et al., 2003; rpez et al., 2009) foi demonstrado nestas experincias que B. braunii possui a habilidade de crescer em guas residuais sem adio de nenhum nutriente mineral. Por outro lado, B. braunii possui tolerncia a uma larga gama de pH (entre 6 e 9) (Dayananda et al., 2006) sem efeitos significativos no crescimento e na produo lipdica o que indica a possibilidade de adaptao e utilizao de guas residuais como

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meio de cultura, alm de se poder aproveitar tambm dessa caracterstica para aplicaes ao cultivo outdoors. Todavia, o mais notvel foi o facto de o contedo lipdico das culturas no meio ETAR (gua residual) ter sido consideravelmente superior ao contedo lipdico das culturas realizadas no meio sinttico BBM o que se pode ver tanto pela dinmica de crescimento lipdico como pelos resultados da extraco lipdica. Este facto j tinha sido observado no trabalho de rpez et al. (2009). Tambm no meio ETAR se nota que a estirpe IO 98-02 apresentou maior crescimento e produo lipdica que a estirpe IO 98-01. O contedo lipdico da estirpe 02 nesse meio, foi muito similar ao que ocorreu na cultura da mesma estirpe no meio sinttico CHU, que o meio em que ambas as estirpes, 01 e 02, apresentaram melhores resultados. Assim, o facto de se obter nveis de lpidos e hidrocarbonetos nas culturas de B. braunii em guas residuais (ETAR) similares aos que foram obtidos nas culturas no meio sinttico CHU e consideravelmente superiores aos que foram obtidos nas culturas do meio BBM consolida a hiptese da utilizao dessas guas residuais para o cultivo desta espcie a larga escala, acoplado aos sistemas de tratamento primrio de guas residuais urbanas, visando a obteno de substrato para produo de biodiesel, embora seja ainda necessrio optimizar as condies para o crescimento da biomassa nesse meio.

5.3Extracodocontedolipdico
Para a recuperao dos lpidos da biomassa de B. braunii tem-se usado em geral extraco por solventes orgnicos. De acordo com Lee et al. (1998), de todos os solventes utilizados, a mais efectiva a combinao de metanol e clorofrmio, sendo o mtodo desenvolvido Bligh e Dyer (1959) o mais popular. Neste trabalho, utilizando uma ligeira modificao deste mtodo, as percentagens do extracto lipdico obtido para todas as culturas indoors encontram-se na mesma ordem dos resultados (15 a 38%) obtidos, em condies ptimas, por Wolf et al. (1985), Singh e Kumar (1992), Lee et al. (1998) e rpez et al. (2009) mas inferior aos resultados (50%) obtidos por Kojima e Zhang (1999) em fotobiorreactores em coluna arejados com 1% CO2. Interessa ressaltar aqui que s se podem comparar resultados obtidos pelo mesmo mtodo de extraco porque, como foi demonstrado por Tran et al. (2009), mtodos diferentes produzem resultados significativamente diferentes. Por outro lado, interessa frisar que os resultados acima mencionados foram obtidos em condies experimentais. Em condies naturais, ou seja, resultados obtidos de biomassa de B. braunii recolhida de

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florescncias em ambientes naturais, indicam que o contedo em hidrocarbonetos pode ser de at 86% da biomassa seca (Brown et al., 1969). A estirpe IO 98-02, em comparao com a estirpe IO 98-01, revelou-se ser mais produtiva em todos os meios de cultura experimentados (Tabela V). Estes resultados so tambm mostrados pela dinmica de crescimento lipdico. Todavia, os resultados obtidos mostram apenas o contedo lipdico da biomassa seca dado que o meio de cultura foi descartado aps a centrifugao e recolha da biomassa. Tendo que grande parte dos hidrocarbonetos produzidos excretada para o exterior das clulas, como foi mostrado por Largeau et al. (1980), estes resultados representam apenas uma fraco de lpidos e hidrocarbonetos produzidos pelas duas estirpes de B. braunii. No sentido de obter uma melhor recuperao dos lpidos e hidrocarbonetos produzidos por estas microalgas, a utilizao de um mtodo capaz de ser aplicado a toda a suspenso algal parece ser o mais adequado. Becker (1994) j tinha proposto esta ideia e o conceito desenvolveu-se para um processo de extraco contnua utilizando um solvente orgnico compatvel que no afecte o desenvolvimento das microalgas. Embora o mtodo proposto possa ter aplicaes escala laboratorial e na recuperao de produtos de elevado valor comercial, o conceito deste mtodo implica desenvolvimentos biotecnolgicos ainda incompatveis com a produo de biocombustveis a baixo custo (Hejazi e Wijffels, 2004).

5.4Anlisedosmetilsteresdecidosgordos(FAME)
O cido oleico e o cido palmtico foram os constituintes dominantes dos cidos gordos obtidos de todos os extractos das duas estirpes de B. braunii (Tabela VII). Os resultados obtidos mostram que em conjunto estes dois cidos constituem de 50% a 78% do total de cidos gordos contidos nos extractos. Dayananda et al. (2006) j haviam verificado a predominncia destes dois cidos gordos nos extractos de diferentes estirpes de B. braunii. Estes cidos gordos de cadeia mdia (C16 e C18) so considerados os ideais para a produo de biodiesel de grande qualidade conforme mencionado nos trabalhos de Canakci e Van Gerpen (2001), Miao e Wu (2006) e Xu et al. (2006) e constituem o parmetro que de forma mais directa e precisa avalia o potencial das microalgas como substrato para a produo de biodiesel, uma vez que nem todos os compostos solveis nos solventes orgnicos utilizados na extraco podem ser convertidos em biodiesel. Esta espcie, alm de produzir estes cidos gordos ideais para a produo de biodiesel, especialmente conhecida por produzir hidrocarbonetos de cadeia longa reconhecidos

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como excepcionais para a produo de biodiesel (Metzger e Largeau, 2005). Todavia, neste trabalho e derivado do mtodo adoptado no ser dirigido especificamente recuperao dos hidrocarbonetos, embora tenham de certo entrado no estudo da dinmica do crescimento lipdico realizado pelo mtodo de fluorescncia (Figura 11), no se fez a anlise das classes de hidrocarbonetos produzidos pelas duas estirpes. Assim, no se pode, por ora, enquadrar as estirpes estudadas numa das trs raas descritas para a espcie B. braunii, pelo que, no sentido de melhor compreender a biologia destes organismos se torna necessrio mais estudos alm deste trabalho no mbito da tese de mestrado, o qual representa um estudo preliminar e pioneiro envolvendo estas duas estirpes portuguesas de B. braunii.

6.Concluses
Muita esperana tem sido depositada nos biocombustveis, em especial nos que podem derivar de microalgas com caractersticas excepcionais, como potencial substituto dos combustveis fsseis num futuro prximo. Estirpes portuguesas da microalga Botryococcus braunii, espcie detentora de uma excepcional habilidade de produzir hidrocarbonetos, revelaram neste estudo pioneiro possuir um crescimento em biomassa relativamente lento, no que coincidem com a generalidade dos estudos anteriores com outras estirpes. Contudo, produziram um considervel contedo lipdico, at 36% da biomassa seca, que tambm est de acordo com maior parte dos estudos realizados com outras estirpes desta espcie. A anlise dos cidos gordos dos extractos das duas estirpes mostrou a predominncia do cido oleico (C18:1, 42% a 63%) e do cido palmtico (C16:0, 8% a 18%), considerados ideais para a produo de biodiesel de alta qualidade. As duas estirpes cultivadas mostraram habilidade para crescer, produzir leo e remover nutrientes como nitratos, nitritos, amnia e fosfatos em guas residuais pr-tratadas. Pelos resultados deste trabalho obvio que muito permanece por ser aprendido acerca do crescimento e produo lipdica destas estirpes de B. braunii, isto , toda a influncia das condies de cultura que permita maximizar a produtividade em biomassa e em leo. Se a inteno for valorizar estas duas estirpes da microalga B. braunii do ponto de vista econmico, muitos aspectos j avaliados e dados disponveis, no apontam ainda para um potencial de implementao a larga escala e aproveitamento do biodiesel derivado muito elevado, num futuro muito prximo.

52

Bibliografia
Agarwal,A.K.,2007.Biofuels(alcoholsandbiodiesel)applicationsasfuelsforinternalcombustionengines.Progress inEnergyandCombustionScience,33:23371. Amin, S., 2009. Review on biofuel oil and gas production processes from microalgae. Energy Conversion and Management,50:18341840. An,J.Y.,Sim,S.J.,Lee,J.S.,Kim,B.W.,2003.Hydrocarbonproductionfromsecondarilytreatedpiggerywastewater bythegreenalgaBotryococcusbraunii.JournalofAppliedPhycology15:185191. Bailliez, C., Largeau, C., Casadevall, E., 1985. Growth and hydrocarbon production of Botryococcus braunii immobilizedincalciumalginategel.ApplMicrobiolBiotechnol,23:99105. BalatM.,2007.Productionofbiodieselfromvegetableoils:asurvey.EnergySources,29:895913. Banerjee,A.,Sharma,R.,Chisti,Y.,Banerjee,U.C.,2002.Botryococcusbraunii:arenewablesourceofhydrocarbons andotherchemicals.CritRevBiotechnol,22:24579. Basha, S.A., Gopal, K.R., Jebaraj, S., 2009. A review on biodiesel production, combustion, emissions and performance.RenewableandSustainableEnergyReviews,13:16281634 Becker,E.W.,1994.Microalgae:biotechnologyandmicrobiology.In:Baddiley,J.(Ed.),CambridgeUniversityPress, Cambridge,NewYork. Belcher,J.H.,1968.NotesonthePhysiologyofBotryococcusbrauniiKiitzing.ArchivfrMikrobiologie,61,335346. Bendschneider,K.,Robison,N.J.,1952.Anewspectrophotometricdeterminationofnitriteinseawater.Journalof MarineResearch,11:8796. Bligh, E.G., Dyer, W. J., 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of BiochemistryandPhysiology,37:911917. Bozbas,K.,2008.Biodieselasanalternativemotorfuel:productionandpoliciesintheEuropeanUnion.Renewable andSustainableEnergyReviews,12:54252. BP,2007.StatisticalReviewofWorldEnergy.Disponvelem:http://www.bp.com.Acesso:14/05/2007. Brown, A.C., Knights, B.A., Ellisie, C., 1969. Hydrocarbon content and its relationship to physiological state in the greenalgaBotryococcusbraunii.Phytochemistry,8:5437. Canakci,M.,VanGerpen,J.,2001.Biodieselproductionfromoilsandfatswithhighfreefattyacids.Transactionsof theAsae,44:14291436. Casadevall, E., Dif, D., Largeau, C., Gudin, C., Chaumont, D., Desanti, O., 1985. Studies on batch and continuous cultures of Botryococcus braunii: hydrocarbon production in relation to physiological state, cell structure, and phosphatenutrition.BiotechnolBioeng,27:286295. Chisti,Y.,2008.Biodieselfrommicroalgaebeatsbioethanol.TrendsinBiotechnology,26(3). Chisti,Y.,2007.Biodieselfrommicroalgae.BiotechnologyAdvances,25:294306. Cooksey,K.E.,Guckert,J.B.,Williams,S.A.,Collis,P.R.,1987.Fluorometricdeterminationoftheneutrallipidcontent ofmicroalgalcellsusingNileRed.Journ.Microbiol.Methods,6:333345 Danielo,O.,2005.Analgaebasedfuel.Biofutur,255. Dayananda, C., Sarada, R., Bhattacharya, S., Ravishankar, G.A., 2005. Effect of media and culture conditions on growthandhydrocarbonproductionbyBotryococcusbraunii.ProcessBiochemistry,40:31253131. Dayananda, C., Saradaa, R., Ranib, M.U., Shamalab, T.R., Ravishankara, G.A., 2007. Autotrophic cultivation of Botryococcus braunii for the production of hydrocarbons and exopolysaccharides in various media. Biomass and Bioenergy,31:8793.

53
Dayananda, C., Sarada, R., Shamala, T.R., Ravishankar, G.A., 2006. Influence of Nitrogen Sources on Growth, HydrocarbonandFattyAcidProductionbyBotryococcusbraunii.AsianJournalofPlantSciences,5(5):799804. Demirbas,A.,2008a.Biodiesel:arealisticfuelalternativeforDieselengines.London:Springer. Demirbas, A., 2008b. Biofuels sources, biofuel policy, biofuel economy and global biofuel projections. Energy ConversionandManagement,49:21062116. Demirbas,A.,2009.Political,economicandenvironmentalimpactsofbiofuels:Areview.AppliedEnergy,86(1):108 117.doi:10.1016/j.apenergy.2009.04.036 Demirbas,A.,2006.Globalbiofuelstrategies.Energy,Education,ScienceandTechnology,17,2763. Dismukes, G.C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G.M., Posewitz, M.C., 2008. Aquatic phototrophs: efficient alternativestolandbasedcropsforbiofuels.CurrentOpinioninBiotechnology,19:235240. EIA, Energy Information Administration, International Energy Outlook 2009. DOE/EIA0484(2009). Disponvel em: http://www.eia.doe.gov/oiaf/ieo/transportation.html.Acesso:13/07/2009. EPEA, 2007. A Scientific Assessment of Environmental and Social Impacts of FirstGeneration Biofuels. EPEA EnvironmentalProtectionEncouragementAgency,Hamburg,FinalReport. Eriksen,N.T.,(2008).Thetechnologyofmicroalgalculturing.BiotechnologyLetters,30(9):15251536. Escobar, J.C., Lora, E.S., Venturini, O.J., Yez, E.E., Castillo, E.F., Almazan, O., (2009). Biofuels: Environment, technologyandfoodsecurity.RenewableandSustainableEnergyReviews,13:12751287. European Commission, 2007. The impact of a minimum 10% obligation for biofuel use in the EU27 in 2020 on agricultural markets, impact assessment renewable energy roadmap. European Commission (EC), Directorate GeneralForAgricultureandRuralDevelopment; Falkowski,P.,Raven,J.,1997.AquaticPhotosynthesis.Malden:Blackwell. Fernando,S.,Hall,C.,Jha,S.,2006.NOxreductionfrombiodieselfuels.EnergyFuels,20:376382. Ferrari,R.A.,Oliveira,V.S.,ScabioA.,2005.BiodieseldeSojaTaxadeconversoemsteresetlicos,caracterizao fsicoqumicaeconsumoemgeradordeenergia.Quim.Nova,28(1):1923. Fulton, L., Howes, T., Hardy, J., 2004. Biofuels for Transport: An International Perspective. International Energy Agency,Paris. Gielen, D., Unander, F., 2005. Alternative Fuels: An Energy Technology Perspective. International Energy Agency. ETO/2005/012,IEA/ETOWorkingPaper. Gouveia, L., Oliveira, A.C., 2009. Microalgae as a raw material for biofuels production. Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology36(2):269274. Goyal, H.B., Seal, D., Saxena, R.C., 2008. Biofuels from thermochemical conversion of renewable resources: A review.RenewableandSustainableEnergyReviews,12:504517. Grasshoff,K.,1976.MethodsofSeawaterAnalysis.VerlagChimie,NewYork. Hansen,J.,Sato,M.,Kharecha,P.,Beerling,D.,Berner,R.,MassonDelmotte,V.,Pagani,M.,Raymo,M.,Royer,D.L., Zachos,J.C.,2008.TargetAtmosphericCO2:WhereShouldHumanityAim?TheOpenAtmosphericScienceJournal, 2:217231. Hejazi,M.A.,Wijffels,R.H.,2004.Milkingofmicroalgae.TrendsinBiotechnology22(4):189194. Henke,J.M.,Klepper,G.,Schmitz,N.,2005.TaxexemptionforbiofuelsinGermany:isbioethanolreallyanoption forclimatepolicy?Energy,30:26172635. Hill, J., Nelson, E., Tilman, D., Polasky, S., Tiffany, D., (2006). Environmental, economic, and energetic costs and benefitsofbiodieselandethanolbiofuels.PNAS,103(30:1120611210.

54
Hoek,C.vanden,Mann,D.G.,Jahns,H.M.,1995.Algae:anintroductiontoPhycology.CambridgeUniversityPress, Cambridge,623p. Hoekman,S.K.,2009.BiofuelsintheU.S.ChallengesandOpportunities.RenewableEnergy,34:1422 Hosseinpoor, A.R., Forouzanfar, M.H., Yunesian, M., Asghari, F., Naieni, K.H., Farhood, D., 2005. Air pollution and hospitalizationduetoanginapectorisinTehran.EnvironRes,99:12631. Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M., Darzins, A., 2008. Microalgal triacylglycerolsasfeedstocksforbiofuelproduction:perspectivesandadvances.PlantJournal,54:621639. Huber,G.W.,Iborra,S.,Corma,A.,2006.SynthesisofTransportationFuelsfromBiomass:Chemistry,Catalysts,and Engineering.AmericanChemicalSociety. IEA,InternationalEnergyAgency,2006.Keyworldenergystatistics.Disponvelonlineem: http://www.iea.org/Textbase/nppdf/free/2006/Key2006.pdf.Acesso:13/07/2009. Indarti,E.,Majid,M.,Hashim,R.,Chong,A.,2005.DirectFAMEsynthesisforrapidtotallipidanalysisfromfishoil andcodliveroil.JournalofFoodCompositionandAnalysis,18:161170. Murphy, J., Riley, J.P., 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters,AnalyticaChimicaActa,27:3136 Kesse, D.G., 2000. Global warmingfacts, assessment, countermeasures. Journal of Petroleum Science and Engineering,26:15768. Kim, S., Dale, B.E., 2005. Life cycle assessment of various cropping systems utilized for producing biofuels: Bioethanolandbiodiesel.BiomassBioenergy,29:42639. Knothe,G.,Dunn,R.O.,Bagby,M.O.,1997.Biodiesel:TheUseofVegetableOilsandTheirDerivativesasAlternative DieselFuels.AgriculturalResearchService,U.SDepartmentofAgriculture. Kojima,E.,Zhang,K.,1999.GrowthandhydrocarbonofmicroalgaB.brauniiinbubblecolumnphotobioreactors.J. Biosci.Bioeng.,87:811815. Koroleff, F., 1969. Direct determination of ammonia in natural waters as indophenol blue. Int. Counc. Explor. Sea (ICES)Comm.Meet.Pap.1969/C:9;revised1970:1922. Largeau, C., Casadevall, E., Berkaloff, C., Dharnliencourt, P., 1980. Sites of accumulation and composition of hydrocarbonsinBotryococcusbraunii.Phytochemistry,19:10431051. Lee,J.Y.,Yoo,C.,Jun,S.Y.,Ahn,C.Y.,Oh,H.M.,2009.Comparisonofseveralmethodsforeffectivelipidextraction frommicroalgae.Bioresour.Technol.doi:10.1016/j.biortech.2009.03.058. Lee,S.J.,Yoon,B.D.,Oh,H.M.,1998.RapidmethodforthedeterminationoflipidfromthegreenalgaBotryococcus braunii.Biotechnol.Tech.,12:553556. Li,Y.,Qin,J.G.,2005.ComparisonofgrowthandlipidcontentinthreeBotryococcusbrauniistrains.JApplPhycol, 17:551556 Li, Y., Horsman, M., Wu, N., Lan, C.Q., DuboisCalero, N., 2008. Biofuels from Microalgae. Biotechnol. Prog., 24(4):815820. Lynd, L.R., Laser, M.S., Bransby, D., Dale, B.E., Davison, B., Hamilton, R., Himmel, M., Keller, M., McMillan, J.D., Sheehan,J.etal.,2008.Howbiotechcantransformbiofuels.NatBiotechnol,26:169172. Ma,F.,Hanna,M.A.,1999.Biodieselproduction:areview.BioresourceTechnology,70:115 Mata, T.M., Martins, A.A., Caetano, N.S., 2009. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review.Renew.Sustain.EnergyRev.,doi:10.1016/j.rser.2009.07.020 McHugh,D.J.,2003.Aguidetotheseaweedindustry.Rome,FAO.FAOFisheriesTechnicalPaper,441. Meier,R.L.,1955.Biologicalcyclesinthetransformationofsolarenergyintousefulfuels.In:Daniels,F.,Duffie,J.A. (Eds.),SolarEnergyResearch.MadisonUniversityWisconsinPress,Wisconsin,179183.

55
Metzger,P.,Berkaloof,C.,Casadevall,E.,Coute,A.,1985.Alkadieneandbotryococceneproducingracesof wild strainsofBotryococcusbraunii.Phytochemistry,24:23052320. Metzger,P.,Largeau,C.,2005.Botryococcusbraunii:arichsourceforhydrocarbonsandrelatedetherlipids.Applied MicrobiologyandBiotechnology,66(5):486496. Miao,X.L.,Wu,Q.Y.,2006.Biodieselproductionfromheterotrophicmicroalgaloil.BioresourceTechnology,97:841 846. MolinaGrima,E.,Belarbi,E.H., AcinFernndez,F.G.,RoblesMedina,A.,Chisti,Y.,2003.Recoveryofmicroalgal biomassandmetabolites:processoptionsandeconomics.BiotechnolAdv,20:491515. National Biodiesel Board, 1998. In: Anais do Congresso Internacional de Biocombustveis Lquidos; Instituto de TecnologiadoParan,SecretariadeEstadodaCincia,TecnologiaeEnsinoSuperior,Curitiba,PR,19a22dejulho, 1998,p.42. NEIC (National Energy Information Center), 2009. Greenhouse gases, climate change, and energy. Energy Information Administration. Disponvel online em: http://www.eia.doe.gov/oiaf/1605/ggccebro/chapter1.html. Acesso10/07/2009. Nyberg, H., 1986. GCMS methods for lower plant glycolipid fatty acids. In Gas Chromatographyl/Mass Spectrometry,Linskens,H.F.,Jackson,J.F.,Eds.;SpringerVerlag:Berlin,3:6799. OilandGasJournal,2005.Worldwidelookatreservesandproduction.OilandGasJournal103:2425. rpez,R.,Martnez,M.E.,Hodaifa,G.,Yousfi,F.,Jbari,N.,Snchez,S.,2009.GrowthofthemicroalgaBotryococcus brauniiinsecondarilytreatedsewage.Desalination246:625630. Packer,M.,2009.Algalcaptureofcarbondioxide;biomassgenerationasatoolforgreenhousegasmitigationwith referencetoNewZealandenergystrategyandpolicy.EnergyPolicy,37(9):34283437. Pal,D.,Prakash,D.,Amla,D.V.,1998.ChemicalcompositionofthegreenalgaBotryococcusbraunii.Cryptogamie: algologie,Paris,19(4):311317. Patil, V., Tran, K.Q., Giselrod, H.R., (2008). Towards sustainable production of biofuels from microalgae. InternationalJournalofMolecularSciences,9(7):11881195. Patzek,T.W.,Anti,S.M.,Campos,R.,Ha,K.W.,Lee,J.,Li,B.,Padnick,J.,Yee,S.A.,2005.Ethanolfromcorn:clean renewablefuelforthefuture,ordrainonourresourcesandpockets?Environment,DevelopmentandSustainability, 7:319336. Puppn,D.,2002.Environmentalevaluationofbiofuels.PeriodicaPolytechnicaSeriesSocietyManScience,10:95 116. Qin, J., 2005. Bio Hydrocarbons from Algae: impacts of temperature, light and salinity on algal growth. Rural IndustriesResearchandDevelopmentCorporation(2005).RIRDCPublicationNo05/025. Raja, R., Hemaiswarya, S., Kumar, N.A., Sridhar, S., Rengasamy, R., 2008. A perspective on the biotechnological potentialofmicroalgae.CriticalReviewsinMicrobiology,34(2):7788. Ramanathan, V., Feng, Y., 2009. Air pollution, greenhouse gases and climate change: Global and regional perspectives.AtmosphericEnvironment,43:3750. Rao,A.R.,Dayananda,C.,Sarada,R.,Shamala,T.R.,Ravishankar,G.A.,2007a.Efectofsalinityongrowthofgreen algaBotryococcusbrauniianditsconstituents.BioresourceTechnology,98:560564. Rao, A.R., Sarada, R., Ravishankar, G.A., 2007b. Influence of CO2 on Growth and Hydrocarbon Production in Botryococcusbraunii.J.Microbiol.Biotechnol.,17(3):414419. Reijnders, L., 2008. Do biofuels from microalgae beat biofuels from terrestrial plants? Trends in Biotechnology, 26(7):349350. REN21 (Renewable Energy Policy Network for the 21st Century), 2007. Global status report on renewable. Disponvelonlineem:http://www.ren21.net/pdf/RE2007_Global_Status_Report.pdf.Acesso:20/07/2009.

56
Roberts,P.,2004.TheEndofOil:OntheEdgeofaPerilousNewWorld.HoughtonMifflin.NewYork,NewYork. Runge,C.F.,Senauer,B.,2007.Howbiofuelscouldstarvethepoor.ForeignAffairs,86(3):4154. Ryan, L., Convery, F., Ferreira, S., 2006. Stimulating the use of biofuels in the European Union: implications for climatechangepolicy.EnergyPolicy,34(17):31843194. Sawayama,S.,Minowa,T.,Dote,Y.,Yokoyama,S.,1992.GrowthofthehydrocarbonrichmicroalgaBotryococcus brauniiinsecondarilytreatedsewage.ApplMicrobiolBiotechnol,38:135138. Sawayama,S.,Inoue,S.,Yokoyama,S.,1994.ContinuouscultureofhydrocarbonrichmicroalgaBotryococcus brauniiinsecondarilytreatedsewage.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,41:729731. Saxena, R.C., Adhikari, D.K., Goyal, H.B., 2009. Biomassbased energy fuel through biochemical routes: A review. RenewableandSustainableEnergyReviews,13:167178. Schenk,P.M.,ThomasHall,S.R.,Stephens,E.,Marx,U.C.,Mussgnug,J.H.,Posten,C.,Kruse,O.,Hankamer,B.,2008. SecondGenerationBiofuels:HighEfficiencyMicroalgaeforBiodieselProduction.Bioenerg.Res.,1:2043. Shahid,E.M.,Jamal,Y.,2008.Areviewofbiodieselasvehicularfuel.RenewableandSustainableEnergyReviews, 12:24842494. Sheehan,J.,Cambreco,V.,Duffield,J.,Garboski,M.,Shapouri,H.,1998a.Anoverviewofbiodieselandpetroleum diesellifecycles.AreportbyUSDepartmentofAgricultureandEnergy,135. Sheehan,J.,Dunahay,T.,Benemann,J.,Roessler,P.,1998b.AlookbackattheUSDepartmentofEnergysaquatic speciesprogrambiodieselfromAlgae.NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)Report:NREL/TP58024190, Golden,CO. Sim, S.J., An, J.Y., Kim, B.W., 2001.Twophase extraction culture of Botryococcus braunii producing longchain unsaturatedhydrocarbons.BiotechnologyLetters23:201205. Singh,Y.,Kumar,H.D.,1992.LipidandhydrocarbonproductionbyBotryococcusspp.undernitrogenlimitationand anaerobiosis.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,8:121124 Skov,A.M.,2003.WorldEnergyBeyond2050.SPE,JournalofPetroleumTechnology,77506MS. DOI10.2118/77506MS. Spolaore, P., JoannisCassan, C., Duran, E., Isambert, A., 2006. Commercial applications of microalgae. Journal of BioscienceandBioengineering,101(2):8796. Tran, H.L., Hong, S.J., Lee, C.G., 2009. Evaluation of Extraction Methods for Recovery of Fatty Acids from Botryococcus braunii LB 572 and Synechocystis sp. PCC 6803. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 14:187 192. vanderLaaka,W.W.M.,Raven,R.P.J.M.,Verbong,G.P.J.,2007.Strategicnichemanagementforbiofuels:analyzing pastexperimentsfordevelopingnewbiofuelpolicies.EnergyPolicy,35:32133225. van Harmelen, T., Oonk, H., 2006. Microalgae Biofixation Processes: Applications and Potential Contributions to Greenhouse Gas Mitigation Options. International Network on Biofixation of CO2, International Energy Agency, GreenhouseGasR&DProgram. Veziroglu, T.N., Sahin, S., 2008. 21st Centurys energy: Hydrogen energy system. Energy Conversion and Management,49:18201831. Xu,H.,Miao,X.L.,Wu,Q.Y.,2006.Highqualitybiodieselproductionfromamicroalgachlorellaprotothecoidesby heterotrophicgrowthinfermenters.JournalofBiotechnology,126:499507. Wang, B., Li, Y., Wu, N., Lan, C.Q., 2008. CO2 biomitigation using microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology,79(5):70718. Wolf, F.R. 1983. Botryococcus braunii. An Unusual HydrocarbonProducing Alga. Applied Biochemistry and Biotechnology,8:249.

57
Wolf, F.R., Nonomura, A.M., Bassham, J.A., 1985. Growth and Branched Hydrocarbon Production in a Strain of Botryococcusbraunii(chlorophyta).J.Phvcol.,21:388. Zhu,X.G.,Long,S.P.,Ort,D.R.,2008.Whatisthemaximumefficiencywithwhichphotosynthesiscanconvertsolar energyintobiomass?CurrOpinBiotechnol,19:153159.

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Anexos

BOLDS BASAL MEDIUM (BBM) Modified from original

Reference: Stein, J. (ED.) Handbook of Phycological methods. Culture methods and growth measurements. Cambridge University Press. 448 pp. This medium is highly enriched and is used for many of the green algae. STOCK 1. KH2PO4 2. CaCl2.2H2O 3. MgSO4.7H2O 4. NaNO3 5. K2HPO4 6. NaCl 7. Na2EDTA KOH 8. FeSO4.7H2O H2SO4 (conc.) 9. Trace Metal Solution 10. H3BO3 *Trace Metal Substance 1. H3BO3 2. MnCl2.4H2O 3. ZnSO4.7H2O 4. Na MoO4.5H2O 5. CuSO4.5H2O 6. Co(NO3)2.6H2O STOCK SOLUTION 8.75 g/500 ml 1.25 g/500 ml 3.75 g/500 ml 12.5 g/500 ml 3.75 g/500 ml 1.25 g/500 ml 10 g/L 6.2 g/L 4.98 g/L 1 ml/L See below* 5.75 g/500 ml Solution: g/Litre 2.86 g 1.81 g 0.222 g 0.390 g 0.079 g 0.0494 g ml/Litre 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 1 ml 1 ml 1 ml 0.7 ml

Dissolve each of the above substances for the Trace Metal solution separately, prior to adding the next on the list. Adjust the pH of the medium to 6.8 with NaOH or HCL and autoclave. OPTIONS: As this is a highly enriched medium it can be diluted to 10% of the above concentrations and used successfully when fast and dense growth is not required. For 10% BBM, use 100 ml of 100% BBM/Litre of distilled water. The addition of 5 ml/L of soil extract is also beneficial to some algae particularly when problems with poor growth or morphology occur.

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CHU10(MODIFIEDbyJ.Acreman,UTCC) Reference:Stein,J(ED.)1973.HandbookofPhycologicalmethods.Culturemethodsand growthmeasurements.CambridgeUniversityPress.448pp. STOCK STOCKSOLUTION ml/Litre 1.Na SiO .9H O 5.8g/L 10ml 2 3 2 2.Ca(NO ) .4H O 57.56g/L 1ml 3 2 2 10g/L 1ml 3.K HPO
2 4

4.MgSO .7H O
4 2

25g/L seerecipebelow 20g/L

1ml 0.8ml 1ml 1ml 1ml

5.FeEDTA 6.Na CO 2 3 7.F/2Vitamins

seebelow* 8.Tracemetalmixseebelow**

*FeEDTAstocksolution: Boil1LitreofwatertoremovetheCO .Dissolve5.2ofEDTA(NOTsodiumEDTA)inabout

2

950 ml of distilled water, with 5.4 g of KHCO Add 5.0 g of FeSO .7H O and make final
3. 4 2

volumeto1000ml.Adding1ml/Lofthisstocktothemediumgivesafinalconcentration of1mgFe/ml. InsteadofFeEDTA,onecouldalsouseoneofthefollowing: 1.FeCl .6H O(3.15g/L)andNa EDTA(4.36g/L).Add1ml/Ltomedium

3 2 2

2.Fecitrate(3.35g/100ml)andCitricacid(3.35g/100ml).Add1ml/Ltomedium **Tracemetalmix Substance g/Litre 1.Na EDTA 1.00g

2

2.H BO
3 3 2 2

2.86g 1.81g 0.222g 0.390g 0.079g 0.0494g

3.MnCl .4H O 4.ZnSO .7H O

4 2

5.NaMoO .5H O
4 2

6.CuSO .5H O
4 2

7.Co(NO ) .6H O
3 2 2

Dissolveeachoftheabovesubstancesseparatelypriortoaddingthenext. Adjust pH of the final CHU10 medium to 6.4 for diatoms and green algae or to 8.5 for cyanobacteria. CHU10VARIATIONS 1.CHU10Basic,i.e.therecipeabove. 2.CHU10withSoilExtract,(510%soilextract) 3.CHU10withagar:add15gofDifcoBactoagar/Lofmedium)

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guaResidual(meioETAR)

Varivel NO3 + NO2 (N g.L1) NH4 (N mol.L1) PO4 (P g.L1) pH

Valores 3001,46 64,05 2419,70 7,85

Caractersticasdaguaresidualprtratadausadanasculturas