Universidade Federal do Tringulo Mineiro

Ana Carolina G. Faleiros Javier Emlio Lazo Chica

Biologia Celular Biologia Celular

Aula Pratica 01 Aula Pratica 01
Normas de Biossegurana Mtodos de estudo em Biologia celular:
Introduo Tipos de microscpio Mtodos de obteno de amostras Preparados temporrios e permanentes Confeco de cortes para estudo no microscpio Tipos de colorao Citoqumica Imunohistoqumica Radioautografia Centrifugao

Normas de Biossegurana Biossegurana

O uso do avental (jaleco), bem como o de calados calados fechados obrigatrio. obrigatrio. O trabalho deve ser executado num ambiente limpo e organizado, com muita ateno e cuidados. ateno No permitido fumar, comer e beber, bem como portar ou conservar alimentos no recinto do laboratrio. laboratrio. Antes de iniciar cada experincia ou servio de rotina, servio necessrio ler com ateno a ttcnica a ser executada. necessrio ateno cnica Vidraria e equipamentos danificados no devem ser utilizados.

Normas de Biossegurana Biossegurana

Em caso de risco para os olhos, devem ser utilizados culos de proteo, evitando o uso de lentes de contacto. culos proteo, Na execuo de tcnicas que exijam o emprego de execuo tcnicas presso reduzida (frascos de Dewar, dessecador a vcuo, Dewar, vcuo, etc.) ou de metais alcalinos, obrigatrio o uso de obrigatrio vidraria adequada, luvas e culos. Recipientes de parede culos. fina ou de fundo chato no devem ser submetidos ao vcuo. vcuo. O manuseio de gases venenosos ou irritantes deve ser feito em capela apropriada (com exausto). O mercrio mercrio no deve ser derramado. Caso isto ocorra, o metal deve ser recolhido com uma pina apropriada e o resduo pina resduo deve ser eliminado com carvo, iodo ou flor de enxofre.

Normas de Biossegurana Biossegurana

No caso de manuseio de material com alto grau de risco de contaminao microbiolgica, as luvas devem ser utilizadas. contaminao microbiolgica, No entanto, lembrar que devem ser descaladas logo aps a descaladas aps execuo da tcnica especfica. execuo tcnica especfica. O material contaminado com produtos qumicos ou agentes qumicos biolgicos deve ser tratado adequadamente e/ou descartado biolgicos em recipientes apropriados, contendo sinalizao especfica sinalizao especfica do risco. Ao trmino das atividades no laboratrio, bem como logo trmino laboratrio, aps a execuo de tcnicas especficas, as mos devem ser aps execuo tcnicas especficas, exaustivamente lavadas com sabo llquido e enxugadas com quido toalha de papel.

Introduo
Os conhecimentos sobre clulas progridem paralelamente ao aperfeioamento dos mtodos de investigao.

www.maestria-bmm.iib.uba.ar

Amabis & Marto, 1981

Carl Zeiss (Museu Optsch)

M.O Binocular Sculo XX

M.O. E letrnico Sculo XX

A estrutura celular da retina ( direita, 1 cone e 9 bastonetes; ao centro, 2 clulas bipolares; esquerda, 3 axnios de clulas ganglionares que pertencem ao nervo ptico)

O que luz?

< Comprimento de onda

> Comprimento de onda LV

Ultravioleta Raios X Raios gama

Espectro visvel

Infravermelho Raios T Microondas Rdio

Microscopio eletrnico Microscopio ptico Olho nu

Classificao dos Microscpios

Simple :
Lupa

Composto:
Ocular e objetivas
Fonte luminosa (radiao)

Natural Ftons Artificial Eltrons

Lmpada de quartzo Lmpada de tungstnio

Filamento de tungstnio

Microscpio ptico composto Microscpio ptico Sinnimos :

Microscpio Comum Microscpio Microscpio de Luz Microscpio Microscpio fotnico Microscpio fotnico Microscpio de campo claro Microscpio

Partes integrantes de um microscpio

Uma parte mecnica (estativa) Sistema ptico:
1.- O sistema ptico de observao 2.- O sistema ptico de iluminao

Parte mecnica (estativa)

Tubo ou canho Revlver

Cabea

Corpo Corpo Corpo

Platina
Charriot P
1

Mecanismo de focalizao
1.- Macromtrico 2.- Micromtrico

O sistema ptico de observao

Ocular

Objetivas

Menor

2,5X

10X 20X 3,2X 10X

40X 40X

100X 100X

Maior

LR= K . AN AN= n . sen

LR= 0,61 . 0,55 AN AN= 1,6 . 0.9

O sistema ptico de iluminao Condensador Diafragma

Fonte luminosa

Filtros

Microscpio ptico Microscpio ptico

Microscpio ptico Comum

Mono-ocular

Binocular

Mltiplos observadores

Microscpios especiais

Microscpio ptico composto

Polarizao Comum Contraste de fase Confocal Fluorescncia

Confocal

Fluorescncia Polarizao

Contraste de fase

Contraste de fase

Contraste de fase

Polarizao

Fluorescncia

Confocal

http://www.mc.uky.edu/sharedresource/electron/Equipment.htm

http://handtransplant.com/medschool/anatomy/1-facilities/light-micro.html

http://www.aecom.yu.edu/aif/users/dcox/lr5etc.htm

http://www.aecom.yu.edu/aif/users/dcox/lr5etc.htm

http://www.cs.sunysb.edu/~mueller/research/pop/nerveAl.mov

MICROSCPIOS ELETRNICOS

Microscpio de Transmisso

Microscpio de varredura

www.usp.br/mz/collab/microscopia.html

MTODOS DE OBTENO DE AMOSTRAS

1.- Citologia exfoliativa

www.agendasaude.com.br

Citologia exfoliativa

www.labdml.com.br
Esfregao cervical. (Papanicolau 128X, BANCROFT,1996)

2.- Bipsia por aspirao

3.- Bipsia por agulha

4.- Bipsia incisional e excisional

www.anticorpos.com.br/ C_pc_1.htm

www.unicruz.edu.br

5.- Post-mortem (necropsia)

Post-mortem (necropsia)

Eviscerao:material a fresco.

www.cryonics-europe.org

HE31-04 - FMTM

6.- Experimentao animal.

A remoo de fragmentos nos procedimentos de bipsia e necropsia tm as seguintes finalidades:

Bipsias: Elaborar diagnstico; Avaliar a malignidade de certos tumores; Avaliar margens cirrgicas; Orientar certas formas teraputicas.

Necropsia: Evidenciar a causa mortis.

Tcnicas de preparao das clulas

Tcnicas de Preparao
Preparados temporrios
Exame de clulas vivas;

Preparados permanentes (lminas).

Exemplos: Preparados temporrios

Cultura de clulas e de tecidos; Cultivo de protozorios e vegetais unicelulares; Esperma; Clulas vegetais(pelculas de folhas); Clulas em atividade e/ou em circulao, no organismo de pequenos animais.

Exemplos:
Parasitas em fluidos do organismo animal (ex. Triponossoma cruzi em gota de sangue, entre lmina e lamnula).

- Sol. Salina 0,9% - Lugol - Azul de Toluidina - Sol. Potssio 10%

Comum

Contraste de fase

Interferncia

Campo escuro

PREPARADOS PREPARADOS PERMANENTES PERMANENTES

Preparados permanentes :
formaldedo; Aldeidos: Glutaraldedo

Qumica:

Mercuriais: Fixador de Zenquer. Metanol; Alcolicos Alcol etlico Congelamento e dessecao Calor Ar seco

Fixao

Fsica

Fixao
150ml

www.hurnp-uel.br

10ml
FMTM

Desidratao Diafanizao

Infiltrao Ou impregnao

fragmento de tecido bem endurecido. Parafina metacrilatos Tissue prep Gelatina Resinas plsticas

 Corte (processo de microtomia)

Micrtromo Leica -modelo 2125 e 2135. FMTM/

Preparados permanentes
vantagem! clulas preservadas (fixadas e coradas) melhor demonstrao de seus componentes.

Preparados permanentes

Desvantagem = artefatos.

Tipos de Colorao Colorao

Tipos de Colorao

Simple Especial

Colorao Simple
Bsicos (catinico): Hematoxilina (roxo) cidos (aninico): Eosina (rosa)

Colorao Simple
Bsicos (catinico): Hematoxilina (roxo) Azul de toluidina e Guinsa (metacromasia) Azul de metileno cidos (aninico): Eosina (rosa) Orange G Fucsina cida

Colorao Simple
Bsicos (catinico): Ionizao bsica Grupo amina (-NH2) cidos (aninico): Ionizao cida Grupos : Carboxila (-COOH) Hidroxila (-OH) Sulfato (-HSO4) fosfato (-H2PO4)

*Colorao e montagem
Colorao

Colorao pelo mtodo da hematoxilina/eosina.

Montagem permanente com lmina e lamnula para microscopia ptica.

Cortes (lminas) coradas:

Bipsia renal-B99-4180 FMTM (Hematoxilina-eosina 400X),

Epitrilo ciliado:Hematoxilina/eosina (HE). Ncleos roxos e citoplasma rseo.

SNC: azul de toludina.

Colorao Especial
Citoqumica / histoqumica
Reaes qumicas + especficas

Tcnicas diversas

*Citoqumica/histoqumica
Exemplos: Reao de PAS para glicognio e glicoprotenas. Reao de Feulgen para DNA.

Reao de PAS (Periotic Acid Schiff)

1- Oxidao pelo cido peridico. 2- Colorao pelo reativo de Schiff. Glicognio e glicoprotena com colorao magenta:
Fgado: PAS sem e com digesto prvia do glicognio.

Enzimas
A demonstrao citoqumica da enzima feita pela incubao desses cortes em soluo contendo o substrato adequado. Uma terceira substncia que cora o produto ou subproduto da reao enzimtica utilizada.

Criostato e interior. Patologia Cirrgica-FMTM.

Rim(tbulos): fosfatase cida.

*Imunocitoqumica e imunohistoqumica
So reaes bem especficas. Localizam com preciso, um determinado tipo de molcula, excluindo todas as outras, pois se baseia na reao antgeno-anticorpo.
www.ciencia-hoy.retinawww.ineti.pt/

Reao imunocitoqumica com produo de fluorescncia (imunofluorescncia).

Rim (B99-4180): HE Tcnica de imunofluorescncia. Bipsia renal: B01-4038 FMTM

Imunohistoqumica

Procedimento de imunohistoqumica.

*Radioautografia
Estuda locais de sntese e o destino das macromolculas. Baseia-se: Deteco de istopos radioativos fornecidos clula, como matria prima; Sensibilidade das emulses fotogrficas as radiaes ionizantes emitidas, posteriormente por esses istopos.

Radioautografia

Leucina tritiada(insulina). M.E.

JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1977.

Timidina tritiada, linfonodo M.O.

Fracionamento celular ou Centrifugao diferencial ou Centrifugao fracionada & Ultracentrifugao analtica

BIOLOGIA MOLECULAR

Centrifugao fracionada
Por centrifugao possvel obter organelas celulares em estado de pureza e, em seguida, estudar suas propriedades qumicas, fsicas e biolgicas.

Junqueira,2000.

Ultracentrifugao analtica

Biologia Celular, FMTM

BIOLOGIA MOLECULAR Engenharia Gentica

Anlise molecular do DNA

Tcnicas do DNA recombinante

Tcnicas do DNA recombinante:

Seqenciamento do DNA. Reao em cadeia da polimerase (PCR). Hibridao in situ de cidos nuclicos. So usados: Equipamentos apropriados; Enzima; Sondas; Microrganismos (vrus e bactrias).

O OBJETIVO DE TODOS OS MTODOS DEVE SER:

REMBRAMDT(1606-1669)

DIJANIRA (1914-1979).

Universidade Federal do Tringulo Mineiro

Ana Carolina G. Faleiros Javier Emlio Lazo Chica