ENGENHARIA BIOQUMICA 12/03/12 Ao das Enzimas As enzimas diminuem a energia de ativao da reao catalisada ao se ligarem ao substrato formando um complexo

denominado enzima-substrato sem afetar a constante de equilbrio. As enzimas atuam em baixas concentraes em condies amenas de temperatura e, sendo molculas proteicas, podem sofrer desnaturao quando em temperaturas mais elevadas. Os aspectos moleculares da interao entre enzima e substrato ainda no esto completamente esclarecidos. Normalmente a interao entre enzima e substrato se d por foras fracas, como as de van der Waals ou pontes de hidrognio, formando ento o complexo E-S. Um modelo bastante utilizado para ilustrar a formao do complexo E-S o modelo da chave-fechadura:

As enzimas podem necessitar de um grupo no proteico para se tornarem ativas, que normalmente so chamados de cofatores, que podem ser alguns ons metlicos, molculas orgnicas complexas tambm chamadas de coenzimas, e tambm algumas vitaminas. Uma enzima que contm um grupo no-proteico chamada de holoenzima. A parte proteica chamada de apoenzima, ou seja, holoenzima = apoenzima + cofator. Denominamos de isozimas as enzimas que apresentam estrutura molecular diferente, mas catalisam a mesma reao. Pgina 1

Fatores que afetam a ao das enzimas Diversos fatores contribuem para a catlise enzimtica. Vimos anteriormente que as enzimas, devido ao fato de serem molculas proteicas, apresentam estruturas primrias, secundrias e tercirias (algumas, a quaternria tambm) e que essas estruturas so importantes na interao E-S e so fortemente dependentes do pH, ou seja, o pH no qual a enzima est dissolvida induzir uma determinada distribuio de cargas eltricas, que acabar afetando sua estrutura. Em geral, podemos dizer que qualquer fator que provoque uma mudana na estrutura da enzima poder provocar a desnaturao da molcula, o que provocar um efeito sobre a atividade enzimtica. Dentre os principais fatores que afetam a ao das enzimas, podemos citar: 1) pH 2) Temperatura 3) Foras fludas (hidrodinmicas, presso hidrosttica, tenso interfacial) 4) Agentes qumicos presentes no meio reacional (lcool, uria, ons salinos, perxidos) 5) Radiaes (luz, sonoras, ionizantes, entre outros)

1. Efeito do pH sobre a atividade enzimtica As enzimas, sendo molculas proteicas, so formadas por diferentes aminocidos unidos por ligaes peptdicas. Os resduos dos aminocidos presentes na estrutura primria da molcula apresentam grupos inicos com determinados potenciais de ionizao (pK), sendo assim que suas eltricas iro depender do pH em que se encontram, logo a distribuio de cargas na molcula como um todo ser afetada pelo pH e logicamente tambm no stio cataltico, ou seja, haver uma distribuio de cargas que far com que a molcula tenha uma configurao mais favorvel para interagir com o substrato. A figura abaixo ilustra um comportamento tpico da distribuio de cargas eltricas lquidas de uma molcula proteica em funo do pH. Observa-se que haver um pH em que a carga eltrica lquida da molcula nula e este pH denominado pI (pH Isoeltrico) Pgina 2

Assim, podemos dizer que as enzimas so mais ativas em determinadas faixas de pH e haver um determinado pH da soluo enzimtica em que a atividade ser mxima, conforme podemos observar na figura abaixo.

Geralmente

pH

timo

de

ao

de

uma

enzima

determinado

experimentalmente estando a atividade enzimtica sob diferentes pHs. Cabe lembrar que o pH tambm poder alterar as caractersticas do substrato, o que tambm afetar a cintica enzimtica. Alguns exemplos tpicos para algumas enzimas: lipase do pncreas, pH ~ 8 pepsina, pH ~ 1,5-1,6 urease, pH ~ 7 Pgina 3

 invertase, pH ~ 4,5 amilase do malte, pH ~ 4,6-5,2 amilase do pncreas, pH ~ 6,7-7,0

2. Efeito da Temperatura sobre a atividade enzimtica Como vimos, as enzimas atuam, em sua grande maioria, em temperaturas amenas, por exemplo entre 15 e 70C. Como toda reao qumica, a velocidade da reao enzimtica aumenta com o aumento da temperatura, at um certo valor e neste caso dizemos que h uma ativao trmica da reao enzimtica, que pode ser explicada pela Lei de Arrhenius. A partir de uma determinada temperatura, que a Tmax de atividade, a velocidade da reao enzimtica comea a diminuir. Isto ocorre porque mais e mais molculas de enzimas sofrem desnaturao medida que se aumenta a temperatura acima da Tmax. Assim dizemos que h uma desativao trmica. A figura abaixo ilustra o efeito tpico da temperatura sobre a atividade enzimtica.

Observa-se que as enzimas possuem uma temperatura na qual a atividade mxima. importante observar que normalmente a desativao trmica irreversvel e tambm vai depender de quanto tempo a molcula est submetida estas temperaturas que provocam a desnaturao. Por exemplo, um aumento de temperatura de 30 para 40C pode provocar um aumento de 1,8x na atividade enzimtica, mas tambm pode provocar um aumento de 41x na desnaturao enzimtica. Tambm, a temperatura ir afetar parmetros como a velocidade mxima da reao e as constantes cinticas que veremos mais adiante. Pgina 4

Cabe lembrar que tambm as temperaturas de congelamento podem ter efeito sobre as estruturas das molculas e tambm provocar a desnaturao em baixas temperaturas.

3. Efeito das foras fludas sobre a atividade enzimtica Por foras fluidas entendemos as foras hidrodinmicas da presso hidrosttica e as tenses interfaciais. Em processos industriais, comum o armazenamento de solues em tanques, reatores, etc., bem como o transporte de solues atravs de tubulaes utilizando bombas, isso gera foras e tenses de cisalhamento que podem afetar as estruturas das enzimas, provocando a desnaturao. Tambm comum operaes de agitao e mistura que igualmente contribuem com foras que podem provocar a desnaturao enzimtica. Tambm as enzimas possuem resduos de aminocidos que podem ser polares ou apolares (hidroflicos ou hidrofbicos), o que faz com que as molculas tenham caracteristicas anfiflicas

4. Efeito dos agentes qumicos sobre a atividade enzimtica Diversas substancias qumicas quando presentes ou adicionadas no meio reacional enzimtico podem interagir quimicamente com as molculas de enzimas, por exemplo, formando pontes de hidrognio, o que ir afetar a estrutura da molcula de enzima e consequentemente a atividade enzimtica, por exemplo, agentes como etanol e outros solventes, a presena de sais como sulfato de amnio, cloreto de sdio, etc. (alterao da fora inica do meio), a presena da ureia, etc. que podem alterar as propriedades dieltricas do meio, podem provocar o fenmeno da solvatao, e, consequentemente, a desnaturao das molculas de enzima. Alguns sais em concentraes muito elevadas podem provocar o efeito salting-out, que quando provoca a indisponibilizao de gua e consequente diminuio da solubilidade da enzima, ou seja, pode provocar a precipitao das protenas do meio.

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5. Efeito das radiaes sobre a atividade enzimtica sabido que as radiaes eletromagnticas, a ultravioleta, luz visvel, dentre outras, afetam algumas reaes e estruturas orgnicas, pois transportam uma determinada energia, tal energia pode ser absorvida em maior intensidade por alguns grupos qumicos aromticos presentes em alguns resduos de aminocidos e pode provocar um desequilbrio nas foras que mantm a estrutura enzimtica; dependendo da intensidade da radiao, poder provocar a quebra de ligaes ou ento provocar um aquecimento da soluo com as consequncias vistas para o efeito da temperatura (desnaturao trmica). Efeito similar obtido com as ondas ultrassnicas. 19/03/12 Cintica Enzimtica Como vimos, a cintica das reaes enzimticas afetada pela concentrao da enzima, pH, temperatura, presena de cofatores e outros agentes qumicos, existncia de foras e tenses, etc. Tambm, a concentrao do substrato outro fator importante que afeta a cintica enzimtica. importante conhecer e analisar os diferentes efeitos de diferentes fatores sobre a velocidade das reaes enzimticas de tal forma que permita o melhor entendimento da natureza da catlise e seus mecanismos para determinada enzima. Em termos cinticos, as enzimas podem ser classificadas em: 1) ENZIMAS CLSSICAS: Reaes com essas enzimas mostram que a cintica do tipo de saturao e a velocidade da reao enzimtica em funo da [] do substrato mostra um comportamento assinttico conhecido como Modelo de Michaelis Menten.

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2) ENZIMAS REGULATRIAS: As enzimas regulatrias no obedecem ao Modelo Clssico de Michaelis-Menten, e normalmente essas enzimas tm dois tipos diferentes de stios, um o stio cataltico, onde o substrato se liga e outro um stio regulatrio onde se liga um regulador. Quando o regulador se liga na molcula, provoca uma alterao no stio cataltico e altera suas propriedades cinticas.

Cintica de Michaelis-Menten Considere uma reao enzimtica na qual um substrato S transformado num produto P pela enzima E. Considere o mecanismo abaixo em que uma enzima E, numa interao reversvel com o substrato S formando um complexo E-S que se transforma em produto P de forma irreversvel e liberando o catalisador. Seja S a [] do substrato, E a [] da enzima e E-S a [] do complexo Enzima-Substrato. Desenvolvimento:

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Graficamente, temos:

Observa-se que a [] da enzima afeta a Vmax da reao dentro de certos limites e pode-se observar que se duplicarmos a [] da enzima, a velocidade da reao enzimtica tambm duplicar. [DEMONSTRAR A SITUAO ACIMA]

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Tambm a [] de substrato na qual a velocidade da reao metade da Vmax fornece o Km (DEMONSTRAR ISSO).

Tambm podemos observar que nas altas [] de substrato, a velocidade da reao enzimtica comporta-se como se fosse uma reao de ordem zero, ou seja, alterando-se a [S], a velocidade no ser alterada e sempre ser Vmax (DEMONSTRAR).

J nas baixas [S], a velocidade da reao enzimtica comporta-se como se fosse de 1a ordem. As unidades de velocidade podem ser em Determinao das constantes cinticas Vm e Km. Pgina 9

Para se determinar Vm e Km, podemos lanar mo de mtodos grficos e/ou rearranjar a Eq. de MM numa forma linearizada e com os pares de dados cinticos V x S, conseguimos determinar os valores numricos de Km e Vm sob determinadas condies da reao. Isso importante quando desejamos resolver a equao de projeto de um determinado reator enzimtico, seja em batelada ou contnuo. H varios metodos disponiveis e que podem ser utilizados na determinao de Vm e Km e o que os diferencia entre si ser a preciso final dos valores obtidos. Nesses mtodos, necessrio um conhecimento prvio de V e S (tais dados cinticos podem ser obtidos pode diferentes mtodos, sejam eles diferenciais ou integrais. Um mtodo bastante comum para obteno de V e correspondente S o mtodo das velocidades iniciais. Os trs mtodos mais comuns para de determinar Km e Vm so: 1. Mtodo do Duplo Recproco ou Lineweaver-Burk (LB) - Neste caso, rearranjamos a Equao a de Michaelis-Menten numa forma linear do tipo Isto possvel fazendo a inverso de cada membro da Eq. MM: sabendo que vs .

ento teremos

Logo

Que a equao de uma reta do tipo y = b + ax. Assim, fazendo-se a regresso linear obtemos um coeficiente angular e um coeficiente linear. Conhecendo-se o coeficiente linear, determinamos Vm. Determinado o valor de Vm e conhecendo-se o valor do coeficiente angular, determinamos Km. [DEMONSTRAR!]

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21/03/12

2. Mtodo de Eadie-Hofstee (EH) - Plota-se A linearizao a seguinte:

vs

y=b - a.X Coef. Linear: Vm Coef. Angular: Km

3. Mtodo de Hanes-Woolf (HW) - Plota-se ----> y=b + a.X

vs

4. Mtodo Grfico ou Mtodo de Eisenthal & Cornish-Bawden - O Mtodo Grfico para a determinao de Km e Vm considerado superior, estatisticamente, em relao aos trs mtodos vistos anteriormente e fortemente sugerido para o clculo de Km e Vm. O mtodo consiste em colocar num eixo grfico tanto para v quanto para S os pares v e S, ento, traa-se uma linha reta atravs do par, ou seja,

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Fazendo esse procedimento para os diversos pares de v e S, observa-se que as retas tendem a se interceptar num nico ponto, ento determina-se Km e Vm nos respectivos eixos. Neste Mtodo Grfico, as principais vantagens so que nenhum clculo necessrio e que os pontos experimentais ou dados cinticos ruins so facilmente reconhecidos. Exemplo: Os seguintes dados cinticos foram obtidos para a decomposio da ureia pela urease e so mostrados na tabela abaixo:

[Ureia], kmol/m v kmol/m.s

0,20 1,08

0,02 0,55

0,01 0,38

0,005 0,20

0,002 0,09

Determine a constante de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade mxima para a decomposio da ureia pela urease (Vm) a. Pelo Mtodo LB b. Pelo Mtodo EH c. Pelo Mtodo HW d. Pelo Mtodo Grfico

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26/03/12 Reaes Enzimticas na presena de Inibidores Quando certas substncias esto presentes em uma reao enzimtica e provocam uma diminuio nas taxas da reao, ns dizemos que tais substncias inibem a reao enzimtica e por isso so chamadas de inibidores. Alguns inibidores se ligam irreversivelmente enzima e anulam a atividade enzimtica. Dentre esses tipos de inibidores temos os ons de metais pesados como chumbo, mercrio, cdmio, etc. Alguns inibidores se dissociam mais facilmente aps se ligarem enzima e dentre esses inibidores podemos ter: 1. Os inibidores competitivos, 2. Os inibidores no-competitivos. 1. Cintica Enzimtica na Presena de Inibidor Competitivo Como o nome diz, um inibidor competitivo compete com o substrato pelo stio ativo da enzima. Geralmente so substncias que possuem semelhana com o substrato. O seguinte mecanismo foi proposto para explicar a inibio competitiva.

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Graficamente:

Comparando-se com a Eq. de MM clssica, nota-se que a velocidade mxima da reao no se altera, na presena de um inibidor competitivo, no entanto, Km aumenta, o que provoca uma diminuio na velocidade da reao. Observa-se que os efeitos do inibidor competitivo podem ser atenuados trabalhando-se com elevadas [S]. Um exemplo prtico de inibio competitiva pode ser observado em algumas drogas antibiticas do grupo das sulfas, como a sulfanilamida. A sulfanilamida tem estrutura molecular muito similar do cido p-aminobenzoico que utilizado pela clula microbiana para produzir o cido flico. A sulfanilamida bloqueia esta rota bioqumica e acaba por matar o MO.

cido p-aminobenzoico

Sulfanilamida

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Determinao e Km e Vm na presena do inibidor competitivo: procede-se de forma anloga aos mtodos vistos anteriormente (LB, HW, EH, e Grfico) sendo tambm necessrios os pares v vs S:

2. Cintica Enzimtica na Presena de Inibidor No-Competitivo Inibidores no-competitivos podem se ligar ou enzima ou ao substrato dando um complexo ternrio EIS [enzima-inibidor-substrato], prejudicando a formao do produto. O seguinte mecanismo foi proposto:

Graficamente:

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Inibio da velocidade da reao nas altas concentraes de substrato bastante comum que elevadas concentraes de substrato provoquem um efeito inibitrio, ou seja, h uma diminuio na velocidade da reao a partir de uma determinada concentrao crtica de substrato no meio. O seguinte modelo foi proposto para esse tipo de inibio pelo substrato:

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Ex.: A hidrlise da ureia pela urease pode apresentar inibio. Dados cinticos obtidos: Concentrao do Substrato [S] = 1/v 0,22 0,33 0,51 0,76 0,88 1,10 1,15 0,2M [I] 0 0,0012 0.0027 0,0044 0,0061 0,0080 0,0093 [S] = 1/v 0,68 1,02 1,50 1,83 2,04 2,72 3,46 0,02M [I] 0 0,0013 0,0022 0,0032 0,0037 0,0044 0,0057

Pergunta-se: Qual o tipo de inibio? Justifique sua resposta e determine Ki. Inibio no-competitiva, Km=0,07525 mol/L , Ki=0,00226 mol/L

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28/03/12 Modelo Cintico para Enzimas Regulatrias: Para o caso das enzimas regulatrias, a cintica um pouco mais complexa visto que essas enzimas possuem mais de um stio de ligao. Num dos stios ocorre a ligao de uma substncia que provoca uma alterao no stio de ligao do substrato de tal forma que poder haver uma maior facilidade para que o substrato atinja o stio cataltico, mas tambm pode haver substncias que provocam alteraes no stio de ligao do substrato que acabam por dificultar a entrada do substrato do stio cataltico. No primeiro caso, o efeito conhecido como cooperativo ou alostrico. O modelo matemtico proposto :

Quando n>1, indica cooperao positiva.

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Determinao do coeficiente de cooperatividade (n) Rearranjando a equao acima:

y = a. x - b TECNOLOGIA DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS Vimos anteriormente que a enzima normalmente em soluo aquosa interage com o substrato para formar um produto. Normalmente a enzima se encontra diluda num meio reacional e a dizemos que a enzima livre. Uma problemtica que surge desse caso que no final teremos uma mistura de Enzima, Substrato no convertido e Produto, e como a enzima se encontra muito diluda, fica praticamente invivel a sua reutilizao e ela acaba sendo um contaminante no produto (quando no possvel recuper-la). Logo, a imobilizao de enzimas apresenta inmeras vantagens: 1) As enzimas podem ser reutilizadas (vantagens econmicas) 2) Elimina os processos de recuperao e purificao enzimtica 3) As enzimas podem ganhar maior estabilidade 4) A pureza do produto melhorada e problemas com tratamento de efluentes so minimizados 02/04/12 Mtodos de Imobilizao: Pgina 19

Os principais mtodos de imobilizao das molculas de enzima esto ilustrados na figura abaixo. Podemos dizer que as duas principais categorias de imobilizao so: 1. Imobilizao superficial (em superfcies); 2. Imobilizao interna ou confinamento

Imobilizao por confinamento quando as molculas de enzimas ficam confinadas num pequeno espao (ou volume). Podemos ter o confinamento por membranas, o microencapsulamento e tambm a imobilizao ou aprisionamento em matrizes polimricas. Neste ltimo caso, pode ser utilizado alginato de clcio, gar, -carragena, colgeno, gis de poliacrilamida, entre outros. Tambm, podem ser utilizados outros componentes. Para o caso da imobilizao entre membranas semipermeveis de tal modo que os poros da membrana mantenham as molculas de enzima retidas no confinamento, porm devem pemitir a passagem do substrato e do produto. As molculas de enzimas tambm podem ser imobilizadas por microencapsulamento quando se formam pequenas esferas formadas por uma membrana porosa que so capazes de reter as molculas de enzima mas tambm devem permitir a passagem do substrato e do produto formado. Uma problemtica que surge nesses vrios tipos de confinamento de molculas de enzima que algumas molculas podem se libertar para o meio reacional devido no uniformidade na distribuio dos poros das membranas. Tambm poder haver severas limitaes difusionais, seja das molculas do Pgina 20

substrato, seja do produto. Outro problema que pode surgir um menor controle das condies microambientais (dentro da membrana). Muitos desses efeitos negativos podem ser atenuados utilizando diferentes matrizes e condies de processamento, pode-se reduzir o tamanho das particulas ou o diametro das microcapsulas, de tal modo a se obter um ambiente reacional mais favorvel. Imobilizao superficial Os dois principais tipos de imobilizao de enzimas em superfcies de matrizes ou suportes so a imobilizao por adsoro ou por ligaes covalentes entre as molculas de enzimas e os suportes. A adsoro se refere a uma ligao entre as molculas de enzima e grupos especficos num suporte normalmente por foras fracas ou ligaes inicas (adsoro inica) devido ao compartilhamento de ons entre o suporte e as molculas de enzima. Normalmente, o stio cataltico no alterado no processo e quase que toda a atividade da enzima mantida aps a imobilizao por adsoro. Uma problemtica que surge nesse tipo de imobilizao que devido presena de foras hidrodinmicas fortes poder ocorrer a dessoro de molculas, ou seja, poder haver um escape de molculas para a soluo, j que as foras de adsoro so fracas. A dessoro de molculas de enzimas tambm poder ocorrer caso haja alteraes no pH do meio reacional, visto que o pH tem um importante papel na manuteno das cargas eltricas das enzimas. Isto pode ser resolvido promovendo-se ligaes cruzadas (cross-linking) entre as molculas de enzimas, utilizando, por exemplo, glutaraldedo, bisdiazobenzidina e tambm o cido 2-2-dissulfnico. No entanto, deve-se observar que poder ocorrer o bloqueio de stios catalticos. A imobilizao por ligao covalente quando moleculas de enzimas reagem com grupos qumicos especficos de tal modo a formar uma ligao covalente entre as enzimas e o suporte. Os principais grupos qumicos que reagem nesses processos so os grupos amino, grupos carboxlicos, grupos hidroxilas e grupos sulfidrilas, que obviamente no podem estar nos stios ativos. Para se evitar este problema, efetua-se antes da imobilizao o bloqueio do stio ativo, seja com o prprio substrato ou substncia analoga (por exemplo, um inibidor competitivo), procedendo-se em seguida a imobilizao com um stio ativo protegido. Os gurpos Pgina 21

funcionais presentes na superfcie do suporte (ou matriz) podem ser ativados quimicamente utilizando brometo de cianognio, carbodiimida e glutaraldedo de acordo com o grupo qumico que se quer ativar. Por exemplo, a Tabela 3.3 (Shuller) ilustra os principais mtodos para promover a ligao covalente de enzimas a um suporte especfico.

04/04/12 Tecnologia das Enzimas Imobilizadas [cont]: Imobilizao covalente na superfcie de suportes (matrizes): ATIVAO QUMICA: - Com -OH: Uso de brometo de cianognio Uso de S-triazina - Com -NH2: Por diazotizao (NaNO2 + HCl)

Com glutaraldedo - Com -COOH: Via derivados de azida

Uso de carbodiimida Caractersticas desejveis do suporte de imobilizao enzimtica: Os materiais mais adequados para serem utilizados como suportes de imobilizao enzimtica, bem como o mtodo de imobilizao variam dependendo da enzima e da aplicao em particular. Os dois principais critrios usados na seleo de um material suporte so: 1. A capacidade de ligao existente no suporte que depender da densidade de carga dos grupos funcionais, da porosidade e da hidrofobicidade da superfcie do suporte. Pgina 22

2. Estabilidade e reteno da atividade enzimtica, que depender dos grupos funcionais existentes no suporte e das condies microambentais. Caso a imobilizao provoque alteraes conformacionais na estrutura da enzima ou se o grupo reativo presente no stio cataltico estiver envolvido na ligao qumica entre matriz e protena, poder ocorrer perda da atividade enzimtica aps a imobilizao. Tambm, caso o stio cataltico fique orientado para a superfcie do suporte, poder ocorrer um impedimento de acesso do substrato at o stio cataltico. [comentrio] A imobilizao normalmente afeta a estabilidade trmica das enzimas, que geralmente aumenta aps a estabilizao devido presena de barreiras difusionais trmicas e tambm devido a uma maior dificuldade que a molcula ter para se deformar.

Aplicaes da catlise enzimtica As enzimas podem ter diversas aplicaes, sejam mdicas ou industriais. A Tabela 3.5 do Shuller mostra algumas enzimas de importncia industrial [traduo abaixo].

Amilase Glicoamilase Tripsina Papana Renina Glicose isomerase

Bacillus subtilis, Aspergillus niger A. niger, Rhizopus niveus, Endomycopsis Pncreas animal Mamo papaia Estmago de bezerros Flavobacterium arborescens, Bacillus

Hidrlise do amido, produo de glicose Sacarificao do amido, produo de glicose Amaciante de carne, remoo de turbidez na cerveja Auxlio na digesto, amaciante de carne, aplicaes mdicas Manufatura de queijo Isomerizao da glicose em

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coagulans, Lactobacillus brevis Penicilinase Glicose oxidase Lipases Invertase Pectinase Celulase B. subtilis A. niger Rhizopus, pncreas S. cerevisae A. oryzae, A. niger, A. flavus Trichoderma viride

frutose Degradao da penicilina Glicose cido glucnico, produo de ovo em p Hidrlise de lipdios, auxlio na digesto e flavorizao Hidrlise da sacarose para posterior fermentao Clarificao de sucos de frutas, hidrlise da pectina Hidrlise da celulase

* Fazer resumo da seo 3.6

09/04/12 QUESTES: 1. Considere as seguintes enzimas ou classe de enzimas: 01. Proteases 02. Pectinases 03. Lipases 04. Amilases e glicoamilases 05. Celulases e hemicelulases 06. Lactases 07. Invertase 08. Glicose isomerase 09. Glicose oxidase 10. Asparaginase 11. Penicilinases 12. Aspartase 13. Urease

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Comente sobre essas enzimas com respeito suas fontes (de onde so extradas/produzidas), bem como as respectivas aplicaes industriais ou mdicofarmacuticas. Resposta: 1. Proteases As proteases hidrolisam protenas em unidades peptdicas e constitui um grande e industrialmente importante grupo de enzimas. As proteases constituem cerca de 60% do mercado total de enzimas. Proteases industriais so obtidas de bactrias (Bacillus), bolores (Aspergillus, Rhizopus e Mucor), pncreas animal e plantas. Maior parte das proteases so endoproteases. Proteases so utilizadas no processamento de alimentos, tal como preparao de queijo (renina), panificao, amaciamento de carne (papana, tripsina) e preparo de cerveja (tripsina, pepsina); em detergentes para a hidrlise das manchas proteicas (subtilisina Carlsberg); e no bronzeamento e tratamento mdico de ferimentos. 2. Pectinases As pectinases so principalmente produzidas por A. niger. Os principais componentes nas pectinases so a pectina esterase, poligalacturonase e polimetilgalacturonato-liase. As pectinases so utilizadas no processamento de sucos de frutas e na preparao de vinho para aumentar o rendimento de suco, reduzir a viscosidade e clarificar o suco. 3. Lipases As lipases hidrolisam lipdios em cidos graxos e glicerol e so produzids a partir de pncreas de animais, alguns bolores e leveduras. As lipases podem ser usadas para hidrolisar leos para a manufatura de sabo e para hidrolisar compostos gordurosos lipdicos presentes em fluxos de gua suja. Interesterificao de leos e gorduras pode ser catalisada por lipases. As lipases podem tambm ser usadas nas indstrias de queijo e manteiga para dar sabor como resultado da hidrlise de gorduras. Detergentes contendo lipase so uma importante aplicao das lipases. Pgina 25

4. Amilases e glicoamilases Amilases so usadas na hidrlise do amido e so produzidas por diferentes organismos, incluindo A. niger e B. subtilis. Os trs principais tipos de amilases so a -amilase, -amilase e a glicoamilase. -Amilase quebra ligaes glicosdicas

,1-4 aleatoriamente na cadeia da amilose e solubiliza a amilose. Por esta razo, a -amilase conhecida como a enzima liquefatora do amido. -Amilase hidroliza

ligaes glicosdicas ,1-4 nas terminaes no-redutivas da amilose e produzem resduos de maltose. glicosdicas ,1-6 Aproximadamente na -Amilase conhecida como enzima sacarificadora. Ligaes frao amilopectina do amido so hidrolisadas pela

glicoamilase, que tambm conhecida como uma enzima sacarificadora. lb/ano de glicose produzida pela hidrlise enzimtica do amido nos Estados Unidos na mdia. A enzima pullulanase tambm hidrolisa as ligaes glicosdicas ,1-6 no amido seletivamente. 5. Celulases e hemicelulases As celulases so usadas na hidrlise da celulose e so produzidas por algumas espcides de Trichoderma, tais quais Trichoderma viride ou T. reesei e por alguns bolores, como o Aspergillus niger e Thermomonospora; e por algumas espcies de Clostridium. A celulase uma enzima compleza e sua formao induzida pela celulose. A celulase de Thichoderma hidrolisa a celulose cristalina, mas a do Aspergillus no. A celulose primeiro hidrolisada a celobiose pela celulase, e a celobiose posteriormente hidrolisada a glicose pela -glicosidase.

Ambas enzimas so inibidas pelos seus produtos finais, celobiose e glicose. As celulases so usadas no processamento de cereais, fermentaes alcolicas de biomassa, preparo de cerveja e tratamento de esgoto. As hemicelulases hidrolisam a hemicelulose em unidade de acar de cinco carbonos e so produzidas por alguns bolores, como bolor/podrido branco[a] e A. niger. As hemicelulases so usadas em combinao com outras enzimas em massas de po, misturas de preparo de cerveja, fermentao alcolica de biomassa e tratamento de esgoto.

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06. Lactases Lactases so as enzimas que hidrolizam a lactose em glucose e galactose. Est na famlia das -galactosidase. Faz parte da secreo intestinal dos mamferos jovens e

essencial para a digesto do leite. A deficincia ou improdutividade da lactase no organismo pode resultar em intolerncia a lactose. Porm, nos dias de hoje, ja vendida como suplemento alimentar, em cpsulas, ajudando na digesto da lactose.

07. Invertase A invertase (ou -frutofuranosidase) uma sacarase e, portanto, catalisa/hidroliza a

sacarose em frutose + glicose, geralmente na forma de xarope de aucar invertido. Industrialmente, a invertase comumente obtida a partir de leveduras. Na natureza, sintetizada por abelhas, produzem a invertase para fazer o mel. 08. Glicose isomerase A glicose isomerase uma enzima intracelular e produzida por diferentes organismos, tais como Flavobcterium arborescens, Bacillus licheniformis e algumas espcies de Streptomyces e Arthrobacter. A converso de glicose em frutose por glicose isomerase imobilizada um processo industrial muito importante, uma vez que a frutose 1,7 vezes mais doce que a glicose e usada como adoante em bebidas. 09. Glicose oxidase A glicose oxidase catalisa a oxidao da glicose a cido glucnico e perxido de hidrognio, que pode ser facilmente detectado. Justamente por isso, usada pra a determinao de nveis de glicose no sangue e urina. Pode ser produzida a partir de A. niger, alm de ser encontrada no mel, onde atua como conservante natural (a enzima superfcie do mel reduz o oxignio atmosfrico em perxido de hidrognio, que atua como barreira antimicrobiana. 10. Asparaginase Pgina 27

A asparaginase, uma protena tetramrica de aproximadamente 140 kDa, uma enzima obtida de E. coli ou Erwinia. Sua ao cataltica transforma o aminocido asparagina em cido asprtico e amnia. Em certas linhagens de clulas leucmicas, a baixa concentrao de uma outra enzima, a asparagina sintetase, faz com que estas clulas leucmicas sejam incapazes de produzir asparagina suficiente e, portanto, dependentes de uma fonte extracelular desse aminocido. A degradao da asparagina bloqueia a sntese protica, ocasionando a morte celular.

11. Penicilinases A penicilinase um tipo de lactamase que apresenta especificidade para penicilinas atuando atravs da hidrlise do anel beta-lactama. Pode ser obtida de Bacillus subtilis. 12. Aspartase Uma enzima encontrada em vrias bactrias, leveduras, plantas e que catalisa a converso do cido asprtico ao cido fumrico atravs da remoo de amnia e catalisa a reao inversa por adio de amonaco. Tambm chamado de ammonialyase aspartato. 13. Urease A urease uma enzima que catalisa a hidrlise da ureia em dixido de carbono e amnia. Pode ser encontrada em bactrias, leveduras e diversas plantas superiores. Uma vez que muitos patgenos do trato gastrintestinal e urinrio produzem urease, a medida desta pode ser utilizada como parmetro para diagnstico. Tambm pode ser utilizada em biossensores condutimtricos para deteco de ons de metais pesados.

11/04/12 Reatores Enzimticos

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 Processos descontnuos (bateladas) Volume til V constante. BM para S:

Processos contnuos (Tanque agitado ou CSTR) BM para S:

onde: V = volume til do reator (m) Q = vazo volumtrica (m/s) Pgina 29

Se = [S] na alimentao (entrada) (kgmol/m) S = [S] na sada (retirada) v = velocidade da reao

Reator PFR Do BM, obtemos:

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Cintica da Desativao Enzimtica Como vimos, as enzimas so molculas proteicas de configurao complexa, que atuam como catalisadores no entanto, no transcorrer de uma reao de catalisada por enzimas, a desativao da enzima poder ocorrer com uma velocidade que depender da estrutura da molcula, bem como das condies da reao (pH, temperatura, fora inica, etc). A concentrao de enzima ativa pode diminuir consideravelmente durante a reao, logo importante conhecer a cintica, bem como os parmetros da desativao enzimtica. O modelo mais simples de desativao enzimtica o da desativao irreversvel de primeira ordem com respeito enzima ativa, ou seja:

16/04/12

Desativao de primeira ordem: (irreversvel) Ea = [ ] de enzima ativa Pgina 31

Ei = [ ] de enzima inativa kd = constante de desativao Ou seja: (1)

Como Ea(t=0)=Eao, resolvendo-se (1) temos: (2) Sabendo que , logo ou, com Vmo=k.Eao (3) Assim, Vm=Vm(t) Tempo de meia vida o tempo necessrio para que a concentrao da enzima ativa (Ea) seja reduzida metade. Logo: (4) A taxa de desativao depende da temperatura conforme Arrhenius:

Ed 170 a 400 kJ/mol Exemplos: 1. A catalase tem sido utilizada para acelerar a decomposio do perxido de hidrogenio em agua e oxigenio. Utilizou-se um balo volumtrico com 100mL de meio reacional, contendo a enzima e o substrato em pH = 6,76 e mantidos a 30oC. Acompanhou-se a concentrao do perxido de hidrogenio em funo do tempo, mostrado na tabela abaixo.

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t (min) [H2O2] (M)

0 0,02 -----

10 0,01775 0,011935 0,000225

20 0,0158 0,011786 0,000210

50 0,0106 0,012698 0,000188

100 0,005 0,013863 0,000150

a) Determine Vm e Km b) Se a concentrao da enzima for triplicada, qual ser a concentrao molar do substrato aos 20min a) Linearizao para batelada (dados da resposta em vermelho na tabela): y=b-ax

Fazendo a regresso linear, obtm-se: y = 0,018021 - 28,2078.x (R=0,96799)

b) Se a concentrao de Enzima for triplicada, a velocidade mxima tbm o ser, ou seja: Vm=0,00192 M/s Resolvendo para este valor na eq de projeto de um Batelada, com Km igual ao obtido: , obtm-se S = 0,0092 M 2) Um reator enzimtico tipo CSTR com 500L de volume til utilizado para converter um substrato A num produto B a 35C e pH 4,5. A enzima utilizada foi imobilizada em partculas polimricas pequenas e porosas e obedecem ao modelo de MM. Os dados apresentados na tabela abaixo foram obtidos no estado estacionrio para uma vazo de alimentao do substrato e do produto de 100 L/h. Pgina 33

Se (g/L) X (convers o)

11,70 0,90

16,25 0,80

19,8 0,70

31,0 0,47

59,3 0,25

10,53 x= 9

13 4

13,86 2,333333

14,57 0,886792

14,825 0,333333

a) Determine Km e Vm b) Qual a vazo, em L/h, deve ser alimentada no CSTR para que seja obtida uma converso igual a 95% quando a concentrao de substrato alimentado no CSTR for de 60g/L. a) Linearizao para o CSTR:

y = a - b.x y = 15,00527 - 0,49859.x (R=0,99983) D=Q/V=100/500=0,2

b) Se=60g/L X=0,95

Resolvendo: D=0,045147 Q=D.V=22,57342 L/h Pgina 34

3. Utilizando os dados do exemplo do dia 21/03 (ureia/urease), determinar o tempo necessrio para se atingir uma converso de 95% quando a concentrao inicial de enzima for igual a 0,1 mol/dm. Km=0,0266 mol/dm e Vm=1,33 mol/dm.s Eq. de Projeto Batelada:

18/04/12 Processos Fermentativos

23/04/12 Pgina 35

Processos Fermentativos Microrganismos para fermentaes industriais Fontes; Caractersticas Desejveis Meios de Cultivo para fermentaes industriais Tipos de matrias-primas Matrias-primas amilceas Matrias-primas celulsicas Matrias-primas proteicas Outras

Tratamentos prvios (pr-tratamentos) dos meios de cultivo Caractersticas desejveis dos meios de cultivo para uso industrial

Esterilizao em Bioprocessos Esterilizar -> Remover ou inativar TODAS as formas de vida existentes num sistema. O que dever ser esterilizado? Equipamentos Ferramentas e vidrarias Meios de cultivo Ar Tudo que entrar em contato com o M.O. de interesse dever ser esterilizado (Mas nem sempre -> As vezes uma boa assepsia suficiente para o sucesso da fermentao) Terminologia e Modos de Atuao (Tab 3.1 -> Principais termos tcnicos) Pgina 36

 Calor Seco Calor mido Radiaes Agentes qumicos Resumindo: ESTERILIZAO MTODOS FSICOS Calor Seco Calor mido Radiaes UV e Ionizantes Lquidos Gasosos

MTODOS QUMICOS*

* Podem deixar resduos que contaminam o produto Esterilizao por agentes fsicos [uso de vapor] Esterilizao de fermentadores vazios Esterilizao de fermentadores + meio de cultura

Esterilizao do meio de cultivo e do Fermentador Processo Descontnuo

Pgina 37

I : aquecimento II : esterilizao III: resfriamento Te = Temperatura de Esterilizao Ti = Temperatura Inicial Tf = Temperatura final do meio esterilizado = Temperatura da Fermentao T.m= Temperatura mnima letal teta = tempo de esterilizaao (>= 20 min, 121 oC, 2 atm+).

Esterilizao Contnua (Imagem)

02/05/2012 Pgina 38

Esterilizao do Ar 1) Comente sobre a necessidade da esterilizao do ar em alguns tipos de fermentao. 2) Comente sobre os aerossis microbianos. 3) Como pode ser determinado o nvel de contaminao do ar? 4) Comente sobre os amostradores de ar: a) AGI (All Glass Impinger); b) Shipe; c) Amostragem por filtrao. 5) Quais os mtodos que podem ser usados para esterilizar o Ar? Comenteos.

TRABALHO
09/05/2012 Agitao e Aerao em Bioprocessos Referncia: Captulo 14 - Biotecnologia Industrial - vol. II Eng. Bioqumica Balano de Massa para o oxignio num tanque agitado e aerado: [Eq1] Pgina 39

Acumulo = O2 formado - O2 consumido C: conc. de O2 no lquido C*: conc. de O2 que estaria em equilbrio com a conc de O2 no gs (bolha) kLa: coeficiente global de TM no lquido kr: constante especfica de respirao celular X: concentrao do microrganismo (X ou Cm) Suprimento e Demanda de O2

1. Instante em que cessa a aerao (t=0) 2. Instante em que se reinicia a aerao Co: conc. de O2 no EE Cc. conc. crtica de O2 Determinao de kr Sistema operando em EE e interrompe-se o fornecimento de O2. O B.M. fica:

com C(0)=C0
Logo: [Eq2] kr: coef. angular

Pgina 40

Determinao de kLa Reincio da aerao, logo

Mtodo 1: rearranjando a Eq 1

Logo

uma reta cujo coef angular permite calcular kLa

Mtodo 2: Resoluo da Eq 1, o que resulta

Questes: 1. Por que necessrio agitar e aerar um biorreator? Cite exemplos de processos fermentativos que necessitam oxignio. R.: 2. Quais so os fatores que devem ser levados em considerao quando se projeta um sistema de agitao? R.: Fragilidade do material, tipo de mistura (liquido, gs, slido, lquidos miscveis ou no) disperso de liquidos imiscveis, 3. Quais so as principais resistncias TM que a molcula de oxignio encontra num tanque agitado aerado para fermentao? R.: 4. Quais so os principais sistemas para Transf. de oxignio? Comente sobre cada um deles. R.: Pgina 41

5. Faa um BM global para o oxignio num tanque de fermentao agitado e aerado e explique como podemos determinar seus parmetros a partir de dados experimentais. R.: 6. Com relao aos equipamentos destinados agitao: a. comente sobre os agitadores tipo hlice R.: So rotores muito utilizados para lquidos com baixa viscosidade, possuem uma constituio similar aos das hlices marinhas. Apresentam a vantagem de proverem alto fluxo e baixa potencia quando comparada com os outros tipos de impelidores. Devido a sua construo e faixas de operao e caractersticas construtivas, normalmente dispensam a utilizao de redutores.

b. comente sobre os agitadores tipo turbina R.: So impelidores muito eficientes, apresentando uma alta performance de fluxo, e uma grande faixa de aplicaes. So indicados onde se deseja um grande cisalhamento e/ou alto grau de turbilhonamento. Podem ser construdos com lminas fechadas ou abertas, as ps da turbina pode ser reta, ou curvada longitudinalmente, porm sempre em posio vertical. _____________________________ Operao e Controle de Processos Bioqumicos 1 - Princpios gerais para operao; 2 - Condies gerais para a execuo de um processo fermentativo: Matria Prima -> Preparo dos Substratos -> Preparo do Inculo -> Inoculao e Controle da Fermentao Salas de fermentao, Equipamentos e acessrios 3 - Operao de uma indstria: Operaes com os fermentadores Esterilizao dos meios Pgina 42

Controle operacional da fermentao: T, P,O2, agitao, pH, espuma, gases da exausto, reologia 4 - Operaes asspticas de um processo fermentativo 5 - Exemplo de uma operao industrial (Etanol)

Cintica dos Processos Fermentativos Parmetros de Transformao; Curva de crescimento microbiano (em batelada) Classificao dos processos fermentativos: o Cintica da formao de produtos: Produo associada ao crescimento; Produo parcialmente associada ao crescimento; Produo no-associada ao crescimento; Fatores que afetam o crescimento das clulas: o Nutrientes e substrato o Temperatura o pH o Fora Inica (concentrao de ons) Influncia da concentrao do substrato limitante na velocidade especifica de crescimento

Referencias: o o o Cap 6 Biotecnologia Industrial Vol. II Cap 6 Shuler (pg 148) How Cells Grow outras

04/06/12 Cintica dos Processos Fermentativos (cont) Cintica dos Processos Fermentativos Ex. 6.1 (Shuler): Considere os seguintes dados cinticos para um MO que consome glicose num cultivo em batelada t (h) X (g/L) S (g/L) 0 1,25 100 9 2,45 97 16 5,1 90,4 23 10,5 76,9 30 22 48,1 34 33 20,6 36 37,5 9,38 40 41 0,63

a. Calcule a taxa de crescimento mxima b. Calcule o fator de converso SUBSTRATO em CLULAS (rendimento YXS) Pgina 43

c. Qual a concentrao mxima de clulas possvel de ser obtida caso se utilize 150g de glicose e mesmo inculo? - Soluo: [EXCEL] E. 6.4 (Shuler): Uma nova linhagem de leveduras est sendo considerada para a produo de biomassa. Os seguintes dados cinticos foram obtidos num cultivo contnuo (quimiostato). O reator alimentado com concentrao de substrato igual a 800 mg/L e utilizou-se excesso de O2 em pH 5,5 e T=35C D (h^-1) S (mg/L) X (mg/L) a. b. 0,1 16,7 366 0,2 33,5 407 0,3 59,4 408 0,4 101 404 0,5 169 371 0,6 298 299 0,7 702 59

Determine mu_x_max e Ks Qual a vazo volumtrica que fornece mxima produtividade de clulas

06/06/12 Fermentao Descontnua (Batelada): Clculo do nmero de dornas Seja: F: vazo mdia de lquido fermentado que deve ser fornecido continuamente ao setor de tratamentos finais; tf: tempo necessrio para que o mosto fermente (= tempo de fermentao); V: volume til de cada dorna; D: nmero de dornas; td: tempo necessrio para descarregar (esvaziar) uma dorna; tc: tempo necessrio para limpar e carregar uma dorna; F depende - da quantidade de produto final que se deseja obter na unidade de tempo - do rendimento dos tratamentos finais - da concentrao do produto no lquido fermentado

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Seja M a massa de produto final que se deseja produzir num tempo r com rendimento r, assim:

O tempo de descarga, td, pode ser dado como Considera-se que tc=td (facilita a avaliao de D)

(9.1)

V NO pode ser escolhido de forma arbitrria (depende do fabricante)

Dever existir um intervalo de tempo td separando o incio do funcionamento de duas dornas consecutivas Seja o instante ZERO o incio do trabalho da dorna #1. A dorna D dever comear a funcionar no instante (D-1).td. Se a dorna D inicia seu funcionamento (D-1).td = td+tf (D>3) no instante td+tf, temos:

Logo:

ou,

(9.2)

Nos permite calcular o nmero de dornas D desde que conheamos F, V e tf.

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