Manual de laboratorio de Biotecnologa

NORMAS DE SEGURIDAD PARA LA UTILIZACIN DEL ESPACIO EN PRCTICAS DE LABORATORIO *Use bata de laboratorio para cada prctica y no utilice calzado destapado *Use guantes, tapaboca, lentes de proteccin, y mscara con filtros, cuando se requieran. *No pipetee con la boca, use un pipeteador *No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningn reactivo pues sus vapores pueden ser txicos *No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio *No use durante las prcticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares *No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que all se produce *No se admiten en el laboratorio personas que no estn matriculadas en el respectivo curso, por favor no reciba visitas *No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo UTILIZACIN DE REACTIVOS *Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo prepar y la fecha de preparacin *No arroje por los sumideros cidos, bases o algn otro reactivo, por favor depositelos en los recipientes de desecho *Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, as se previene que algn compaero se queme la piel o se deteriore la ropa. *No arroje al piso ningn reactivo *No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la basura.

Prctica N. 1: CULTIVO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES INTRODUCCIN

El cultivo in vitro, micropropagacin o propagacin vegetal in vitro, es el cultivo de clulas, tejidos u rganos de plantas en un medio asptico que le aporta los nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones fsicas y qumicas apropiadas, las clulas tienen la habilidad de desarrollarse, desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un organismo entero" (Dodds & Roberts, 1985), en cuyo caso, la nueva planta ser genticamente idntica a la planta madre, y su desarrollo se dar en un periodo de tiempo mucho mas corto. As pues, para lograr cualquiera de estos propsitos se debe iniciar con la utilizacin de pequeas muestras de tejidos vegetales (explante) que tras una adecuada desinfeccin superficial, son transferidos aspticamente a medios nutritivos lquidos o semislidos y almacenados bajo condiciones ideales de temperatura y fotoperodicidad que garanticen un rpido desarrollo. Los medios de cultivo, lquidos o semislidos, difieren bsicamente por la presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y energa (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminocidos, suplementos orgnicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintticos conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros qumicos vegetales secretados en un determinado tejido y que actan en el mismo tejido, o en otro distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulacin del crecimiento en plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscsico y Etileno. OBJETIVO GENERAL: Esta prctica pretende que el estudiante conozca e implemente algunas tcnicas bsicas del cultivo de tejidos vegetales. OBJETIVOS ESPECFICOS: Inducir desdiferenciacin tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos vegetales.

Acelerar el crecimiento de plantas utilizando medios nutritivos suplementado con fitohormonas. Conocer la utilidad y el manejo del equipo bsico, instrumentos y herramientas de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. REACTIVOS Y MATERIALES A EMPLEAR: cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D), 6-benzilaminopurina (BA), hipoclorito de sodio, alcohol industrial, etanol, agar, sacarosa, medios de cultivo, bistur, pinzas, mecheros, frascos, placas de vidrio, gasa, algodn, papel de aluminio, papel craft, vinilpel, cinta de enmascarar, probetas, erlenmeyer, pipetas, balanza, pH-metro, agitador magntico, cmara de flujo laminar, guantes, tapabocas, gorro, material vegetal (frjol verde, zanahoria, plantas aromticas) PROCEDIMIENTO 1. Preparacin de los medios de cultivo: Para esta prctica se deben preparar y esterilizar bajo condiciones de calor hmedo (15 psi/ 121 C/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo: Induccin de callos: preparar 60 ml de MS (ver tabla 1)(pH: 5.7-5.8), suplementado con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relacin auxina:citoquinina (1:1 o 2:1) Crecimiento: preparar 60 ml de MS (ver tabla 1) )(pH: 5.7-5.8), enriquecido con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relacin auxina:citoquinina (1:1 o 1:2) 2. Proceso de desinfeccin del material vegetal Una vez lavado el material vegetal con agua y jabn, se sumerge inicialmente en etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de sodio (2%, 15 min.) al que previamente se le han agregado algunas gotas de Tween 80. Pasado este perodo de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres lavados consecutivos (5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estriles a los medios de cultivo y se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad. SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRCTICA

1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales una vez por semana y anotar los avances que estos presenten, incluyendo aparicin de callos, contaminaciones, organognesis y aumento en longitud o tamao. 2. Realizar subcultivos rutinarios cada cuatro semanas y continuar la prctica segn el desarrollo de cada uno de los grupos de trabajo Tabla 1. COMPOSICIN Y PREPARACIN DEL MEDIO MURASHIGE Y SKOOG (Medio MS) (MurashigeSkoog, 1962) Concentracin de la Volumen de la Constituyente solucin madre solucin madre (g/L) por litro de medio Macros NH4NO3 16,5 KNO3 19 100 ml CaCl2.2H2O 4,4 MgSO4.7H2O 3,7 KH2PO4 1,7 Micros MnSO4.H2O 1,69 ZnSO4.7H2O 0,86 H3BO3 0,62 KI 0.083 Na2MoO4.2H20 0.025 10 ml CuSO4.5H2O 10 ml de sol. 25 mg/100ml CoCl2.6H2O 10 ml de sol. 25 mg/100ml Fuente de hierro FeSO4.7H2O 0.00556 10 ml Na2EDTA.2H2O 0.00746 Vitaminas Inositol 10 Nicotnico 0,05 HCl-Piridoxina 0,05 10 ml Glicina 0,2 HCl-Tiamina 0,01 Adicionar al medio 3% de sacarosa y 0.7% de agar. GLOSARIO

Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintticas), que producen elongacin celular, y en algunos casos divisin celular; frecuentemente inducen la aparicin de races adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los vstagos). Ejemplo el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintticas), que inducen la divisin celular y frecuentemente la formacin yemas adventicias (en los vstagos). En la mayor parte de los casos inhiben el desarrollo de races adventicias. Las citoquininas disminuyen la dominancia apical. Ejemplo: 6benzilaminopurina (BA). Callo: Tejidos no organizados, formados por clulas diferenciadas y no diferenciadas, que se dividen de forma activa y que generalmente se originan en zonas daadas (por heridas), o en cultivo de tejidos. BIBLIOGRAFIA farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132. Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia, Seccional Medelln. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronoma. Murashige T., Skoog F., 1962, A revised mdium for rapid growth and bioassays with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15:473-97 Pierik R.L.M., 1990, Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa, Madrid.

Prctica No. 2 CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS

INTRODUCCIN El cultivo de clulas animales permite la realizacin de diferentes actividades docentes que tienen importancia en el mbito de la biotecnologa. Los diferentes tipos celulares animales tienen dos opciones de crecimiento, en suspensin y

adheridas, el estudiante deber conocer los dos sistemas. Para ello deber realizar cultivos a corto plazo mximo una semana y realizar dos experiencias, la primera la obtencin de cromosomas y la segunda la criopreservacin. OBJETIVO GENERAL Dar al estudiante las bases del cultivo de clulas en suspensin (linfocitos) y de clulas adheridas (lnea celular). OBJETIVOS ESPECFICOS Obtener cromosomas de un cultivo de linfocitos de sangre de diferentes especies.de mamferos. Cultivar clulas adheridas, para establecer cambios morfolgicos durante su crecimiento. Criopreservar clulas conservando las caractersticas morfolgicas iniciales MATERIALES Jeringa de 2,5cc, frasco de cultivo ( Boterito), pipeta de 5ml , pipeta de 1 ml, incubadora a 37oC, tubos cnicos de centrfuga, centrfuga, pipetas pasteur, lminas portaobjetos, lminas cubreobjetos, aceite de Inmersin, microscopio de luz (100X), heparina, medio de cultivo RPMI, suero fetal bovino, extracto de frijol, solucin hipotnica de KCL 0.075M, colchicina, metanol, cido actico, colorante de Giemsa PROCEDIMIENTO La muestra que ser suministrada a los estudiantes, ser tomada en forma estril de la vena yugular en una jeringa heparinizada (Liquemine, Roche). Estas muestras han de ser identificadas. La siembra debe hacerse en condiciones estriles y se sembrarn 10 gotas de sangre en 5 ml de medio RPMI (Roswell Park memorial Institute) suplementado con suero fetal bovino al 10% y 100ul de Fitohemaglutinina (50Ugrml). Se lleva el cultivo a una incubadora de 37oC por 72 horas. OBTENCIN DE CROMOSOMAS Se adiciona al cultivo 0,1 ml de Colcemid (5ugr/ml)y se deja en incubacn por 30 minutos, luego se centrifugan 10 minutos a 1800 rpm. Se descarta el

sobrenadante y se adicionan 8 ml de solucin hipotnica y se homogeniza bien la muestra y se incuba 10 minutos a 37oC , posteriormente se adiciona 1 ml de Carnoy ( Metanol: Acido actico 3.1), se homogeniza y se centrfuga.1800 rpm x 10 minutos. All pellet se le adicionan 10 ml, se homogeniza y se deja por 30 minutos en refrigeracin (5oC). Se centriufa por 10 minutos, el pellet se resuspende en 5 ml de fijador y se vuelve a centrifugar, esta operacin se repite dos veces mas. Al final el pellet se resuspende en 0,5 ml de Fijador , finalmente se colocan 2 o 3 gotas de fijador sobre la lmina, esta se deja secar. Las lminas son coloreadas con colorante de Giemsa y se observan al microscopio las metafases. Seguimiento: El cultivo debe revisarse a las 24 horas para evidenciasr signos de contaminacin. Las lminas una vez coloreadas deben revisarse para observar la presencia de metafases y si es posible tomar fotograficas para analizarlas. GLOSARIO Medio de cultivo : Solucin de aminocidos, vitaminas y sales que es capaz de soportar el desarrollo celular Colchicina: Inhibidor de la despolimerizacin de los microtbulos, necesario para detener las clulas en metafase Fitohemaglutinina: Mitgeno, utilizado para promover la divisin de los linfocitos en el cultivo Cultivo: Procedimiento mediante el cual una suspensin de clulas son puestas a crecer en condiciones controladas

Prctica No.3 CULTIVO Y CRIOPRESERVACIN DE CELULAS ANIMALES

INTRODUCCIN Dentro del proceso de aprendizaje el estudiante conocer el comportamiento de las clulas que crecen adheridas y sumado a esto realizara un ejercicio de cri preservacin de las mismas.

Las clulas que crecen dependientes de anclaje son aquellas que necesitan un soporte slido para su desarrollo in Vitro, usualmente son las clulas del cuerpo que sirven de sostn, fibroblastos, tejido conectivo. Ellas crecen tomando formas especificas que sirven para su identificacin y caracterizacin. La cri preservacin naci hace aproximadamente 50 anos y puede definirse como el procedimiento mediante el cual se conservan las clulas a temperaturas inferiores 00C , esto se pudo dar gracias a dos desarrollos importantes, el primero el descubrimiento de los crioprotectores y el desarrollo de sistemas de fri. Los crioprotectores mas usados son el glicerol y el dimetil sulfoxido son molculas pequeas, hasta 150 kd que entran a la clula desplazando el agua intracelular lo que impide que a bajas temperaturas se formen cristales de hielo que rompen la membrana. Posteriormente se realiza la curva de congelacin que en ocasiones es muy rpida, caso fibroblastos o lenta caso espermatozoides. Se pueden congelar cualquier tipo de clulas, pero lo ms importante es que al descongelar se encuentre viabilidad y funcionalidad de las mismas, por eso aunque se hable de congelacin es igual o ms importante la descongelacin, esta se hace transfiriendo las clulas a 370C por 5 minutos. Para que la preservacin de las clulas pueda hacerse por largo tiempo se utilizan sistemas que producen o generan fri, en el primer caso la nevera de hasta menos -800C, en el segundo gracias a someter a presin los gases estos se licuan a temperaturas bajas, en el caso del nitrgeno -1960C y el helio -2100C. Criopreservar es detener el tiempo, esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se congelan clulas germinales, espermatozoides y/o vulos, pues no se puede asegurar que la respuesta de la informacin gentica a los efectos medioambientales sea la misma que cuando fueron congeladas. OBJETIVO GENERAL Conocer el proceso de congelacin y descongelacin en un modelo de clulas dependientes de anclaje. OBJETIVOS ESPECFICOS Conocer los cambios morfolgicos que ocurren en los cultivos de clulas dependientes de anclaje. Criopreservar clulas eucarioticas Materiales

Clulas, pipetas de 5 ml, pipetas de 1ml, cajas de petri para cultivo, tubos cnicos de centrfuga, crioviales, congelador de - 80 oC, microscopio, centrfuga, medio de cultivo Ham F12, suero fetal bovino, solucin de Tripsina, glycerol o Dimetil sulfxido, solucin Salina Bufferada Procedimiento Las clulas son recuperadas cuando la poblacin alcanza el mximo dentro del frasco de cultivo, idealmente las culas se han de cosechar cuando estn en su fase mayor de crecimiento (log phase). Las clulas se deben mantener a 37 oC, con un ph entre 7.2 y 7.5, una osmolaridad de 220 mosm, alta humedad , con una fase gaseosa en equilibrio (C02 con el bicarbonato del medio) y en lo posible protegido de la luz. CULTIVO Y CRIOPRESERVACION A cada grupo se le entregara una suspensin de clulas, que deber lavar , contar (al menos mirar la microscopio cuantas tiene por campo) y determinar su viabilidad. Ellos sembraran en cajas de petri de 30 mm con medio RPMI suplementado con suero al 10%, algn grupo puede usar otro medio como Hams F12 o Dulbecco. All las dejarn observando los cambios morfolgicos hasta la confluencia, una vez confluentes procedern a soltarlas y a criopreservarlas. Tripsinizacin de clulas adherentes Evalu la densidad celular de su cultivo (frasco, botella, etc), si tiene confluencia o usted estima conveniente remover las clulas pase al paso No 2., remueva el medio de cultivo (OPCIONAL: Lave una o dos veces con solucin salina bufferada (PBS) su cultivo con el fin de remover las protenas, adicione 1 ml de Tripsina 0.25 % y djelo por 10 minutos a 37oC. A los 5 minutos observe si las clulas se estn soltando. Cuando las clulas estn totalmente sueltas, adicione 5 ml de medio sin suero fetal bovino, transfiera la suspensin celular a un tubo de ensayo y centrifuge a 1800 rpm x 10 minutos. Descarte el sobrenadante y resuspenda en 5 ml de medio con suero fetal bovino y dependiendo de sus necesidades, determine la concentracin y la viabilidad Ajuste con medio de cultivo de acuerdo con sus necesidades, si simplemente va a duplicar un cultivo existente aada 10 ml de medio con suero y siembre de a 5 ml en una cada frasco Criopreservacin

A 4 ml de suspensin de clulas agregue 4 ml de suero fetal bovino y 1 ml de glycerol, homogenize y transfiera a los crioviales. Una los crioviales y envulvalos en gasa. Llvelos a -80 oC, y djelos all mnimo 72 horas. Descongelacin Tome un vial y llvelo al bao de maria a 37 oC espere a que el vial se descongele totalmente, transfiera el contenido del vial a un tubo de centrfuga con medio de 5 ml de medio de cultivo, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de medio con suero fetal bovino al 20%, siembre las clulas en las cajas de cultivo y observe el crecimiento SEGUIMIENTO 24 horas despus de la siembra de debe verificar si hay o no contaminacin. Cada 24 horas se observa el cultivo para ver el crecimiento de las clulas y la formacin de monocapas Verificacin del crecimiento despus de la descongelacin. GLOSARIO Criopreservacin: Procedimiento de almacenamiento celular mediante el cual estas se conservan vivas a temperaturas inferiores a - 70 grados centgrados Tripsinizacin: Procedimiento mediante el cual, se aplica una solucin de tripsina a clulas adheridas para que estas se suelten. Vial: Recipiente pequeo, de un volumen no mayor a 2 ml usado para almacenar clulas. Pasaje: Procedimiento mediante el cual, una vez formada la monocapa de clulas estas se sueltan y son sembradas en dos o mas nuevos frascos de cultivo. BIBLIOGRAFA 1. 2. 3. 4. 5. 6. Bergenholtz, A., Halimus, G., Hanstrom, m. anat. Rec. 189, 4.42.1977. Burrows, M.T. J.A.V.M.A. 55. 20-57. 1910. Carrel, A. J.J. Exp. Med. 15, 516-528.1912. Curtis, A.S.G., Varde, N.J. Nat. Cancer. Inst. 33,15-23.1964. Elsdale, T., Tolbert, W.R. Scientific American. 54, 626-637.1972. Freshney, R.I. Culture of animal cells. A manual of basic technics. Alan, R. Ciss. Inc. New York. 1987.

7. Gngora, A, Villamil, L.C. Vera, V., Parra, JL., Ramrez, G., Lpez, G. Aislamiento de un herpes virus bovino tipo-1 (HVB-1) de secrecin nasal y esmegma prepucial en un toro reproductor. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLIII. No. 1.pp 43-48. 1995. 8. Harrison, R.G. Proc. Soc, Exp. Biol. 4, 140-143. 1907. 9. Harrison, R.G. J. Exp. Zool. 17, 521-544. 1914. 10. Jaime, J., Villamil, L.C., Vera, V., Ramrez, G. infeccin persistente con el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en hatos lecheros de la Sabana de Bogot. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLIV. No. 1 pp 4654.1996. 11. Kler, G., Milstain, C. continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefine specificity. Nature. 256, 495-497. 1975. 12. Leighton, J.J. Nat. Cancer. Inst. 12,545-560. 1951. 13. Littlefield, J. W. Science. 145, 709-710. 1964. 14. Mendigaa, C., Vera, V., Villamil, L.C., Jaime, J. Caracterizacin proteica de cepas colombianas citopticas y no citopticas del virus de la Diarrea Viral Bovina. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLII. No. 1 pp 5258. 1994. 15. Moscona, A.A, Moscona, M.M. J. Anat. 86,287-290. 1952. 16. Morgan, S.J.; Darling, D.C. cultivo de clulas animales. Editorial Acribia. 1993. 17. Parulekar, S., Hassel, T., Tripathi, S. Recent development in vertebrate cell culture technology. In: Wang, J., Frienlander, M. Academic Press. USA. Pp 145-211. 1992. 18. Pollard, J.: Walker, J. Animal cell culture. In: Methodos In Molecular Biology. Fd. Pollard J. And Walker H. in Humana Press, New Jersey, Vol 5. 1990. 19. Parra, J.L., Vera, V., Villamil, L.C., Ramrez, G. Seroepidemiologa de la diarrea viral bovina en explotaciones lecheras de la Sabana de Bogot. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLLL. No 1. Pp 29-45. 1994

Prctica No. 4 Produccin in vitro de embriones de ratn

INTRODUCCIN Desde hace tiempo el hombre ha querido conocer los secretos ms ntimos de su naturaleza, especialmente en lo relacionado con el desarrollo, esto es, el proceso mediante el cual los gametos fusionados en el zigoto se convierten en un ser humano. Para ello ha utilizado diferentes modelos algunos mas cercanos evolutivamente que otros a si mismo. Se sabe mucho de la biologa del desarrollo en especies como la Drosophila Melanogaster o el Xenopus laevis, estas especies

de genoma relativamente pequeo y corto intervalo generacional no permiten extrapolar totalmente a los eventos del desarrollo mamfero. El ratn es el modelo mas parecido al humano, por su versatilidad se ha convertido en la especie de eleccin para el estudio de la biologa de los embriones y la gentica del desarrollo Se conoce desde hace ms de 30 aos que se pueden manipular gametos y embriones, gracias a ello y a los diferentes avances conceptuales y tcnicos hoy en da esa manipulacin puede ser usada en el tratamiento de la infertilidad humana. La falla reproductiva, entendida como la inhabilidad para concebir, gestar y parir un individuo se puede cuantificar y expresarla como una proporcin determinada en cada especie siendo el ser humano una de las ms ineficientes, en esta especie si una pareja no se embaraza luego de un ao sin relaciones sexuales sin proteccin se considera infrtil. Una de las tcnicas mas usadas hoy en da es la inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (ICSI), una tcnica costosa y de la cual an se desconocen algunos aspectos de sus efectos sobre los nacidos vivos, es por eso que se plantea la posibilidad de utilizar las tcnicas de manipulacin existentes con el fin de intentar obtener fertilizacin de la forma mas natural posible. En este manual se presenta informacin derivada de los procedimientos de manipulacin de gametos y de ciruga utilizados para el desarrollo del proyecto de investigacin " Efecto de la remocin de la Zona Pelcida sobre el desarrollo embrionario" Para incrementar el nmero de oocitos que son ovulados se administran gonadotropinas exgenas a las hembras antes del apareamiento, permitiendo recuperar grandes nmeros ( hasta 35, de nuestra experiencia ) de embriones preimplantatorios que pueden utilizarse en los diferentes tipos de experimentacin ( microinyeccin de huevos, infeccin viral de mrula y marcaje metablico de los embriones con radioistopos). La fuente mas comn de gonadotropinas son las que se obtienen del suero de yegua preada (PMSG), esta tiene un marcado efecto estimulador del desarrollo folicular ( accin folculo estimulante, FSH) y la gonadotropina corinica humana (hCG) cuyo efecto es similar a la funcin de la hormona luteinizante (LH). Una superovulacin eficiente depende de la edad, el peso y las condiciones de salud. Usualmente se utilizan hembras prepberes entre las 3 y 5 semanas de edad, el peso bajo o la enfermedad alteran la respuesta a las gonadotropinas y reducen el nmero de oocitos obtenidos en la superovulacin.; la dosis de gonadotropinas empleada con mayor frecuencia es 5 UI de PMSG y 5 UI de hCG estas son inyectadas intraperitonealmente en volmenes muy bajos que no exedan 0.2 ml; con un intervalo de 42 a 48 horas en su administracin, primero es la PMSG y posteriormente la hCG. Una cepa de ratones se clasifica como buena respondedora cuando ovulan entre 40 a 60 oocitos y mala respondedora si ovulan 15 o menos .

Adems para maximizar el nmero de oocitos fertilizados es necesario mantener ratones con fertilidad probada, un alto conteo espermtico y una buena proporcin de formacin de tapn vaginal en las hembras apareadas. Materiales y Equipos Ratones, Jeringa de 1cc, Tijeras y Pinzas, Cajas de Petri de 30mm, Cajas de cultivo de cuatro pozos, Agujas calibre 16, Pipetas Pasteur (2), Mechero, Esteromicroscopio y/o microscopio invertido, Algodn, Alcohol, Gonadotropina Srica de Yegua Preada, Gonadotropina Corinica Humana, Medio de cultivo Hams F10 u otro similar, Albmina Srica Bovina, Solucin salina Bufferada INYECCION INTRAPERITONEAL Para realizar la inyeccin intraperitoneal se deben tener en cuenta dos factores: el primero relacionado con tomar el ratn de la caja y el segundo el proceso de inyeccin propiamente dicho. Recuerde que usted debe utilizar un adecuado equipo y proteccin para evitar ser herido por el animal. Para la primera tome el ratn por la cola y colquelo en una superficie firme y seca, no mantenga el ratn por mas dos 2 minutos de la cola pues causa una gran cantidad de estrs. Coloque el ratn en una superficie firme y rugosa de forma que el animal pueda fijarse en ella por sus garras. Con la otra mano , una vez el ratn esta fijo, tmelo por la nuca asegurndose de abarcar toda la piel de la zona, finalmente coloque la cola del animal entre los dedos y permita que la otra mano quede libre para hacer cualquier procedimiento de manipulacin. Para la superovulacin se utilizan generalmente jeringas de tuberculina, previamente llene la jeringa con el volumen que vaya a inyectar. Fije un ratn de la forma anteriormente mencionada, incline el animal 45 o con la cabeza abajo, con esta prctica los intestinos se desplazan cranealmente al sitio de inyeccin. Limpie con alcohol el rea donde va ha hacer la inyeccin. Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen formando un ngulo de 30oC, aspire una pequea cantidad de aire con el fin de asegurar la localizacin de la aguja. En la regin entre el diafragma y la vejiga, administre el fluido que vaya a inyectar. Sacrificio por dislocacin cervical Tome el ratn por la cola y pngalo en una superficie firme y rugosa de forma que el animal pueda fijarse en ella por sus garras, con la otra mano fije el ratn de la nuca asegurndose de tomar la mayor cantidad de piel posible, fije la nuca y estire el animal de la cola, hasta sentir que la cabeza se separa de la columna vertebral.

FABRICACIN DE LAS PIPETAS PARA RECOLECTAR Y MANIPULAR EMBRIONES Las pipetas utilizadas para la manipulacin de vulos y embriones se fabrican en el laboratorio, tomando Pipetas Pasteur , usualmente de 2 " de longitud en su parte estrecha. Estas se mantienen estriles en recipientes y son adelgazadas hasta el dimetro necesario en el momento de la manipulacin embrionaria. Para adelgazarlas se calientan las pipetas Pasteur con una llama fina , bien sea de mechero a gas o de alcohol, se fijan los dos extremos, cuando est lo suficientemente caliente y se siente que el vidrio est blando , se estira para producir un tubo con un dimetro interno de aproximadamente 200 (m. Es de anotar que se hace el estiramiento manteniendo los dos extremos fijos, no se trata de hacer un capilar con un extremo cerrado, se hace un tubo muy delgado, posteriormente con el microscopio se observa el dimetro de la pipeta y se corta por el sitio que mas se ajuste al tipo de clula o de procedimiento a realizar. Con la llama se deben pulir los bordes de la pipeta. FERTILIZACIN IN VITRO Se inyectan las hembras con PMSG y hCG para inducir la superovulacin. Obtencin de espermatozoides: Los machos se sacrifican por dislocacin cervical 12 horas despus de que las hembras han sido inyectadas con hCG, se deben utilizar machos que se hayan tenido por lo menos 3 das de abstinencia sexual. Se realiza una incisin media ventral y se fija el animal por las extremidades, una vez abierto se identifica y extrae la cola del epiddimo, removiendo la mayor cantidad de tejido adiposo como sea posible. Se corta el conducto deferente lo ms cerca posible al epiddimo y luego se coloca en un plato con 500 l de medio de cultivo suplementado con 30 mg/ml de albmina srica bovina. Utilizando unas pinzas finas se presiona el epiddimo para facilitar la salida de los espermatozoides. Los espermatozoides as obtenidos se deben incubar durante 90 minutos a 37C con 5 % de CO2 para capacitarlos. Obtencin de vulos Se sacrifican las hembras por dislocacin cervical 12.5 horas despus de la inyeccin de la hCG, se extraen los oviductos, se sacan las masas de oocitos y se colocan en un plato con 1000 l de medio de cultivo con 30 mg/ml de albmina srica bovina y se llevan a incubadora con 5% de CO2 en aire y 37C de temperatura. Luego de que hayan transcurrido 13.5 horas despus de haber

inyectado las ratonas con hCG se adicionan 100 l de espermatozoides a los platos donde se encuentran los oocitos, se debe ajustar a una concentracin de espermatozoides mviles de 1x106 a 2x 106 espermatozoides/ml. Incubar los espermatozoides con los oocitos durante 4 horas a 37C. Luego de que hayan transcurrido las 4 horas de incubacin se transfieren los oocitos a medio de cultivo con 4 mg/ml de albmina srica bovina, con la menor la menor cantidad de espermatozoides como sea posible. Unas 12 a 16 horas posterior a la inseminacin de los oocitos, se evalua la fertilizacin mediante la observacin de los pronucleos masculino y femenino y la extrusin del segundo cuerpo polar. CULTIVOS EN MICROGOTAS En un plato de cultivo estril se vierten gotas de 20 a 40 l de medio M16, luego se cubren con aceite de parafina y se transfieren los embriones al medio de cultivo, por ltimo se llevan a una incubadora con atmsfera de CO2 al 5% y se verifica su desarrollo hasta llegar al estadio de blastocisto SEGUIMIENTO Una vez fertilizados a las 18 horas se realiza la evaluacin de los pronucleos, es decir la fertilizacin. Cada 24 horas se evalua el desarrollo embrionario hasta el estado de blastocisto. GLOSARIO Oocito.: Gameto femenino Oocito maduro: Gameto femenino que una vez ovulado se encuentra en metafaseII Pronucleo: Estado del desarrollo embrionario en el que se encuentra previos a la singamia. Singamia: Proceso mediante el cual se unen los genomas femenino y masculino (pronucleos). Embrin: Estado de desarrollo del ser, previo a la implantacin. Blastocisto: Estado de desarrollo del embrin en el que se forma una cavidad, previo a la implantacin.

Gonadotropinas : Hormonas que se suministran a los animales para la induccin del desarrollo folicular y ovulacin. Peritoneo : Capa de tejido que cubre la cavidad abdominal.

Prctica No. 5 ESTABILIZACIN DE LA MATERIA ORGNICA MEDIANTE PROCESOS BIOXIDATIVOS AEROBIOS (COMPOSTAJE)
INTRODUCCION La tierra se considera como un sistema termodinmico cerrado. En consecuencia, la nica posibilidad de generacin de nueva biomasa es el reciclaje de la materia. Los denominados biosistemas han evolucionado en consecuencia con esta condicin termodinmica hasta generar una clasificacin, basada en la transformacin de la materia, que determina la configuracin de tres tipos de organismos: Productores, consumidores y descomponedores. Se denomina como productores a los biosistemas que estn en capacidad de biotransformar la energa lumnica procedente del sol en energa qumica almacenada en forma de molculas reducidas. El segundo tipo de biosistemas que se denominan consumidores se caracterizan por ser intermediarios de la energa qumica. Finalmente, se denominan descomponedores a los organismos especializados generar energa qumica a expensas de la biooxidacin de la biomasa generada en los otros dos tipos de biosistemas. Con la consolidacin del urbanismo en el siglo XX se estableci una doble problemtica: En primera el deterioro paulatino de los suelos con vocacin agrcola y en segunda instancia la contaminacin ambiental por acumulacin de materia orgnica. Ante esta doble problemtica, se vienen buscando alternativas cientficas y tecnolgicas que puedan dar respuesta en ambos sentidos: En el sentido agronmico buscar formular sustratos que permitan recuperar la fraccin orgnica del suelo y, en el sentido ambiental al minimizar el impacto de la acumulacin de materia orgnica. El compostaje se considera hoy como una de las alternativas ms plausibles a la condicin anotada. El compostaje se puede entender como el proceso acelerado e irreversible de la degradacin biooxidativa y catablica seguida de un proceso de resntesis de un substrato orgnico slido, a travs de organismos descomponedores endmicos (normalmente artrpodos y microorganismos), endo y exoenzimas presentes en el medio, que actan sobre la matriz orgnica hasta la obtencin de un producto heterogneo denominado compost, con apariencia

completamente independiente del material de origen y que se caracteriza por su estabilidad qumica y sanitizacin, con respecto a parmetros de referencia establecidos por un patrn. El objeto de la presente prctica es dar una serie de herramientas a los estudiantes sobre los tratamientos bioxidativos de materiales orgnicos de desecho, para la generacin de insumos agrcolas. OBJETIVO GENERAL Disear, producir y evaluar un proceso bioxidativo aerobio (compostaje) bajo condiciones de laboratorio. OBJETIVOS ESPECIFICOS Definir las materias primas aptas para el proceso de compostaje mediante la evaluacin de variables fsicas, qumicas, biolgicas y ambientales. Establecer las mezclas adecuadas para dar inicio a un proceso de compostaje. Evaluar cinticamente el proceso (variables fsicas, qumicas y biolgicas) para definir el punto final del proceso en consideracin a la normatividad vigente. MATERIALES Como materias primas se utilizarn residuos slidos urbanos (con separacin en fuente), gallinaza (estircol) y aserrn. Adems un reactor con capacidad para 25 lts segn se presenta en el esquema siguiente.

Sistema de biofiltros

aire

Termmetro

METODOS Definicin de materias primas. En funcin del origen, la humedad y la relacin carbono/nitrgeno se estima la mezcla ms adecuada para iniciar el proceso. Estudio cintico. Una vez definidas la mezcla inicial, con intervalos de dos semanas, obtener una muestra para la realizacin de un estudio cintico. Para el caso presente se realizar el estudio por 60 das. Determinacin de punto final del proceso y calidad del producto final. Carbono orgnico Para determinar la cantidad de carbono orgnico, las molculas orgnicas deben romperse en unidades de carbono simples y ser convertidas en una forma molecular sencilla que pueda medirse de forma cuantitativa. Se sigue el protocolo descrito a continuacin.
Transferir a un Matraz de Erlenmeyer 1.0 g (0.5 g o menos s es alto en materia orgnica el material debe pasar una malla N 80)

Adicionar 10.0 mL de Dicromato de Potasio 1 N

Inmediatamente adicionar 20 mL de cido sulfrico concentrado sobre la disolucin anterior y agitar vigorosamente por 1 minuto

Reposo por 30 minutos

Adicionar 200 mL de agua y 10 mL de cido fosfrico

Adicionar 0.5 mL de difenilaminosulfonato de Bario antes de titular

Titular con FeSO4 .7 H2O hasta que aparezca un ligero verde fosforescente

Cenizas Es un parmetro til en definiciones cinticas (dado que debe aumentar en funcin del tiempo) e igualmente necesario para el reconocimiento de la calidad del producto final. Debe tenerse en cuenta que realmente se determina tanto contenido de cenizas como el carbono orgnico fijo. Materiales y procedimiento Crisol de porcelana, horno mufla, desecador y balanza analtica con sensibilidad de 0.001 g. Para iniciar, se pesan 2 g de la muestra en un crisol de porcelana, previamente tarado a la temperatura de trabajo, se lleva la muestra a un horno mufla precalentado a 250 C y se calienta gradualmente, hasta alcanzar una temperatura de 550 C. Se calcina la muestra durante cuatro horas, se enfra en un desecador y se pesa. CLCULOS El contenido de cenizas, expresado como porcentaje, se calcula aplicando la siguiente ecuacin: % de Cenizas = (B - C)/(A - C) x 100 Donde: A: Peso de la cpsula ms muestra en gramos, B: Peso de la cpsula ms cenizas en gramos y C: Peso de la cpsula vaca en gramos Nitrgeno Dado que es un macronutriente, es trascendental definir las cantidades presentes. El nitrgeno calculado corresponde a nitrgeno total y el procedimiento empleado para la determinacin de nitrgeno total es el mtodo de Kjeldhal, que consiste en convertir el nitrgeno presente en sulfato de amonio por digestin con cido sulfrico concentrado en presencia de un catalizador. El amonio formado se libera por adicin de NaOH en exceso, luego se destila sobre una disolucin de H2SO4 HCl y se titula el exceso de cido con disolucin valorada de NaOH o KOH. Reactivos: Catalizador: Pesar 100 g de sulfato de potasio (K2SO4) y mezclarlos con 1.6 g de sulfato de cobre (CuSO4) NaOH al 50 %: Pesar 50 g de hidrxido de sodio en escamas y adicionar 50 mL de agua destilada, Acido clorhdrico 0.1 N, Acido Sulfrico concentrado (98%) e Indicador Tashiro

Para calcular el nitrgeno total se emplea la siguiente ecuacin: % de N = [ (V HCl x N HCl) (V NaOH x N NaOH) ] 14x 100 / g de muestra El protocolo se ilustra a continuacin Muestra 0.4 g

Baln Kjeldhal 10.0 mL de H2SO4 Concentrado 4.0 g de catalizador Aprox. 1 hora Lavar con agua paredes del baln Hasta temperatura ambiente Baln destilacin realizando lavados 40.0 mL de NaOH al 50 %

Adicionar

Adicionar

Digestin

Adicionar

Reposo

Traspasar

Adicionar

Destilar

Recibir

Aprox. 100 mL sobre 50 mL de HCl de concentracin conocida NaOH 0.1 N

Titular

Capacidad de retencin de agua Es fundamentalmente un parmetro de calidad del producto final.7,9 EQUIPO Embudo pequeo de vidrio con tallo corto, matraz de Erlenmeyer de 250 mL, balanza analtica con sensibilidad de 0.001 g, papel de filtro, malla 60 PROCEDIMIENTO Se coloca un papel de filtro previamente humedecido hasta saturacin en un embudo de vidrio, se registra el peso y se coloca en un Matraz de Erlenmeyer. Se coloca el conjunto en la balanza, se tara y se pesa una cantidad determinada de muestra (aproximadamente 5 gramos, secada al aire y que pase por malla 60). A la muestra pesada se le adiciona agua en exceso, se deja hasta que filtre por completo y se pesa nuevamente el embudo con muestra hmeda y se registra el dato de diferencia entre el peso de embudo, papel y muestra, y peso de embudo y papel. RESULTADOS La capacidad de retencin de agua, expresada como mililitros/gramo de muestra, se calcula aplicando la siguiente ecuacin: C.R.A. = Vr W Donde: C.R.A.:

Capacidad de retencin de agua, W : Peso inicial de muestra en gramos, Vr : Volumen de agua retenido por la muestra; el cual se calcula como la diferencia entre el peso final y el peso inicial de la muestra. Vr = Wfinal - Winicial (W: peso de muestra)

La capacidad de retencin de agua es reportada como un promedio con su respectiva desviacin estndar. Densidad aparente Es igualmente un indicativo de la calidad del producto final y definitiva en la comercializacin del producto.10,11 EQUIPO Recipiente de vidrio o de plstico con volumen definido, balanza analtica con sensibilidad de 0.001 g, malla de 360 micrmetros

PROCEDIMIENTO Se toma un baln volumtrico de 2 mL , se tara en la balanza analtica, se deja caer libremente la muestra (seca y cernida) hasta completar el volumen del recipiente y se registra el peso. RESULTADOS La densidad aparente expresado como gramos/mililitros de muestra se calcula aplicando la siguiente ecuacin: D = W (g) V Donde:
D : Densidad de la muestra, W : Peso de la muestra en gramos y V : Volumen del recipiente en centmetros cbicos

Prctica No.6 OBTENCIN DE BIONSECTICIDAS

INTRODUCCIN La actividad insecticida de contacto se basa en la determinacin de un modelo estadstico matricial que considera el efecto (actividad biocida) como la variable dependiente, en funcin de la concentracin (o dosis) y el tiempo de contacto como las variables independientes. Para un modelo de regresin mltiple, la Dosis Letal Media (DL50) (o Concentracin Letal Media, CL50) y el Tiempo Letal Medio (TL50), se obtienen mediante dos anlisis: En el primero se hace constante el tiempo y se genera la DL50. En el segundo la dosis se hace constante y se genera el TL50. Para cada evaluacin se realizan dos tipos de ensayos. Un exploratorio y uno definitivo. En el ensayo exploratorio se utilizan al menos cinco concentraciones diferentes del extracto, calculadas as: la recomendada por el fabricante como una concentracin intermedia y a partir de ella se seleccionan dos concentraciones superiores y dos inferiores, separadas entre si por un factor de 10. Con base en los resultados, se calculan las nuevas concentraciones del extracto para los ensayos definitivos, as: Para el nuevo intervalo de concentraciones, se toma como valor mnimo la mxima concentracin donde no se observaron efectos y como valor mximo, la mnima concentracin donde se observ el mximo efecto. Entre estos dos valores extremos, se calculan al menos otras cuatro

concentraciones intermedias separadas por un factor logartmico, que vara en cada ensayo y segn el intervalo establecido en el ensayo exploratorio. Los datos de efectos son anotados en los formatos especficos para cada prueba. Luego se elabora la matriz de dosis-respuesta y se calcula el modelo de regresin mltiple. En cada ensayo se deben incluir dos controles: el negativo consiste en someter ejemplares a las mismas condiciones experimentales pero sin extracto o sustancia y como control positivo se utiliza un extracto de referencia. En el presente caso se consideran tanto pruebas de contacto como de interrupcin del ciclo de vida en insectos. Por esta caracterstica este tipo de compuestos insecticidas. Especficamente se considera prueba de contacto al bioensayo sobre un insecto de referencia que al entrar en contacto con un producto permite estimar el porcentaje de mortalidad en un tiempo relativamente corto (aproximadamente menor a 1 hora) y que no requiere de la ingestin para lograr el efecto. Por su parte, se denomina bioensayo de interrupcin del ciclo de vida, al estudio del efecto que un extracto o producto tiene sobre los diferentes instar del ciclo del insecto de referencia. OBJETIVO GENERAL Evaluar insecticidas naturales y de sntesis para determinar concentraciones letales y tiempos de mortalidad. Procedimientos Las pruebas de actividad insecticida (contacto e interrupcin de ciclo) se realiza segn los siguientes diagramas. Para su seguimiento y toma de datos se utiliza el formato adjunto. PRUEBAS POR CONTACTO (DISCOS IMPREGNADOS) 1. Materiales y equipos Colonias de D. Melanogaster, estereomicroscopio, cartulina blanca, pincel suave, pinzas entomolgicas, balanza, viales de 25 mL, papel de filtro, embudo, tapones de algodn y gasa, CO2, beaker, Erlenmeyer, pipetas (1, 5, 10 mL), micropipeta, agitadores de vidrio, papel de filtro, bandejas plsticas, capturadores manuales, jaulas para cra de insectos, bandejas de alumio, bombillas 2. Procedimiento

La prueba de actividad insecticida por contacto se realiza de la siguiente manera: Se seleccionan grupos de 30 individuos de la colonia principal, utilizando CO2 para anestesiarlos y manejar fcilmente. Se deben separar al menos tres grupos por cada concentracin de extracto que se desee evaluar (3 rplicas). Las concentraciones de extracto se preparan como se describe en la Fundamentacin terica previamente descrita y cada grupo de 30 ejemplares se deposita en un vial limpio y transparente. A otro grupo de viales limpios y transparentes (3 rplicas por cada concentracin de extracto), se les introducen discos de papel de filtro hasta el fondo. stos se saturan con 0.20 mL del extracto a las concentraciones seleccionadas. Una vez despiertos los individuos, con la ayuda de un embudo se deposita cada grupo de 30 en los viales con los discos impregnados del extracto. El intervalo para depositar cada grupo es de 5 minutos. Durante 60 minutos y cada 5 minutos, se hace un recuento de los individuos muertos en cada vial. Los datos se registran en el formato respectivo (Importante: Los tiempos de observacin pueden variar de un producto a otro). Con la informacin obtenida se debe estimar la media y la desviacin estndar para cada tiempo de observacin y correlacionar resultados y registrar estos datos en el formato adjunto.

Formato para evaluacin de actividad insecticida de extractos (por contacto) Concentracin Tiempo t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 T10 MODELO Valor p TL50 C1 C2 C3 C4 C5 C6 MODELO Valor p CL50

PRUEBA DE INHIBICIN DEL CICLO DE VIDA (PRUEBA POR INGESTIN) CON Drosophila melanogaster Esta prueba se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo: Procedimiento para pruebas de inhibicin del ciclo de vida con D. melanogaster Se preparan los viales con las diferentes concentraciones de extracto que se quiera evaluar, al menos seis concentraciones con tres rplicas cada una Se prepara el alimento clsico para D. melanogaster y se deposita en los viales con el extracto, hasta completar un volumen de 15 mL, se agita la mezcla para homogenizarla y cubrir los viales con gasa hasta el da siguiente. Pasado este tiempo, se depositan tres parejas jvenes en cada vial y se dejan all durante 2 das, para luego descartarlas (Observacin: Los ejemplares se deben dormir previamente con CO2 antes de manipularlos). El da 9 se cuentan las pupas y a partir del da 10 se cuentan los adultos una vez al da y durante 10 das (para el vigsimo da ha culminado el desarrollo de los individuos de la primera generacin filial). Los datos se registran en el formato para pruebas de inhibicin del ciclo de vida. Para cada concentracin se estiman: la relacin entre las pupas obtenidas y el nmero de adultos que eclosionaron, el porcentaje de inhibicin y la CL50

Prctica No. 7 PRODUCCIN DE JARABES A PARTIR DE ALMIDN DE YUCA

En este informe se presentan los resultados obtenidos en la experimentacin de cada una de las etapas, a saber: licuefaccin, sacarificacin e isomerizacin. Tambin se presentan los resultados obtenidos en la puesta en marcha del proceso de sacarificacin en continuo, as como, las posibles estrategias de escalamiento, dado el caso de querer llevar los resultados a nivel piloto. Despus se presenta la evaluacin de la economa del proceso en la que se determin a partir de que volumen y en que tiempo se puede recuperar la inversin. Este costeo se realiz utilizando el SuperPro Designer Versin 4.1. Para la etapa de licuefaccin, se diseo y se construy un reactor por lotes en acero inoxidable, con agitacin y control de temperatura de 10L. Se concluy que la mejor conversin de almidn de yuca se obtiene al trabajar con una concentracin de almidn del 40%; con una concentracin de enzima (Termamyl 120L) de 1,33 mL/L; a las condiciones de: pH = 5,5, temperatura = 85C y agitacin = 200 rpm. En estas condiciones, al cabo de dos horas, se logra una conversin del 50% (DE) trabajando en un reactor en acero inoxidable enchaquetado y con un volumen efectivo de trabajo de 8L. Las mejores condiciones operacionales para el proceso de sacarificacin por lotes fueron: pH 4.5, temperatura 55C y tiempo de reaccin 6 horas, utilizando una concentracin de enzima (AMG 300L) de 1 ml/L de sustrato, en estas condiciones se obtiene una conversin del 98% de DE. Este proceso se trabaj tambin en continuo, con un volumen de 3 L, y empleando una membrana de Ultrafiltracin para recuperar la enzima. En este se logr un flujo de 20 ml/min. y un tiempo de residencia de 2.2 h durante 6h. Se trabajo con una concentracin de 1.5 ml de enzima/L de sustrato Las conversiones alcanzadas en estas condiciones fueron de solo el 75% DE. METODOLOGA: LICUEFACCIN: Medicin colorimtrica de azcares reductores Equivalente de dextrosa: Para la caracterizacin de los productos de la hidrlisis del almidn se emplea el parmetro que mide el grado de hidrlisis: Equivalente de dextrosa (DE) que se define como unidades de glucosa pura requeridas para reducir la misma cantidad de reactivo cido dinitrosalicilico (DNS) que 100 unidades de masa de hidrolizado seco (Miller G.L, 1959).

Para determinar el equivalente de dextrosa, se utiliz el mtodo del DNS, descrito anteriormente, elaborando una curva patrn de concentracin de glucosa vs. absorbancia. Las lecturas fueron hechas en un espectrofotmetro Spectronic Genesys 2PC. Condiciones de Operacin Temperatura. Para este ensayo se utilizo almidn a una concentracin de 1%, la concentracin de la enzima fue de 60 KNU, el pH: 5,5 y el tiempo de reaccin fue de 30 minutos. Las temperaturas a las cuales se analiz el grado de hidrlisis fueron: 60, 70, 80, 85, 90, 95 y 100C. Preparacin del almidn Las soluciones concentradas de almidn (40, 45 y 50%) se preparan diluyendo el almidn en 2/3 del volumen total de agua que lleva la solucin y agregndolo al 1/3 de agua restante que ha sido calentada previamente a una temperatura aproximada de 70C y homogeneizando con agitacin vigorosa. SARIFICACIN: Equivalente de dextrosa: Para la caracterizacin de los productos de la hidrlisis del almidn se emplea el parmetro que mide el grado de hidrlisis: Equivalente de dextrosa (DE), que se define como unidades de glucosa pura requeridas para reducir la misma cantidad del reactivo cido Dinitrosaliclico (DNS) que 100 unidades de masa de hidrolizado seco (Miller G.L, 1959). Para determinar el equivalente de dextrosa se utiliz el mtodo del DNS descrito anteriormente, elaborando una curva patrn de concentracin de glucosa vs. absorbancia. Las lecturas fueron hechas en un espectrofotmetro Spectronic Genesys 2PC. Glucosa oxidasa: La determinacin de glucosa para las soluciones obtenidas despus de la sacarificacin se realizaron mediante el anlisis enzimtico con glucosa-oxidasa (GOD-PAP, obtenido de Merck). Este mtodo consiste en una reaccin colorimtrica exclusiva para glucosa, lo cual permite diferenciarla de los dems subproductos obtenidos en la sacarificacin. Actividad enzimtica: Para la determinacin de la actividad enzimtica de la AMG 300L se sigui la tcnica desarrollada por INDUSTRIAS NOVO NORDISK, Mtodo Analtico Novo AF 22/6-GB, en la que 1 AGU es la cantidad de enzima que a condiciones estndar hidroliza una micromol de maltosa por minuto a 25oC y pH 4.3.

Practica N. 8 FERMENTACIN ALCOHLICA CON LEVADURAS

INTRODUCCIN La Fermentacin alcohlica de define como el proceso bioqumico por el cual las levaduras transforman los azcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la fermentacin se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen 1g de levadura por cada 4g de azcar consumidos los productos obtenidos son muy poco etanol, agua y CO2. En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentacin; es decir degradan los azcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energa. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por cada 100g de azcares consumidos. Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la produccin de etanol. Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms comnmente utilizada. El Etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es crtica para obtener rendimientos altos. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentacin. Los ms relevantes son los siguientes: TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentacin transcurre mas rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y mas cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encima de 35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes de 45C. OXIGENO: Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxigeno disuelto en el mosto. NUTRIENTES: Los azcares son fuente de energa para las levaduras. OBJETIVO Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin realizada por la levadura de Saccharomyces cerevisiae .

MATERIALES Y EQUIPOS Azcar, miel o panela, Levadura, Recipiente de vidrio, Manguera y tapn, Licuadora, Colador, Antiespumante, Alcoholmetro, Agitador mecnico pHmetro, Equipo de destilacin, Probeta, Esptulas, Balones de 4-6 L, Refractmetro, Perlas de ebullicin REACTIVOS KMNO4, Bisulfito de Sodio, cido Cromotrpico, H2SO4 DATOS Y OBSERVACIONES Consideraciones a tener en cuenta en la elaboracin del fermento: Tabla 1: Cantidad de azcar del mosto para corregir los Brix MATERIALES QUE CONTIENEN AZCAR Azcar Blanca Azcar Morena Miel Glucosa NOTA: No es recomendable utilizar para la prctica frutas tales como: Mango, Papaya, Guanbana y Guayaba; ya que estas tienen mucho muclago y son muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentacin Se sugiere utilizar frutas tales como: Mora, Uva, Lulo, Maracay, Naranja. CANTIDAD (g) 10 10 10 10 AGUA (ml) 100 100 100 100 BRIX 1 1 0,6 1

Tabla 2: %Azcar en algunas frutas

FRUTA Anon Badea Jugo sin semilla Banano comn Ciruela comn Cereza Ciruela Claudia Curaba Chirimoya Durazno amarillo Feijoo sin cscara Frambuesa Fresas enteras Guayaba comn Guayaba pera Guanbana pulpa Higo sin semilla Kiwi pulpa Lima Limn comn jugo Limn mandarina Limn Tahit Lulo sin semilla Mamey pulpa Mandarina Jugo Manzana Ana Manzana sin cscara ni semilla Maracuy morado pulpa Maracuy amarillo pulpa Mora castilla pulpa sin semilla Naranja jugo Pera sin cascara Pia jugo Tamarindo pulpa concentrada Tomate arbol pulpa semilla Toronja jugo Uchuvas enteras Uva Queen verde Uva Isabela Uva negra Uva Red Globe Uva Ribier Uvas pasas sin semilla Zapote pulpa %AZCAR (g/1000ml) 25.4 10.1 23.4 20.8 16.6 13.0 6.3 18.2 12.0 11.9 11.6 6.9 11.9 6.8 13.0 9.6 14.9 6.0 8.6 5.8 7.2 5.7 12.4 10.1 15.0 14.8 13.6 14.5 5.6 10.4 8.5 13.0 61.3 7.0 9.2 19.6 14.0 15 9.6 17 17 75.0 12.4 AZCAR (gramos/litro) 254 101 234 208 166 130 63 182 120 119 116 69 119 68 130 96 149 60 86 58 72 57 124 101 150 148 136 145 56 104 85 130 613 70 92 196 140 150 96 170 170 750 124

Tabla 3: Gramos de azcar a adicionar por kilo de mosto.

Gramos de azcar a adicionar por litro de mosto Densidad 20C 1.0000 1.0050 1.0070 1.0100 1.0110 1.0150 1.0196 1.0200 1.0250 1.0300 1.0350 1.0399 1.0441 1.0483 1.0500 1.0525 1.0550 1.0567 1.0610 1.0653 1.0696 1.0740 1.0784 1.0828 1.0873 1.0918 1.0963 1.1009 Brix 0.0 1.5 2.0 2.7 3.0 4.0 5.0 5.2 6.4 7.6 8.8 10 11.0 12.0 12.4 13.0 13.5 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 Alcohol 8% 144.0 129.0 124.1 116.7 114.2 104.4 94.0 92.1 80.0 67.9 55.9 44.0 34.0 24.0 20.3 14.0 8.6 4.0 0.0 Alcohol 10% 180.0 165.0 160.1 152.7 150.2 140.4 130.0 128.1 116.0 103.9 91.9 80.0 70.0 60.0 56.3 50.0 44.6 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 Alcohol 12% 216.0 201.0 196.1 188.7 186.2 176.4 166.0 164.1 152.0 139.9 127.9 116.0 106.0 96.0 92.3 86.0 80.6 76.0 66.0 56.0 46.0 36.0 26.0 16.0 6.0 0.0 Alcohol 14% 252.0 237.0 232.1 224.7 222.2 212.4 202.0 200.1 188.0 175.9 163.9 152.0 142.0 132.0 128.3 122.0 116.6 112.0 102.0 92.0 82.0 72.0 62.0 52.0 42.0 32.0 22.0 12.0

PROCEDIMIENTO A (Produccin con Clulas libres) Preparar un sustrato (tener en cuenta que est en buen estado), medir los grados Brix y verificar que se encuentren entre 17-20 grados. En caso de ser necesaria una correccin, se puede adicionar azcar como fuente de carbono suplementaria hasta obtener los grados Brix requeridos. Una vez corregidos, se ajusta el pH (3.0-3.5). Finalizado este proceso, se toman 200ml del mosto y en l, se adiciona la levadura (aproximadamente 2-4g/l) para sua ctivacin a 37 C. Al mosto sobrante, se le agrega Bisulfito de Sodio (100 p.p.m.) para impedir la proliferacin bacteriana y el pardeamiento del medio. Es necesario dejar un espacio en el recipiente para el control de espuma y la salida del CO2, para ello se le pone el tapn de caucho con un orificio para la introduccin de una manguera aproximadamente de 1 metro de longitud la cual tiene una salida que llega a un recipiente con agua donde se observarn las burbujas del CO2 producidas.

Dejar fermentar libremente durante 4 semanas aproximadamente. A lo largo de todo el proceso, se debe realizar un control peridico de las propiedades fisicoqumicas del material en fermentacin, tales como: pH y grados Brix, las cuales ponen en evidencia el curso que lleva el proceso. (Produccin no de fermentacin). En caso de que los grados Brix bajen puede ser necesaria la adicin de ms cantidad de azcar, proporcional a los grados Brix que se quieran aumentar. VER TABLA 1. Finalizado el proceso de fermentacin por parte de la levadura, indicado por la estabilidad de los grados Brix, se procede a separar el alcohol del material no til, mediante destilacin, para esto se procede as: DETERMINACIN DEL GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO Medir 200 ml del medio en un matraz aforado y anotar la temperatura. Transvasar la muestra al baln de destilacin, enjuagar el matraz aforado 4 veces, con 10 ml de agua destilada cada vez y aadir los lquidos de lavado al mismo baln; adicionar perlas de vidrio y adicionar unas gotas del antiespumante. Ensamblar el equipo y destilar recibiendo el destilado en el mismo matraz donde se midi la muestra, el cual debe permanecer en bao de hielo. Recoger el destilado, hasta obtener un volumen aproximadamente igual a del volumen. Agitar y llevar a volumen con agua, a la temperatura inicial, con una tolerancia de +/- 2C. Para comprobar la produccin de etanol producido, se realiza una prueba cualitativa, el cual se toma una porcin del destilado con una esptula y con una candela se pone la llama debajo de esta, presenciar la produccin de una llama de color azul intenso, la cual indica la presencia de etanol relativamente puro, descartndose la presencia de agua en el producto destilado. Lectura: Colocar el destilado en la probeta, la cual debe mantenerse en perfecta posicin vertical. En el lquido no deben existir burbujas ni partculas flotando. Introducir el alcoholmetro en el lquido, agitar, dejar en reposo al menos 30 segundos y anotar la temperatura. Leer el grado alcohlico, por encima o por debajo. PROCEDIMIENTO B (Produccin con Clulas inmovilizadas utilizando como sustrato jarabe glucosado) MATERIALES Cepa de Saccharomyces cerevisiae mantenida en caja petri con agar Sabouraud 4 % de glucosa a 4 C.

Medio de cultivo para la activacin de la cepa Componente Fuente de carbono KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4 7 H2O Extracto de Levadura Peptona Universal Agua destilada PROCEDIMIENTO Se debe repicar la cepa de levadura para obtener un cultivo fresco, esto se realiza preparando algunas cajas con agar Sabouraud 4 % de glucosa y sembrando el ellas el microorganismo. Se deben incubar las cajas a 38 C durante 4 das. Activacin de la levadura: Como el microorganismo se conserva en caja, para transferirlo al medio de cultivo de produccin del etanol; es necesario activarlo, para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del medio de cultivo para activacin. NOTA: La fuente de carbono utilizada es sacarosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados, posteriormente se incuban a 38 C y 150 rpm durante 4 das. Pasado este tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la cantidad de biomasa que presente y este se escala a un volumen final de 100 mL del mismo medio de cultivo utilizado para la activacin de la cepa. Pasadas 24 horas, los 100 mL son escalados nuevamente a un volumen de 250 mL del mismo medio de cultivo. Finalmente se escala a 2 L. NOTA: Todos los volmenes escalados se incuban a 38 C y 150 rpm. Despus de 2 das se presentan un crecimiento representativo de clulas que servirn como inculo. Se deshecha alrededor de 1 L de sobrenadante, y el medio con clulas restante se divide en dos partes aproximadamente iguales, 50 mL sern utilizados como inculo para el proceso en batch y el resto para el proceso en continuo con clulas inmovilizadas. Se preparan 2.5 L del medio de cultivo pero esta vez el sustrato ser jarabe glucosado. Para preparar este medio es necesario conocer la concentracin de azcares en el jarabe, puede utilizarse el mtodo de DNS o Antrona y posteriormente hacer la dilucin correspondiente para que el jarabe quede a una concentracin de 100.0 g/L. FERMENTACIN EN BATCH Para esta fermentacin se preparan 450 mL de medio de cultivo con jarabe glucosado a este medio se le agregan los 50 mL del medio separado como inculo para este proceso y se incuba durante 12 horas a 35 C y 150 rpm; Cantidad por litro 100.0 g 2.0 g 3.0 g 1.0 g 4.0 g 3.6 g 1.0 L

pasado este tiempo, se toman 10 mL del sobrenadante, a esta muestra se le realiza un anlisis para determinar la concentracin de sustrato por el mtodo DNS o Antrona. Se toman aproximadamente 100 mL del mismo sobrenadante para ser destilados con el fin de concentrar el Etanol y determinar su concentracin. FERMENTACIN EN CONTINUO Las clulas que quedaron en los ltimos 2 L de medio para crecimiento sern las utilizadas en la inmovilizacin. Antes de montar la fermentacin es necesario inmovilizar las clulas. INMOVILIZACIN DE CLULAS MATERIALES: Jeringa estril, 150 mL de solucin isotnica al 0.85 % (p/v) (solucin acuosa de NaCl), 190 mL de solucin acuosa de Alginato de sodio al 3 % (p/v), 400 mL de solucin acuosa de CaCl2 al 3 % (p/v). NOTA: Todas las soluciones deben ser esterilizadas. PROCEDIMIENTO Despus de tener una cantidad suficiente de clulas para inmovilizar, se descarta el sobrenadante del medio de cultivo en el que han crecido. Las clulas que quedan se centrifugan para obtener pellets libres de medio de cultivo y, se resuspenden en una solucin de NaCl estril (solucin isotnica). La inmovilizacin se realiza mezclando una suspensin de levaduras en 100 mL de solucin isotnica estril con una solucin estril al 2 % de Alginato de Sodio. Se hace gotear esta mezcla mediante una jeringa estril sin aguja sobre una solucin previamente esterilizada de CaCl2 al 3 %. Con una altura de gotea de 1 cm se pueden obtener esferas homogneas de menos de 5 cm de dimetro. MONTAJE DEL BIOREACTOR Esterilizar durante 15 minutos y a 15 psi el reactor incluyendo las mangueras y la tapa de este, adems, esterilizar 2 L de medio del cultivo con jarabe glucosado. En un ambiente estril llenar completamente el reactor con las esferas de levadura inmovilizada. llenar la columna con el medio de cultivo preparado con jarabe y mantener durante 8 horas el proceso en batch para acondicionar las clulas inmovilizadas. Pasado este tiempo, operar el reactor en continuo durante 12 horas a 37 C. Por ltimo, tomar una muestra de 10 mL de medio de cultivo para el anlisis de azcares y 100 mL para la destilacin y determinacin de la concentracin de Etanol. Hacer clculos de rendimiento en los dos procesos y comparar los resultados.

DETERMINACIN DE METANOL Prueba cualitativa Diluir la muestra a una concentracin alcohlica entre 5 y 6% (G.L), tomar 50 ml de la muestra diluida y destilar recolectando 40 ml en el mismo baln donde se midi la muestra (baln de 50 ml). Ajustar a volumen con agua destilada. Adicionar 1 ml de solucin de KMNO4 a un erlenmeyer y enfriar en bao de hielo por 15 minutos, agregar 0,5 ml del destilado. (Mantener en bao de hielo por 30 minutos), decolorar la solucin con una pequea cantidad de NaHSO3 (Bisulfito de Sodio) seco (+/- 100 mg), aadir 0,5 ml de cido Cromotrpico y adicionar lentamente y con agitacin 7,5 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se pone el erlenmeyer en un bao mara a 60C., durante 15 minutos (para desarrollar color). La aparicin de un color que va del violeta al morado intenso indica la presencia de metanol. Prueba cuantitativa Muestra Proceder igual que la prueba cualitativa, pero dejar enfriar despus del bao mara. Llevar a volumen con etanol al 5.5 %, agitar y mantener siempre a temperatura ambiente. Leer absorbancia a 575 nm. Blanco Tomar 1 ml de alcohol al 5.5 % llevarlo a un baln volumtrico de 50ml que contiene 1 ml de KMnO4, colocar en bao de hielo y tratar igual que la muestra. Solucin estndar de metanol Medir exactamente 1 ml de metanol y llevar a un baln volumtrico de 100 ml, ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentracin = 1 % de metanol. Tomar 2.5 ml de la solucin anterior y llevar a un volumtrico de 100 ml, ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentracin = 0.025 % de metanol. Tomar 1 ml de esta ltima solucin y llevar a un volumtrico de 50 ml que contiene 1 ml de KMnO4 y tratar en igual forma que la muestra y el blanco. Leer la absorbancia del estndar. Determinar la cantidad de metanol en la muestra como sigue: % v/v metanol = A X 0.025 X F A*
Donde: A: absorbancia de la muestra A*: absorbancia del estndar de metanol F: factor de dilucin de la muestra.

Preparacin de: Alcohol del 5.5 %: A partir de etanol absoluto. Tomar 55.5 ml de etanol absoluto y ajustar a 1 L con agua destilada. GLOSARIO GRADOS BRIX: Es el porcentaje de slidos solubles presentes en el jugo o material fermentecible, los cuales relacionan la gravedad especfica de la solucin con la concentracin equivalente de sacarosa pura. PH: Medida de grado de acidez o basicidad de una solucin. FERMENTACIN: Consiste en el que el azcar contenido en el mosto, su mayor parte desaparece, ocupando su lugar el alcohol. GRADO ALCOHOLIMTRICO: Porcentaje de alcohol etlico a 20C. BILBLIOGRAFA POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, Mxico. (1978). Pg. 359-376. JAGNOW, G. Y David W.Bioctenologa: induccin con experimentos modelos. Ed. Acribia, Zaragoza-Espaa (1991). RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatologa. Medelln, Enero de 1999.

Prctica No. 9 CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIN DE PROTEASAS

INTRODUCCIN El incremento poblacional que resulta de la multiplicacin celular, es un componente esencial de la funcin microbiana, y con l se asocian, tanto el crecimiento, como la generacin metablica; de hecho, las bacterias son mquinas de duplicacin constante en las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formacin de las macromolculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayora de los procariotes, el desarrollo de una clula individual es continuo hasta la divisin en dos clulas nuevas (fisin binaria), el conocimiento de las caractersticas de crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se pueden reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los procesos generadores de metabolitos.

En cultivos de produccin por lotes (sistema batch), el aumento en la masa celular como consecuencia del cambio en el nmero de clulas o absorbancia (Abs) por unidad de tiempo (Velocidad de crecimiento), permite establecer una curva tpica de crecimiento (Figura 1) en la que se pueden observar las diferentes fases de la misma: latencia (a), exponencial (b), estacionaria (c) y muerte celular (d), y el grado de asociacin de estas con la generacin de metabolitos primarios y secundarios, pues los primeros son aquellos que se forman durante el crecimiento exponencial, mientras que los segundos, como las proteasas objeto de la prctica, se producen casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energtico de la clula.

El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en donde la Velocidad de crecimiento, es el cambio en el nmero de clulas o absorbancia (Abs), experimentado en unidad de tiempo. Durante el crecimiento de los microorganismos, se generan una serie de productos, llamados metabolitos, que pueden clasificarse como primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que se forman durante la fase de crecimiento exponencial y adems se forman como parte del metabolismo energtico de las clulas, mientras que los metabolitos secundarios se forman casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energtico de la clula. Como ejemplos de metabolitos se encuentran etanol, proteasas, entre otras. OBJETIVOS Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de Bacillus subtilis .

Establecer el grado de relacin entre la produccin metablica secundaria y las diferentes fases de una curva de crecimiento microbiano . REACTIVOS Y EQUIPOS Microorganismo Bacillus subtilis, caldo nutritivo, solucin de cido tricloroactico, casena (leche), espectrofotmetro, agitador orbital, centrfuga, bao de agua, erlenmeyer (250 mL), tubos de ensayo (3), pipetas estriles de 1 y 5 mL, papel milimetrado. PROCEDIMIENTO Al inicio de prctica, cada uno de los grupos de trabajo debe alistar ciento treinta (130) mililitros de un medio de cultivo nutritivo preparado segn las indicaciones del fabricante. Estos medios de cultivo se debern repartir en tres tipos de recipientes diferentes (un tubo de ensayo con cinco mililitros, un erlenmeyer con cien mililitros y veinticinco mililitros repartidos en frascos pequeos a razn de aproximadamente 3 militros) antes de su esterilizacin con las condiciones de calor hmedo convencional para medios de cultivo (15 psi/ 121 C/ 20 minutos). Una vez estriles los medios de cultivo, y con ayuda de una asa de cultivo, se toma una muestra del microorganismo a utilizar en la prctica y se transfiere al tubo de ensayo dispuesto con los cinco mililitros del medio de cultivo. Una vez alcanzada la fase exponencial, este volumen completo se utiliza como inculo del erlenmeyer y se incuba a 28o C con una agitacin orbital permanente de aproximadamente 100 r.p.m. Con una periodicidad descrita por el profesor, se deben tomar 2 mL de medio de cultivo y cuantificar la absorbancia con ayuda de un espectrofotmetro (550 - 600 nm), utilizando como blanco el medio de cultivo estril que se almacena en los frascos pequeos. Para determinar la produccin del metabolito deseado (proteasas) durante el tiempo del cultivo, se toman muestras con la periodicidad descrita por el profesor, se someten a fuerza centrfuga (4.000 rpm, 10 minutos), y se almacena el sobrenadante para realizar la siguiente prueba: Se llenan 3 tubos de ensayo con 1 mL de solucin de casena o leche muy diluida y se agregan segn el caso: Tubo 1 + 1 mL de agua (blanco) Tubo 2 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de clulas Tubo 3 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de clulas, previamente sometido durante 2 minutos a 100C. Se llevan los tres tubos a bao de agua (30C) durante30 minutos y se adiciona un mililitro de cido tricloroactico. RESULTADOS

En esta prctica se utilizar como mtodo para determinar el crecimiento microbiano, la medida de la densidad ptica, para ello se registrarn los resultados obtenidos en la siguiente tabla: Lecturas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Horas de cultivo Absorbancia (550 nm)

Reportar los datos obtenidos a partir de la accin del sobrenadante sobre la protena casena. 6. GLOSARIO Crecimiento: incremento en el nmero de clulas. Crecimiento Exponencial: crecimiento de un microorganismo cuyo nmero de clulas se duplica en un perodo constante de tiempo. Cultivo Tipo Batch o Monofsico: cultivo microbiano que funciona como un sistema cerrado de volumen constante. Fase Estacionaria: perodo que sigue al crecimiento exponencial cuando la velocidad de crecimiento de la poblacin es cero. Fase Lag. Perodo anterior a la fase de crecimiento exponencial cuando las clulas pueden tener un metabolismo activo pero an no crecen. Proteasas: enzimas que degradan protenas por hidrlisis. 7. BIBLIOGRAFA Jagnow, G., David, W. Bitecnologa. Introduccin con experimentos. 1991. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 251p. Madigan, M., Martinko, J., Prker, J. 2004. Brock. Biologa de los Microorganismos. Dcima edicin. Pearson Education S.A. Madrid. 1011p. Martnez, M., Carrascal, A., Martnez, P. 1999 Manual de Laboratorio. Introduccin a la Biotecnologa. Facultad de ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. 81p.

Prctica No. 10 OBTENCIN DE CIDO CTRICO CON HONGOS INTRODUCCION: El cido ctrico se obtiene por extraccin natural de los jugos de frutas ctricas o artificialmente por la transformacin del azcar realizada con algunos microorganismos entre los que se destacan ciertas especies de hongos correspondientes al gnero Aspergillus. Estos trabajos de produccin metablica con hongos se iniciaron en la dcada de los aos veinte con crecimientos miceliares en superficie, continuaron algunos aos mas tarde con procesos sumergidos en cubas profundas y actualmente se llevan a cabo tanto en superficie como en fermentadores de hasta 220 metros cbicos de volumen. Lo realmente valioso de este tipo de produccin biotecnolgica es que ha alcanzado niveles muy importantes, pues por esta va microbiolgica se obtiene ms del 99% de la produccin mundial de este cido orgnico que comercializado como monohidratado o como anhidro, es utilizado fundamentalmente en las industrias de alimentos y bebidas en las que aumenta o preserva el sabor de los jugos, de los extractos de jugo de fruta, de los caramelos, de los helados y de las mermeladas. En la industria farmacutica (10% de la utilizacin total) se utiliza el citrato de hierro y el cido ctrico como preservante de sangre, o, en la elaboracin de tabletas, pomadas y en algunas preparaciones cosmticas. En la industria qumica (25% del uso total) el cido ctrico se utiliza como reemplazo de polifosfatos, como agente antiespumante, como reblandecedor y para el tratamiento de textiles, mientras que en la industria metalrgica los metales puros se producen como citratos metlicos. OBJETIVO GENERAL. Obtener cido ctrico por cultivo de esporas de Aspergillus niger en medio de cultivo enriquecido con sales apropiadas para la generacin y crecimiento de la biomasa. MATERIALES Y REACTIVOS: Aspergillus niger, jeringa desechable de 5 ml, agua estril para inyeccin, gasa, asa metlica, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero, erlenmeyer de 500ml y agitador orbital Procedimiento: Inicialmente y con ayuda de asa bacteriolgica, se siembra Aspergillus niger en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud previamente esterilizado con calor hmero (15 psi/ 121 C/ 20 minutos), y se deja crecer durante aproximadamente 10 das a temperatura ambiente. Paralelamente y esterilizado bajo las mismas condiciones, se preparar un medio de cultivo lquido que por su composicin permita el crecimiento miceliar. Para lograr esto se utiliza un erlenmeyer de 500 mililitros en el que se prepara un volumen final de 100 mililitros

(pH: 2) que incluye: sacarosa: 19.0g, nitrato amnico: 230 mg, dihidrogenofosfato potsico: 100 mg, y sulfato magnsico: 0.03g En la fermentacin ctrica la conversin del azcar es efectuada dentro de las clulas vivas de los hongos, para lograr esto, el sustrato debe ingresar por smosis y por lo tanto, en un recipiente profundo y de gran capacidad la formacin de cido ser relativamente lenta, puesto que la superficie de la capa de hongos ser pequea en comparacin con el volumen inversamente en el empleo de recipientes de forma plana se consigue una gran superficie de micelio y la conversin de azcar a cido ctrico se efecta con gran rapidez. Para faciltar esto y una vez esporulado el microorganismo en el medio de cultivo inicial (agar sabouraud), a este se le agregan 5ml de agua estril, se agita suavemente para desprender las esporas (se ven a simple vista) y estas se transfieren al erlenmeyer donde se encuentra el medio de cultivo. Finalmente se tapa el erlenmeyer con algodn y se transfiere al agitador orbital (shaker, 150 r.p.m.) por espacio de 14 a 20 das en los que se controla peridicamente el pH para facilitar la obtencin del metabolito. Una vez terminado el proceso, el medio de cultivo (microroganismo incluido), se macera y filtra, resultando un licuado cuyo pH se debe neutralizar con hidrxido de calcio. Una vez neutralizado, se calienta y se aade un exceso del hidrxido, con el que probablemente se obtiene un precipitado insoluble correspondiente al citrato de calcio. Tratando esta sal con cantidades equivalentes de cido sulfrico diluido y filtrando, se obtiene un precipitado de sulfato de calcio insoluble (sulfato de calcio) y un sobrenadante en el que se precipitan algunos cristales que una vez lavados en fro (agua de hielo), permiten realizar las pruebas cuali- cuantitativas necesarias para demostrar la existencia del cido ctrico. Identificacin cualitativa de citratos: a 15 mililitros de pyridina, se deben agregar unos pocos miligramos de un citrato disuelto o suspendido en 1 mililitro de agua. Una vez agregado, se adicionan 5 mililitros de anhidrido acetico y se mezcla esperando que aparezca un color rojo propio de la presencia del citrato. Para un ensayo cuantitativo, se debe consultar alguna farmacopea en la que se encuentren tcnicas especficas de anlisis para este metabolito. GLOSARIO Cepa: Conjunto de clulas o cultivos con un origen comn y que poseen una dotacin gentica similar; cultivo puro de organismos, compuesto por la descendencia de un nico individuo. Inculo: Cultivo iniciador de un organismo, o una mezcla de organismos, aadido a un medio para iniciar la produccin de un nmero mayor. Micelio: Parte vegetativa de un hongo filamentosos. Consta de una masa de hifas. Hifa: Filamento tubular que constituye la fase vegetativa de la mayora de los hongos y muchas algas.

Inoculacin: Introduccin de un pequeo nmero de microorganismos en un medio, con la perspectiva de que a partir de stos se desarrolle un nmero grande de individuos, mediante crecimiento y reproduccin. BIBLIOGRAFA CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza Espaa. 3 edicin. 1989. JAGNOW, Gerhard. Biotecnologa Introduccin con experimentos modelo. Editorial Acribia S.A. Zaragoza Espaa. 1991. PRESCOTT, S.C. Microbiologa Industrial. Aguilar S.A. Ediciones Madrid.

Prctica No. 11 OBTENCIN DE PENICILINA Y COMPROBACIN DE SU ACCIN ANTIBITICA

Antibiticos Las sustancias medicinales seguras tienen el poder para destruir a verificar el crecimiento de organismos infecciosos en el cuerpo. Los organismos pueden ser bacterias, virus, hongos, o los animales minsculos llamados protozoa. Un grupo particular de estos agentes se constituye de drogas llamadas antibiticos, desde el griego anti ("contra") y bios ("vida"). Algunos antibiticos se producen desde organismos vivientes tales como bacterias, hongos y moldes. Los otros son totalmente o en parte sintticos que es, producido artificialmente. La penicilina es quizs el mejor antibitico conocido. Su descubrimiento y luego desarrolla ha permitido a la profesin mdica tratar efectivamente muchas enfermedades infecciosas, incluyendo algunas que alguna vez amenazaron la vida. FABRICACIN El natural; hace tiempo todos los antibiticos se hicieron desde organismos vivos. Este proceso conocido como biosntesis, se usa todava en la fabricacin de algunos antibiticos. Realmente los organismos fabrican el antibitico. La gente involucrada solo provee las condiciones favorables para que los organismos puedan hacer el trabajo y entonces ellos extraen la droga. Sinttico; Todos los tipos de penicilina poseen un ncleo qumico idntico llamado anillo. La cadena qumica que es adjunta al anillo es diferente en cada tipo. Cambiando las molculas de la cadena, los cientficos idean drogas con efectos potencialmente diferentes sobre organismos diferentes. Algunas de estas drogas son tiles para tratar infecciones, algunas no lo son. Obtencin y separacin de antibiticos Como se hallan y aslan los microorganismos productores de los antibiticos

La bsqueda directa de antibiticos se puede efectuar de dos maneras, cada una de las cuales tiene particularidades propias aunque estn ligadas entre s, como veremos de inmediato. Ellas son: -Examen sistemtico de cultivos puros de microorganismos, sea los que se guardan en colecciones o recogidos al azar. - La investigacin de poblaciones microbianas mezcladas, sea del suelo, cloacas, heces, aire, polvo, abonos, etc., previa una seleccin y de acuerdo con los mtodos idnticos a los empleados con cultivos puros. Los mtodos se han dividido en dos grupos, segn sea el antagonista, cuya capacidad se analiza, y el organismo frente al cual se prueba dicha propiedad, se cultivan al mismo tiempo (implantacin simultnea) o si el organismo de prueba se siembra despus que el antagonista ha desarrollado un cierto tiempo (implantacin sucesiva). Esta distincin que pudiera parecer trivial a primera vista, es importante en la prctica, porque el primero de los mtodos no puede mostrar efectos positivos si se trata de la produccin de un antibitico incapaz de disolver clulas antagonista, excepto que el antagonista crezca mucho ms rpidamente. Por el otro lado, si el organismo de prueba se introduce despus que el antibitico se ha producido, ser posible observar efectos tanto si la sustancia activa bacteriosttica, o sea, simplemente capaz de impedir el desarrollo del germen de prueba, si es bactericida, es decir que mata a los organismos, o bien bacterioltica, con la propiedad de disolver otros microbios. Asimismo pueden subdividirse dichos mtodos de acuerdo a si el antagonista est presente o ausente mientras el germen de prueba se est desarrollando. Este hecho es de mucha importancia, ya que en determinados casos slo hay resultados positivos (es el caso de sustancias muy inestables) cuando el antibiticos se forma continuamente durante el desarrollo del germen de prueba. Organismos de prueba. La eleccin del antagonizado es un punto esencial para poder apreciar en un estado inicial de las investigaciones cual es el campo de accin del agente activo que se forma. Hay dos divisiones entre las bacterias comunes respecto a su comportamiento frente a una tcnica de tincin, la de Gram, que permite una separacin de notable utilidad en la clasificacin de los grmenes. Los que retienen el colorante de genciana mordentado con iodo, despus de un lavado con alcohol o acetona, se llaman Gram positivos, y los que lo pierden en iguales condiciones y pueden ser nuevamente coloreados con otro tinte de contraste, se denominan Gram negativos. Esta separacin demuestra tener profundas bases en la fisiologa y estructura de las clulas y tambin en cuanto a la sensibilidad frente a distintos antibiticos, pues hay algunos que obran solamente sobre organismos Gram positivos, mientras otros (mucho menores en nmero) exclusivamente lo hacen sobre Gram negativos. Aunque hay un importante grupo que acta, en general sobre ambos grupos de grmenes.

Modo de accin de los microorganismos La prescripcin o eleccin de un antibitico es ms efectiva si se conoce la forma de accionar del germen. Se debe reconocer que los microorganismos actan segn diversos mecanismos. El conocimiento de los mismos aplican no solamente la patogenia y la sintomatologa de la enfermedad sino tambin el xito de la accin del antibitico. El poder de los grmenes se clasifica de la siguiente manera: Poder de virulencia: Se define como el poder de un germen para desarrollarse y reproducirse en la intimidad de los tejidos. Ejemplo: Neumococo, el cual instalado en el odo o en meninges, provoca abundante supuracin. Muchas bacterias son vulnerables, pero casi todas estn acompaadas por otras propiedades: presin, temperatura. Antibitico: Ejerce su accin contra la virulencia ya fuere porque inmoviliza el germen o lo destruye, segn el mecanismo de accin bacteriosttica o bacterioltica. Toxinas -Endotoxinas -Exotoxinas Las Exotoxinas proceden casi siempre de grmenes Gram (+). Ejemplo: Clostridium tetanis que segrega una potente toxina contra el sistema nervioso. En este caso los resultados inmediatos con los antibiticos sern posibles, debido a que el tratamiento deber involucrar suero antitxico especfico. Frente a toxinas de incorporacin externa (botulinum) no hay terapia con antibiticos. Las endotoxinas proceden casi siempre de bacterias Gram (-), son de naturaleza liposacrida y poco antignicas. Esta se libra con la destruccin o autolisis del microbio. Ejemplo: Bacilo de Eberth. Su destruccin libera endotoxina tfica. Accin de los antibiticos Los antibiticos se pueden aplicar por va oral, parenteral o directamente cutaneomucosa y puede generar dos efectos. Bacteriostasis: inmoviliza vitalmente al germen, mientras se espera que la inmunognesis aporte los elementos defensivos necesarios. Bacteriolasis: es la destruccin, lisis o muerte del germen. CLASIFICACIN DE LOS ANTIBITICOS Antibiticos que actan en la pared bacteriana. Ejemplo: penicilina, la pared bacteriana protege a la clula contra los cambios osmticos y contiene elementos

patgenos caractersticos de cada especie. Basamento qumico de la pared (micropptidos) es una unin tridimensional de pptidos acetil-glucosamino y acetil-murmico. Los Gram (+) 40-90% y los Gram (-) 4-10% de muramil pptidos. Un antibitico de este tipo impide la unin de ciertas estructuras qumicas del mucopptido. Como consecuencia, la clula bacteriana, sin pared no resiste los cambios osmticos se hincha y estalla. Antibiticos que actan sobre la membrana celular: La membrana celular se ubica debajo de la pared celular y es de gran importancia. Este tipo de antibiticos puede alterar la permeabilidad y provocan salinidad en el interior de la clula. Antibiticos que interfieren en la sntesis proteica: Ejemplo: tetraciclinas, la proteinosntesis es de vital importancia en la vida de la bacteria y los diferentes pasos del mecanismo de obtencin pueden ser infectados por los antibiticos. Estos son bacteriostticos y bactericidas. Sin produccin o con produccin alterada mueren. Antibiticos que impiden la formacin de ARN: son los que interfieren a la polimerasa y la inhabilitan Los antibiticos en la conservacin de los alimentos Se han obtenido antibiticos de diversos microorganismos, a saber: bacterias no esporuladas, bacterias aerobias esporuladas, actinomicetes y estreptomicetes, hongos filamentosos, basidiomicetes y algas. Entre ellos pueden citarse: 1. De bacterias no esporuladas, por ejemplo: los pyos Ib, Ic, II, III y IV (de la Pseudomona aeruginosa), la diplococcina (de streptococcus cremoris), etc. 2. De aerobios esporulados: la tirotricina (del B. Brevis), la bacitracina, la subtilina (del B. subtilis), la gramicidina, la polimixina, entre otros. 3. De actinomicetes: la estreptomicina, la actinomicina, la estreptotricina, la actinopmicetina, la actinorubina, etc. 4. De algas: la chorellina. 5. De hongos filamentosos: la penicilina (seis variedades), el cido ponicilinico, la citrinina, el cido asperglico, la flavacidina, la fumigacin, etc. 6. De basidiomicetes: la pleutoina, la biformina, la clitocibina, etc. 7. El grupo de estreptomices ha sido el que dio un mayor nmero de antibiticos y muy valiosos, principalmente el grupo de las tetraciclinas y la nistatina. Otros son: la higromicina, la estreptogramina, la ruticina, la carbomicina, la cloromicetina, la nistatina, etc.

Merece especial mencin el grupo de las tetraciclinas, por la amplitud de espectro y por ser las de mayor aplicacin en la preservacin de alimentos. Las tetraciclinas son formadas por el Streptomyces aureofaceins y la nistatina por el Streptomyces noursei. La penicilina es un antibitico que pertenece al grupo de los -Lactmicos; los cuales son inhibidores de la sntesis de la pared celular bacteriana. Se combinan especficamente con las denominadas protenas que unen penicilina de la clula bacteriana e inhiben la actividad enzimtica de estas protenas produciendo la muerte celular. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus. La fabricacin de penicilina es un ejemplo del proceso tpico de obtencin de antibiticos. El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillium chrysogenum y es particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, as como sobre la mayor parte de los microorganismos Gram. Positivos, presentando escasa accin sobre los Gram. Negativos. La penicilina es lbil en medio cido y puede ser inactivada por hidrlisis del anillo -Lactmico con penicilinasas. PENICILINA; FABRICACIN INDUSTRIAL La fabricacin de penicilina es un ejemplo del proceso tpico de obtencin de antibiticos. El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillum chrysogenum y es particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, as como sobre la mayor parte de los microorganismos Gram. Positivos, presentando escasa accin sobre los Gram. negativos. Las 4 fases principales para la fabricacin de penicilina son: - Fermentacin - Separacin del micelio del caldo fermentado y extraccin de la penicilina por medio de disolventes - Purificacin con disolventes y formacin de la sal sdica de la penicilina - Ensayos de control y almacenamiento. PREPARACIN: El caldo de cultivo para la fermentacin se obtiene por infusin acuosa de maz, aadiendo de un 2 a un 3% de lactosa, y tambin se adicionan compuestos inorgnicos conteniendo hidrgeno, oxgeno, fsforo, azufre, potasio, magnesio, nitrgeno y trazas de hierro, cobre y zinc. La adicin de ciertos compuestos que favorecen el crecimiento del hongo debe evitarse, ya que podran ser tolerados al administrar el producto, ni su eliminacin sera econmica. Despus de buscar el pH a 4.5-5.0, el medio de cultivo se pasa al fermentador, que est equipado con un agitador vertical, con un sistema de introduccin de aire esterilizado por filtracin y con serpentines para mantener la temperatura deseada. El hongo se

introduce por medio de conducciones estriles y con ayuda de airea presin. Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presin, y la temperatura se mantiene entre 23 y 25C. El aire estril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitacin facilita su uniforme distribucin en el seno del lquido. Se requiere un volumen de aire por minuto y por volumen de medio de cultivo. El proceso se controla a intervalos que oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va haciendo ms lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo. La masa se enfra a 5C a causa de la inestabilidad de la penicilina a la temperatura ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina; solamente un pequeo porcentaje de personas desarrollan alergia. OBJETIVO GENERAL: Obtencin de penicilina por inoculacin de esporas de Penicillium chrysogenum previamente sembradas en agar sabouraud en medio de cultivo liquido que contiene los nutrientes apropiados para la generacin y crecimiento de la biomasa. MICROORGANISMO Cultivo en agar inclinado de Penicillium chrysogenum (DSM 1.075), realizado en agar Sabouraud-glucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua corriente: 1L (pH 5.6) MATERIALES 1 jeringa desechable de 5 ml, agua estril para inyeccin, algodn, gasa, asa de siembra, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero Bunsen, erlenmeyer de 500ml PREPARACIN DEL INCULO PROCEDIMIENTO OPERATIVO: Se debe repicar Penicillium Chrysogenum en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer durante 8 das, mientras este tiempo transcurre se disuelven los componentes del caldo de cultivo (lactosa: 30.0g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sdico: 3.0g, dihidrogenofosfato sdico: 0.5g, fenilacetato sdico: 0.3g, sulfato magnsico: 0.25g, sulfato de cinc: una punta de esptula, agua corriente: 1L) en un erlenmeyer de 500ml, se ajusta a pH entre 5.5 y 6, se tapa con algodn y se esteriliza en autoclave a 121oC por 15 minutos. Al da siguiente se procede a la siembra, para ello, se debe limpiar la cabina correctamente, y llevar all, el medio autoclavado, guantes quirrgicos, asa de siembra, jeringa desechable de 5 ml, agua estril para inyeccin, aspersor con alcohol, gasa y mechero; encender el

motor de la cabina y la lmpara germicida y dejar durante 20 minutos, luego apagar la lmpara germicida , encender la lmpara fluorescente, incluir el inculo y proceder con la inoculacin de la siguiente manera: Saque 5ml de agua para inyeccin con la jeringa y descrguelos sobre el tubo donde se encuentra el inculo, agite un poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer donde se encuentra el medio, realice el mismo procedimiento con 5 ml ms y tape con el algodn. Saque todo el material de la cabina, limpie bien con alcohol y gasa, lleve el medio al agitador orbital (shaker) controle el pH cada 2 3 das mantenindolo a pH 5, durante 10 a 15 das. Cristalizacin de la penicilina: Filtrar el caldo de cultivo; tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con cido fosfrico, aadir un volumen igual de ter enfriado en un bao de hielo; luego adicionar unas puntas de esptula de sulfato sdico anhidro, concentrar a vaco hasta reducir a 1/4 el filtrado, aadir un poco de solucin de ter disuelto en trietilamina. Filtrar y recoger los cristales obtenidos. Cortar con perforadora pequeos crculos de papel de filtro e impregnarlos con el filtrado del medio, luego colocarlos en una caja de petri, la cual previamente ha sido sembrada con un microorganismo sensible a la penicilina, que puede ser: Bacillus subitlis, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. Incubar a 28C por 24 horas; al da siguiente se comprueba la actividad de la penicilina por la aparicin de halos de inhibicin alrededor de los discos de papel. Preparacin de las placas de ensayo Microorganismos Cultivos en agar inclinado de de microorganismos de ensayo: B. subtilis (DSM 402), Micrococcus luteus (DSM 348), Escherichia coli (DSM 348), Pseudomonas fluorescens (DSM 50.090), Agar de ensayo para bacterias indicadoras: Glucosa 2,0g Peptona 10,0g Extracto de levadura 1,0g Agar 12,0g Agua desmineralizada 1,01 pH 7 Aparatos Asa de siembra y mechero Bunsen, esptula de Drigalski, pipetas desechables (1ml estriles), solucin de NaCl (0,9%, estril), tubos de ensayo (estriles) Procedimiento operativo Suspender un asa de siembra de las bacterias de ensayo en 2ml de solucin de cloruro sdico estril; pasar 0,1ml de la suspensin bacteriana a la placa con agar de ensayo; extenderla regularmente con la esptula de Drigalski, secar las placas: dejarlas a 45C en una incubadora o estufa abierta. Duracin: 20minutos

Colocar la tapa, tener listas las placas de ensayo. Duracin: 2 horas Comprobacin de la penicilina con un ensayo de difusin Material: Placas de ensayo, discos de papel impregnados de penicilina Aparatos: Pinzas, mechero Bunsen, estufa regla graduada Procedimiento operativo Colocar los discos de papel con penicilina sobre las placas de ensayo con las pinzas esterilizadas a la llama (3-5 discos), incubar las placas de ensayo a 28C. Duracin: 24 horas Control de las placas: se comprueba la actividad de la penicilina por la aparicin de halos de inhibicin alrededor de los discos de papel. Resultado El dimetro del halo de inhibicin es una medida de la accin (y concentracin) antibitica de la penicilina obtenida. Los halos claros se miden con la regla y los datos obtenidos se renen en una tabla. Si se tiene poca prctica, aunque la manipulacin haya sido cuidadosa pueden producirse errores, por lo que es recomendable llevar a cabo cada experiencia por triplicado. Por ello, habra que realizar la preparacin para la cristalizacin de la sal de penicilina slo cuando se haya establecido con certeza la actividad antibitica con el ensayo con el filtrado de cultivo. GLOSARIO ANTIBITICO: Sustancia natural de peso molecular relativamente bajo, producida por un microorganismo, la cual en solucin diluida inhibe el crecimiento o destruye otros microorganismos. HIDRLISIS: Rotura cataltica de macromolculas o polmeros en sus constituyentes con la incorporacin de los elementos del agua. BIOMASA: Masa celular producida durante la fermentacin. BIBLIOGRAFA COOMBS, J. Diccionario de biotecnologa. Editorial Labor, S.A. 1 edicin 1989. Espaa. CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza Espaa. 3 edicin. 1989. JAGNOW, Gerhard. Biotecnologa Introduccin con experimentos modelo. Editorial Acribia S.A. Zaragoza Espaa. 1991.

Prctica No. 11 TRANSFORMACION BACTERIANA

INTRODUCCION La transformacin se puede definir como la variacin hereditaria de una clula bacteriana susceptible, originada por la captacin de ADN desnudo libre en el medio. Tras la transformacin, la clula que ha recibido el ADN se suele denominar transformante. En los ltimos aos se ha logrado desarrollar sistemas artificiales para producir "clulas competentes" en algunas de ellas (como Escherichia coli, Salmonella typhimurium y algunas especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los estudios genticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro: por ejemplo, la transformacin artificial de E. coli con ADN plasmdico es una de los mtodos bsicos de la Ingeniera Gentica. La obtencin de clulas competentes en E. coli consiste en ir concentrando un cultivo recogido en fase logartmica, mediante lavados sucesivos en una solucin fra (4C) de Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de clulas y ADN se someten a unos 2 min. a 42C (choque por calor). Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN. Los plsmidos entran a la clula como molculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas citoplsmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algn o algunos antibiticos conferidos por los plsmidos artificiales usados en Ingeniera Gentica. OBJETIVOS Producir clulas bacterias competentes para transformacin Transformar clulas de Escherichia coli con plasmidos que portan genes de resistencia a antibiticos A.- Preparacin de clulas competentes. 1.- Tome con un palillo o punta de micro pipeta una sola colonia bacteriana e inoclela en un Erlenmeyer de 250 ml que contenga 30 ml de medio de cultivo SOB. 2.- Incube toda la noche a 37C con agitacin moderada (150 o 200 rpm)

3.- Tome un mililitro de cultivo bacteriano que usted ha crecido toda la noche e inoclelo en un Erlenmeyer de 500ml que contenga 50ml de medio de cultivo SOB. Incube a 37C a 250 rpm, hasta que la densidad ptica a 550 sea de aproximadamente 0.3. 4.- Colecte el cultivo bacteriano en dos tubos estriles de polipropileno de 50 ml y enfri en hielo por 15 minutos. 5.- Precipite las bacterias mediante centrifugacin a 3000 X g (5000rpn utilizando un rotor Sorval SS-34) por 15 minutos a 4C. Elimine el sobre nadante con cuidado de no eliminar el precipitado bacteriano. 6.- Adicione 8 ml de tampn de transformacin 1 (16 ml por 50 ml de cultivo inicial). Resuspenda el precipitado con agitacin suave, puede utilizar un vortex. 7.- Incube los tubos en hielo por 15 minutos. 8.- Precipite las bacterias como se describi en el paso 5. 9.- Resuspenda el precipitado bacteriano en 2 ml de tampn de transformacin 2. Almacene a 4C no mas de 4 o 5 horas antes de ser utilizadas. 10.- Las clulas competentes pueden ser almacenadas a -70C hasta por dos meses. Para congelar las clulas siga el siguiente procedimiento: Adicione 70 ul de Dimetil sulfoxido (DMSO) por cada 2ml de clulas competentes. Mezcle suavemente y almacene la suspensin en hielo por 15 minutos. Adicione otros 70 ul de DMSO, agite suavemente y regrese la suspensin a un bao de hielo. Dispense 100 ul de suspensin de clulas competentes a tubos eppendorf , sumerja los tubos eppendorf con las clulas en nitrgeno lquido e inmediatamente almacene en una nevera de -70C hasta que las necesite. B.- Transformacin 1.- Si las clulas han sido congeladas, desconglelas en hielo. 2.- Adicione aproximadamente 20 ul de DNA plasmidico a la fraccin de clulas competentes y mezcle suavemente con una micropipeta. 3.- Incube las clulas en hielo por 40 minutos. 4.- Someta las clulas a choque trmico, introducindolas en un bao mara que este a 42C por 45 segundos. No agite las clulas.

5.- Adicione 1 ml de medio de cultivo SOB (sin antibitico) a cada tubo con las bacterias transformadas e incube a 37C con agitacin suave por 45 o 60 minutos. 6.- Sirva entre 100 a 200 ul de las bacterias transformadas del paso anterior sobre cajas de petri con LB-agar suplementado con antibitico (cuyo gen de resistencia se encuentra presente solo en el DNA del plasmado). Incube los transformantes toda la noche a 37C y evalu el crecimiento bacteriano. C. Medios de cultivo y tampones. Medio de cultivo SOB (1 litro) Bacto triptona Extracto de levadura NaCl KCl MgCl2 MgSO4 20.0 g 5.0 g 0.6 g 0.5 g 10 mM (Vea mas abajo) 10 mM (Vea mas abajo)

Disuelva triptona, extracto de levadura, cloruro de sodio y cloruro de potasio en un volumen fina de 990 ml de H2O destilada (dH2O). Esterilice mediante auto clavado. Justo antes de utilizar, adicione 10 ml del stock magnesio (vea mas abajo) al medio de cultivo SOB para producir un medio 20 mM con respecto al magnesio. Medio LB agar(1 litro): Bacto triptona Extracto de levadura NaCl 10.0 g 5.0 g 10.0 g

Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0 con NaOH 5N. Adicione 15 g de bacto agar lleve a 1 litro y autoclave. Tampn de Transformacin 1 (500 ml) RbCl MnCl24H2O Acetato de potasio CaCl22H2O* Glicerol 6.0 g 5.0 g 15.0 ml (1 M stock, pH 7.5) 0.75 g 75.0 ml

Combine los reactivos en dH2O. Ajuste a pH 5.8 con 0.2 M de cido actico. Lleve a un volumen final de 500ml con dH2O. Esterilice mediante filtracin con una membrana 0.22 m. Almacene a 4C. Tampn de Transformacin 2 (500 ml) MOPS RbCl CaCl22H2O* Glicerol dH2O 10.0 ml (0.5 M stock, pH 6.8) 0.6 g 5.5 g 75.0 ml 500.0 ml

Combine los reactivos en dH2O. Lleve a un volumen final de 500ml con dH2O. Esterilice por filtracin utilizando una membrana de 0.22 m. Almacene a 4C. * Si utiliza CaCl2 anhidro, utilice 0.57 g para el Tampn 1, y 4.15 g para el Tampn 2. Stock 2 M Mg2+ (100 ml) MgCl2 MgSO4 20.3 g 24.7 g

Disuelva los reactivos en un volumen final de 100 ml de dH2O. Esterilice por filtracin utilizando una membrana de 0.45 m. La solucin resultante es 2 M con respecto al Mg2+. MOPS 0.5 M (100 ml) Disuelva 10.47 g MOPS en dH2O. Ajuste a pH 6.8 con NaOH. Lleve a un volumen final de 100 ml. Esterilice por filtracin utilizando una membrana de 0.22 m. El Tampn MOPS debe ser claro y sin color. Acetato de potasio 1 M (100 ml) Disuelva 9.82 g de acetato de potasio en dH2O. Ajuste a 7.5 con cido actico. Lleve a un volumen final de 100 ml. Esterilice mediante autoclave. Bibliografa: http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/25_Micro.html Sambrook, J., Fritsch, EF., Maniatis, T. 1989 Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York, USA

Prctica No. 12 EXTRACCIN DE ADN (cido desoxirribonucleico)

INTRODUCCIN La extraccin de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular, libre de protenas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. Diferentes mtodos de extraccin han sido descritos para el aislamiento de cidos nucleicos, aqu se trabajara especficamente con la extraccin de AND vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN. En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extraccin, es necesario degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los mtodos fsicos son los ms empleados, especialmente la congelacin y la maceracin. Para bacterias y clulas desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza inica para permitir que el ADN se libere en el buffer. La inhibicin de nucleasas es un factor critico, esta se alcanza empleando buffer1 con pHs poco ptimos para accin de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato). Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las protenas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es precipitado con alcohol y centrifugacin. El ADN libre de protenas y otros compuestos celulares se disuelve en un buffer2 . Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacridos, para separarlos de los cidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extraccin o sustancias como CTAB ( cetil trimethyammonium) que colabora en la precipitacin del ADN. El pH durante el proceso de extraccin debe ser ptimo, que evite la accin de enzimas degradativas del cido nucleico. La mayora de los procedimientos de extraccin de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0. Para cuantificacin del ADN se hace uso de la espectrofotometra (absorbancia a una longitud de honda de 260nm), o la observacin directa con fluorescencia despus de teir el gel de extraccin con bromuro de

etidio.(mtodo de saram wrap, mtodo del plato de agarosa, mtodo del minigel) o por fluorometria. OBJETIVO Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y alta pureza. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Material del que se extrae el DNA ( se recomienda utilizar material fresco), bistur, mortero, balanza analtica, tubos de ensayo con tapa, centrfuga refrigerada, bao agua (60 C), pipetas de 5 ml, micropipetas y puntas, tubos eppendorf, espectrofotmetro. Buffer 1 50mM Tris-HCl (pH8.0) 5mM EDTA 350mM Sorbitol 0.1% Mercaptoetanol 10% polyetilienglicol

Buffer 2 50 mM Tris- HCl (pH 8.0) 5 mM EDTA 350 mM Sorbitol 0.1% Mercaptoetanol 1% Sodio Sarkosyl 710 mM NaCl 0.1% Cetiltrimetilamonio. (CTAB)

Otros reactivos Cloroformo, alcohol Isoamilico, iIsopropanol, etanol 70% PROCEDIMIENTO No. 1 Pesar 70mg del tejido, llevarlo a mortero y macerar. Agregar 1ml de buffer1por cada 70mg de la muestra Agitar Centrifugar a 5000 rpm /10min en fri a 4C Descartar sobrenadante Resuspender slido agregando 500l del buffer2 por cada 70mg de la muestra.

Incubar a 60 C por 15 minutos Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamilico en una proporcin 24:1 Centrifugar a 5000rpm/10mit Transferir la fase acuosa a otro tubo Agregar 2 volmenes de isopropanol fri -20 C (para precipitar el ADN) Centrifugar y eliminar el Alcohol (isopropanol) Lavar con Etanol 70% Centrifugar y eliminar el Alcohol (etanol) Resuspender el precipitado en 300l de Tris-Edta, agitar suavemente. Leer espectrofotmetro a 260nm. (50g/ml ADN absorbancia de 1)

Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido realizamos la siguiente relacin ADN/Proteina =260nm/280nm Un valor menor de 1.8 indica contaminacin por protenas. MINIPREPARACION DE DNA PLASMIDICO INTRODUCCION Por lo general, los plsmidos son purificados a partir de cultivos (Crecidos en medio lquido que contienen el antibitico apropiado) que han sido inoculados con una colonia bacteriana, tomada de un plato de agar. Muchos de los plsmidos comnmente utilizados, se replican a muy altas tasas y pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de bacterias transformadas que alcanzan la fase logartmica del crecimiento, en medio lquido. Las bacterias se recuperan por centrifugacin y son lisadas por uno de varios mtodos, incluyendo tratamiento con detergentes inicos y no inicos, solventes orgnicos, lcali o calor. En la presente prctica utilizaremos el mtodo de lisis alcalina para la preparacin de DNA plasmdico, debido a su facilidad de implementacin, rapidez y las altas cantidades de DNA obtenido. OBJETIVO Obtener DNA plasmdico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos. MATERIALES Y MTODOS 1. Tome con un palillo o punta de micropipeta una colonia bacteriana e inoclela en un tubo falcn de 50 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo LB suplementado con 50 ug/ml de ampicilina. Ponga el cultivo en agitacin a 250 RPM y 37oC toda la noche

2. Centrifugue 1.5mL del cultivo bacteriano crecido toda la noche a 12000 rpm por 1 minuto. Retire el sobrenadante. 3. Resuspenda el precipitado de clulas bacterianas en 100 ul de tampn GTE (50 mM Glucosa, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8). Mezcle hasta que el precipitado quede totalmente disuelto, utilice un vortex si es necesario. 4. Adicione 200 ul de solucin de lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Invierta el tubo unas 6 a 8 veces. 5. INMEDIATAMENTE adicione 150 ul de una solucin 5M de acetato de potasio pH 4.8. Esta solucin neutraliza el NaOH utilizado en el paso previo de lisis precipitando simultneamente el DNA genmico y el SDS. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. 6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf, teniendo especial cuidado en no remover el precipitado blanco. Precipite los cidos nucleicos utilizando un volumen de isopropanol e incubando en hielo por 10 minutos. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. 7. Retire el sobrenadante de isopropanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el isopropanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado en 400 ul de tampn TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Adicione 10ul de solucin de RNAse A (Stock de 20 mg/ml almacenado a -20 C), agite e incube a 37 C por 20 a 30 minutos para digerir todo el RNA. 8. Extraiga las protenas de la solucin que contiene el DNA del plasmido utilizando un volumen igual de FCI (fenol/cloroformo/alcohol isoamilico). Agite vigorosamente por 30 o 60 segundos. Centrifugue a 12000 rpm a temperatura ambiente. Observe que la fase orgnica de FCI se localiza en la parte baja del tubo eppendorf. 9. Remueva la fase acuosa (superior) que contiene el DNA del plasmado, cuidadosamente, sin alterar la interfase blanca que se encuentra por encima de la fase orgnica de FCI y transfirala a un tubo limpio de 1.5 ml. 10. Para precipitar el DNA del plasmado, adicione 100 l de acetato de amonio 7.5 M y 1 ml de etanol, incube a -20C por 15 minutos. Centrifugue a 12000 rpm por cinco minutes a temperatura ambiente. 11. Retire el sobrenadante de etanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el etanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado de DNA en 50 ul de Tampn TE. Corra una electroforesis en gel de agarosa al 1% y observe el DNA del plasmido.

Para cuantificar el DNA realice una dilucin 1/200 y lea la absorbancia a 260nm. Medio LB agar(1 litro): Bacto triptona Extracto de levadura NaCl 10.0 g 5.0 g 10.0 g

Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0 con NaOH 5N. Autoclave por 20 o 30 minutos. Solucin GTE Solucin stock Glucosa estril 40% EDTA 0.5 M, pH 8 Tris-HCl 1M, pH 8 ddH2O estril Total volumen 2.27 ml 2.0 ml 2.5 ml 93.23 ml 100.0 ml concentracin final 50 mM 10 mM 25 mM

Utilice todas las soluciones stock estriles. Almacene a 4C. Solucin de lisis NaOH/SDS Solucin stock NaOH 1N SDS 10% ddH2O estril Total volumen 2.0 ml 1.0 ml 7.0 ml 10.0 ml concentracin final 0.2 N 1%

Solucin de acetato de potasio 5 M. Solucin stock Acetato de potasio 5 M cido actico glacial ddH2O Total: volumen 60 ml 11.5 ml 28.5 ml 100 ml

Esterilice con filtro. La solucin resultante es 3 M de potasio y 5 M de acetato y tiene un pH aproximado de 4.8. Tampn TE : Tris-Cl 10 mM, pH 7.5 + EDTA 1 mM

Se deben tener soluciones stock de Tris-Cl 1M (pH 7.5) y 500 mM de EDTA (pH 8.0). GLOSARIO ADN: cido desoxirribonucleico (ADN), material gentico de todos los organismos celulares y casi todos los virus. El ADN lleva la informacin necesaria para dirigir la sntesis de protenas y la replicacin. Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampn biolgico. Su principal funcin es mantener el pH de la solucin estable (7.0 8.0). EDTA: (Etilen diamino tetra actico) Es un agente quelante. Se encarga de remover iones de magnesio que son esenciales para preservar l estructura de la envoltura celular. Cloroformo: Solvente orgnico que se encarga de remover residuos de lpidos y fenoles en la muestra. Colabora en la desnaturalizacin de protenas. CTAB: cetil trimetil bromuro de amonio, detergente cationico que solubiliza las membranas celulares, dependiendo de la concentracin de cloruro de sodio en la solucin, permite la remocin de polisacridos y otras macromolculas. El CTAB forma un complejo con el ADN y por lo tanto puede ser empleado para precipitar ADN selectivamente. Cloruro de sodio: colabora para equilibrar las fuerzas inicas. Mercaptoetanol: Antioxidante. Forma enlaces disulfuro, forma disulfuros mixtos con las cadenas laterales de las protenas. Evita color pardo en ADN extrado. Alcohol Isoamilico: Antioxidante. Reduce o imposibilita la formacin de interfases durante la extraccin de ADN. Etanol, Isopropanol: Alcoholes. En presencia de sales (temperatura de aproximadamente 20 C ) precipita ADN, reduciendo la constante dielctrica del solvente. BIBLIOGRAFA Perea Arango Irene, Pineda Tuirn Rosana, Arango Isaza Rafael, MANUAL DE TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR. 2002 U de A pg 11-16 Plant Tissue Culture and Biotechnology . June 1998 vol 4 N 2 pg 76 -79 Sambrook, J., Fritsch, EF., Maniatis, T. 1989 Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York, USA.

Prctica No. 13 Electroforesis de DNA y de protenas

Introduccin: Electroforesis es la migracin de las molculas cargadas presentes en una solucin acuosa como respuesta a la presencia de un campo elctrico, dichas molculas son atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Dos fuerzas de accin opuesta determinan la velocidad de la partcula en cuestin. Por un lado, la fuerza elctrica, que la atrae al electrodo, cuya intensidad es directamente proporcional a la carga, y, de acuerdo a la segunda ley de Newton (F=m x a, entonces a=F/m), le impone una aceleracin directamente proporcional al cociente carga/masa (q/m). Por otro lado, la fuerza de rozamiento, que se opone a la migracin con una intensidad que depende del tamao y la forma de la partcula y de las caractersticas del medio (viscosidad y estructura, por ejemplo). La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromolculas en solucin, en forma analtica (es decir, slo para verlas) o preparativa (para purificarlas). Los cidos nucleicos tienen un fosfato cargado negativamente por nucletido. Como el peso molecular de los cuatro nucletidos es similar, la relacin q/m es independiente de la secuencia y el tamao de la molcula. Por lo tanto la aceleracin impuesta por la fuerza elctrica es igual para cualquier molcula de cido nucleico. La nica diferencia en velocidad de migracin estar dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea de su forma y de su tamao. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molcula, entonces las distintas molculas tendrn una velocidad que slo depender de su tamao, es decir, de su longitud en pares de bases. Sin embargo, si tratramos de separar molculas de DNA doble cadena en una electroforesis en una solucin acuosa, nos encontraramos con que el rozamiento impuesto por sta es tan pequeo que todas las molculas migraran juntas. Adems, durante la electroforesis, las molculas se separaran unas de otras por difusin, impidiendo el anlisis. Para lograr una separacin eficiente, se utiliza un medio soporte que aumente considerablemente la friccin recibida por las macromolculas y reduzca la difusin a un mnimo. Este medio suele ser una red molecular de algn polmero orgnico, conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Los ms utilizados en laboratorios de biologa molecular son de poliacrilamida, una red molecular estabilizada por uniones covalentes, y agarosa (un derivado del agar-agar), un polisacrido extrado de un alga que forma, al disolverlo, una red estabilizada por interacciones no covalentes. Las mezclas de DNAs de distinto tamao se hacen migrar (desplazarse) a travs del gel durante un cierto tiempo y se obtiene una separacin en la que la distancia migrada por una molcula dada es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular (o de su longitud en pares de bases). El tamao de una muestra desconocida puede estimarse corriendo en paralelo muestras de longitud conocida.

Cuando se hace un anlisis electrofortico de muestras de cidos nucleicos que no poseen todos la misma forma, debido, por ejemplo, a la presencia de estructuras secundarias que dependen del apareamiento interno, o sea, de la secuencia (RNA o DNA simple cadena), es necesario, para determinar su peso molecular, homogeneizar su estructura. Para ello se utilizan agentes desnaturalizantes fuertes que destruyan la estructura secundaria, por ejemplo urea, formamida, formaldehdo o pH bsico (para DNA). En el caso de las protenas el problema es ms complejo porque no slo distintas molculas de igual tamao (peso molecular) tienen formas distintas sino que adems la carga (y con ella el q/m) vara mucho de una a otra, adems, como son compuestos anfotricos, su carga neta est determinada por el pH del medio en que se encuentren, en una solucin con un pH superior a su punto isoelctrico estarn cargadas negativamente y en un campo elctrico migrarn hacia el nodo(+) pero si el pH del medio es inferior a su punto isoelctrico, migrarn hacia el ctodo(-). Para igualar la relacin q/m y la forma de todas ellas se utiliza un detergente cargado negativamente, el dodecil sulfato de sodio (SDS), que las desnaturaliza y las recubre en cantidad proporcional al tamao, proveyndoles un gran nmero de cargas que hacen que las propias sean despreciables y que el q/m de todas las molculas se equipare. El SDS envuelve al polipptido en una relacin de masas 1,4:1 y el polipptido queda cargado negativamente con una carga proporcional a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes de disulfuro de las protenas para permitir la unin cuantitativa del SDS, esta reduccin se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. Slo en estas condiciones es posible determinar el tamao de un polipptido en un gel, en el que tendr una migracin inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Objetivo general: Preparar, realizar una electroforesis de DNA en gel de agarosa y otra de protenas en gel de poliacrilamida e interpretar los resultados. Procedimiento experimental: Reactivos para electroforesis de DNA en gel de agarosa: Buffer Tris-borato (TBE) pH 8.0 sln 5x: Preparacin: Disolver 54g de Tris base, 27,5g de cido brico, 20mL de una solucin de EDTA 0.5M ajustar pH y ajustar volumen a 1L, guardar en frasco mbar bajo refrigeracin. Preparacin del molde para preparar un gel horizontal: Sobre una placa de vidrio limpia y desengrasada de tamao adecuado haga un marco con cinta de enmascarar para que quede con una profundidad de mnimo 7mm teniendo la precaucin de que quede bien sellado. Preparacin del gel de agarosa: Preparar una solucin de agarosa al 0.8% en buffer TBE. Agregar la cantidad adecuada de agarosa en polvo al volumen de

buffer TBE medido, calentar hasta que la agarosa se disuelva (quede translcida la solucin). Verter la solucin en caliente sobre el molde previamente preparado y colocar la peineta sin traspasar el gel; es decir, teniendo la precaucin que los dientes que formarn los posuelos queden a una distancia de 0,5-1 mm por encima de la base del gel para que los posuelos queden completamente sellados. Despus de que el gel se enfre y solidifique, retire cuidadosamente la peineta y la cinta de enmascarar con la que hizo el molde del gel y coloque el gel en el tanque de electroforesis. Agregue suficiente buffer TBE para cubrir el gel 1mm por encima de su parte superior. Mezcle las muestras de DNA que estn suspendidas en TE con buffer de carga (una solucin de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en agua) en una proporcin 1:1. Coloque lentamente las muestras mezcladas con el buffer de carga en los posuelos dentro del gel de agarosa con la ayuda de una micropipeta. Complete el montaje teniendo la precaucin de que el polo positivo este al lado opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente elctrica (3-5V/cm) hasta que el color haya migrado casi hasta el final del gel (unos 10cm), suspenda la corriente elctrica, retire el gel y sumrjalo 45 minutos en una solucin con bromuro de etidio (en buffer o agua) con una concentracin de 0,5 g/mL. Tenga la precaucin de usar guantes cuando manipule el gel o las soluciones ya que el bromuro de etidio es un poderoso mutagnico. Coloque luego el gel sobre un transiluminador ultravioleta (UV) y observe las bandas de DNA protegiendo los ojos de la radiacin UV. Reactivos para electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida: Precaucin, la acrilamida y bisacrilamida como monmeros son potentes neurotoxicos acumulativos que se absorben rpidamente por la piel, no pipetear con la boca ni manipular las soluciones sin usar guantes. Buffer Tris-HCl pH 8.9 (solvente para poliacrilamida y persulfato de amonio): Preparacin: Disolver 36.6 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12) en 850 mL de agua destilada, ajustar pH y ajustar volumen a 1 L, guardar en frasco mbar bajo refrigeracin.

Preparacin de los geles: Gel de corrida (Sln. 1A): Para 50 mL: 9,2 g de acrilamida, 0,184 g de bisacrilamida y llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl, mezclar bien, filtrar y empacar en frasco mbar bajo refrigeracin. Gel de separacin (Sln. 1B): Para 50 mL: 4,2 g de acrilamida, 0,184 g de bisacrilamida y llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl, mezclar bien, filtrar y empacar en frasco mbar bajo refrigeracin Solucin de persulfato (Sln. B): Para 50 mL: 0,125 g de persulfato de amonio, llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl, mezclar bien, no filtrar y empacar en frasco mbar bajo refrigeracin. Buffer Tris-Borato pH 8.8 (para los tanques): Para 1 L: 7,86 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12), 1.925 g de cido brico p.a. (AC-3). Disolver el Tris en 600 mL de agua destilada, agregar el cido brico hasta disolverlo completamente, ajustar a volumen de 1L con agua destilada, mezclar bien y guardar bajo refrigeracin. Colorante (Amido Black) (150 mL): 1 g de Amido Black, 15 mL de cido actico, 67 mL de metanol y 67 mL de agua destilada. Preparacin de los geles de poliacrilamida para electroforesis de protenas: Seguir las instrucciones del docente o tcnico del laboratorio para ensamblar el montaje. Gel de corrido: 10 mL de Solucin 1A, 10 mL de solucin B y 40 L de TEMED, mezclar y rpidamente verter entre las placas de vidrio, agregar un poco de agua en la superficie para evitar el contacto con el aire, dejar polimerizar o gelificar. Gel de separacin: 3 mL de solucin 1B, 3 mL de solucin B y 20 L de TEMED, mezclar y rpidamente verter entre las placas de vidrio sobre el gel de corrido habiendo retirado previamente el agua, colocar la peineta del tamao adecuado para formar los posuelos evitando la formacin de burbujas. Dejar polimerizar o gelificar y retirar la peineta con precaucin para no daar el gel, inmediatamente lavar los posuelos con agua. Preparacin de las muestras: 10 L de plasma o suero y 10 L de una solucin de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25%, mezclar.

Terminar de ensamblar el montaje, agregar suficiente buffer Tris-Borato pH 8.8 para cubrir los posuelos. Con la ayuda de una jeringa colocar las muestras en los posuelos, complete el montaje teniendo la precaucin de que el polo positivo este al lado opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente elctrica hasta que el color haya migrado casi hasta el final del gel, suspenda la corriente elctrica, retire el gel y sumrjalo al menos una hora en la solucin de colorante Amido Black, luego desteir el gel sumergindolo en una solucin de metanol al 20% en agua y acido actico al 10%. Observar las bandas de protenas de color azul oscuro. Referencias: Maniatis, T, Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Seventh impression. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 150-185. United States of America, 1982. ISBN: 0-87969-136-0 Perea, I., Pineda, R., Arango, R. Manual de Tcnicas de Biologa Molecular. Posgrado en Biotecnologa. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. 2002 Corzo, J. Curso de doctorado Electroforesis. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Universidad de la Laguna. Espaa, 2004. Tomado de: http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/listado.htm Electroforesis en Geles de Poliacrilamida. Mtodos en Biologa Celular. Universidad de Barcelona. 2004. Tomado de: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm Lpez, C. Electroforesis de proteinas del suero humano en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Universidad de Antioquia, departamento de Qumica, Laboratorio de Cromatografa CNQ-533. 2004. Tomado de: http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/cnq533g.html Electroforesis de dna plasmdico en gel de agarosa. 2004. Tomado de: http://orbita.starmedia.com/~animalia/cosas/3electroforesis.htm Electroforesis de cidos nucleicos en gel. Diagramas animados de tcnicas y procesos bioqumicos. Complementos de Bioqumica y Biologa Molecular. Universidad de Alcal. Espaa. 2004. Tomado de: http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof_txt.htm Electroforesis en geles de agarosa. Introduccin a la Biologa Molecular y Celular. Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular, Universidad de Buenos Aires. Argentina. 2004. Tomado de: http://therion.dna.uba.ar/ibmc/Agarosa.htm

Prctica No. 14 Esterilizacin

Microorganismo: Saccharomyces cerevisae Introduccin El control de microorganismos mediante procesos de esterilizacin, tiene especial importancia en el laboratorio, dado que la escogencia del mtodo a utilizar y del material a procesar me definen la eficacia del proceso de eliminacin microbiana y por ende garantizan la no contaminacin de muestras o cultivos, hechos fundamentales en la validez de un resultado en el laboratorio.

Marco Terico Agentes fsicos: Los factores ambientales como son la temperatura y la humedad son fundamentales para el desarrollo de bacterias, de forma tal que la alteracin del de este ambiente causa inhibicin o muerte de los microorganismos. Se cuenta actualmente con diferentes agentes fsicos para el control de microorganismos en la industria y en el rea de la salud, los ms usados son: calor seco y hmedo, radiacin, y filtracin. Calor hmedo Autoclave: El calor como vapor a saturacin y a presin ejerce accin bactericida incluyendo la destruccin de esporas, este es el mtodo de esterilizacin mas utilizado dado que ofrece las ventajas de mayor capacidad de penetracin y distribucin homognea en el recipiente de esterilizacin (autoclave), este calor a presin acta desnaturalizando las protenas, cidos nucleicos y fragmentando las membranas celulares. Se recomienda la utilizacin de este mtodo para la esterilizacin de material contaminado y de medios y soluciones siempre y cuando este proceso no altere su naturaleza. Algunos materiales no deben someterse al accin de la autoclave, entre ellos sustancias que no se mezclen con agua como grasa y aceite por su dificultad de penetracin, algunos medios de cultivo lbiles a altas temperaturas y materiales plsticos y metlicos que pueden deteriorase; en el caso de los medios de cultivo sensibles a calor se ha utilizado la esterilizacin fraccionada o filtracin. Radiaciones: Las ondas electromagnticas, acsticas o de partculas subatmicas producen dao en el material gentico de la bacteria que puede causar su muerte, este es el mtodo de esterilizacin en fro, se utiliza mas frecuentemente en la industria de alimentos y en la farmacutica. La luz ultravioleta emplea lmparas en la que se emite a una longitud de onda entre 30 y 40 nanmetros, estas radiaciones son absorbidas por el cido nucleico de

la bacteria y por lo tanto tiene accin letal, el uso mas amplio de este mtodo es en salas de quirfano, medios de cultivo y en cmaras de bioseguridad en el laboratorio.} Loas rayos X son letales para las clulas microbianas y los seres vivos superiores, por su alto costo y mala difusin de las radiaciones que afectan al usuario son de poco uso en el control microbiano. Los rayos gama tienen mucha energa y poder de penetracin, son emitidos por istopos radioactivos como el Co60 , son letales para todas las formas de vida, se ha utilizado alimentos empacados pero su uso en el rea hospitalaria es limitado a algunos procedimientos de diagnstico. Los rayos catdicos o haz de electrones son microbicidas a velocidades extremas, se usan parea esterilizar material quirrgico, drogas o otros materiales tienen como ventaja que estos pueden esterilizarse despus de empacados a temperatura ambiente.

Objetivos Comprender el fundamento del mtodo de esterilizacin fsico: calor a vapor presin, su importancia y utilidad dentro de procesos industriales. Aprender el funcionamiento bsico del autoclave. Comprender el fundamento y utilidad de la LUV. Evaluar y analizar el comportamiento del medio lquido preparado y esterilizado, as tambin el medio: PCA expuesto a LUV y cmara de flujo laminar ms incubacin a 37 C; y exposicin a ambiente.

Materiales Agua destilada Cajas de petri con medio servido (PCA) Cajas de petri sin medio Reactivos Medio melaza: Extracto de levadura y melaza (realizar los clculos)

Prctica No. 15
CULTIVO Y MANEJO DE MICROORGANISMOS En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mnimos para el manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la prctica cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener especial cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminacin. Marco Terico Microorganismos: La observacin de los microorganismos se valora en dos aspectos ; el aspecto microscpico en el que se evala color , forma y tamao de las colonias, y, el aspecto microscpico en el que se evala la forma ,el tamao y propiedades de la pared del microorganismo como tal Estas apreciaciones le permitirn al microbilogo determinar aspectos como: Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo y la morfologa microscpica debe presentar uniformidad en el tamao, absorcin de la coloracin y forma de los microorganismos evaluados Composicin de la pared, ya que la coloracin de gram utilizada para la observacin microscpica, da cuenta de los componentes presentes en la pared celular; puesto que al ser negativa el microorganismo en esta tendra mayor porcentaje de lipopolisacaridos, mientras que al ser positiva, indicara que el microorganismo en esta estructura presenta mayor porcentaje de pptidoglicanos. Viabilidad, dado que la observacin en fresco, permite ver el movimiento microbiano. Preparaciones Preparaciones no coloreadas: Con este mtodo se observan los microorganismos vivos, lo que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad de los mismos. Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el mismo ndice de refraccin del agua, es necesario utilizar colorantes para

poderlos visualizar. Los mtodos para observar los microorganismos proporcionan las siguientes ventajas: ***Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar los tipos morfolgicos microbianos. *** Una visualizacin de las estructuras internas y externas tales como. Espora, equivalente nuclear, grnulos citoplasmticos, pared celular, cpsula y flagelo. Una de las coloraciones mas utilizadas en el laboratorio, para la identificacin de microorganismos es la coloracin de Gram, por tal razn se ver en detalle.

Coloracin de Gram La coloracin de Gram es un mtodo que ha permitido la divisin de las bacterias en dos grupos: El de gram positivas y el de las gram negativas. La tcnica esta basada en la capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta durante la decoloracin con el alcohol acetona. Las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color prpura propio del cristal violeta. Las bacterias gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Despus de la decoloracin, se utiliza la safranina , que es un colorante de contraste de color rojo, dicho colorante da un color rosado a las clulas decoloradas. Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmtica, y las Gram negativas, encima de sta, presentan una delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de lipopolisacridos-lipoprotena, denominada membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemtica bacteriana: las que no lo poseen, Gram (+) y las que s, Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de enorme importancia taxonmica. En el comportamiento como patgenos y en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la realizacin rpida de una coloracin de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnolgicos y en la bacteriologa clnica. Medios de cultivo Un cultivo microbiolgico, puede realizarse para diferentes fines, por ejemplo: aislamiento e identificacin de una bacteria, pruebas de esterilidad de diferentes productos, anlisis microbiolgico de aguas, alimentos ambientes etc. Estos pueden denominarse como sustratos sobre los cuales los microorganismos encuentran los elementos nutricionales necesarios para realizar su metabolismo en forma similar a como lo hacen cuando se encuentran en la naturaleza. En ellos las bacterias crecen y se reproducen dando como resultado la formacin de colonias en los medios slidos y enturbiamiento, grumos, natas, velos o produccin de gas en los lquidos

Muestreo y Cultivo de Microorganismos: En el caso del muestro de microorganismos, se debe tener en cuenta la fuente de la cual se va a extraer, es decir si el medio en el que se encuentran corresponde a un suelo, a una corriente de agua o a un alimento en especial, esto con el fin de utilizar medios de cultivo similares al hbitat natural de la bacteria para de esta forma garantizar su recuperacin, la cual se constituye como el primer paso dentro de un muestreo convencional. Posteriormente se pasa a analizar los tipos de microorganismos obtenidos, esto se logra con tcnicas de aislamiento y seleccin. En el aislamiento simplemente lo que se busca es obtener colonias separadas con el fin de evaluar sus caractersticas macro y microscpicas y finalmente, si se considera de inters proceder a su purificacin y crioconservacin. Lo anterior puede realizarse mediante la siembra en medios especficos de las diluciones seriadas del material que se cree, presenta los microorganismos buscados. El nmero de diluciones depende de la carga microbiana, a mayor carga, mayor ser el nmero de diluciones a efectuar. En la seleccin, se hace lo mismo que en el aislamiento, la diferencia es que se emplean medios de cultivo selectivos, los cuales permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos e inhiben el desarrollo de otros, lo que facilita la separacin del mismo. Este procedimiento se efecta, cuando se conoce tanto el microorganismo como su metabolismo como tal, dado que por lo regular la selectividad de este tipo de medios radica en la presencia de antibiticos o reactivos que suelen ser txicos, por lo que la eleccin del medio depende de las caractersticas del agente microbiano con el que se desea trabajar. Luego de aislado y /o seleccionado, la bacteria, moho o levadura, debe ser purificado, se parte de la premisa que una colonia, es un conjunto de clulas que provienen de una misma clula madre, por lo tanto debe garantizarse lo anterior sometiendo a tal colonia a evaluaciones macroscpicas (uniformidad en las caractersticas) y microscpicas (que la totalidad de las estructuras observadas presenta la misma forma, apetencia tintorial y agrupacin). En caso de que pueda realizarse la purificacin, se pretende aumentar la biomasa del microorganismo, para lo que se hace crecer en un medio de enriquecimiento que estimule su crecimiento y finalmente se pasa a crioconservacin, mediante tcnicas como la de nitrgeno lquido conservacin en glicerol. Objetivos Mostrar al alumno las diferentes tcnicas de manipulacin de microorganismos, para lo cual se partir de un pool de tres microorganismos (E. coli, Saccharomices. c y Bacillus sp). Sembrar en medio PCA la suspensin con el contenido de los tres microorganismos (E. coli, Saccharomices. c y Bacillus sp.) Observar y describir las caractersticas morfolgicas de las colonias.

Materiales Cajas de petri con PCA Colorantes para Gram Mecheros Micropipetas de 100 y 1000 ul Pipetas de vidrio de 10 ml estriles Puntas para pipetear de 200 y 1000 ul estriles Solucin salina y/o solucin peptonada estriles Suspensin con microorganismos Tubos tapa rosca estriles Tubos con perlas de vidrio estriles

Procedimiento Para el cultivo: Tome 1 ml de la suspensin suministrada Realice las diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 con solucin salina estril.

1 1:10

3 2 4 1:100 1:1000 1x104

Lleve 9 ml de agua peptonada o solucin salina a todos los tubos. Agregue 1 ml de la suspensin que contiene los microorganismos al tubo uno y agite en el vortex. Del tubo uno sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 2, agitar. Del tubo dos sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 3, agitar Repita el procedimiento hasta completar el tubo 6 De cada dilucin tome 100 ul y agrguelos a la caja de petri A cada caja agregue entre 15-20 perlas de vidrio y realice un movimiento circular para dispersar todo el contenido agregado. Incube por 16 horas a 37C, (observe al da siguiente) Observe la morfologa de las colonias a nivel microscpico y descrbalas segn: Tamao, color y forma.

Para coloracin de gram: Tome colonias separadas de acuerdo a su morfologa y realice coloracin de gram. Describa su forma (cocos, bacilos, espiral), el tipo de agrupacin y clasifquela segn la absorcin de la coloracin en gram+ en gram -.

Prctica No. 16 DEGRADACIN DE COLORANTES CON HONGOS LIGNINOLTICOS INTRODUCCION

Existe una gran cantidad de organismos (bacterias y hongos) degradadores de celulosa y hemicelulosa, pero muy pocos con la capacidad de desdoblar la ligina; de hecho, los nicos con la capacidad de hacerlo son un grupo de basidiomicetes poseedores de un complejo enzimtico compuesto por enzimas oxidasas y peroxidasas, que al catalizar las primeras reacciones pueden generar molculas ms pequeas que se incorporan a los ciclos metablicos del organismo. Entre las peroxidadas, las mas importantes en la mineralizacin de la lignina son la lignina peroxidasa (LiP), la manganeso peroxidasa (MnP), y peroxidasa verstil (PV). MnP y PV tienen un grupo hemo como cofactor y emplean H2O2 como primer aceptor de electrones, mientras que la LiP puede oxidar directamente sustratos aromticos no fenlicos, como el alcohol veratrlico. La MnP puede oxidar sustratos del tipo fenlico a travs de Mn2+ pero tambin puede hacerlo con aqullos del tipo no fenlico a travs de los productos de peroxidacin de cidos grasos insaturados, mientras que la PV comparte las propiedades catalticas con las descritas anteriormente, pues puede oxidar el Mn2+ a Mn3+ (como lo hace la MnP) y tambin oxida compuestos no fenlicos (como lo hace la LiP), La lacasa es una oxidasa ampliamente distribuida entre los hongos de pudricin blanca con cuatro tomos de cobre como cofactor y cuyo aceptor de electrones es el O2 dando agua como producto. La enzima oxidada ataca principalmente sustratos fenlicos, pero en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (1-HBT), 2,2-azinobis [cido 3-etilbenzothiazoline- 6-sulfnico] (ABTS) o cido violrico [10,11] stos actan como cooxidantes y capacitan a la enzima para atacar sustratos menos oxidables como los de tipo no fenlico. Los colorantes sintticos son ampliamente utilizados en muchas industrias (textil, papel, cosmtica, farmacutica y alimentaria), por su fcil uso, bajo costo y alta estabilidad, sin embargo, algunos estudios sugieren que estos colorantes pueden ser txicos, carcingenos y generadores de reacciones alrgicas y asmticas en personas susceptibles. Adicionalmente, estos colorantes no son removidos por los tratamientos tradicionales de manejo de aguas residuales y por ello, en muchos pases se utilizan microorganismos degradadores que separan los enlaces azo de su respectivo azocolorante y produce la decoloracin de los

productos. Para este fn, los microorganismos generalmente emplean su sistema ligninoltico, compuesto por enzimas oxidativas producidas en respuesta a la limitacin de nutrientes, y con poca especificidad por el sustrato como la Ligninaperoxidasa (LiP), la Manganesoperoxidasa (MnP) y la polifenoloxidasa o lacasa). OBJETIVO GENERAL. Evaluar la actividad ligninolitica de las enzimas producidas por hongos ligninoliticos crecidos en condiciones de cultivo. OBJETIVOS ESPECIFICOS: - Determinar la capacidad ligninolitica de los hongos utilizando el colorante azul de coomassie como sustrato, y modificando variables como el pH y la adicin de manganeso. -Realizar un grfico que permita visualizar la degradacin en el tiempo del colorante azul de coomassie MATERIALES Y REACTIVOS Cajas de petri, erlenmeyers de 125 ml, torundas de algodn, extracto de malta, agar-agar, glucosa, tartrato de amonio, tween 80, alcohol veratrlico, manganeso, acido tartrico, NaOH, azul de coomassie (colorante). PROCEDIMIENTO Inicialmente y con ayuda de asa bacteriolgica, se siembran algunas fragmentos de un hongo ligninoltico, en un medio de cultivo (agar al 1.5 % y extracto de malta al 3.0%) previamente esterilizado con calor hmero (15 psi/ 121 C/ 20 minutos). Paralelamente y esterilizado bajo las mismas condiciones, se preparar un medio de cultivo lquido que por su composicin permita la expresin enzimtica. Para lograr esto se utiliza un erlenmeyer de 500 mililitros en el que se prepara un volumen final de 100 mililitros que incluye: glucosa 1g, tartrato de amonio 0.02 g, tween 80 0.05 g, alcohol veratrilico 2.5 mmol (0.02 mL de alcohol veratrlico 1.25M), manganeso a 40 ppm (4ml de solucin de manganeso de concentracin inicial 1000ppm), cido tartrico 0,3 g y un pH: 4.5 previo a la adicin de un colorante (azul de coomassie) al 0.002%. En caso de no utilizar agua como blanco de calibracin, se debe preparar un poco mas de este medio y esterilizarlo en pequeas alcuotas. Una vez ha esporulado el microorganismo en el medio de cultivo inicial (agar malta), se cortan 4 o 5 pequeos fragmentos de agar (hongo incluido), se transfieren al medio de expresin enzimtica y se somete a agitacin orbital (aproximadamente 150 r.p.m.), en temperatura ambiente y por espacio de una o dos semanas aproximadamente. En este lapso de tiempo, se deben tomar

pequeas alcuotas del medio a partir del cuarto o quinto da, y con ellas realizar unas cuantificaciones espectrofotomtricas (598 nm) que faciliten la elaboracin de un grfico que evidencie el decoloramiento progresivo del color. BIBLIOGRAFA 1. Pelez F, Martnez MJ, Martnez AT.Screening of 68 species of basidiomycetes for enzymes involved in lignin degradation. Mycol Res 1995; 99: 37-42. 2. Kirk TK, Farrell RL. Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annu Rev Microbiol 1987; 41: 465-505. 3. Kirk TK, Connors WJ, Zeikus JG. Requirement for a growth substrate during lignin decomposition by two woodroting fungi. Appl Environ Microbiol 1976; 32: 192-194. 4. Prez J, Jeffries TW. Roles of manganese and organic acid chelators in regulating lignin degradation and biosynthesis of peroxidases by Phanerochaetechrysosporium. Appl Environ Microbiol 1992; 58: 2402-2409. 5. Tuor U, Wariishi H, Schoemaker HE, Gold MH. Oxidation of phenolic arylglycerol beta-aryl ether lignin model compounds by manganese peroxidase 6. Soares GM, de Amorim MT, Costa- Ferreira M. Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. J Biotechnol 2001; 89: 123-129. 7. Hess J, Leitner C, Galhaup C, et al. Enhanced formation of extracellular laccase activity by the white-rot fungus Trametes multicolor. Appl Biochem. Biotechnol 2002; 98-100: 229-241. 8. Galhaup C, Wagner H, Hinterstoisser B, Haltrich D. Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens. Enzyme Microb Technol 2002; 30: 529-536. 9. Levin, L, Papinutti, L., Forchiassin, F. Evaluation of Argentinean white rot fungi for their ability to produce lignin-modifying enzymes and decolorize industrial dyes. Bioresource Technology 94. pp. 169176 (2004) 10. Camarero, S., Sarkar, S., Ruiz-Dueas, F., Martnez, M., Martnez, A. Description of a Versatile Peroxidase Involved in the Natural Degradation of Lignin That Has Both Manganese Peroxidase and Lignin Peroxidase Substrate Interaction Sites. The Journal of Biological Chemistry. 274(15), 1032410330. (1999) 11. Yonni, F., Moreira, M.T., Fasoli, H., Grandi, L., Cabral, D. Simple and ea

ANEXO Cuantificacin de variables con importancia en los procesos que se realizan en el laboratorio DETERMINACIN DE AZUCARES TOTALES POR EL MTODO DE ANTRONA PREPARACIN DE LA SOLUCIN BASE DE ANTRONA La vidriera a utilizar debe estar previamente lavada con solucin de cido sulfrico al 10%. Tomar 100 mL de cido sulfrico al 96% en un recipiente mbar o en un erlenmeyer previamente cubierto con papel aluminio para evitar que la solucin final de Antrona en cido reaccione con la luz. A los 100 mL de cido adicionarles 200 mg de Antrona slida y llevar a agitacin hasta obtener una solucin homognea. Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alta toxicidad. ELABORACIN DE CURVA ESTANDAR Pesar 0.25 g de glucosa y llevarlo a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin 5 g/L. Tomar una alcuota de 0.5 ml de esta solucin y llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin 0.05 g/L. Con esta ltima solucin preparar las siguientes diluciones en tubos de ensayo, utilizar micropipeta de 1 mL para esto. Volumen de solucin Volumen de madre (mL) agua destilada (mL) 0 1.5 0.15 1.35 0.30 1.20 0.45 1.05 0.60 0.90 0.75 0.75 0.90 0.60 1.05 0.45 1.20 0.30 1.35 0.15 1.50 0

Solucin Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentracin [g/L] 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05

Conservar en un bao de hielo durante todo el tiempo que se demore el tratamiento de las diluciones puesto que la reaccin con el reactivo de Antrona es demasiado exotrmica. Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 3 mL del reactivo de Antrona incluyendo el blanco; agitar en vortrex hasta obtener soluciones homogneas. Llevar todas las soluciones al bao termosttico a temperatura de 80 90 C durante 10 minutos. Pasados 10 minutos exactos de calentamiento llevar las soluciones a un bao de hielo hasta que las soluciones se enfren completamente. Agitar nuevamente y esperar 15 minutos hasta que las burbujas de aire desaparezcan. Leer absorbancia de todas las soluciones a 625 nm y realizar una curva de concentracin de glucosa en g/L versus Absorbancia y hacerle un ajuste lineal. DETERMINACIN DE AZUCARES POR EL MTODO DE DNS PREPARACIN DE LA SOLUCIN BASE DE DNS Se preparan 20 mL de una solucin de NaOH al 2 N con NaOH slido en un erlenmeyer de 200 mL y llevar a agitacin hasta obtener una solucin homognea. A esta solucin se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio y se completa el volumen a 100 mL. Para la adicin del DNS, se debe tener en cuenta, que este en solucin es reactiva a la luz; por lo tanto es necesario utilizar un recipiente mbar o en su defecto cubrir el erlenmeyer con papel aluminio. Por ltimo a esta solucin se le aade 1 gramo de DNS (cido 3 5 dinitrosaliclico). Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alto poder cancergeno. ELABORACIN DE CURVA ESTANDAR Pesar 0.1 g de glucosa y llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin 2 g/L. Tomar una alcuota de 5 ml de esta solucin y llevarlos a un volumen final de 25 mL para obtener una solucin de concentracin 0.4 g/L correspondiente a la solucin madre. Con esta ltima solucin preparar las siguientes diluciones en tubos de ensayo, utilizar micropipeta de 1 mL para medir estos volmenes.
Solucin Blanco 1 2 3 4 5 6 7 Concentracin [g/L] 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 0.28 Volumen de solucin madre (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Volumen de agua destilada (ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6

8 9 10

0.32 0.36 0.40

1.6 1.8 2.0

0.4 0.2 0

Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 2 mL de la solucin de DNS incluyendo el blanco; tapar con papel vinipel todos los tubos para evitar prdidas por evaporacin (En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones guardar todos los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar). Llevar todas las soluciones al bao termosttico a temperatura de 80 90 C durante 5 minutos. Pasados 5 minutos exactos de calentamiento llevar las soluciones a un bao de hielo durante otros 5 minutos o hasta el momento en que se dispone a hacer las lecturas. Leer absorbancia de todas las soluciones a 540 nm, realizar una curva de Concentracin de glucosa en g/L versus Absorbancia y hacerle un ajuste lineal. DETERMINACIN DE PROTEINA SOLUBLE ( MTODO DE LOWRY) El mtodo ms exacto para determinar concentracin de protena es probablemente la hidrlisis cida seguida por la determinacin de aminocidos. La mayora de los otros mtodos son sensibles a la composicin de aminocidos de la protena, por lo que no se pueden obtener concentraciones absolutas. El mtodo de Lowry no es una excepcin, pero su sensibilidad es moderadamente constante de protena a protena y ha sido tan ampliamente usado, que se constituye en el mtodo de eleccin para mezclas de protenas y extractos crudos. El mtodo se basa en la reaccin de Biuret, donde el enlace peptdico reacciona con el cobre bajo condiciones alcalinas produciendo ion cuproso, el cual reacciona con el reactivo de Folin va aminocidos aromticos. La reaccin produce un complejo de color azul, que depende principalmente de Tyrosina y Triptofano. El mtodo es sensible hasta niveles de 0.01 mg de protena / ml, pero es mejor para concentraciones de 0.01 1.0 mg/ml. Reactivos Reactivo A: En un beaker pequeo pesar 20.0 g de Na2CO3 y 4.0 g de NaOH. Transvasar a un baln volumtrico de 1.0 L y completar volumen con agua destilada. Reactivo B-1 En un beaker pequeo pesar 1.0 g de CuSO4.5H2O, transvasar a un baln de 100 ml y completar volumen con agua destilada. Reactivo B-2 En un beaker pequeo pesar 2.0 g de Tartrato de Na-K, transvasar a un baln de 100 ml y completar volumen con agua destilada.

Reactivo C: En un recipiente apropiado mezclar en el siguiente orden 1 ml de Reactivo B-1, 1 ml de Reactivo B-2 y 100 ml de Reactivo A. Preparar esta solucin diariamente. Reactivo de Folin Coplcateau 2.0 N: Reactivo grado analtico, marca Merck. Fenol 1.0 N: En un recipiente apropiado diluir un volumen del reactivo de Folin Ciocalteau (2.0 N) con un volumen igual de agua destilada. cido Tricloroactico 10 % p/v: En un beaker pequeo pesar 10 g del reactivo y transvasar a un baln volumtrico de 100 ml. Preparacin de la muestra: Filtrar o centrifugar la muestra de cultivo, con el fin de remover los slidos presentes. Usar el lquido sobrenadante. Precipitacin: Colocar 2.0 ml de muestra en un tubo de centrfuga cnico de 15 ml. Aadir 2.0 ml de cido tricloro acetico al 10 % p/v. Mezclar en un vortex. Incubar de 30 60 minutos en la nevera. Centrifugar durante 25 minutos a 2000 r.p.m. Descartar el supernadante y disolver el pelet en 2.0 ml del Reactivo A. La protena soluble tambin puede precipitarse por adicin de 4.0 ml de acetona a 2.0 ml de muestra. En este caso el pelet se disuelve en un buffer apropiado, de acuerdo al medio en el que se desee evaluar la protena. Este procedimiento se usa para medir la concentracin de enzima en muestras que contienen altas concentraciones de azcar que interfieren con el ensayo de celulasa Derivatizacin de la protena soluble: En un tubo de ensayo colocar 0.5 ml de muestra (debe contener entre 0.05 g 1.0 mg de protena /ml). Aadir 5.0 ml del reactivo C y mezclar con vortex.. Dejar en reposo durante 10 minutos. Luego aadir 0.5 ml del reactivo de Fenol 1.0 N y mezclar con vortex. Esperar 30 minutos y leer la Absorbancia a 750 nm contra un blanco reactivo. Curva de calibracin: Solucin Stock de Albmina de Suero Bovino (A.S.B.): En un beaker pequeo pesar 0.5 g del reactivo grado analtico, transvasar a un baln volumtrico de 50 ml y completar volumen con agua destilada. Agitar. Conservar esta solucin en el congelador (0 5 C). La solucin preparada tiene una concentracin final de 10000 ppm. Soluciones estndar de Albmina de Suero Bovino: A partir de la solucin stock tomar alcuotas de 0.125, 0.250, 0.750, 1.25 1.75 y 2.5 ml. Transferir cada alcuota a un baln volumtrico de 25 ml. Completar volumen con agua destilada y agitar. Las soluciones preparadas tienen una concentracin de 50, 100, 300, 500, 700 y 1000 ppm de A.S.B. Dichas concentraciones se encuentran en el rango recomendado para el ensayo (0.05 1.0 mg/ml). Almacenar los estndares en el congelador. Curva de Calibracin: En tubos de ensayo para centrfuga, tomar alcuotas de cada uno de los estndares y centrifugar a 7500 r.p.m. durante 12 minutos. Del sobrenadante tomar 2.0 ml en otro tubo de ensayo y adicionar 2.0 ml de cido tricloro acetico al 10 %. Agitar con vortex y llevar a la nevera durante 45 minutos.

Retirar de la nevera y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 25 minutos . Descartar sobrenadante. Al residuo adicionar 2.0 ml del Reactivo A. Mezclar con vortex. De la solucin anterior se toman 0.5 ml en un tubo de ensayo y se adicionan 5.0 ml del Reactivo C. Agitar con vortex y dejar en reposo durante 10 minutos. A la solucin anterior aadir 0.5 ml del reactivo de Folin 1.0 N. Agitar y esperar 30 minutos. Finalmente leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 750 nm contra un blanco reactivo. Blanco reactivo: En un tubo de ensayo tomar 2.0 ml de agua destilada y proceder de igual forma como en el numeral 5 c. Curva de Calibracin: Construir un grfico de Absorbancia versus concentracin para cada uno de los estndares. Trazar la mejor lnea recta, por el mtodo de los mnimos cuadrados (regresin lineal). Verificar que existe una relacin lineal entre la Absorbancia y la concentracin para el rango establecido (coeficiente de correlacin mayor a 0.95). Obtener la ecuacin para la lnea recta con el fin de interpolar los valores de absorbancia obtenidos para cada muestra ensayada. Contenido de protena en la muestra ensayada: Una vez obtenido el valor de Absorbancia para la muestra, este se interpola en la curva de calibracin, con el fin de obtener la concentracin de protena en ppm, para la solucin leda. Si la muestra leda es producto de diluciones previas sobre la muestra de inters, el valor obtenido se multiplica por el factor de dilucin correspondiente. C final = C interpolacin * F.D.
C final = Concentracin de protena en el problema, C interpolacin = Concentracin obtenida por interpolacin de la absorbancia de la muestra leda, en la curva de calibracin. F.D. Factor de dilucin.
Datos experimentales: Los siguientes datos se obtuvieron en un espectrofotmetro Espectronic 20, marca instruments, de pantalla digital. Las muestras ensayadas consisten en medios de cultivo de hongos ruminales, evaluados para actividad celuloltica. # Estndar 1 2 3 4 5 [Estndar] 50 100 300 500 700 Absorbancia 0.074 0.134 0.346 0.548 0.709

Ppm 50 100 300 500 700

Absorbancia 0.074 0.134 0.346 0.548 0.709

Para un extracto enzimtico ensayado, se obtuvo una absorbancia de 0.548, que al Interpolarse en la curva de calibracin, corresponde a 518.6 ppm de protena en la muestra leda. Bibliografa Ghose T. K. Measurement of cellulase activities. International Union of Pure and Applied Chemistry. Applied Chemistry Division Commission on Biotechnology. Walker John. Basics protein and peptides protocols. Chapter 1. The Lowry Method for protein quantitation. Humana Press. Totowa, New Jersey. DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO POR EL MTODO DE PESO SECO Se siembra el microorganismo de inters en agar (sobre medio slido) para permitir el crecimiento de cepas aisladas.Luego de observar un crecimiento representativo del microorganismo, se procede a extraer una cepa aislada del cultivo en caja y sembrarla en un caldo de cultivo rico, que permita la adaptacin a un nuevo ambiente y el crecimiento de las clulas (este proceso se denomina inocular). Este caldo se prepara en un erlenmeyer y corresponde al 10% del volumen total con el que se desea trabajar posteriormente. El inculo se pasa a otro erlenmeyer que corresponde a un medio de cultivo con un volumen especfico de trabajo deseado. Se vierte el inculo en este medio recientemente preparado, y se deja en suspensin con agitacin y calentamiento hasta observar que los microorganismos han crecido lo suficiente, lo cual se hace apreciable cuando el medio del cultivo se torna turbio. Despus de obtener un medio de cultivo con una cantidad de clulas representativa se procede a centrifugar toda la suspensin, se descarta el sobrenadante y se lava con solucin salina al 0.9 %; esta nueva solucin se suspende y corresponde a la solucin madre. Se extraen alcuotas de la solucin madre para concentraciones (%v/v) de 100, 50, 40, 30, 20, 10, 0 %; para ello se toman 25, 12.5, 10.0, 7.5, 5.0, 2.5, 0.0 ml respectivamente, estos volmenes se llevan a 25 ml (en baln volumtrico). Se toma un papel filtro por cada dilucin y para cada uno un trozo de papel aluminio, este ltimo se usa como soporte para el papel filtro por lo tanto no debe ser cambiado con ningn otro a fin de no generar errores en el peso obtenido. Los papeles filtro y aluminio se pesan y se marcan con las diluciones de cada una de las soluciones; el papel filtro se pesa tanto seco como hmedo.

Se prepara el montaje para filtracin al vaco que presenta los siguientes elementos: un erlenmeyer, una manguera con tornillo, un embudo, un tapn de caucho, una malla metlica, un tubo, una pinza y una bomba de vaco. Se retira el tornillo de la manguera y se conecta a un orificio que se encuentra en la parte superior del erlenmeyer, se pone nuevamente el tornillo y se aprieta fuertemente, el extremo opuesto de la manguera se conecta a la bomba de vaco por medio de un orificio que se encuentra en la parte superior de la bomba; luego, se toma el embudo y se inserta en el orificio del tapn de caucho, este montaje se une a la boca del erlenmeyer y se asegura, en la parte superior del embudo se adhiere la malla metlica y sobre esta se sujeta con la pinza el tubo. Posteriormente, de cada solucin, se toman 10 ml y se llevan al equipo; luego de filtrar cada solucin, se pesan los papeles filtro para obtener el peso hmedo de las clulas y se transfieren a la estufa de 90 105 C, despus de secados se pesan nuevamente y se obtiene el peso seco de muestra. Este ltimo paso debe repetirse hasta obtener un peso seco constante. Se hace el anlisis por espectrofotometra, midiendo la absorcin de la muestra a una longitud de onda de 600 nm. Y se realiza una curva de peso seco vs. absorbancia. MANTENIMIENTO DE COLONIAS DE Drosophila melanogaster (cepa canton) (Dptera: Drosophilidae) 1. MATERIALES Y EQUIPO Ejemplares adultos de Drosophila melanogaster, viales de vidrio de 60 mL, algodn, gasa, pincel suave, CO2, cartulina blanca, bandejas plsticas, lmpara, estereoscopio, recipientes termorresistentes para preparar el alimento (capac 1 L), embudo, balanza, pipetas de 10 mL, probeta de 100 mL, estufa Ingredientes para un litro de alimento: Levadura fleishmann seca....... .....30 mL Harina de maz..............................100 g Agar agar.........................................6 g Melaza...........................................80 mL Acido propinico ......................... 5 mL Agua............................................900 mL 2. PREPARACIN DEL ALIMENTO El agua se divide en dos porciones. La primera se agrega a la levadura y se mezcla muy bien. Luego se agrega la harina de maz y se contina con la agitacin hasta obtener una mezcla homognea.

A la segunda porcin de agua se le agrega el agar y se calienta hasta hervir. En este momento se adiciona la porcin de agua que contiene la levadura y la harina, adems se agrega la melaza y se mezcla muy bien. Sin dejar de mezclar, se adiciona el cido propinico y antes de que espese por completo, se retira del fuego y se sirve en los viales de vidrio de 60 mL. Estos se cubren con tapones de algodn y gasa limpios hasta el da siguiente para que la mezcla se solidifique completamente. Se realiza entonces el repique de la colonia. 3. REPIQUE DE LA COLONIA Los viales con el alimento ya solidificado deben estar rotulado con la fecha. De un cultivo anterior, se pasan todos los ejemplares a un vial limpio sin alimento y se duermen utilizando CO2. Luego se pasan a una cartulina blanca y bajo el estereoscopio y con la ayuda de un pincel, se seleccionan los ejemplares que van a los nuevos recipientes en una proporcin de 3 machos y 7 hembras ca cada nuevo vial. Este procedimiento se conoce como repique y debe realizarse semanalmente. Los individuos se dejan mximo 15 das y luego se descartan sumergindolos en alcohol, filtrndolos y disponindolos con los residuos slidos orgnicos. 4. RENOVACIN DE LA COLONIA Dos veces al ao, se adquieren nuevos ejemplares de Drosophila melanogaster provenientes del Instituto de Biologa de la Universidad de Antioquia, para renovar la colonia y evitar endogamia.