ISTITUTO TECNICO PER ATTIVIT SOCIALI GIORDANO BRUNO PERUGIA

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni Febbraio 2008

REPERTORIO DEI MODULI E DELLE UNIT DIDATTICHE

1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI

1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA 1.2 LUBIQUIT DEI MICRORGANISMI pag. 3 pag. 10

2. OSSERVARE I MICRORGANISMI
2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE 2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE 2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA 2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM pag. 13 pag. 16 pag. 18 pag. 21 pag. 23

3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE TECNICHE DI SEMINA 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI pag. 25 pag. 31 pag. 33

4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA 4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA 4.4 4 4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELLACQUA POTABILE DELL ACQUA 4.5 VALUTAZIONE DELLAZIONE INIBENTE DI ALCUNI DISINFETTANTI DI USO COMUNE 4.6 ANTIBIOGRAMMA pag. 37 pag. 40 pag. 42 pag. pag 46 pag. 52 pag. 56 pag. 61 pag. 64 pag. 67 pag. pag 70 pag. 73

5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI

5.1 UTILIZZAZIONE DELLAMIDO 5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI 5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE 5.4 5 4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI 5.5 ENTEROTUBE

6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO
6.1 PROTEINA C REATTIVA 6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO pag. 77 pag. 79

APPENDICE
TERRENI DI COLTURA BIBLIOGRAFIA 1 pag. 81 pag. 90

1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI

U.D. 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA

Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennarelli), non mangiare, bere e fumare in laboratorio. Non d i N sedersi sopra i banconi e non appoggiarsi agli strumenti. b i i i li t ti Indossare il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose. E compito di ciascuno mantenere i camici puliti e in buone condizioni. I capelli devono essere raccolti in modo da evitare contatti con superfici sporche o con la fiamma del bunsen. Non lasciare mai senza controllo reazioni in corso o apparecchi in funzione. Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone. Non portare in tasca forbici, tubi di vetro o oggetti taglienti e appuntiti. Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e, in particolare, alla fine dellattivit lavorativa dopo la manipolazione di materiale biologico. Le apparecchiature di laboratorio devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo luso. Sulletichetta dei reagenti sono riportati: nome del prodotto composizione chimica simboli di pericolosit frasi di rischio e sicurezza

SIMBOLI DI PERICOLO

Tossico: sostanza chimica che pu causare danni acuti o cronici allorganismo

Infiammabile: qualsiasi sostanza liquida, solida, vapore o gas che si infiammi facilmente e bruci rapidamente.

Materiale ossidante: sostanza in grado di rilasciare ossigeno che pu incrementare o accellerare la combustione.

Esplosivo: materiale che produce un istantaneo e improvviso rilascio di pressione, gas o calore quando sottoposto ad un brusco shock, pressione o temperatura. Irritante: materiale non corrosivo che causa effetti infiammatori reversibili sui tessuti viventi attraverso lazione chimica nel punto di contatto in funzione della concentrazione e del tempo di esposizione.

Corrosivo: sostanza chimica che provoca distruzione visibile o alterazione irreversibile dei tessuti organici nel punto di contatto.

 TECNICHE DI ASETTICITA

Le finalit di queste tecniche sono: a) ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi b) svolgere il lavoro in laboratorio di microbiologia con sicurezza Una coltura pura costituita solo da una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla q q pelle, nellaria, sulle superfici dei piani di lavoro. Le regole fondamentali delle tecniche di asetticit sono: usare terreni e attrezzature sterili lavorare vicini alla fiamma del bunsen sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per lintera lunghezza dellastina metallica, sia prima che dopo i prelievi la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati, dopo l uso dentro apposite buste usati luso autoclavabili disinfettare il bancone di lavoro accuratamente sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto

INCUBAZIONE DELLE COLTURE

Scrivere sulla base della piastra Petri prima dellinoculo indicando il nome delloperatore, la data, il nome del microrganismo, in modo da riconoscere la piastra e sapere ci che contiene. Le colture pure in piastra devono essere sigillate con nastro adesivo.

 TECNICHE DI STERILIZZAZIONE

Sterilizzazione: trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita. Pu essere realizzata con: a- calore secco b- calore umido c- filtrazione
CALORE SECCO

a) aria calda La stufa a secco, utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio. I parametri duso della stufa sono: 160 per 60 150 per 120 140 per 180 b) flambatura Alla fiamma del bunsen, si pu sterilizzare la superficie esterna delle provette, o delle beute. La fiamma del bunsen esercita unazione germicida nellaria intorno alla fiamma per un raggio di circa 10 cm, creando una zona sterile. c) arroventamento Alla fiamma del bunsen, anche possibile sterilizzare lansa o lago prima e dopo i prelievi. Pinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla fiamma.

TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN

CALORE UMIDO

a) tindallizzazione La soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100 C 100 con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento indicato per terreni nei quali possono crescere spore, le quali sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con il secondo e il terzo. b) vapore sotto pressione Per questa tecnica si usa lautoclave che unisce lazione del calore alla pressione. Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato. La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121 per 15 15. Tabella di sterilizzazione in autoclave:
Temperatura 110 115 120 125 Pressione (atm) 0,5 0,75 1 1,35 tempo (minuti) 150 50 15 6,5

FILTRAZIONE

a) filtri millipore Si utilizza per le sostanze che non possono essere sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di grandezza superiore ai loro pori.

b) membrane filtranti Per filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in esso presenti, si utilizzano opportune membrane con lapposito apparato di filtrazione.

c) cappa a flusso laminare Serve per eseguire al suo interno manipolazioni microbiologiche per eliminare la contaminazione dei prodotti ma anche delloperatore e dellambiente.

 APPARECCHIATURA DA LABORATORIO

MICROSCOPIO Strumento capace di fornire un'immagine ingrandita di un piccolo oggetto osservato attraverso di esso. Il microscopio composto di: - una parte meccanica detta stativo - una parte ottica USO DEL MICROSCOPIO - accendere la luce - porre il vetrino sul tavolino traslatore, sistemare il preparato rivolto verso lalto e in prossimit dellapertura centrale del tavolino - avvicinare il tavolino allobiettivo pi piccolo (4x) mediante la vite macrometrica - mettere a f fuoco con l vite micrometrica la i i i - regolare lintensit della luce - regolare lapertura del diaframma considerando che con lobiettivo 100x il diaframma deve avere la massima apertura - spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso - individuare un buon campo e quindi ruotare lobiettivo successivo (10x) e passare poi al 40x mantenendo sempre il fuoco - abbassare l bb leggermente il tavolino traslatore, mettere una goccia di olio d i li l i li da immersione al centro d l i l del vetrino, abbassare lobiettivo 100x con cautela verso la goccia e mettere a fuoco - descrivere quanto osservato

PRECAUZIONI DUSO DEL MICROSCOPIO - non lasciare i vetrini sul tavolino traslatore - t li lolio dallobiettivo 100X d togliere l li d ll bi tti dopo averlo usato utilizzando la carta imbevuta di alcool l t tili d l t i b t l l - non far toccare gli obiettivi al preparato - non forzare alcuna manopola e non svitare gli obiettivi o gli oculari

CAPPA A FLUSSO LAMINARE La cappa consente la protezione delloperatore e dellambiente dal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare in condizioni di sterilit. Il flusso continuo di aria sterile, allinterno della cabina, impedisce la fuoriuscita verso lesterno, di microbi. La sterilizzazione viene realizzata facendo passare laria attraverso dei filtri. E opportuno accendere la cappa circa 20 prima di iniziare a lavorare per assicurare una completa sterilit allinterno della stessa.

AUTOCLAVE Lautoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose e colture di rifiuto. N l processo di sterilizzazione, viene usato il vapore ad alta lt ifi t Nel t ili i i t d lt pressione, di solito 121C. I microbi si eliminano meglio con il caldo umido che con quello secco della stufa, perch il vapore denatura le loro proteine. Assicurarsi prima di tutto che ci sia acqua sufficiente che copra la serpentina di rame in modo che non scaldi a secco durante il processo. Il coperchio deve essere perfettamente chiuso prima di iniziare il ciclo di sterilizzazione, quando questo completato, si attende che lautoclave sia raffreddata prima di aprirla. Lapertura anticipata del coperchio pu causare lebollizione dei liquidi nei recipienti.

PRECAUZIONI DUSO DELLAUTOCLAVE Esistono due fattori critici per la riuscita del processo: - tutta laria deve fuoriuscire dallautoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con la superficie di ci che deve essere sterilizzato. In caso contrario la temperatura resterebbe pi bassa. - i materiali non d t i li devono essere sigillati, t i e coperchi d i ill ti tappi hi devono essere appena avvitati. I t l modo l i it ti In tal d laria contenuta al loro interno pu uscire liberamente. - il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei contenitori.

TERMOSTATO Apparecchio a circolazione daria calda, termoregolato, che permette di mantenere costante la temperatura. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 20 e 80C. Internamente ci sono dei ripiani forati per favorire la circolazione dellaria. Le colture batteriche, dopo la semina nei terreni appositi, vengono poste ad incubare nei termostati dove la temperatura impostata a 37 in quanto ottimale per il loro sviluppo.

BAGNOMARIA Apparecchio che consente di mantenere terreni di colture a temperatura costante in bagni di acqua. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 25 e 98C. Allinterno contiene d i portaprovette, il coperchio a ti Alli t ti dei t tt hi timpano per permettere tt allacqua di condensazione di ricadere allinterno. Il bagnomaria si usa per tenere in incubazione test sierologici a 37C e per lagar fuso pronto per luso per le semine in dispersione.

BILANCIA TECNICA Strumento destinato alla misura dei pesi. Permette di pesare quantit fino a 2000 g circa, con sensibilit di 0.01 g.

CENTRIFUGA La centrifugazione un metodo di separzione della fase liquida nelle sospensioni, per mezzo della forza centrifuga La centrifuga costituita da un rotore parte centrifuga. mobile e girevole, con logge fisse per la collocazione delle provette. Sul pannello frontale sono inseriti un orologio per regolare la durata della centrifugazione, una manopola per regolare la velocit, un freno automatico per abbreviare i tempi di arresto. Prima di centrifugare necessario che le provette nel rotore siano equilibrati. Il rotore deve poi essere portato progressivamente alla velocit desiderata.

CONTACOLONIE DIGITALE QUEBEC Apparecchio per losservazione e il conteggio delle colonie cresciute in piastra attraverso limpiego di una lente di ingrandimento (x1,5), un piano dappoggio centimetrato e illuminato. Un contatore digitale registra automaticamente i dati ottenuti esercitando una lieve pressione, con una penna, sulla superficie della p , p , p piastra, in corrispondenza di ogni colonia.

STUFA Apparecchio a circolazione daria calda utilizzabile sia per asciugare che per sterilizzare la vetreria. La temperatura di esercizio compresa tra +50 e +290C.

PHMETRO Strumento che consente di misurare il valore del pH delle soluzioni acide o basiche. Si basa sulla misura della differenza di potenziale che si istaura fra due elettrodi immersi nella soluzione da saggiare.

FRIGORIFERO Apparecchio che serve a incubare a basse temperature e per la conservazione di campioni e materiale. Il f i if i i t i l frigorifero i f tti permette l b tt i t i cio l infatti tt la batteriostasi, i lassenza di crescita o di riproduzione della coltura. Gli aerobi possono essere conservati per mesi in agar inclinato, gli anaerobi infissi in agar. La conservazione in frigo ha degli svantaggi quali la breve durata di immagazzinamento, quindi lobbligo di trapianti frequenti e la facile inquinabilit delle colture.

U.D. 1.2 UBIQUIT DEI MICRORGANISMI

OBIETTIVO: Scoprire che i microrganismi hanno la capacit di popolare qualsiasi ambiente ed osservare i caratteri morfologici delle colonie che si sono sviluppate.

PRINCIPIO: Lubiquit dei microrganismi pu essere messa in evidenza contaminando con diversi ambienti (acqua, latte, polpastrelli, aria, terriccio) piastre di Petri riempite con Nutrient agar per contatto diretto o per esposizione. Poich il terreno Nutrient agar possiede i nutrienti capaci di far crescere un gran numero di microrganismi, l l i i i la loro presenza i ambienti di in bi ti diversi sar evidenziata d ll sviluppo di colonie i id i t dallo il l i visibili ad occhio nudo.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Acqua di pozzo (lago o fiume) latte fresco o pastorizzato yogurt polpastrelli delle dita fiume), pastorizzato, yogurt, dita, aria di una stanza, terriccio o torba. TERRENI DI COLTURA Nutrient agar VETRERIA, ... Piastre sterili monouso, contenitori sterili, spatole sterili monouso, pipette pasteur monouso, beuta, provette, bacchette vetro STRUMENTI Bilancia, autoclave, bunsen, termostato, contacolonie o lente di ingrandimento

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METODICA
(1a FASE) A CURA DELLINSEGANTE

Preparare il terreno.

Distribuire in provettoni con tappo metallico (18-20 ml per provettone).

3 4
(2a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15.

Piastrare in ambiente sterile.

Seminare: a) una piastra con 0,1ml di acqua, una con 0,1ml di y g p p latte ed una con 0,1ml di yogurt per spatolamento

b) una piastra appoggiando delicatamente i polpastrelli sul terreno per qualche secondo c) una piastra lasciandola aperta per circa 20-30 nella stanza prescelta d) una piastra con 0,1 ml di sospensione di terriccio preparata prelevando 2/3 spatolate di terriccio, sciolto in 50 ml di acqua distillata sterile - lasciare una piastra senza seminarla come prova in bianco - siglare le piastre con il proprio nome e il tipo di batteri seminati

Incubare le piastre capovolte a 37 C per 48 h.

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(3a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI

1
a) numero

Osservare le colonie formatesi e descriverle in relazione a:

b) forma

puntiforme

rotonda

lenticolare

irregolare

rizoide

filamentosa

c) margine

intero

ondulato

d) profilo

piatto

convesso

umbonato

e) superficie

liscia

rugosa

lucida

opaca

f) consistenza

compatta

sfaldabile

pastosa

mucosa

g) colore

Disegna ci che hai osservato

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2. OSSERVARE I MICRORGANISMI
U.D. 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice.

PRINCIPIO: I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali detti cromofori associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con lambiente rendendo pi visibili le cellule. Poich i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il Blu di metilene.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis MATERIALI CHIMICI Blu di metilene, olio da immersione VETRERIA, ... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen

Blu di metilene 1%: aggiungere, in una bottiglia con contagocce, ad 1 g di blu di metilene 99 ml di acqua distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.

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METODICA (1a FASE) fissazione

Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata.

Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata.

Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dellacqua. Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza, sulla zona pi calda della fiamma del becco bunsen, per almeno tre volte. b l l

(2a FASE) colorazione

Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di metilene. Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua mediante una spruzzetta. Eliminare buona parte dellacqua di lavaggio p q gg inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima con carta da filtro, poi allaria.

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METODICA (1a FASE) osservazione al microscopio

Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, p procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo p g , g p ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

I pi comuni tipi morfologici dei batteri

cocchi

streptococchi

stafilococchi

diplococchi

bastoncelli

vibrioni

spirilli

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U.D. 2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA

OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.

PRINCIPIO: La Nigrosina un colorante acido che non in grado di penetrare allinterno dei batteri e forma dunque un deposito scuro attorno alle cellule che vengono evidenziate per contrasto.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus MATERIALI CHIMICI Nigrosina, olio da immersione VETRERIA, ... Vetrini portaoggetto ansa vaschetta per colorazione spruzzetta pinza di legno portaoggetto, ansa, colorazione, spruzzetta, STRUMENTI Microscopio, bunsen

Nigrosina 2%: aggiungere, in una bottiglia con contagocce, a 2 g di nigrosina 99 ml di acqua distillata. Agitare fino a completa dissoluzione.

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METODICA (1a FASE) colorazione

Deporre una goccia di nigrosina su un vetrino portaoggetti.

Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata e miscelarla con la nigrosina.

Distendere uniformemente il materiale sul vetrino asciugare allaria non scaldare e non fissare alla fiamma.

(2a FASE) osservazione al microscopio

Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

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U.D. 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE (secondo Shaeffer e Fulton)

OBIETTIVO: Osservare la presenza di endospore e spore libere.

PRINCIPIO: PRINCIPIO Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il colorante anche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore del colorante di contrasto (safranina).

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Bacillus subtilis MATERIALI CHIMICI Verde malachite 5%, safranina, olio da immersione TERRENI DI COLTURA Agar al manganese VETRERIA, ... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno, piastre sterili, beuta, provette STRUMENTI Microscopio, autoclave, termostato, bilancia, bunsen

Agar al manganese: - Nutrient broth 8g -A Agar 20 g - MnCl2 1% 0,5 ml - Acqua 1000 ml Unire al brodo lagar e scaldare, aggiungere poi 0,5 ml di MnCl2 1% in acqua. Preparazione soluzione di safranina: 1 g di safranina sciolta in 10 cc di alcool, aggiungere acqua fino a 100 cc.

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METODICA
(1a FASE) a cura dellinsegnante

Preparare delle provette con 16-18 ml di agar al manganese.

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15.

Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare.

S i Seminare per striscio unansata d ll coltura i ti i t della lt in esame.

Incubare a 35 per 18-24 h.

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METODICA
(2a FASE) a cura dello studente

Allestire e fissare un vetrino con una delle colonie ottenute nella 1a FASE.

Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra una A i ti t vaschetta contenente acqua la quale verr portata allebollizione. Colorare abbondantemente con verde malachite, lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa per 3-5 e aggiungere ancora il colorante facendo attenzione che il vetrino non rimanga a secco. (p (per evitare che il vetrino cada nella vaschetta trattenerlo con una pinza di legno)

Lavare con acqua e colorare con safranina per 5. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente.

(2a FASE) osservazione al microscopio

Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

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U.D. 2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA

OBIETTIVO: Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica.

PRINCIPIO: La capsula dei batteri non ha alcuna affinit per i coloranti perci per metterla in evidenza si fa ricorso a colorazioni negative.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Sospensione batterica (inoculo di terra) MATERIALI CHIMICI Inchiostro di china al 10% VETRERIA, ... Vetrini V t i i portaoggetto, vetrini coprioggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, t tt ti i i tt h tt l i tt pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen

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METODICA
(1a FASE)

Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al 10% su un vetrino portaoggetti.

Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata.

Sospendere il materiale sullinchiostro di china e coprire con un vetrino coprioggetto.

(2a FASE) osservazione al microscopio

Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

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U.D. 2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM

OBIETTIVO: Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram+ e i Gram-. PRINCIPIO: La diversa colorazione che assumono i b tt i con questa t i di d d ll diff L di l i h batteri t tecnica dipende dalle differenze esistenti nella loro parete cellulare. La parete dei Gram+ costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che non permette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante basico cristal violetto) da parte del decolorante. I Gram+ rimangono dunque colorati in violetto. I Gram- hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risulta permeabile allagente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante di contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus e Escherichia Coli MATERIALI CHIMICI Cristal violetto, liquido di Lugol, safranina, decolorante alcool-acetone, olio da immersione VETRERIA, ... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen

Le soluzioni coloranti vengono preparate come soluzioni idroalcooliche che si allestiscono sciogliendo nellalcool il colorante: ll ti i li d ll l l l t Sostanza colorante in polvere g 10 Alcool etilico assoluto ml 100 Si lascia a contatto per qualche giorno ottenendo una soluzione satura. Queste soluzioni necessarie a mantenere a lungo i coloranti, non sono adatte ad essere usate direttamente nelle colorazioni. Pertanto, con una diluizione in acqua, si ottengono soluzioni idroalcooliche: Soluzione alcoolica madre del colorante ml 10 Acqua distillata ml 90

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METODICA (1a FASE) fissazione e colorazione

Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata.

Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di p g acqua distillata.

Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dellacqua.

Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza sulla zona pi calda della fiamma del pinza, becco bunsen, per almeno tre volte. a) colorare il preparato depositando, mediante una pipetta qualche goccia del 1 colorante (cristal violetto), lasciare agire per 1 b) lavare con acqua distillata e poi coprire con il liquido di Lugol e lasciare agire per 1, lavare ancora con acqua c) decolorare con soluzione alcool-acetone e sciacquare immediatamente d) colorare con la soluzione di contrasto (safranina) per 1, sciacquare accuratamente e asciugare il vetrino. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente g

(2a FASE) osservazione al microscopio

Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino allobiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

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3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

U.D. 3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE TECNICHE DI SEMINA

OBIETTIVO: Acquisire la corretta manualit nelle varie tecniche di semina e la consapevolezza degli scopi per i quali la semina viene effettuata.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche TERRENI DI COLTURA Terreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina) VETRERIA, ... Piastre Petri sterili, pipette graduate sterili, provettoni, provette, tamponi faringei sterili, spatole sterili, anse, aghi, cilindri STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, bunsen

UTILIZZO DEI TERRENI DI COLTURA DISIDRATATI

Solubilizzazione: pesare il terreno e porlo in una beuta e aggiungere la met del volume di acqua distillata richiesta. Agitare per solubilizzare poi aggiungere lacqua rimanente lavando le pareti della beuta. Utilizzare sempre beute di volume almeno 2 volte e mezzo quello della sospensione. Riscaldare per ottenere una completa solubilizzazione agitando continuamente fino ad arrivare allebollizione. La completa solubilizzazione dopo alcuni minuti di ebollizione, indicata dalla trasparenza della soluzione.

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SEMINA IN TERRENO SOLIDO

Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (a) Operare in ambiente sterile, passare lansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po di patina batterica da una piastra o da una provetta. Trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando lansa con movimenti ampi a zig-zag senza incidere il terreno, non tornare sui punti gi seminati. Sterilizzare lansa dopo luso. La crescita si manifesta con formazione di colonie confluenti e isolate presenti sulla superficie dellagar.

Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (b)

3 2 1

Sempre operando in ambiente sterile, passare lansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po di patina batterica. Trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando lansa con movimenti a zig-zag senza incidere il p ( ) terreno solo su met piastra (1). Sterilizzare e raffreddare lansa, ruotare la piastra e riprendendo dal punto interrotto, strisciare laltra met della piastra (2); ripetere loperazione unaltra volta in modo da ottenere tre strisci in tre diverse direzioni (3). La crescita si manifesta con formazione di colonie confluenti nella prima met e isolate nella seconda met della i d ll piastra, presenti sulla superficie d ll i ll fi i dellagar.

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SEMINA IN TERRENO SOLIDO

Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (c) p p ( )

Nel caso in cui si voglia ottenere una crescita compatta, si pu effettuare lo striscio con tamponi sterili che vengono passati pi volte e in pi direzioni sul terreno. Immergere un tampone in un brodo e trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando pi volte sulla superficie. Ruotare la piastra e strisciare ancora; sterili are il tampone dopo sterilizzare luso. La crescita si manifesta con formazione di una patina pi o meno omogenea.

Tecnica dello spatolamento in piastra (d) Operando sotto una cappa sterile o accanto alla fiamma del bunsen, prelevare con una pipetta sterile 0,1 ml di brodocoltura e trasferirlo al centro di una piastra con agar nutrient. Con una spatola sterile distribuire l inoculo linoculo sulla superficie dellagar in tutte le direzioni. dell agar Rovesciare la piastra ed incubarla a 28-32 per 2448h. Deporre la spatola nellapposito sacchetto per la sterilizzazione. La crescita si manifesta con lo sviluppo di una patina p presente sulla superficie dellagar. p g

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SEMINA IN TERRENO SOLIDO

Tecnica della inclusione o diffusione in piastra (e) Nellinclusione usiamo pipette sterili graduate per trasferire volumi precisi di inoculi nelle piastre. Successivamente si riempie la piastra con terreno di coltura sterile mantenuto fuso a b.m. a 45C. Se la sospensione da seminare concentrata, si procede ad una diluizione come nella sezione 4.1. La crescita si manifesta con lo sviluppo di colonie isolate presenti sulla superficie dellagar ma soprattutto in profondit.

Diluizione ed i l i Dil i i d inclusione (f) Diluire la brodocoltura quando particolarmente concentrata procedendo ad una diluizione come nella sezione 4.1. Predisporre 4 piastre nelle quali verserete 1 ml di ogni diluizione preparata mettendo nella prima piastra linoculo concentrato (conc. 100). Versare il terreno sterile, mantenuto fuso a b.m., nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con un movimento rotatorio, rotatorio lasciar solidificare solidificare. Le colonie crescono sia in superficie che in profondit e se la semina stata fatta bene, le colonie saranno in progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e pi piccole dove il numero maggiore.

Contaminazione

Bassa (+)

Media (++)

Alta (+++)

Altissima (++++)

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SEMINA IN TERRENO SOLIDO

Tecnica di isolamento e striscio su slant

Operare in ambiente sterile, passare lansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po di patina batterica da una piastra. Aprire e flambare la provetta, trasferire il materiale strisciando lansa con movimenti a zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della provetta. p p Sterilizzare lansa dopo luso. La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o patina di consistenza cremosa o secca.

Tecnica di trasferimento per striscio da slant a slant (o becco di clarino) Sempre operando in ambiente sterile, passare lansa alla fiamma e raffreddarla. Impugnare le due provette con una mano, togliere i tappi e flambare limboccatura alla fiamma. Prelevare un po di patina batterica dalla prima provetta, trasferire il materiale strisciando lansa con mo imenti a movimenti zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della seconda provetta. Flambare e tappare le due provette. Sterilizzare lansa dopo luso. Anche qui la crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o patina di consistenza cremosa o secca.

Tecnica per infissione in agar o gelatina

Si utilizza questa semina con un ago per inoculare terreni solidificati in provetta. Lago consente di inserire le cellule lungo una linea verticale e in profondit, per permettere lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorire losservazione di forme mobili che si diffondono a partire dalla linea dellinoculo. d lli l

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SEMINA IN TERRENO LIQUIDO

Tecnica di trasferimento da slant a brodo Disporre le provette con il ceppo di Escherichia Coli e il brodo sterile da seminare vicino alla fiamma. Sterilizzare e raffreddare lansa, togliere i tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con lansa un po di patina batterica dallo slant, inserire lansa con linoculo nel brodo sterile e stemperare. Flambare e tappare le provette. Sterilizzare lansa dopo luso.

Tecnica di trasferimento mediante pipetta Disporre le provette con linoculo in brodo e il brodo sterile da seminare vicino alla fiamma, togliere i tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di inoculo dalla prima provetta e trasferirla nella seconda. Flambare e tappare le provette. Deporre la pipetta nell nell apposito sacchetto per la sterilizzazione.

La crescita in brodo si evidenzia a occhio nudo attraverso: - intorbidamento del terreno; - formazione di un sedimento sul fondo della provetta che agitato sale verso lalto; - formazione di fiocchi o granuli in sospensione.

Incubare i terreni seminati insieme ad alcuni non seminari, come controllo, a 37 per 24-48h

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U.D. 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT

OBIETTIVO: Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurt

PRINCIPIO: Nello yogurt sono generalmente presenti due gruppi batterici: il Lactobacillus bulgaricus e lo Streptococcus thermophilus, che trasformano il lattosio presente nel latte in acido lattico. Lo striscio, in MRS agar, permette lisolamento dei lattobacilli, mentre lM17 favorisce la crescita degli streptococchi lattici e inibisce quella del Lactobacillus bulgaricus. Pur essendo improbabile, per lacidit dello yogurt e per le norme igieniche di produzione e conservazione, conservazione la presenza di microrganismi contaminananti tuttavia possibile verificare contaminananti, leventuale presenza di batteri coliformi Gram- seminando in Levine EMB Blue agar che consente di differenziare le colonie di E. coli in base alla presenza di riflessi verdi metallici e alla colorazione violacea con centro nero.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Yogurt MATERIALI CHIMICI Sol. di Ringer, reattivi per anaerobiosi, cartina indicatrice TERRENI DI COLTURA g , g , g MRS agar, M17 agar, EMB blue agar VETRERIA, ... Beute, cilindri, bacchette, provette, beuta da 100 ml, piastre sterili, ansa STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, bunsen

Soluzione di Ringer Sodio cloruro 9 g, Potassio cloruro 0,42 g, Calcio cloruro anidro 0,24 g, Sodio bicarbonato 0,2 g, acqua distillata 1 litro. Viene impiegata nella diluizione di 1:4 con acqua distillata. distillata In alternativa soluzione di Ringer in tavolette Sciogliere 1 tavoletta in 500 ml di acqua distillata sterile.

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METODICA

Preparere i terreni e la sol. di Ringer, sterilizzare dopo aver controllato il pH dei terreni (pH 6,2) con la cartina indicatrice.

Piastrare i tre diversi terreni e raffreddare.

Prelevare 10 g di yogurt sterilmente, diluirlo in 100 ml di Ringer sterile omogenizzando bene.

Per striscio seminare 3 piastre dei terreni diversi. Poich i lattobacilli crescono bene in anaerobiosi anaerobiosi, aggiungere sopra lo striscio un altro strato di MRS e solidificare. In alternativa usare la giara come allunit 3.3

Mettere in termostato a 37 per 2 o 3 giorni 37 giorni. Controllare la crescita e la presenza di colonie isolate, confermare il tipo di microrganismo per mezzo della colorazione di gram.

Coltura mista di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus dello yogurt al microscopio elettronico

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U.D. 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

OBIETTIVO: Verificare ladattamento di alcune specie microbiche a condizioni differenti di ossigenazione e di pH del mezzo di crescita. PRINCIPIO: Ogni specie microbica presenta esigenze nutrizionali e colturali diverse. Variando in modo controllato alcuni fattori ambientali si pu valutare la risposta di ciascuna specie microbica in esame attraverso losservazione della crescita in coltura.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Brodocolture di Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae MATERIALI CHIMICI Reattivi per anaerobiosi (catalizzatori, indicatori), cartina indicatrice (test a) Soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) (test b) TERRENI DI COLTURA Glucose agar (test a) TSB (test b) VETRERIA, ... Beute, cilindri, bacchette, provette, beker 100 ml, piastre sterili con setto, ansa, piastre sterili, pipette sterili da 1 ml STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, phmetro, bunsen

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METODICA test a) Influenza dellossigeno atmosferico sulla crescita Ricerca di aerobi, anaerobi e anaerobi facoltativi Ri bi bi bi f lt ti i
(1a FASE 1 parte)

Sciogliere il terreno per una prova in doppio, pi il controllo.

Distribuire in provette, controllare il pH con la cartina indicatrice e autoclavare.

3
(1a FASE 2 parte)

Piastrare e raffreddare il terreno.

Seminare in ciascuna met della piastra, in maniera sterile, mediante striscio, linoculo dei due ceppi batterici. Una piastra va messa in termostato e laltra in giara.

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Giara: sistemare le piastre capovolte nella giara, inserire lindicatore per anaerobiosi e il reattivo per eliminare lossigeno (il reattivo va attivato aggiungendo 10 ml di acqua nella bustina operando lontano dalla fiamma per la presenza di idrogeno altamente infiammabile); l reazione viene portata a t i fi bil ) la i i t t termine i i in circa 60, dopodich controllare la pressione nel manometro (1 atm. circa). Dopo 2-3 ore controllare se lindicatore per lanaerobiosi virato al rosso.

Riporre la giara e la seconda serie di piastre in termostato a 37 per 48 h. Dopo incubazione aprire la giara sotto cappa controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondo cappa, la seguente scala:

+ ++ +++

= assenza di crescita = crescita scarsa = crescita normale = crescita abbondante

NB: il catalizzatore situato nellapposita sede posta sotto il coperchio della giara; tra un impiego e laltro va asciugato riscaldandolo in stufa a 160 per 90.

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METODICA test b) Influenza del pH del mezzo sulla crescita Si verifica linfluenza del pH sulla crescita coltivando i batteri in terreni in cui viene variato il pH per aggiunta di acidi o di basi.
(1a FASE 1 parte)

1 2
METODICA PHMETRO

Sciogliere il terreno, distribuirlo in 4 beute.

Preparare le soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) e correggere il pH in ognuna delle beute con i valori 3,0-4,57,0-9,0 controllandole con il phmetro.

Accendere il pHmetro almeno 10 prima delluso ed effettuare la calibrazione. Selezionare il tasto pH e automatico, inserire lelettrodo nel campione a pH 7. Pigiare il tasto cal e attendere che lo strumento si stabilizzi. Lavare e asciugare lelettrodo e ripetere l i t loperazione con il campione a pH 4 o 10 Eff tt i i H 10. Effettuare l la lettura dei vari campioni pigiando il tasto read o = lavando accuratamente lelettrodo tra una lettura e laltra.

Distribuire 10 ml in ogni provetta in modo da ottenere 4 provette per ogni prova Sterilizzare a 121 per 15 e prova. 15 ricontrollare infine il pH.

(1a FASE 2 parte)

Seminare 1 ml delle due brodocolture in ogni provetta, incubare sia i tubi seminati che quelli non seminati a 36 per 24-48 h. Controllare la crescita nei tubi e registrare i risultati secondo la seguente scala: + ++ +++ = assenza di crescita = crescita scarsa = crescita normale = crescita abbondante
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4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI

U.D. 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA

OBIETTIVO: Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa.

PRINCIPIO: Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione e incubata, si riproduce formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si pu risalire al numero di microrganismi presenti in un volume noto del campione.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture batteriche TERRENI DI COLTURA Nutrient N t i t agar VETRERIA, ... Beute, cilindri, bacchette, provette, piastre sterili, ansa, pipette sterili da 1 ml STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, bunsen

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METODICA Conta dei batteri mediante semina per inclusione in piastra (previa diluizione in serie)

Preparare il terreno agar nutrient e sterilizzarlo.

Partendo dalla sospensione in esame, preparare diluizioni scalari 1:10, 1:100, 1:1000 come segue: prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml del campione in esame e porlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fi i l i sterile. l l i fisiologica il Ripetere loperazione per le successive diluizioni cambiando opportunamente la pipetta ogni volta. Numerare 4 piastre 10 campione non diluito 1 fattore di diluizione 1:10 10-1 f tt dil i i 1 10 -2 fattore di diluizione 1:100 10 10-3 fattore di diluizione 1:1000 quindi seminarci 0,1 ml di ogni diluizione.

Versare il terreno sterile mantenuto fuso a b.m. nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con un movimento rotatorio, lasciar solidificare.

Incubare a 37 per 48h poi contare al contacolonie, le colonie ben isolate quando sono comprese tra 100 e 300. Le colonie crescono sia in superficie che in p profondit e se la semina stata fatta bene, le colonie saranno in progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e pi piccole dove il numero maggiore.

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Predisporre una tabella per i risultati

n. colonie 10 Campione 1 Campione 2 p Campione 3 n. colonie 10-1 n. colonie 10-2 n. colonie 10-3

Dalla conta si risale al numero di batteri/ml nelle sospensione in esame mediante la seguente formula: N= n*1/d*1/V N= numero di germi/ml del campione puro n= numero di colonie nella piastra 1/d= reciproco della diluizione dellinoculo in quella piastra 1/V= reciproco della frazione di volume considerato (1ml) utilizzato per linoculo1/10 di ml

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U.D. 4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO

OBIETTIVO: Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica classica)

PRINCIPIO: La crescita in terreni liquidi viene rivelata dallintorbidamento del terreno e/o sviluppo di gas. Il numero dei batteri presenti nel campione viene calcolato mediante una stima su base probabilistica basata sulla determinazione dellindice MPN (Most probable number) che rappresenta il numero pi probabile di microrganismi presenti in un volume noto di campione di acqua.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture batteriche TERRENI DI COLTURA Brodo lattosato VETRERIA, ... Beuta, cilindri, bacchette, provettoni, pipette sterili da 10, 1, 0,1 ml STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, bunsen

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METODICA Conta dei batteri su terreno liquido (es: ricerca dei batteri coliformi)

Preparare e sterilizzare 3 serie di 3 provettoni con 10 ml di terreno. P ili i i l

10 ml di Brodo lattosato concentrazione doppia con campanella di durham

10 ml di Brodo lattosato concentrazione normale con campanella di durham

10 ml di Brodo lattosato concentrazione normale con campanella di durham

Seminare.

Campione 10 ml 1 ml 0,1 ml

3
Incubare a 37 per 24-48 ore.

RISULTATI Prova negativa Prova positiva

Assenza di gas nella campanella

Presenza di gas nella campanella

Per il calcolo dellMPN si rileva il numero di prove positive per ogni serie di provette seminate (3 per serie) e, sulla base della sequenza ottenuta, si risale al numero pi probabile tramite apposita tabella (vedi tabella su U.D. 4.4)
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U.D. 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA

OBIETTIVO: Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica delle membrane filtranti)

PRINCIPIO: Filtrando volumi determinati di liquidi attraverso membrane sterili, con una porosit inferiore a 1 m, e ponendo tali filtri sulla superficie di terreni agarizzati in piastra, dopo incubazione, si otterranno colonie isolate che possono venire contate. MATERIALI E STRUMENTI STRUMENTI: TERRENI DI COLTURA PCA, ENDO broth MF, Faecal coliform broth, Azide maltose agar VETRERIA, ... p , p , p , , p , p Pipette sterili da 1-10ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre sterili, filtri sterili con membrana da 0,2 m STRUMENTI Apparato per la filtrazione, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, cappa sterile, pompa da vuoto, bunsen

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METODICA Procedimento A (Conta batterica totale)

(1a FASE)

Sterilizzare dentro una busta per autoclave lapparato di filtrazione (composto dallimbuto, il porta filtro, la beuta codata), pinze di metallo, un cilindro da 100 ml, 5 matracci da 100 ml, pipette graduate da 10 ml.

Sterilizzare e piastrare 6 piastre con il terreno PCA. Sterilizzare una beuta contenente 500 ml di acqua distillata per le diluizioni del campione.

Sotto la cappa sterile preparare le diluizioni del campione di acqua.

(2 campioni 1:10) Prelevare 10 ml di campione e metterlo in tre matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile. Un matraccio servir per la diluizione successiva . (2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo in due matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile.

Montare lapparato di filtrazione inserendo tra limbuto e il porta filtro lapposito filtro sterile, collegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare i campioni di acqua partendo da quelli pi diluiti. Dopo la prima filtrazione si toglie il filtro e lo si depone sulla superficie della piastra di PCA. Si procede cos per tutti e sei i campioni (campioni 100 10-1- 10-2).

Mettere le piastre capovolte in termostato per 24h; una piastra a 22 e laltra a 37 per ogni diluizione.

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METODICA Procedimento B (Individuazione coliformi totali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Endo broth agarizzato. Incubare a 36 per 24h.

Procedimento C (Identificazione coliformi fecali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Faecal coliform broth agarizzato. Incubare a 44 per 24h.

Procedimento D (Individuazione Streptococchi fecali)

Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Azide maltose agar. Incubare a 36 per 48h. p

Valutazione: a) Per la conta batterica totale si prendono in considerazione tutte le colonie presenti sulla membrana dopo incubazione. Riportare il valore alle diluizioni eseguite. (valori guida: 10 colonie a 36 C, 100 colonie a 22C/1 ml) 36C 22 C/1 Per i coliformi totali contare le colonie rosse e tutte le colonie che presentano riflesso metallico (fucsina); queste ultime possono essere presumibilmente classificate come colonie di Escherichia coli. Altre colonie eventualmente presenti non vanno conteggiate. Riportare il valore a 100 ml di campione. Per i coliformi fecali contare le colonie in grigio, grigio-blu e blu. Altri tipi di colonie eventualmente presenti non si contano. Riportare il valore a 100 ml di campione. l i i Ri l l i Per gli streptococchi fecali contare solo le colonie rosso, rosso-scuro, puntiformi (diametro max 1 mm) con contorni netti e cupoliformi. Ogni altro tipo di colonia non deve essere conteggiato. Riportare il valore a 100 ml di campione.

b)

c) d)

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METODICA

Risultati: Carica batterica totale 100 10-2 10-1 Coliformi totali C lif i t t li Coliformi fecali Streptococchi fecali

22C ./ml ./ml ./ml

36C ./ml ./ml ./ml ./100ml /100ml

44C

./100ml ./100ml

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U.D. 4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELLACQUA POTABILE

OBIETTIVO: Valutare se il campione in esame corrisponde ai requisiti di potabilit dal punto di vista microbiologico.

PRINCIPIO: Ricerca e quantificazione delle varie specie che rappresentano indicatori batterici di inquinamento e pi precisamente: carica microbica totale coliformi t t li e f li lif i totali fecali streptococchi fecali MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI CHIMICI Cartine indicatrici TERRENI DI COLTURA PCA, Lactose broth, Brillant green bile broth, Azide dextrose broth, Ethyl violet azide broth VETRERIA, ... Pipette sterili da 10-1-0,1 ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre sterili STRUMENTI Centrifuga, bagnomaria, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, bunsen

PRELIEVO DEI CAMPIONI

Il prelievo viene effettuato con bottiglie sterili in vetro o in plastica con tappo a vite, chiusi da fogli di carta di alluminio. Il prelievo sar effettuato dopo aver fatto defluire lacqua per alcuni minuti. I campioni vanno sottoposti allesame quanto prima, in ogni caso lintervallo di tempo fra il prelievo e lanalisi non dovr superare le 24h.

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ANALISI MICROBIOLOGICA ACQUA POTABILE

CARICA MICROBICA TOTALE Semina in PCA per inclusione con eventuali diluizioni scalari

Incubare a 36C per 48h

Incubare a 22C per 72h

Osservare e contare le colonie, ricavare il valore medio delle piastre alla stessa diluizione

Osservare e contare le colonie, ricavare il valore medio delle piastre alla stessa diluizione

COLIFORMI TOTALI E FECALI

STREPTOCOCCHI

Test presuntivo in Lactose broth

Test presuntivo in Azide dextrose broth

Incubare a 36C per 24/48h

Incubare a 37C per 48h

Test negativo

no Produzione di gas?

SCHEMA DI LAVORO
Intorbidamento del brodo?

no

Test negativo

si Test positivo Inoculo in Brillant green Bile broth

si Test positivo

Inoculo in EVA broth

Incubare a 36C per 24/48h

Incubare a 44C per 24h

Incubare a 37C per 48h

no Test negativo

Produzione di gas?

Produzione di gas?

no

Test negativo

Intorbidamento e precipitato color porpora?

no

Test negativo

si Test positivo

si Test positivo

si Test positivo

Conta con metodo MPN dei coliformi totali

Conta con metodo MPN dei coliformi fecali

Conta con metodo MPN degli streptococchi

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METODICA
(1a FASE)

a)

CARICA MICROBICA TOTALE a 36 e 22 36 22

Trasferire con pipette sterili, 1 ml del campione di acqua in 4 piastre, se il campione molto contaminato procedere a diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000) con acqua dist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2).

Piastrare con PCA mantenuto fuso in b.m. ruotare delicatamente le piastre per omogenizzare il campione nel terreno.

Incubare 2 piastre a 36 per 48h e le altre 2 a 22 per 72h.

Osservare le colonie cresciute con il contacolonie, ricavare il valore medio su ogni coppia di piastre, esprimere il risultato come colonie su agar/ml a 36 e 22C.

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METODICA b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test presuntivo) c) STREPTOCOCCHI FECALI (test presuntivo)

Preparare e sterilizzare (per i coliformi): 3 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione doppia. 6 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Brodo lattosato a concentrazione normale. normale

Preparare e sterilizzare (per gli streptococchi):

3 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione g doppia. 6 provettoni con campanella di durham contenenti ognuno 10 ml di Azide dextrose broth a concentrazione normale.

Seminare 10 ml di campione nei 3 provettoni contenenti il Brodo lattosato e 3 con lAzide dextrose broth a concentrazione doppia. Seminare 1 ml di campione nei 3 provettoni contenenti il Brodo lattosato e 3 con lAzide dextrose broth a concentrazione normale. Seminare 0,1 ml di campione nei 3 provettoni contenenti il Brodo lattosato e 3 con lAzide dextrose broth a concentrazione normale.

Incubare a 36 per 24-48 h tutti i test, leggere dopo 24 h considerando positive solo le colture che hanno crescita con sviluppo di gas e intorbidamento del terreno. I b di nuovo solo i tubi negativi per altre Incubare l bi i i l 24 h.

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METODICA b) COLIFORMI TOTALI E FECALI (test di conferma) c) STREPTOCOCCHI FECALI (test di conferma) Preparare e sterilizzare:

tanti provettoni con campanella di durham quante sono le prove positive con 4 ml di Brillant green bile broth (per i coliformi) e altrettante con 5 ml di EVA broth (per gli streptococchi).

Seminare 1 ansata di ogni brodocoltura positiva delle prove presuntive nei tubi contenenti il Brillant green e 3 ansate in quelli contenenti EVA broth.

Incubare a 36 per 24h i coliformi totali, a 44 per 24h i coliformi fecali, a 36 per 48h gli streptococchi.

Osservare i risultati, la determinazione numerica dei batteri ricercati viene espressa rispetto al numero di tubi positivi (intorbidamento e produzione di gas per i coliformi, sedimento color porpora per gli streptococchi) e esprimere l concentrazione d i b hi) i la i dei batteri come MPN/ l di campione, cio di numero i MPN/ml i i pi probabile.

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Tabella MPN
Numero tubi positivi su 3 da 10 ml 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 da 1 ml 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 da 0,1 ml 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 MPN per 100 ml 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 Limiti fiduciari inferiori <0,5 <0,5 <0,5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 38 71 150 superiori 9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800

Parametri microbiologici dalla Gazzetta Ufficiale maggio 1985 Caratteristiche di qualit delle acque destinate al consumo umano
Parametro ed unit di misura Coliformi fecali/100 ml Coliformi totali/100 ml Valore guida Valore limite 0 0 osservazioni Non pi del 5% dei campioni esaminati nellarco dellanno e non pi di 2 campioni prelevati nello stesso punto possono eccedere tale limite. Comunque mai superiore a 5/100 ml. Alte i h batteriche i hi d Alt cariche b tt i h richiedono indagini e accertamenti appropriati.

Conteggio l i C t i colonie su agar/1 ml a 36C /1 l a 22C Streptococchi fecali/100 ml

10 100 -

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U.D. 4.5 VALUTAZIONE DELLAZIONE INIBENTE DI ALCUNI DISINFETTANTI DI USO COMUNE

OBIETTIVO: Confrontare lattivit inibente di alcuni disinfettanti utilizzati comunemente per usi sanitari e domestici. PRINCIPIO: Il potere antibiotico di alcuni composti chimici pu essere valutato indagando la loro capacit di inibire la crescita di microrganismi. Il metodo utilizzato quello della diffusione in agar basato sulluso di dischetti di carta da filtro sterili imbevuti del composto da saggiare. I dischetti, disposti sulla superficie del terreno agarizzato, seminato con un ceppo microbico standardizzato, permettono la diffusione del disinfettante nel terreno. Dopo incubazione si osserver i t intorno al di h tt un alone di i ibi i l dischetto l inibizione d ll crescita che avr un di della it h diametro t t t tanto pi grande quanto pi efficace sar il disinfettante. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Ceppi di Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis MATERIALI CHIMICI Alcool denaturato, tintura di iodio, acqua ossigenata 10 volumi, amuchina, ammoniaca e candeggina di uso commerciale. TERRENI DI COLTURA TSB, TSA VETRERIA, VETRERIA ... Beute, cilindri, bacchette, provette 16x100, piastre sterili, beker, dischi di carta da filtro sterili con diametro di 6 mm, tamponi sterili, pinze, ansa STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, contacolonie, bunsen

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METODICA
(1a FASE 1 parte)

Preparare delle provette contenenti 5 ml di TSB, sterilizzarlo per gli inoculi dei ceppi batterici.

preparare, sterilizzare e piastrare il TSA doppio volume (40 ml a piastra).

(1a FASE 2 parte)

Seminare i brodi prelevando circa 4-5 ansate di ogni ceppo batterico.

Incubare per 18 h a 37 C.

53

METODICA
(2a FASE 1 parte)

Standardizzare linoculo confrontando la torbidit della brodocoltura con quella dello standard MacFarland, (tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml) usare brodo sterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.

(2a FASE 2 parte)

Seminare, con un tampone sterile in maniera uniforme, ripetendo loperazione pi volte ruotando la piastra di 60, i ceppi batterici.

2 4 1

Segnare sul fondo delle piastre la posizione in cui deporre i dischi imbevuti indicando con un numero il composto da saggiare. Testare, per ogni ceppo batterico, i disinfettanti pi un dischetto imbevuto con acqua p p sterile come controllo. Con le pinze sterili deporre i dischi sulla superficie dellagar dopo averli imbevuti dei campioni di disinfettante.

Incubare le piastre a 37 per 24 h.

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METODICA
(3a FASE)

La misura degli aloni di inibizione viene fatta su un contacolonie o su fondo scuro, con un millimetro, compilare poi una tabella con i risultati segnando con + o con la presenza o lassenza di alone.

Ceppo 1 C 1 alcool denaturato 2 tintura di iodio 3 acqua ossigenata 10 volumi 4 amuchina 5 ammoniaca 6 candeggina

Ceppo 2 C

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U.D. 4.6 ANTIBIOGRAMMA

OBIETTIVO: Stabilire lo spettro di sensibilit di un determinato ceppo microbico a diversi antibiotici. PRINCIPIO: Come nella precedente esperienza (U.D. 4.5), la valutazione della sensibilit del ceppo microbico in esame a diversi antibiotici, si effettua misurando il diametro dellalone di inibizione che si formato intorno a dischetti contenenti quantit prestabilite e controllate di antibiotico (tecnica di Kirby-Bauer). Linterpretazione dei risultati la si ottiene consultando apposite tabelle che permettono di stabilire se il ceppo microbico resistente, intermedio o sensibile ad un determinato antibiotico. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia Coli, Enterobacter aerogenes MATERIALI CHIMICI Standard MacFarland, dischi di antibiotici TERRENI DI COLTURA Trypticase Soy broth, Mueller Hinton agar VETRERIA, ... Piastre sterili, ansa, provette 16x100, tamponi sterili, pinze mettalliche, beker 100 ml, righello STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, Bilancia autoclave termostato bunsen

Standard MacFarland: 0,5 ml di Bario cloruro 0,048M + 99,5 ml di Acido Solforico 0,35 N (0,99 ml/100ml di acido solforico, 0,117 g/10 ml di Bario Cloruro). Tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml). La soluzione stabile per circa 6 mesi. Agitare prima delluso.

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METODICA
(1a FASE)

Preparare il brodo.

Distribuire 4-5 ml di brodo in ogni provetta.

Preparare il terreno Mueller Hinton agar a doppio volume.

Distribuire in provettoni con tappo metallico (40 ml per provettone).

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15.

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METODICA
(2a FASE 1 parte) 1

Piastrare il terreno Mueller Hinton agar in ambiente sterile.

(2a FASE 2 parte)

Con lansa, inoculare un ceppo microbico in ogni provetta contenente il brodo TSB.

Incubare le provette a 37 per 18h.

58

METODICA
(3a FASE 1 parte) 1

Standardizzare linoculo confrontando la torbidit della brodocoltura con quella dello standard MacFarland, (tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml) usare brodo sterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.

(3a FASE 2 parte)

Immergere un tampone sterile nella brodocoltura e seminare sulla superficie del terreno in maniera uniforme, ripetendo loperazione pi volte ruotando la piastra di 60.

Entro 15 applicare sulla piastra seminata i dischi di antibiotici mediante pinze sterili (selezionare gli antibiotici in relazione al tipo di batteri). Disporre i dischi ad una analoga distanza tra loro.

Incubare le piastre a 37 per 16-18 h.

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METODICA
(4a FASE)

Misurare con un centimetro il diametro degli aloni di inibizione sul fondo della piastra posta sopra una superficie luminosa. Interpretare i risultati in base allo schema di lettura.

2
Antibiotico Ampicillina (AM) (enterococchi, enterobatteri) t b tt i) Ampicillina (AM) (stafilicocchi) Amikacina Amoxicillina (Gram-) Amixicillina (Gram+) Acido nalidixico (NA) Eritromicina (E) Fosfomicina (FFL) Gentamicina (GM) Neomicina Rifampicina Penicillina G (P) (Stafilococchi) Penicillina G (P) (Altri microrganismi) Resistente <11 <20 <14 <11 <20 <13 <13 <10 <12 <12 <11 <20 <11

Diametro alone di inibizione Moderat. sensibile 12-13 21-28 15-16 12-13 21-28 14-18 14 18 14-17 11-14 ------13-16 12-18 21-28 12-21 Sensibile >14 >29 >14 >14 >29 >19 >18 >15 >13 >17 >19 >29 >22

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5. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI

U.D. 5.1 UTILIZZAZIONE DELLAMIDO

OBIETTIVO: Verificare la capacit dei microrganismi di utilizzare lamido quale fonte di glucosio per il proprio metabolismo

PRINCIPIO: La capacit dei batteri di idrolizzare lamido, trasformandolo in destrine, maltosio e glucosio, dipende da una propriet genetica dei batteri stessi: quella di produrre lenzima amilasi Utilizzando un terreno di coltura in cui presente amido, possibile rilevarne la presenza, dopo semina e incubazione, con il reattivo di Lugol, che si colora in blu. Non danno invece colorazione blu i prodotti di idrolisi dellamido. Laggiunta del Lugol sulla coltura determiner una colorazione blu se il batterio in esame non possiede lamilasi, giallo-bruna o rossa se il batterio amilasi + MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli e Bacillus subtilis MATERIALI CHIMICI Liquido di Lugol TERRENI DI COLTURA Starch agar (Nutrient agar, Amido solubile) VETRERIA, VETRERIA ... Beuta, treppiede, piastre sterili monouso, ansa, provette, portaprovette STRUMENTI Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen

Liquido di Lugol: ( (soluzione iodo-iodurata) composto da 1 g di Iodio, 2 g di ioduro di potassio e 200 ml ) p , p di acqua. La soluzione deve essere fresca perch con il tempo si decolora e acidifica per alterazione dello iodio.

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METODICA
(1a FASE)

Preparare il terreno: soluzione al 10% di amido solubile in Nutrient agar fuso in ragione di 20ml di soluzione per 100ml di Nutrient agar.

Distribuire in 2 provettoni con tappo metallico (18-20 ml per provettone).

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15.

(2a FASE)

Piastrare in ambiente sterile.

Seminare solo met di 2 piastre, una piastra con Escherichia coli e laltra piastra con Bacillus subtilis.

Incubare a 37 per 48 h.

62

METODICA
(3a FASE)

Aggiungere una goccia di Lugol sulla met piastra seminata e una goccia sulla met non seminata.

Una colorazione chiara denota che lamido stato idrolizzato, mentre la colorazione blu-azzurro rivela ancora presenza di amido. id

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U.D. 5.2 UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI

OBIETTIVO: Saggiare la capacit dei microrganismi di utilizzare carboidrati diversi (Glucosio, Lattosio, Saccarosio) a scopi fermentativi.

PRINCIPIO: I microrganismi metabolizzano diversi carboidrati attraverso processi fermentativi che portano alla produzione di acidi e/o gas. La produzione di acidi si pu rilevare utilizzando un terreno come il Phenol red broth base che contiene un indicatore di pH, il rosso fenolo, che rosso in ambiente alcalino, arancio in ambiente neutro e giallo i ambiente acido. bi i ll in bi id La produzione di gas pu essere rilevata con le campanelle di Durhan. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis MATERIALI CHIMICI Soluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio TERRENI DI COLTURA Phenol red broth base VETRERIA, ... Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provettoni, portaprovettoni, palloncini tarati, siringhe e filtri sterili campanelle di Durham sterili, STRUMENTI Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen

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METODICA
(1a FASE)

1 2 3

Preparare il terreno.

Distribuire in provette con tappo a vite ( ml per provetta; p pp (10 p p ; 3 provette per ogni microrganismo in esame pi una provetta di controllo che non verr inoculata).

Mettere in ogni provetta una campanella di Durhan.

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15.

(2a FASE)

Aggiungere ad ogni provetta 1ml di soluzione di carboidrato, i d i l l i b id utilizzando una siringa munita di filtro sterile (3 provette per i 3 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).

Con lansa inoculare con lo stesso ceppo microbico le 3 provette l ansa, con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in esame.

Incubare a 37. Dopo 4h fare la prima lettura; la seconda dopo 24h.

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(3a FASE)

Osservare il colore del terreno e la presenza di gas allinterno delle campanelle (dopo 4 e 24 ore) e riportare i risultati nella seguente tabella: glucosio microrganismo i i E. coli A. faecalis gas pH saccarosio gas pH gas lattosio pH

Caratteristiche colturali dei due batteri

glucosio microrganismo E. coli A. faecalis gas + pH + -

saccarosio gas pH gas + -

lattosio l tt i pH + -

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U.D. 5.3 OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE

OBIETTIVO: Saggiare la capacit dei microrganismi di metabolizzare i diversi carboidrati (Glucosio, Lattosio, Saccarosio) mediante due processi: la fermentazione e lossidazione aerobia.

PRINCIPIO: I processi per metabolizzare i carboidrati sono due: la fermentazione, che avviene in condizioni di anaerobiosi, e lossidazione aerobia. I microrganismi che fermentano, producono una reazione acida (colorazione gialla) in entrambe le condizioni, quelli che ossidano producono una reazione acida solo in condizione di aerobiosi. I microrganismi non fermentanti e non ossidanti danno reazione alcalina (colorazione blu) in aerobiosi e nessuna modificazione di pH in anaerobiosi anaerobiosi. Il terreno contiene blu di bromotimolo come indicatore di pH; con la degradazione del carboidrato si ha una variazione del pH verso lacidit e il conseguente viraggio del terreno da verde a giallo.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli e Alcaligenes faecalis MATERIALI CHIMICI Soluzioni al 10% di glucosio, lattosio, saccarosio olio di vasellina o paraffina TERRENI DI COLTURA O/F agar VETRERIA, ... Bunsen, beuta, treppiede, ago per infissione, provette, portaprovette, palloncini tarati, siringhe e filtri sterili STRUMENTI Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen

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METODICA
(1a FASE)

Preparare il terreno.

Distribuire in provette con tappo a vite (5 ml per provetta; 6 provette per ogni microrganismo in esame:2 per il glucosio, 2 per il saccarosio e 2 per il lattosio). i l i )

Preparare una beuta con della paraffina o dellolio di vasellina.

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15 sia il terreno che la paraffina.

(2a FASE)

Aggiungere ad ogni provetta 0,5ml di soluzione di carboidrato, utilizzando una siringa munita di filtro sterile (2 provette per i 3 carboidrati diversi per ogni microrganismo in esame).

Seminare per infissione con lo stesso ceppo microbico le 2 provette con i 3 carboidrati diversi. Ripetere per ogni batterio in esame.

Coprire il terreno (una sola provetta per ogni zucchero) con 2 ml di paraffina liquida, infine tappare.

Incubare a 32-35 per 48h esaminando le provette ogni giorno.

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(3a FASE)

Osservare l colorazione in ciascuna coppia di provette e riportare i dati in tabella. O la l i i i i i d i i b ll

glucosio microrganismo E. E coli A. faecalis aperta chiusa

saccarosio aperta chiusa

lattosio aperta chiusa

Ca atte st c e co tu a de Caratteristiche colturali dei due batteri batte

glucosio microrganismo E. coli A. faecalis aperta AG chiusa AG -

saccarosio aperta chiusa -

lattosio aperta AG chiusa AG -

A = reazione acida AG = reazione acida e produzione di gas - = nessuna reazione o reazione alcalina

La produzione di gas si evidenzia con il distacco dal terreno e lo spostamento verso lalto della paraffina.
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U.D. 5.4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI

OBIETTIVO: Saggiare la capacit dei microrganismi di degradare un amminoacido il triptofano, dalla cui demolizione si ottiene indolo e altri composti.

PRINCIPIO: Il test dellindolo serve a caratterizzare alcuni microrganismi appartenenti agli Enterobatteri, la cui presenza in un campione pu o meno indicare contaminazione fecale. Lindolo un composto contenente azoto che si forma dalla degradazione del triptofano da parte di certi batteri. La degradazione ad i d l svelabile con il reattivo di K L d d i d indolo l bil i Kovacs cha d l h luogo ad un composto d colorato di rosso. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli e Enterobacter aerogenes MATERIALI CHIMICI Reattivo di Kovacs TERRENI DI COLTURA Acqua triptonata o peptonata VETRERIA, ... Bunsen, beuta, treppiede, ansa, provette, portaprovette STRUMENTI Bilancia tecnica, autoclave, termostato, bunsen

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METODICA
(1a FASE)

Preparare lacqua triptonata.

Distribuire in 2 provette con tappo a vite (5 ml per provetta).

Sterilizzare in autoclave a 121C per 15.

(2a FASE)

Con lansa, inoculare un ceppo microbico per ogni provetta.

Incubare a 32-35 per 24-48h.

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(3a FASE)

1 2

Aggiungere a ciascuna provetta alcune gocce del reattivo di Kovacs e agitare delicatamente. Dopo alcuni minuti la formazione di una colorazione rossa sulla superficie del terreno costituisce una prova positiva.

Riportare i dati ottenuti nella tabella.

microrganismo E. coli l E. aerogenes Caratteristiche culturali dei due batteri.

Indolo

microrganismo E. coli E. aerogenes + = reazione positiva - = nessuna reazione

Indolo + -

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U.D. 5.5 ENTEROTUBE

OBIETTIVO: Lenterotube un sistema pronto allimpiego per lidentificazione rapida delle Enterobacteriacae che consente lesame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimiche dei batteri.

PRINCIPIO: Gli enterobatteri vengono identificati in base alla valutazione dei risultati di diverse prove biochimiche: fermentazione del destrosio e produzione di gas in decarbossilazione della lisina anaerobiosi decarbossilazione dellornitina fermentazione del triptofano e produzione di H2S fermentazione delladonitolo fermentazione del lattosio fermentazione dellarabinosio dell arabinosio in fermentazione del sorbitolo aerobiosi fermentazione del glucosio (Voges-Proskauer) fermentazione del dulcitolo e della fenilalanina idrolisi dellurea utilizzazione del citrato MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli, Proteus, Enterobacter aerogenes, ... MATERIALI CHIMICI Rreattivo di Kovacs, -naftolo (6% in alcool etilico), idrato di potassio (40g in 60ml di acqua) TERRENI DI COLTURA Kit enterotube VETRERIA, ... Portaprovette, siringhe sterili STRUMENTI Termostato, bunsen

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METODICA
(1a FASE)

Accanto alla fiamma del bunsen svitare i cappucci dellenterotube e con la punta dellago prelevare una colonia isolata.

2
Inoculare lenterotube ruotando ed estraendo lago attraverso tutti gli scomparti del tubo. tubo

Reinserire lago fino alla tacca e poi spezzarlo piegandolo. La parte di ago che rimane allinterno assicura lanaerobiosi l anaerobiosi.

Con lo spezzone dellago perforare la pellicola di plastica in corrispondenza dei fori degli ultimi 8 scomparti al fine di creare un ambiente aerobio. Riavvitare i tappi.

Incubare a 35-37C per 20-24 h possibilmente in posizione verticale su un portaprovette con lo scomparto del destrosio rivolto verso lalto.

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(2a FASE)

Registrare le reazioni (+ o -)

e riportarle nella tabella: fenilala anina arabino osio adonit tolo destro osio sorbito olo dulcito olo

orniti ina

Voges s-P

lattos sio

indol lo

reazione

Eseguire il test dellindolo iniettando con una siringa 4 gocce di reattivo di Kovacs direttamente sotto la pellicola di plastica dello scomparto H2S/indolo (il reattivo vira al rosso se la prova positiva).

Eseguire il test di Voges-Proskauer iniettando con una siringa 3 gocce di soluzione di -naftolo e 2 di KOH direttamente sotto la pellicola di plastica dello scomparto VP (il reattivo vira al rosso entro 10 minuti se la prova positiva).

Registrare gli ultimi due dati.

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citrat to

lisin na

urea a

H2S

gas

(3a FASE)

Per identificare il batterio in esame confrontare i dati ottenuti con la tabella per ldentificazione biochimica degli enterobatteri.

In alternativa, utilizzare i foglietti di identificazione allegati alla confezione di Enterotube, contrassegnando per ogni reazione positiva i numeri corrispondenti. Per esempio:

Sommare i numeri contrassegnati, come indicato sopra. Il numero a 5 cifre ottenuto (ID value), consente la rapida identificazione del batterio in esame utilizzando il sistema di identificazione con codifica computerizzata.

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6. INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO
U.D. 6.1 PROTEINA C REATTIVA (Test di agglutinazione indiretta)

OBIETTIVO: Verificare la presenza di infezioni in atto sul soggetto in esame.

PRINCIPIO: La proteina C reattiva compare nel siero umano in risposta ad una grande variet di processi infiammatori determinati da infezioni batteriche, nel reumatismo acuto, nellinfarto miocardico, nelle neoplasie maligne. La proteina C ha un forte potere antigene e produce negli animali da laboratorio un anticorpo specifico chiamato reactive protein antiserum CRPA. La ricerca della PCR si esegue utilizzando lantisiero CRPA.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Siero, sieri positivo e negativo per PCR MATERIALI CHIMICI Kit PCR VETRERIA, ... Vetrini per agglutinazione a fondo nero

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METODICA

Il siero in esame deve essere limpido intero e diluito 1/20 (1 parte di siero e 19 parti di soluzione tampone pH 8,2). I sieri di controllo positivo e negativo sono prediluiti 1:20 e quindi pronti alluso. Agitare prima delluso.

Agitare delicatamente prima delluso il reattivo al Latex con la proteina C reattiva.

Su S un apposito vetrino a f d nero, di i i tre settori, si procede come segue: i i fondo diviso in i i d I settore 1 goccia di siero in esame + 1 goccia di Latex test PCR II settore 1 goccia di siero positivo + 1 goccia di Latex test PCR III settore 1 goccia di siero negativo + 1 goccia di Latex test PCR

Miscelare con lapposita bacchetta e quindi roteare delicatamente il vetrino per 1 circa.

Il test positivo con la comparsa di agglutinazione visibile ad occhio nudo trascorsi da 1 a 3 minuti. Agglutinazioni posteriori non sono da considerare.

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U.D. 6.2 TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO (Test di neutralizzazione)

OBIETTIVO: Determinare la presenza o meno nel siero in esame di anticorpi anti O-streptolisinici e valutarne il titolo.

PRINCIPIO: La O-streptolisina una emolisina prodotta da Streptococcus pyogenes beta emolitico. La Ostreptolisina provoca sulla membrana delle emazie dei fori dai quali fuoriesce lemoglobina. Gli anticorpi che si fissano alla tossina, (reazione di neutralizzazione) impediscono levento. Come sistema rivelatore della presenza o meno di anticorpi nel siero si usano le emazie. Se i globuli rossi pi il siero in esame vengono lisati dallaggiunta di O streptolisina non si verificata una esame, O-streptolisina reazione di neutralizzazione, dunque nel siero non sono presenti anticorpi anti O-streptolisinici. Viceversa lassenza di lisi segnala la presenza di anticorpi capaci di legare e neutralizzare la tossina.

MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI O-streptolisina titolata, globuli rossi di coniglio al 5% MATERIALI CHIMICI Soluzione tampone a pH 6,5 , VETRERIA, ... Pipette in vetro o pipette automatiche, puntali, provette da sierologia, portaprovette STRUMENTI Centrifuga, bagnomaria

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METODICA
(1a FASE)

Diluire il siero

1/10 = 0,2 ml di siero + 1,8 ml di soluzione tampone 1/100 = 0,5 ml siero 1/10 + 4,5 ml 1/500 = 1 ml siero 1/100 + 4 ml

1
Lavare la sospensione di globuli rossi almeno 3 volte con il tampone, centrifugando ogni volta a 1500-2000 rpm per 5. Dopo il lavaggio finale preparare la sospensione al 5% in tampone.

3
provetta

Disporre 14 provette come da schema:

1:10 1 0,8 0,2 0,5 2 0,2 0,8 0,5 3 1 0,5 4 0,8 0,2 0,5 1:100 5 0,6 0,4 0,5 6 0,4 0,6 0,5 7 0,3 0,7 0,5 8 1 0,5 9 0,8 0,2 0,5 1:500 10 0,6 0,4 0,5 11 0,4 0,6 0,5 12 0,2 0,8 0,5 Controlli 13 1,5 14 1 0,5

siero diluito tampone reagente o-streptolisina

Agitare ed incubare a 37 per 15

emazie al 5%
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Agitare e incubare a 37 per 45, ripetere lagitazione dopo 15. Centrifugare le provette per 1-2 a 1000-1500rpm Il titolo del siero in esame espresso dalla pi alta diluizione che capace di inibire lemolisi. Lemolisi nelle provette caratterizzata dal colore rosso della soluzione in esame. Le unit anti-o-streptolisiniche sono espresse come il reciproco del titolo di anticorpi come nello schema:
provetta 1 2 3 4 5 6 7 1/12 1/50 1/100 1/125 1/166 1/250 1/333 diluizione 8 9 10 11 12 13 14 provetta 1/500 1/625 1/833 1/1250 1/2500 non vi deve essere emolisi vi deve essere emolisi completa diluizione

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APPENDICE TERRENI DI COLTURA

AGAR BIOS SPECIAL LL Agar Bios Special LL l'agente solidificante d'elezione per i terreni dl coltura per microbiologia. Grazie al suo elevato grado di purezza fornisce soluzioni acquose limpide alle concentrazioni d'uso nei terreni di coltura (1.5%). AZIDE DEXTROSE BROTH Formula ( F l (grammi per lit ) i litro) Peptocomplex Beef Extract Glucose Sodium Chloride Sodium Azide Preparazione Sciogliere 34.7 g di polvere in 100 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire in tubi da 10 ml ed autoclavare a 121C per 15 minuti. Per inoculi superiori a 1 ml per 10 ml di terreno, preparare il terreno a concentrazione doppia o multipla. pH finale 7.20.2. Impiego Azide Dextrose B th un t A id D t Broth terreno selettivo per l l tti la determinazione presuntiva degli streptococchi fecali nelle acque e negli alimenti: la composizione conforme a quanto stabilito da OMS e APHA. Eseguire il conteggio in tubi, secondo il metodo del numero pi probabile; variare l'entit dell'inoculum (multipli o frazioni di 1 ml) in funzione del tipo di campione, allestendo almeno cinque tubi per ogni diluizione. Usare come liquido per diluizione tampone di fosfati oppure una soluzione acquosa di peptone allo 0 5% ( / ) I b l i ll 0.5% (p/v). Incubare a 35C per 24 ore, osservare se vi sviluppo; in caso negativo protrarre l'incubazione per altre 24 ore. Calcolare il risultato servendosi delle apposite tabelle ed esprimerlo come numero pi probabile presuntivo. Confermare il risultato presuntivo trapiantando in Ethyl Violet Azide Broth AZIDE MALTOSE AGAR (KF) Formula (grammi per litro) Peptocomplex Yeast Extract Sodium Chloride Sodium Glycerophosphate Maltose Lactose Agar Bios LL Sodium Azide Brom Cresol Purple 10 10 5 10 20 1 15 400 mg 15 15.0 4.5 7.5 7.5 0.2

Preparazione Sciogliere 71.4 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda, portare all'ebollizione sotto agitazione bollire per cinque minuti, raffreddare in bagnomaria a 50C ed aggiungere, con le cautele dell'asepsi, 10 ml di una soluzione acquosa di 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC) all'1% sterilizzata per filtrazione; il terreno cos preparato pu essere conservato a 50C per circa tre ore prima di essere versato nelle piastre. Le piastre preparate possono essere conservate per circa 15 giorni i f i if i 5 i i in frigorifero al b i l buio. Il terreno non aggiunto di TTC pu essere sterilizzato in autoclave a 121C per 10 minuti e quindi conservato in frigorifero: una volta scelto un modo di preparazione attenervisi sempre. pH finale 7.20.2. Impiego Azide Maltose Agar, preparato secondo la formula di Kenner, Clark e Kabler, un terreno selettivo utilizzato per l'isolamento ed il conteggio degli streptococchi fecali. APHA e FDA raccomandano il terreno nell'isolamento primario degli enterococchi (nel senso lato del termine) nelle acque e negli alimenti con la tecnica della membrana filtrante o con il conteggio in piastra (agar-germi). Su Azide Maltose Agar coltivano con colonie da rosse a rosa per la riduzione del TTC tutti gli streptococchi fecali considerati tali da Hartman: enterocchi di gruppo D (S. faecalis, S f f li S. faecalis subsp. li f i li b liquefaciens, S f S. faecalis subsp. li b zymogenes, S. faecium), i non enterococchi di gruppo D (S. bovis, S. equinus) ed inoltre S. mitis e S. salivarius. Dopo 48 ore a 35C si registra sul terreno una crescita scarsa con colonie incolori, di Lactobacillus plantarum e di Pediococcus cerevisiae; completamente inibiti sono gli streptococchi non di gruppo D (S. cremoris, S. lactis, S. pyogenes, S. termophilus) altri batteri acido lattici (Leuconostoc mesenteroides, L. lactis, L. acidophilus) ed i coliformi. APHA nell'esame degli alimenti suggerisce di inoculare 1 ml delle diluizioni decimali del campione con la tecnica dell'agar germi e di incubare le piastre a 35C per 48 ore. Per il test di conferma trapiantare 5-10 colonie tipiche in Brain Heart Infusion Broth e incubare a 35C per 18-24 ore; usare queste brodocolture per una colorazione Gram, un test della catalasi, un trapianto in Aesculin Bile Broth, una semina in Brain Heart Infusion Broth normale (incubazione a 45C) e addizionato di NaCI 6.5%. La g p p diagnosi presuntiva di streptococco fecale data da: catalasi negativa, sviluppo in brodo bile dopo 72 ore a 35C, crescita a 45C e in presenza a di NaCI. Tra gli streptococchi fecali considerati da APHA solo S. equinus, S. bovis non coltivano in presenza di NaCI 6.5%.

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BRILLIANT GREEN BILE BROTH 2% Formula (grammi per litro) Ox Bile Bios Lactose Peptomeat Brilliant Green Preparazione Sciogliere 40 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda, riscaldare fino a soluzione, distribuire e autoclavare a 121C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo e nella temperatura di sterilizzazione Per un terreno sterilizzazione. 2X sciogliere 80 g di terreno in 1000 ml di acqua. pH finale 7.20.2. Impiego Brilliant Green Bile Broth 2% un terreno selettivo raccomandato per la determinazione e la conferma dei q q p coliformi nelle acque, nei liquami, nei prodotti lattierocaseari, negli alimenti. La presenza del verde brillante sopprime la crescita dei batteri anaerobi lattosio-fermentanti (C/ostridium perfringens) non ottenendosi falsi positivi con incubazione a 44C; il verde brillante ed i sali biliari inibiscono la crescita dei microrganismi Gram positivi. Nella rassegna dei metodi per la determinazione dei coliformi negli alimenti ICMSF suggerisce l'uso del Brilliant Green Bile Broth 2% per la determinazione, con il metodo del numero pi probabile, dei coliformi totali con incubazione a 35-37C per 24 e 48 ore, seguito dal test di conferma su piastre di Violet Red Bile Agar o di E d A Vi l R d Bil A Endo Agar i b a 35 37C per incubate 35-37C 48 ore; questo metodo soprattutto utilizzato nei laboratori europei. ICMSF in conformit ad APHA ed a FDA consiglia l'uso del Brilliant Green Bile Broth 2% nel test di conferma dei coliformi: trasferire un'ansata di crescita microbica dai tubi positivi di Lauryl Pepto Bios Broth o di Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 35C per 24 e 48 ore. La formazione di gas entro le 48 ore conferma la presenza dei coliformi nei tubi del test presuntivo in Lauryl Pepto Bios Broth. Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSF descrive l'uso del terreno al verde brillante nella determinazione dei coliformi fecali: trasferire un'ansata di crescita dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provette di Brilliant Green Bile Broth 2% e di Peptone Water ed incubare a 440.1C; osservare lo sviluppo di gas nelle provette di Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 e 48 ore di incubazione ed eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24 ore in Peptone Water; le colture che producono gas e sono p g indolo positive sono da considerarsi coliformi di origine fecale. Anche OMS raccomanda per le acque potabili l'uso del Brilliant Green Bile Broth 2% per il test di conferma dei coliformi con incubazioni differenziate a 37C ed a 44C per rispettivamente 48 e 6-4 ore per la distinzione tra coliformi e coliformi fecali; il test di conferma segue la semina preliminare in Lactose Broth o in Mac Conkey Broth e precede il test di verifica finale in terreno solido (Endo Agar o Levine EMB Blue Agar o Mac Conkey Agar OMS). 20.0000 10.0000 10.0000 0.013

ENDO BROTH MEMBRAN FILTER Formula (grammi per litro) Peptone Bios D Peptomeat Biotone Yeast Extract Lactose Sodium Chloride Dipotassium Phosphate Monopotassium Phosphate Sodium Sulphite di l hi Sodium Desoxycholate Sodium Lauryl Sulphate Basic Fuchsin Preparazione Sciogliere 48 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda contenente 20 ml di etanolo, mescolare e portare all'ebollizione. N ll' b lli i Non autoclavare. Il terreno d l deve essere usato il giorno stesso della sua preparazione; se necessario conservare al buio a 4C per non pi di 96 ore. pH finale 7.20.2. Impiego Endo Broth Membran Filter un terreno selettivo per il conteggio dei coliformi nell'acqua e nel latte con la tecnica della membrana filtrante. Per l'esecuzione del metodo si consiglia di seguire le indicazioni dell'APHA. I coliformi coltivano con viraggio del terreno verso il color porpora con o senza riflessi metallici in superficie. Il volume di campione da filtrare deve essere scelto in base al numero di cellule batteriche che si attende di trovare. La quantit ideale quella che fornisce una crescita microbica compresa tra 50 e 200 colonie. Ad eccezione delle acque potabili e delle acque delle piscine che devono essere filtrati in duplicato ad un unico volume di 100 o 500 ml, tutti gli altri campioni di acqua devono essere filtrati a tre diversi livelli volumetrici, diluiti o non diluiti, (Si veda la tabella sottostante). Volumi da filtrare per il conteggio dei coliformi nelle acque: 5.000 5.000 10.000 1.500 12.500 5.000 4.375 1.375 2.100 0.100 0.050 1.050

Per le acque potabili l'arricchimento preliminare del campione d risultati eccellenti, anche se esso non indispensabile per l'esame di routine dei campioni.

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EOSINE METHYLENE BLUE AGAR Formula (grammi per litro) Peptone Bios D Sodium Chloride Lactose 5.00 Sucrose Dipotassium Phosphate Methylene Blue Eosin Yellow Agar Bios LL Preparazione P i Sciogliere 42.5 g di polvere in 1000 mi di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire e sterilizzare a 121C per 15 minuti. Raffreddare il terreno a circa 50C e, prima di trasferirlo in piastra, agitare delicatamente per disperdere il materiale flocculante che si forma durante la sterilizzazione. pH finale 7.20.2. 10.00 5.00 5.00 20.0 0.065 0.40 15.00

ETHYL VIOLET AZIDE BROTH Formula (grammi per litro) Biotone Sodium Chloride Glucose Dipotassium Phosphate Monopotassiurn Phosphate Sodium Azide Ethyl Violet Preparazione P i Sciogliere 35.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completo scioglimento del terreno, distribuire in provette ed autoclavare , a 121C per 15 minuti. Si raccomanda di non eccedere nel tempo di sterilizzazione. pH finale 7.00.2. Impiego 20.0 5.0 5.0 2.7 2.7 0.4 0.83 mg

Impiego Eosine Methylene Blue Agar un terreno differenziale preparato secondo una modificazione del terreno originale di Halt-Harris e Teague, da usarsi in piastra per l'isolamento degli enterobatteri e per la differenziazione dei microrganismi lattosio-Saccarosio fermentanti. I batteri Gram-positivi sono notevolmente inibiti. La combinazione d ll' i e d l bl di metilene nel terreno, bi i dell'eosina del blu il l contenente lattosio e saccarosio, permette di distinguere i membri dei generi Escherichia e Enterobacter dagli altri enterobatteri. I batteri lattosio-saccarosio fermentanti sull'EMB Agar formano colonie mucoidali e convesse con una colorazione da rosso a porpora con assenza o presenza di riflessi metallici. Salmonella, Shigella e gli altri batteri lattosio-saccarosio non fermentanti formano colonie da incolori a rosa. La presenza del tampone fosfato nel terreno permette di distinguere E. coli da E. aerogenes; E. coli anche in presenza di un sistema tampone, produce una notevole acidificazione del terreno, mentre E. aerogenes, avendo modeste propriet fermentanti, provoca una minore acidificazione del terreno. L'abbassamento del p H durante la crescita di E. coli induce la formazione di legami amidici tra l'eosina e il blu di metilene che si traduce in una colorazione porpora metallica delle colonie. Per l'isolamento degli enterobatteri patogeni si consiglia di utilizzare, parallelamente all'EMB Agar, terreni pi selettivi quali l'XLD, il Brilliant Green Agar, ecc. Nella tabella sottostante sono riportate le caratteristiche colturali di alcuni microrganismi su EMB Agar:

Ethyl Violet Azide Broth un terreno selettivo per la determinazione degli enterococchi nelle acque, come indice di un inquinamento fecale delle stesse. Il terreno preparato secondo una modificazione della formula originale proposta da Litsky ed in accordo con le specificazioni dell'APHA riguardo all'uso delle tecniche per la determinazione degli streptococchi fecali nelle acque. L'uso dell'azide sodica, associata al violetto di etile, rende il terreno selettivo per gli enterococchi essendo inibiti tutti gli altri microrganismi Gram-positivi ed i microrganismi Gram-negativi. Gli enterococchi che si devono considerare come indicatori di inquinamento fecale sono: Streptococcus faecalis subsp. liquefaciens, Streptococcus faecalis subsp. zymogenes, Streptococcus faecium, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus. Le caratteristiche di crescita di questi microrganismi, resistenza alle alte temperature, ai detergenti, ai disinfettanti, fanno si che l'indice di inquinamento da loro espresso debba essere integrato dalla ricerca di altri indicatori faecali (coliformi). APHA consiglia di utilizzare l'Ethyl Violet Azide Broth per il test di conferma degli enterococchi coltivati nei tubi di Azide Broth. Dopo 24-48 ore di incubazione delle provette di Azide Broth si trasferiscono tre ansate di crescita i bi in bi i l Ethyl Violet Azide microbica i tubi contenenti 10 ml di E h l Vi l A id Broth e si incuba per 24 ore a 35C. La presenza di enterococchi rivelata dall'intorbidimento del brodo e dalla formazione di un anello porporino attorno al menisco del liquido.

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FAECAL COLIFORM BROTH Formula (grammi per litro) Biotone Peptocomplex Yeast Extract Sodium Chloride Lactose Bile Salts Bios Aniline Blue Preparazione Sciogliere 37 g di polvere i 1000 ml di acqua di ill S i li l in l distillata fredda; addizionare 10 ml di una soluzione al1'1 %, in NaOH 0.2 N, di acido rosolico. Portare all'ebollizione sotto agitazione, raffreddare e saturare dei tamponi assorbenti sterili con 2 ml di terreno in piastre Petri. p H finale 7.40.1. Impiego ,p p Faecal Coliform Broth, preparato in in accordo alla formula proposta da APHA, utilizzato per il conteggio dei coliformi fecali nell'acqua con il metodo delle membrane filtranti. Per l'esecuzione del test filtrare un volume opportuno di campione d'acqua (si veda la tabella sottostante) e depositare i filtri sui tamponi impregnati di Faecal Coliform Broth in piastre Petri. Entro 30 minuti deporre in bagnomaria termostatato a 44-45C e incubare in contenitori a tenuta per 24 ore. I coliformi fecali coltivano con colonie blu, le rare colonie date dai coliformi non fecali appaiono di colore g g grigio-crema. Per il conteggio delle colonie si consiglia di gg g utilizzare un microscopio a basso potere d'ingrandimento (1015 ingrandimenti). Volumi da filtrare per il conteggio del coliformi fecali nelle acque: 10.0 5.0 3.0 5.0 12.5 1.5 0.1

Preparazione Sciogliere 13 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire in tubi Durham ed autoclavare a 121C per 15 minuti. Se necessario, usare il terreno a doppia o tripla concentrazione. concentrazione pH finale 6.80.2. Impiego Lactose Broth consigliato da APHA per la determinazione presuntiva dei coliformi con il metodo del numero pi probabile, nelle acque e nei liquami, per eseguire il test finale di conferma dei coliformi nei prodotti lattiero caseari dopo la semina in Endo Agar o in Levine g g p EMB Blue Agar ed consigliato da FDA e ICMSF per l'arricchimento non selettivo di SaJmonella. Il terreno contiene lattosio, estratto di carne e peptone in quantit tali da permettere una crescita ottimale dei microrganismi non particolarmente esigenti quali sono i coliformi. Per la determinazione presuntiva dei coliformi nelle acque APHA suggerisce la seguente tecnica: inoculare una serie di tubi da fermentazione con volumi i ti i in d da lt t appropriati di campione i modo d non alterare il rapporto tra volume finale di terreno inoculato e ingredienti per litro; ogni variazione rispetto allo schema di lavoro consigliato e riportato nella tabella sottostante, pu alterare le caratteristiche biologiche del terreno

Incubare i tubi da fermentazione a 35C ed eseguire una p prima lettura agitando leggermente le provette dopo 24 ore; g gg p p ; se non si osserva produzione di gas incubare per ulteriori 24 ore. La formazione di gas entro le 48 ore indice di positivit per i coliformi. Il limite arbitrario di 48 ore pu escludere la possibilit di coltivare occasionali coliformi che fermentano lentamente il lattosio, i quali comunque hanno scarso interesse sanitario e non inficiano la validit del metodo. GELATIN BIOS Gelatin Bios, costituita da materiale proteico, utilizzata come agente solidificante nei terreni di coltura per la microbiologia e per saggiare l'attivit gelatinolitica dei batteri. Gelatin Bios, priva di carboidrati a fermentabili e di conservanti, realmente solubile in acqua e fornisce soluzioni limpide e prive di colore. LACTOSE BROTH Formula (grammi per litro) Beef Extract Peptocomplex Lactose 3 5 5 84 Co e a e Confermare il test presuntivo con semine dai tubi positivi p esu t vo co se e da tub pos t v di Lactose Broth in tubi di Brilliant Green Bile Broth 2% e ricercare, se necessario, i coliformi fecali con semine in EC Medium. La presenza di coliformi nelle acque considerata indice di inquinamento fecale; il loro ritrovamento in prodotti lattiero caseari indice di cicli produttivi non rigorosamente controllati da un punto di vista sanitario e/o di modalit di conservazione non idonee.

M17 AGAR Formula (grammi per litro) Tryptone Meat Peptone Soya Peptone Yeast Extract Meat Extract Sodium Glycerophosphate Magnesium Sulphate Ascorbic Acid Lactose Agar Bios LL Preparazione Sciogliere 57 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire beuta ed autoclavare a 121C per 15 minuti. Non eccedere nella temperatura di ebollizione. Lacidit del terreno pu L acidit idrolizzare parzialmente lagar. pH finale 6.80.2. Impiego Il terreno M17 selettivo Sterptococcus thermophilus. MRS AGAR Formula (grammi per litro) Peptomeat Beef Extract Yeast Extract Glucose Dipotassium Phosphate 6odium Acetate Triammonium Citrate Magnesium Sulphate Manganous Sulphate Agar Bios LL MRS BROTH Formula (grammi per litro) Peptomeat Beef Extract Yeast Extract Glucose Dipotassium Phosphate 6odium Acetate Triammonium Citrate Magnesium Sulphate Manganous Sulphate 10.00 10.00 5.00 20.00 2.00 2 00 5.00 2.00 0.20 0.05 85 10.00 10.00 5.00 20.00 2.00 5.00 2.00 0.20 0.05 15.00 per lidentificazione di 2.50 2.50 5.00 2.50 5.00 19.00 0.25 0.50 5.00 00 15.00

Preparazione Sciogliere 69.2 g di agar e 54.2 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, aggiungere 1 ml di polisorbato 80 (Tween), distribuire ed autoclavare a 121C per 15 minuti. pH finale 6.4O.2. Impiego MRS Agar e Broth, preparati secondo la formula di De Man, Rogosa e Sharpe, sono terreni selettivi indicati per l'isolamento dei lattobacilli. Sui due terreni coltivano lattobacilli provenienti da qualsiasi materiale: latte, prodotti lattiero caseari, cavo orale, feci, ed inoltre i lattobacilli normalmente difficili da coltivare su altri t lti lt i terreni (L t b ill i (Lactobacillus b i brevis, Lactobacillus fermentum). De Man e coll. riportano una migliore rispondenza dell'MRS Agar rispetto ai terreni contenenti estratto di pomodoro di Briggs e di Cox Briggs e al terreno all'estratto di carne di De Man, nell'isolamento dei lattobacilli. Il Tween 80, il sodio acetato e il triammonio citrato intensificano la crescita dei lattobacilli; il magnesio solfato inserito per motivi precauzionali poich lo Yeast Extract dovrebbe f i una quantit di magnesio sufficiente alla d bb fornire i i ffi i ll crescita dei lattobacilli. Per l'isolamento dei lattobacilli operare come segue: inserire 1 mi delle diluizioni decimali del campione in piastre Petri e addizionare 10-15 ml di terreno, lasciar solidificare e addizionare un secondo strato di MRS Agar non inoculato e incubare a 37C per 3 giorni o a 30C per 5 giorni. Le colonie coltivate su MRS Agar o la crescita in MRS Broth devono essere sottoposte ai tests biochimici per l'identificazione dei lattobacilli in MRS Aesculin Broth, MRS Arginine Broth ed in MRS Fermentation B th F t ti Broth. MUELLER HINTON MEDIUM Formula (grammi per litro) Beef, Infusion from Hydrolyzed Casein Bios A Starch Agar Bios LL MUELLER HINTON BROTH Formula (grammi per litro) Biomeat Hy Casein Bios A Starch Preparazione Sciogliere 36 g di agar e 21 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione l'agar e scaldare fino a completa soluzione il brodo, distribuire ed autoclavare a 115C per 10 minuti. Non superare il tempo e la temperatura di sterilizzazione indicati. pH finale 7.40.2. 2.0 17.5 1.5 300.0 17.5 1.5 15 14.0

Impiego Mueller Hinton Medium e Broth sono terreni originariamente preparati per l'isolamento dei meningococchi e dei gonococchi e trovati indicati, dato i bassi livelli di acido paminobenzoico per il test di sensibilit ai sulfamidici. Mueller Hinton Medium raccomandato da FDA per il test di sensibilit agli antibiotici chemioterapici con il metodo dell'agar diffusione utilizzando dischi di carta da 6 mm ad alta concentrazione. Mueller Hinton Medium preparato con peptoni rigorosamente selezionati, contenenti bassi livelli di agenti inibitori dei sulfamidici e del co-trimossazolo, tanto che possibile effettuare l'antibiogramma senza ricorrere all'utilizzo del sangue lisato di cavallo per neutralizzare l azione l'azione della timidina antagonista del trimetoprim nell'associazione trimetoprim-sulfametossazolo. Il contenuto di cationi bivalenti (Ca++, Mg++) del terreno entro l'intervallo di valori suggerito da Reller e coll. (Ca++: 50-100 mg/l; Mg++: 20-35 mg/l), cosicch gli aloni di inibizione da aminoglucosidi su Pseudomonas aeruginosa risultano entro il range raccomandato da ASM e riportati in tabella. Nell'esecuzione dell'antibiogramma secondo il metodo di Bauer e coll. e raccomandato da FDA utilizzare il Mueller p Hinton Medium in piastre da 14 cm o da 10 cm, in strato di 4 mm (60 ml di terreno per piastre 140 mm 25 ml per piastre 100 mm); addizionare sangue defibrinato di montone o di cavallo al 4-5% per eseguire l'antibiogramma su specie batteriche particolarmente esigenti (streptococchi, pneumococchi) e utilizzare l'agar cioccolato con gli emofili. Per preparare l'inoculo sospendere 4-5 colonie coltivate su terreno primario d'isolamento in 4-5 ml di Tryptic Soy Broth e incubare per 2-6 ore fino a che la brodocoltura raggiunga la stessa densit dello standard opacimetrico preparato aggiungendo a 99 5 ml di acido solforico 0 36 N 0 5 ml di 99.5 0.36 N, 0.5 bario cloruro 1 %. Entro 15 minuti dalla preparazione dell'inoculo immergere un tampone sterile nella brodocoltura, spremerlo contro le pareti della provetta per eliminare l'eccesso di liquido quindi strisciare sulla superficie dell'agar in piastra in modo da ottenere una dispersione uniforme dell'inoculo. Lasciare asciugare le piastre quindi depositare i dischi di carta premendoli sulla superficie dell'agar con la punta dell'ago; depositare un massimo di 5 dischi nelle piastre 100 mm e un massimo di 9 dischi nelle piastre 140 mm in modo tale che tra i dischi e il bordo della piastra vi siano non meno di 2 cm. Incubare 18 ore a 35C quindi leggere gli aloni di inibizione tenendo conto della zona completamente priva di crescita microbica e con bordi netti. Essendo numerose le variabili del metodo dell'agar diffusione che giocano un ruolo fondamentale per l'ottenimento di risultati precisi ed accurati (inoculo, strato dell'agar, temperatura di incubazione, contenuto dei dischi, etc.), indispensabile stabilire un programma per il controllo di qualit del metodo. Per tale scopo si utilizzano d i tili due ceppi: St h l i Staphylococcus aureus, Escherichia coli; questi ceppi devono essere inseriti di routine nella procedura operativa, ogni volta che si esegue l'antibiogramma. NUTRIENT AGAR Formula (grammi per litro) Beef Extract Peptomeat Agar Bios LL 3 5 15

NUTRIENT BROTH Formula (grammi per litro) Beef Extract Peptomeat Preparazione Sciogliere 23 g di agar e 8 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, distribuire ed autoclavare a 121C per 15 minuti. pH finale 6.80.2. Impiego Nutrient Agar e Nutrient Broth sono terreni a base di peptoni di carne utilizzati per la coltivazione dei microrganismi non particolarmente esigenti sotto il profilo delle richieste nutritive. Il Beef Extract e il Peptomeat forniscono una quantit di carbonio, azoto e vitamine sufficienti per la crescita della maggior parte dei microrganismi non esigenti (enterobatteri, stafilococchi). L'APHA raccomanda l'uso di Nutrient Agar nell'esame microbiologico delle acque e dei prodotti lattiero caseari. I terreni possono essere i i ti come b t i impiegati base a cui i aggiungere vari materiali quali carboidrati, sali, coloranti ecc., per ottenere terreni selettivi, differenziali, d'arricchimento. Il Nutrient Agar e il Nutrient Broth, sono stati tra i primi terreni utilizzati in microbiologia e tuttora possono essere usati di routine per l'esame a delle acque, degli alimenti, per preparare colture stock, per la coltivazione preliminare di un campione da sottoporre a successivi esami batteriologici, per l'isolamento dei microrganismi in coltura pura. O/F HUGH LEIFSON BASE Formula (grammi per litro) Peptone Bios D Sodium Chloride Dipotassium Phosphate Bromthymol Bl B th l Blue Agar Bios LL Preparazione Sciogliere 9.8 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, distribuire ed autoclavare a 121C per 15 minuti. Raffreddare a 50C ed aggiungere sterilmente una soluzione del carboidrato desiderato (concentrazione finale 1-2% p/v) ovvero, per evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili sterili, addizionare dischi di carta contenenti carboidrati. Inoculare due tubi e ricoprire uno di essi con olio di vasellina sterile. pH finale 7.10.2. Impiego O/F Hugh Leifson Base preparato in accordo alla formula proposta da Hugh e Leifson un terreno a cui possono i i i b id i lo di delle essere aggiunti vari carboidrati per l studio d ll ossidazioni e/o fermentazioni dei microrganismi. 2.00 5.00 0.30 0.03 0 03 2.50 3 5

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Il terreno usato per la differenziazione della flora intestinale non enterica, Gram negativa dagli enterobatteri, per la differenziazione dei micrococchi e per la determinazione del modello metabolico con cui vengono degradati gli zuccheri dai microrganismi. L utilizzo L'utilizzo dei carboidrati da parte dei batteri pu avvenire secondo due processi: fermentativo o ossidativo. Alcuni microrganismi sono capaci di utilizzare i carboidrati con produzione di acido solamente in condizioni aerobie, altri in condizioni sia aerobie che anaerobie (anaerobi facoltativi). La degradazione anaerobia dei carboidrati avviene attraverso la via metabolica di Embden Meyerhof o attraverso una combinazione di questa con lo shunt dei pentosi con la via di Entner Doudoroff; tutte e tre le vie metaboliche richiedono la fosforilazione iniziale del glucosio, hanno come prodotto i d intermedio l' id piruvico, richiedono un composto di l'acido i i i hi d organico come acettore ultimo di elettroni e conducono a metaboliti finali diversi essendo diverso il patrimonio enzimatico delle varie specie batteriche. La degradazione ossidativa del glucosio non richiede la sua fosforilazione iniziale, ha come prodotto intermedio l'acido piruvico e richiede l'ossigeno o un composto inorganico, come acettore finale di elettroni. L'O/F Medium Base, addizionato del carboidrato adatto, permette di di i distinguere tra i d processi metabolici d due i b li i descritti. i i Il terreno contiene il blu di bromotimolo come indicatore di pH; una variazione del pH del mezzo verso l'acidit, indotta dalla degradazione del carboidrato aggiunto, fa virare l'indicatore da verde a giallo. Il permanere, dopo l'incubazione, di una colorazione verde del terreno o l'apparizione di una colorazione blu, dovuta ad una trasformazione alcalina del mezzo, indicano che il test negativo e che non vi stata nessuna degradazione dei carboidrati. carboidrati Il terreno ha un basso contenuto di peptoni per evitare una loro degradazione da parte dei microrganismi con metabolismo ossidativo, che porterebbe alla formazione di prodotti finali di natura alcalina che potrebbero mascherare l'acidit del mezzo. O/F Hugh Leifson Base un terreno semisolido; la presenza dell'agar a una concentrazione del 0.25% impedisce ai prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con una conseguente loro diluizione diluizione. Il dipotassio fosfato incorporato per promuovere la fermentazione dei carboidrati e per stabilizzare il pH del terreno, mentre il sodio cloruro stimola la crescita di Brucella. II glucosio il carboidrato che pi frequentemente viene usato per il test O/F; Cowan e Steel comunque raccomandano di usare, per la differenziazione dei microrganismi che non degradano il glucosio, una batteria di zuccheri costituita da glucosio, lattosio, saccarosio, maltosio. glucosio lattosio saccarosio maltosio Per l'esecuzione del test si inoculano due provette, contenenti il carboidrato alla concentrazione dell'1 %, per infissione di un ago caricato di una sospensione batterica. Dopo aver ricoperto una delle provette con olio di vasellina si incuba per 48 ore o pi a 37C. I microrganismi con metabolismo ossidativo produrranno un'acidificazione del mezzo, con viraggio dell'indicatore da verde a giallo, nella provetta aperta; i batteri con metabolismo fermentativo produrranno n'acidifica ione fermentati o prod rranno un'acidificazione del terreno in entrambe le provette. Con il test O/F si pu determinare anche la produzione di gas da parte dei microrganismi e la loro mobilit (crescita diffusa a partire dalla linea dell'inoculo).

Nelle tabelle sottostanti sono indicati i modelli di reazione su O/F Hugh Leifson Base, e le caratteristiche colturali di alcuni microrganismi su detto terreno.

+ reazione positiva, acidificazione con viraggio al giallo dellindicatore g , - reazione negativa, nessun cambiamento di colore del mezzo PEPTONE WATER Formula (grammi per litro) Peptone Bios D Sodium Chloride Preparazione P i Sciogliere 15 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Riscaldare agitando, distribuire ed autoclavare a 121C per 15 minuti. Per studi sull'utilizzazione degli zuccheri aggiungere, prima della sterilizzazione, a 900 ml di terreno, 100 ml di una soluzione acquosa allo 0.2% di un indicatore (porpora bromocresolo, blu bromotimolo o rosso fenolo). Aggiungere alla base sterilizzata una soluzione sterile dello zucchero desiderato e distribuire in tubi con campanella oppure addizionare alle provette dischi di carta contenenti carboidrati. L'aggiunta di alcuni zuccheri pu produrre un abbassamento del pH del terreno: in questo caso ricorreggere il pH con NaOH 0.1 N sterile. pH finale 7.20.2. p ego Impiego Peptone Water, dato l'elevato contenuto in triptofano del Peptone Bios D, particolarmente adatto come substrato per .la determinazione della produzione di indolo. La capacit di metabolizzare il triptofano con formazione di indolo caratteristica distintiva di alcune specie batteriche; il test perci utile ai fini dell'identificazione e classificazione dei microrganismi. Il tempo e la temperatura di incubazione variano a seconda della d ll specie b i batterica i esame; l presenza di i d l pu i in la indolo essere rivelata con il reattivo di Kovacs o di Erlich. 10 5

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Il metodo prescelto deve essere controllato con ceppi di collezione: Escherichia coli indolo +, Enterobacter aerogenes indolo -. Seguendo la procedura descritta da Mackenzie, ICMSF suggerisce l'uso di Peptone Water nel test di conferma dei coliformi fecali negli alimenti: trasferire un'ansata di crescita un ansata microbica dai tubi positivi di Mac Conkey Broth in provette di Peptone Water e di Brilliant Green Bile Broth 2% e incubare a 44C; eseguire il test dell'indolo sulla crescita di 24 ore in Peptone Water e osservare lo sviluppo di gas in Brilliant Green Bile Broth 2% dopo 24 ore e 48 ore. Le colture che a 44C sono indolo positive e producono gas sono da considerarsi coliformi di origine fecale. Peptone Water anche utilizzato come base per lo studio della utilizzazione degli zuccheri. Dopo l'aggiunta degli zuccheri incubare alla temperatura desiderata e osservare tutti i giorni per 7 giorni se vi stata produzione di gas e/o di acido. PHENOL RED AGAR BASE Formula (grammi per litro) Peptocomplex Sodium Chloride Phenol Red Ph l R d Agar Bios LL PHENOL RED BROTH BASE Formula (grammi per litro) Peptomeat Beef Extract Sodium Chloride Phenol Red Preparazione Sciogliere 31 g di agar e 18 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire in tubi da fermentazione il brodo in ragione di 3-4 34 ml per tubo, e in beuta l'agar, autoclavare a 121C per 15 minuti. Raffreddare a circa 50C ed aggiungere con le precauzioni dell'asepsi una soluzione sterilizzata per filtrazione dell'appropriato carboidrato, in modo che si ottenga una concentrazione finale dell'1-2% (p/v). Per evitare la lunga preparazione delle soluzioni sterili si pu addizionare in provetta (brodo) o deporre sulla superficie dell agar piastra, dell'agar in piastra dischi di carta contenenti carboidrati pH finale 7.40.1 Impiego Phenol Red Agar Base e Broth Base sono terreni contenenti un indicatore di pH utilizzati per lo studio delle fermentazioni dei carboidrati rispettivamente con il metodo in terreno solido e con il metodo in terreno liquido. Phenol Red Broth Base preparato in accordo alla formula raccomandata da AOAC e p da ICMSF per lo studio della fermentazione dei carboidrati con il metodo preparato da International Committe on Enterobacteriaceae"; Phenol Red Agar Base preparato in accordo alla formula raccomandata da APHA. Per l'identificazione e la classificazione delle specie batteriche si fa spesso ricorso a prove biochimiche che ne studiano il metabolismo glucidico. 88 10.000 3.000 3 000 5:000 0.018 11.000 5.000 0.025 0 025 15.000

Tali prove, che vanno sotto il nome generico di prove di fermentazione degli zuccheri, anche se a volte vengono eseguite su microrganismi a metabolismo prevalentemente ossidativo e se fanno uso di carboidrati che non sono solo zuccheri ma anche alcoli e glucosidi, consistono nel seminare il germe in esame, in coltura pura, in terreni contenenti vari carboidrati. t ti i b id ti Phenol Red Agar Base e Broth, contengono il rosso fenolo come indicatore di pH che, da rosso, in terreno alcalino, diventa arancio in terreno neutro e giallo in terreno reso acido dallattacco dei carboidrati da parte dei microrganismi. Metodo in terreno solido con dischi di carta (Bios Discs) Dividere il terreno autoclavato in piastre sterili ( 14 mm), lasciar solidificare indi seminare in superficie il germe in esame. Per ottenere risultati pi rapidi e pi netti ricorrere alla tecnica dell'agar-germi. Deporre i Bios Discs sulla superficie dell'agar inoculato, facendo attenzione che siano opportunamente distanziati e ben aderenti al terreno (seminare anche una piastra di controllo senza carboidrati) incubare a 37C. La produzione di acido segnalata da un alone di viraggio giallo attorno ai dischi. Metodo in terreno liquido con dischi di carta (Bios Discs) Nelle provette di Phenol Red Broth Base autoclavate autoclavate, introdurre sterilmente i Bios Discs e inoculare con un'ansata di crescita microbica. Seminare anche una provetta di controllo senza carboidrati e incubare a 37C. La produzione di acido segnalata dal viraggio al giallo del brodo di coltura. Con entrambi i terreni la produzione di acido rapida, bene quindi eseguire letture frequenti, la prima dopo circa 4 ore. Dopo che si osservata una reazione positiva scartare il tubo; prolungando infatti il p periodo di incubazione si pu assistere ad un'inversione p della reazione con viraggio dell'indicatore verso l'alcalinit. TRIPTIC GLUCOSE EXTRACT AGAR Formula (grammi per litro) Peptone Bios D Beef Extract Glucose Agar Bios LL 5 3 1 15 (Plate count

TRIPTIC GLUCOSE YEAST AGAR agar) Formula (grammi per litro) Peptone Bios D Yeast Extract Glucose Agar Bios LL Preparazione 5.0 2.5 1.0 15.0

Sciogliere 24 g di Tryptic Glucose Extract Agar e 23.5 g di Tryptic Glucose Yeast Agar in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione, distribuire ed autoclavare a 121C per 15 minuti 121 C minuti. pH finale 7.00,2.

Impiego Tryptic Glucose Extract Agar e Tryptic Glucose Yeast Agar sono terreni d'uso generale raccomandati da APHA, ICMSF, AOAC per il conteggio dei microrganismi con la tecnica dell'agar germi, utilizzato in passato per la conta microbica totale nel latte e prodotti lattiero caseari Tryptic Glucose caseari, Extract Agar ora raccomandato da APHA insieme al Tryptic Glucose Yeast Agar, solo per il conteggio dei microrganismi nelle acque e negli alimenti, Tryptic Glucose Yeast Agar, corrispondente al Plate Count Agar (Standard Methods Agar) di APHA, AOAC, ICMSF, il terreno d'elezione per il conteggio dei microrganismi aerobi e di quelli anaerobi facoltativi eterotrofi, nell'acqua, latte, prodotti lattiero caseari, alimenti. Lo schema di lavoro da seguire per effettuare la conta microbica su ciascun tipo di materiale d i bi i i i l deve essere il pi i possibile conforme a quanto raccomandato dagli organismi ufficiali citati. Il metodo dell'APHA consiste nel preparare diverse diluizioni del campione in esame; a 1 ml di ciascuna diluizione in piastre Petri viene aggiunto in duplicato uno dei due terreni al 44-46C. Dopo aver mescolato l'inoculo con agar si incuba per 48 ore a 32-35C e quindi si contano le colonie coltivate, in quelle piastre in cui siano presenti da 30 a 300 colonie. Per il conteggio di microrganismi che richiedono altre temperature di crescita si incuba a 5-7C per 10 giorni a 20C per 3 5 giorni e a 45C per 2 3 giorni 3-5 2-3 giorni. TRYPTIC SOY AGAR Formula (grammi per litro) Tryptic Casein Bios D Soy Peptone SQdium Chlbride Agar'Bios LL TRYPTIC SOY BROTH Formula (grammi per litro) Tryptic C~sein Bios D Soy Peptole Sodium Ch.foride Dipotassium Phosphate Glucose Preparazione Sciogliere 40 g di agar e 30 g di brodo in 1000 ml di acqua distillata fredda fredda. Portare all'ebollizione sotto agitazione all ebollizione agitazione, distribuire e autoclavare a 121C per 15 minuti. pH finale 7.30.2. Impiego Tryptic Soy Agar e Tryptic Soy Broth sono terreni d'uso generale che supportano la crescita di una larga variet di microrganismi. 17.0 3.0 5.0 2.5 2.5 15 5 5 15

Per le loro caratteristiche nutrizionali; per l'assenza di inibitori, per la possibilit di essere supplementati con i composti pi svariati, i due terreni si prestano bene per l'isolamento dei patogeni, per lo studio dei microrganismi a crescita fastidiosa, per il mantenimento dei ceppi di collezione, per la preparazione di autovaccini, per l'esecuzione d ll' tibi l' i dell'antibiogramma. Il sangue l'additivo pi comune per il Tryptic Soy Agar e viene aggiunto a concentrazioni variabili tra il 5 e i115% come sangue defibrinato (di coniglio, cavallo, montone, uomo). In alcuni casi (isolamento di Neisseria e di Haemophilus) il sangue viene aggiunto come tale al terreno e poi riscaldato a 80C per 10 minuti ottenendo cos l'agar cioccolato. Tryptic Soy Agar comunemente usato per il conteggio dei germi presenti nelle urine e negli espettorati ed in microbiologia alimentare per la conta dei microrganismi presenti nel latte, carni, alimenti conservati, ecc. Tryptic Soy Broth utilizzato per la coltivazione di microrganismi aerobi, aerobi facoltativi, inclusi alcuni funghi e, aggiunto d'agar a concentrazioni 0.1-0.2% per la coltivazione degli anerobi obbligati.

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BIBLIOGRAFIA

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