isolasi bakteri

Posted on Juni 18, 2011 by monruw Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri dulu terbagi menjadi Bacteria dan Archaebacteria, namun sekarang Archaebakteria memiliki domain sendiri yang disebut Archaea. Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran inti, tidak memiliki organel bermembran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan materi asam nukleatnya berupa plasmid (Postlethwait dan Hopson, 2006). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk, seperti coccus, basil, dan spiral. Bakteri dapat hidup soliter maupun berkoloni dan berkembang biak dengan cara membelah diri. Bakteri memiliki habitat yang bervariasi, dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan, misalnya dalam usus manusia. Bakteri ada yang dapat hidup secara anaerob murni dan akan mati dengan adanya oksigen, ada yang bersifat aerob dan memerlukan oksigen untuk metabolismenya, dan ada yang bersifar aerob fakultatif yaitu dapat hidup pada kondisi anaerob, tapi bila ada oksigen, metabolismenya bersifat aerob (Betsy dan Keogh. 2005). Bakteri secara genetis diklasifikasikan menjadi 5 grup besar, yaitu Proteobacteria, Cyanobacteria, Spirocheta, Chlamydia, dan Firmicuta. Proteobacteria merupakan grup bakteri terbesar dan merupakan asal usul mitokondria pada eukariota dengan proses endosimbiosis. Cyanobacteria merupakan grup bakteri yang memiliki klorofil dan dapat berfotosintesis. Spirocheta adalah kumpulan bakteri yang berbentuk spiral. Chlamydia adalah bakteri dengan ukuran yang relatif kecil dibanding grup lain dan umum hidup sebagai parasit. Firmicuta adalah bakteri yang umum memproduksi endspora (Purves dan Sadava, 2003). Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006). Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200 bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni yang berasal dari bakteri tunggal. Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta

lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri. (Harley dan Presscot, 2002). Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni. Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50C kemudian menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan suspensi pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masingmasing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal. Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal. Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode untuk mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni. Betsy dan Keogh. 2005. Microbiology Demystifed. McGraw-Hill Publisher. USA. Harley dan Presscot. 2002. Laboratory Exercise in Microbiology. McGraw-Hill Publisher. USA. Postlethwait dan Hopson. 2006. Modern Biology. Holt, Rinehart and Winston. Texas. Purves dan Sadava. 2003. Life The Science of Biology 7th Edition. Sinauer Associates Inc. New York.

Bakteri Gram dan Pewarnaannya

BAB I. PENDAHULUAN Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut sebagai mikroba atau mikroorganisme atau jasad renik. Jasad renik disebut sebagai mikroba bukan hanya karena ukurannya yang kecil, sehingga sukar dilihat dengan mata biasa, tetapi juga pengaturan kehidupannya yang lebih sederhana dibandingkan dengan jasad tingkat tinggi. Mata biasa tidak dapat melihat jasad yang ukurannya kurang dari 0,1 mm. Ukuran mikroba biasanya dinyatakan dalam mikron ( ), 1 mikron adalah 0,001 mm. Sel mikroba umumnya hanya dapat dilihat dengan alat pembesar atau mikroskop, walaupun demikian ada mikroba yang berukuran besar sehingga dapat dilihat tanpa alat pembesar. Whittaker membagi jasad hidup menjadi tiga tingkat perkembangan, yaitu: (1) jasad prokariotik yaitu bakteri dan ganggang biru (Divisio Monera), (2) Jasad eukariotik uniseluler yaitu algae sel tunggal, khamir dan protozoa (Divisio Protista), dan (3) Jasad eukariotik multiseluler dan multinukleat yaitu Divisio Fungi, Divisio Plantae, dan Divisio Animalia. Sedangkan Woese menggolongkan jasad hidup terutama berdasarkan susunan kimia makromolekul yang terdapat di dalam sel. Pembagiannya yaitu terdiri Arkhaebacteria, Eukaryota (Protozoa, Fungi, Tumbuhan dan Binatang), dan Eubacteria. Bakteri merupakan mikroba prokariotik uniselular yang berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasit, saprofit, patogen pada manusia, hewan dan tumbuhan. Bakteri tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai + 10 km diatas bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk bulat, batang, dan lengkung, namun bentuk bakteri juga dapat dipengaruhi oleh umur. Bakteri dapat mengalami perubahan bentuk yang disebabkan faktor makanan, suhu, dan lingkungan, juga dapat mengalami pleomorfi, yaitu bentuk yang bermacam-macam dan teratur walaupun ditumbuhkan pada syarat pertumbuhan yang sesuai. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 . Bakteri diklasifikasikan berdasarkan deskripsi sifat morfologi dan fisiologi. Bakteri dibagi menjadi 1 kelompok (grup), dengan Cyanobacteria pada grup 20. Pembagian ini berdasarkan bentuk, sifat gram, kebutuhan oksigen, dan apabila tidak dapat dibedakan menurut ketiganya maka dimasukkan ke dalam kelompok khusus. BAB II. ISI A. PENGERTIAN BAKTERI I. Sel Prokariotik Sel prokariotik berukuran lebih kecil dari sel eukariotik. Sel ini tidak mempunyai organela seperti mitokondria, khloroplas dan aparat golgi. Inti sel prokariotik tidak mempunyai membran. Bahan genetis terdapat di dalam sitoplasma, berupa untaian ganda (double helix) DNA berbentuk lingkaran yang tertutup. Kromosom bakteri pada umumnya hanya satu, tetapi juga mempunyai satu atau lebih molekul DNA yang melingkar (sirkuler) yang disebut plasmid. Sel prokariotik tidak mengandung organel yang

dikelilingi oleh membran. Ribosom yang dimiliki sel prokariot lebih kecil yaitu berukuran 70S. Ukuran genom sel prokariot berbeda dengan sel eukariot. Jumlah DNA penyusun pada sel prokariot berkisar antara 0,8-8.106 pasangan basa (pb) DNA. Sel prokariotik tidak seluruhnya membutuhkan oksigen, misalnya pada bakteri anaerob. II. Struktur Sel 1. Membran Sel Prokariotik Pada beberapa bakteri, membran mengelilingi sitoplasma tanpa menunjukkan adanya lipatan. Membran pada bakteri lain mengalami pelipatan ke dalam yang disebut mesosom. Pada bakteri fotosintetik, khlorofil tidak terdapat dalam suatu khloroplas, melainkan terdapat dalam membran yang sangat berlipat-lipat di dalam sel, yang disebut membran tilakoid. Sistem fotosintetik pada bakteri disamping menggunakan khlorofil, juga karotenoid. Keduanya mengandung sistem transport elektron yangmenghasilkan ATP pada proses fotosintesis. 2. Dinding Sel Dinding sel bakteri bersifat agak elastis dan tidak bersifat permeable terhadap garam dan senyawa tertentu dengan berat molekul rendah. Secara normal konsentrasi garam dan gula yang menentukan tekanan osmotik di dalam sel lebih tinggi daripada di luar sel. Apabila tekanan osmose di luar sel naik, air sel akan mengalir keluar, protoplasma mengalami pengkerutan, dan membran akan terlepas dari dinding sel. Proses ini disebut dengan plasmolisis. Dinding sel bakteri gram positif: Dinding sel bakteri gram positif terdiri 40 lapis rangka dasar murein, meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun dinding sel gram positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan asam teikoat yang sangat spesifik. Dinding sel bakteri gram negatif: Dinding sel bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis rangka dasar murein, dan hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya mengandung diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain. Senyawasenyawa ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak terdapat dalam dinding sel ini. 4. Flagel dan Pili Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Letak flagel dapar polar, bipolar, peritrik, maupun politrik. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah. Ukuran flagel berdiameter 12-18 nm dan panjangnya lebih dari 20 nm. Pada beberapa bakteri, permukaan selnya dikelilingi oleh puluhan sampai ratusan pili, dengan panjang 12 nm. Pili disebut juga sebagai fimbrae. Sex-pili berperan pada konjugasi sel. Pada bakteri Escherichia coli strain K-12 hanya dijumpai 2 buah pili. 5. Kapsul dan Lendir

Beberapa bakteri mengakumulasi senyawa-senyawa yang kaya akan air, sehingga membentuk suatu lapisan di permukaan luar selnya yang disebut sebagai kapsul atau selubung berlendir. Fungsinya untuk kehidupan bakteri tidak begitu esensial, namun menyebabkan timbulnya sifat virulen terhadap inangnya. Keberadaan kapsul mudah diketahui dengan metode pengecatan negatif menggunakan tinta cina atau nigrosin. Kapsul akan tampak transparan diantara latar belakang yang gelap. Pada umumnya penyusun utama kapsul adalah polisakarida yang terdiri atas glukosa, gula amino, rhamnosa, serta asam organik seperti asam piruvat dan asam asetat. Ada pula yang mengandung peptida, seperti kapsul pada bakteri Bacillus sp. Lendir merupakan kapsul yang lebih encer. Adakalanya kapsul bakteri dapat dipisahkan dengan metode penggojokan kemudian diekstrak untuk menghasilkan lendir. III. Klasifikasi Bakteri 1. Bakteri berbentuk kokus (bulat) a. Bakteri kokus gram positif Aerobik: Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Leuconostoc Anaerobik: Methanosarcina, Thiosarcina, Sarcina, Ruminococcus b. Bakteri kokus gram negatif Aerobik: Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Paracoccus (grup 10) Anaerobik: Veillonella, Acidaminococcus, Megasphaera (grup 11) 2. Bakteri berbentuk batang a. Bakteri gram positif 1. Bakteri gram positif tidak membentuk spora (grup 16) Aerobik: Lactobacillus, Listeria, Erysipelothrix, Caryophanon. 2. Bakteri Coryneform dan actinomycetes (grup 17) Aerobik Coryneform: Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium. Aerobik Actinomycetes: Mycobacterium, Nocardia, Actinomyces, Frankia, Actinoplanes, Dermatophilus, Micromonospora, Microbispora, Streptomyces, Streptosporangium. 3. Bakteri pembentuk endospora (grup 15) Aerobik: Bacillus, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Thermoactinomyces Anaerobik: Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira

b. Bakteri gram negatif 1. Bakteri gram negatif aerobik (grup 7) Aerobik: Pseudomonas, Xanthomonas, Zoogloea, Gluconobacter, Acetobacter, Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia, Derxia, Rhizobium, Agrobacterium, Alcaligenes, Brucella, Legionella, Thermus. 2. Bakteri gram negatif aerobik khemolitotrofik (grup12) Aerobik: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus. 3. Bakteri berselubung (grup 3) Aerobik: Sphaerotilus, Leptothrix, Cladothrix, Crenothrix. 4. Bakteri gram negatif fakultatif anaerobik (grup 8 ) Fakultatif anaerobik: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, Erwinia, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Photobacterium. 5. Bakteri gram negatif anaerobik (grup 9) Sangat Anaerobik: Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia 6. Bakteri Methanogens dan arkaebakteria (grup 13) Sangat Anaerobik: Methanobacterium, Methanothermus, Methanosarcina, Methanothrix, Methanococcus. Aerobik: Halobacterium, Halococcus, Thermoplasma. Anaerobik: Thermoproteus, Pyrodictium, Desulforococcus. 3. Bakteri berbentuk lengkung a. Bakteri gram negatif spiril dan lengkung (grup 6) Aerobik: Spirillum, Aquaspirillum, Azospirillum, Oceanospirillum, Campylobacter, Bdellovibrio, Microcyclus, Pelosigma. b. Bakteri gram negatif lengkung anaerobik (grup 9) Anaerobik: Desulfovibrio, Succinivibrio, Butyrivibrio, Selenomonas. c. Spirochaeta (grup 5) Aerobik dan anaerobik: Spirochaeta, Cristispira, Treponema, Borrelia, Leptospira.

4. Bakteri yang termasuk kelompok khusus a. Bakteri yang merayap (meluncur) (grup 2) Bakteri ini dapat merayap walaupun tidak berflagela. Bakteri ini selalu bersifat gram negatif. Dalam kelompok ini termasuk beberapa ganggang biru, beberapa bakterikhemoorganotrof dan beberapa bakteri belerang (sulfur). Kelompok bakteri yang menjadi anggota bakteri merayap (meluncur) adalah sbb: 1. Bakteri yang mengandung sulfur intraselular, berbentuk benang. Contoh: Beggiatoa, Thiothrix, Achromatium. 2. Bakteri bebas sulfur, membentuk trikoma (bulu). Contoh: Vitreoscilla, Leucothrix, Saprospira. 3. Bakteri uniselular, bentuk batang pendek. Contoh: Cytophaga, Flexibacter, Myxobacteria. 4. Bakteri fototrof yang bergerak merayap. Contoh: Chloroflexus 5. Cyanobacteria yang bergerak merayap. Contoh: Oscillatoria. b. Bakteri bertangkai atau bertunas (grup 4) Bakteri ini mempunyai struktur mirip tangkai atau tunas yang merupakan tonjolan dari sel, atau hasil pengeluaran lendir. Contoh: Hypomicrobium, Caulobacter, Prosthecomicrobium, Ancalomicrobium, Gallionella, Nevskia. c. Bakteri parasit obligat: Rickettsiae dan Chlamydiae (grup 18) Merupakan bakteri yang berukuran paling kecil, tetapi lebih besar dari virus, yaitu 0,32. Bentuk sel pleomorfik, dapat berupa batang, kokus, atau filamen. Bakteri ini cara hidupnya sebagai parasit sejati (parasit obligat) di dalam sel jasad lain dan bersifat patogen. Hidupnya intraselular di dalam sitoplasma dan inti sel binatang dan manusia. Oleh karena itu bakteri kelompok ini merupakan penyebab penyakit, yang biasanya ditularkan oleh vektor serangga. Contoh: Rickettsia prowazekii, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii. d. Mycoplasma (klas Mollicutes) (grup 19) Mycoplasma disebut juga PPLO (Pleuropneumonia Like Organisms). Cirinya yaitu tidak mempunyai dinding sel, atau merupakan bentuk L dari bakteri sejati (Eubakteria) atau bentuk speroplas sel eubakteria, sehingga sifatnya mirip bakteri sejati. Mycoplasma berukuran 0,001-7 . Umumnya lebih besar dari Rickettsiae dan dapat dicat dengan cat anilin. Ukuran koloni mencapai 10-600NOSelnya berbentuk kokus, filamen, roset, dan sangat pleomorfik. Selnya dapat memperbanyak diri dengan pembelahan biner, fragmentasi, dan perkecambahan. Cara hidupnya sebagai saprofit atau patogen. Contoh: Mycoplasma mycoides, M. homonia, M. orale, Acholeplasma, Spiroplasma. Bakteri bentuk L atau bakteri dalam bentuk protoplas, tidak berdinding sel. Hal ini dapat terjadi karena mutasi atau dibuat. Contohnya (a) Mycobacterium tuberculosis dalam medium

dengan tegangan muka rendah dan ditambah lisosim serta EDTA, (b) Strain mutan Staphylococcus aureus dalam medium dengan penisilin G. e. Bakteri anaerobik anoksigenik fototrofik (grup 1) Bakteri ini mempunyai ciri berpigmen fotosintetik. Ada yang berbentuk kokus, batang, dan lengkung. Berdasarkan sifat fisiologinya dapat dibagi menjadi: 1. Familia Thiorhodaceae (bakteri sulfur ungu). Contoh: Thiospirillum sp., Chromatium sp. 2. Familia Athiorhodaceae/Rhodospirillaceae (bakteri sulfur non-ungu). Contoh: Rhodospirillum, Rhodopseudomonas. 3. Familia Chlorobiaceae (bakteri sulfur hijau). Contoh: Chlorobium, Chloropseudomonas, Chlorochromatium. f. Bakteri aerobik oksigenik fototrofik: Cyanobacteria (grup 20) Bakteri ini termasuk Myxophyceae atau Cyanophyceae. Sifatnya yang mirip bakteri adalah dinding selnya terdiri mukokompleks, tidak berdinding inti, tidak ada mitokondria dan kloroplas. Sifatnya yang berbeda adalah dapat berfotosintesa mirip tumbuhan tingkat tinggi, dan menghasilkan O2. Bakteri ini mempunyai klorofil a dan fikobilin (fikosianin dan fikoeritrin). Bentuk selnya tunggal (uniselular), koloni, dan benang-benang (filamen). Selnya dapat bergerak meluncur tetapi sangat lambat (250 per menit), meskipun tidak berflagela. Cara hidupnya bebas, dan berasosiasi simbiosis. Umumnya dapat menambat nitrogen dari udara, dan bersifat fotoautotrof obligat. Contoh: Gloeobacter, Gloeocapsa, Dermocarpa, Spirulina, Nostoc, Anabaena, Oscillatoria, Calothrix, Cylindrospermum. Anabaena azollae dapat bersimbiosis dengan tanaman paku air Azolla sp. dan Nostoc bersimbiosis dengan jamur membentuk Lichenes. B. PEWARNAAN BAKTERI GRAM Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul. Macam-macam pewarnaan: 1. Pewarnaan negatif - Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang - Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta Cara pewarnaan negatif - Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahanbahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. 2. Pewarnaan sedehana - Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) - Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). 3. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah. 4. Pewarnaan structural/khusus - Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, flagel dll i) Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. ii) Pewarnaan spora

Dinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat. iii) Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. iv) Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA. 5. Pewarnaan diferensial - menggunakan lebih dari satu macam zat warna - Tujuan untuk membedakan antar bakteri - Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol .

Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

BAB III. KESIMPULAN

Bakteri merupakan sel prokariotik berukuran lebih kecil dari sel eukariotik. Bakteri mempunyai struktur el yang terdiri atas Membran Sel , Dinding Sel, Flagel dan Pili, serta Kapsul dan Lendir Bakteri di Klasifikasi atas dua golongan, yakni bakteri gram-positif dan bakteri gram-negatif. Terbagi atas: o Bakteri berbentuk kokus (bulat) o Bakteri berbentuk batang o Bakteri berbentuk lengkung o Bakteri yang termasuk kelompok khusus

Bakteri diidentifikasi dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri yang berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pewarnaan negative merupakan metode mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Pewarnaan structural/khusus Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri seperti kapsul, spora, flagel dll Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan menggunakan lebih dari satu macam zat warna yang bertujuan untuk membedakan antar bakteri. Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : o Zat warna utama (violet kristal) o Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. o Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. o Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alkohol.

DAFTAR PUSTAKA Jawetz, Melnick, Adelberg, 2008, Mikrobiologi Kedokteran, edisi 23, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Prescott, Harley, Kleins, 2008, Microbiology 7th edition, Published by McGraw-Hill, Boston. Bailey and Scotts, 2007, Diagnostic Microbiology 12th edition, Mosby Elsevier, Houston. Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan, PT. Citra Aditya Bakti, Jakarta. Iud W, 2008, Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi, UMM Pres, Malang.

ISOLASI MIKROBA UDARA

ISOLASI MIKROBA UDARA

1.

Prinsip Kerja Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat baktri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah di mengerti jenis- jenis nutrien yang disyaratkan bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut. Selain teknik pertumbuhan bakteri atau teknik isolasi di atas, dikenal juga adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak diiinginkan. Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat- alat yang ada sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikkroorganisme yang tidak diinginkan. Berdasarkarkan hal tersebut di atas maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik dari isolasi mikroba udara.

2.

Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengisolasi mikroba udara pada medium pertumbuhan.

3.

Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan adalah mikroskop, petridish, jarum ose, kaca objek, lampu spiritus, cover glass sedangkan bahan yang digunakan yaitu medium PDA dan NA yang telah diisolasi di udara.

4.

Cara kerja Dimasukkan medium PDA dan NA masing-masing ke dalam petridish yang sebelumnya sudah disterilkan terlebih dahulu dan bekerja dengan tangan yang telah disterilkan dengan spiritus dan dekat lampu bunzen. Tunggu hingga medium sudah benar-benar padat. Lalu letakkan petridish yang sudah berisi medium tersebut di toilet, laboratorium, di luar ruangan ( kawasan kafe ). Kemudian dibiarkan terbuka selama 10 menit, setelah dipetridish di tutup kembali petridish ditutup dengan kertas. Setelah itu diinkubasi selama 2 hari di laboratorium. Lalu diamati dan catat jumlah koloni, bentuk koloni, warnanya dan bentuk permukaannya.

5.

Hasil dan Pembahasan Hasil pengamatan isolasi mikroba udara pada pada medium PDA dan NA di toilet sebagai berikut Tabel. 1 Hasil isolasi mikroba udara di toilet No 1 Lokasi Isolasi Toilet Sifat khas koloni PDA miselium berkapang NA permukaan mengkilat dan licin warna kuning, orange, putih kekuning-kuningan jumlah 28 koloni

Kelompok V -

warna orange, putih, hijau Jumlah 31 koloni

A. Medium NA

B. Medium PDA

Gambar 1. Isolasi mikroba udara di dalam toilet

Dari pratikum yang dilakukan, dapat dilihat perbedaan dari jumlah koloni yang tumbuh dari medium PDA dengan medium NA. Pada pengamatan di toilet pada medium PDA nya ditemukan jamur yang miseliumnya berkapang warna orange,putih,hijau, dan pada medium NA ditemukan bakteri yang permukaannya mengkilat dan licin warna kuning,orange,putih kekuningan dan biru. Medium yang digunakan sebelumnya telah di sterilisai dengan autoklaf. Mikroba pada isolasi udara pasti banyak jumlahnya. Koloni yang tumbuh bermacam-macam warna dan bentuknya. Setelah diinkubasi selama 2 hari, maka didapatkan sifat-sifat khas dari koloni. Isolasi mikroba udara pada medium PDA berjalan dengan baik, karena yang tumbuh jamur sesuai dengan apa yang diharapkan. Sedangkan pada medium NA yang tubuh seharusnya bakteri, tapi pada percobaan ini juga tumbuh jamur. Hal ini disebabkan karena petridish yang kurang steril, kesalahan dalam pembuatan media dan kurang kehati-hatian dalam melaksanakan praktikum sehingga terjadi kesalahan. Kelompok mikroba yang paling banyak ditemukan sebagi jasad hidup yang tidak diharapkan kehadirannya melalui udara, dan kelompok jasad tersebut umumnya disebut jasad kontaminan (hal ini mengingat kalau suatu benda/substrat yang ditumbuhinya dinyatakan sebagai substrat terkontaminasi), antara lain sebagai berikut : 1. Bakteri : Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Sarcina dan sebagainya 2. Jamur : Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillium, Trichoderma, dan sebagainya 3. Ragi : Candida, Saccharomyces, Paecylomyces, dan sebagainya Banyak jenis jamur kontaminan udara yang bersifat termofilik, yaitu jamur yang tahan pada pemanasan tinggi di atas 80 derajat celcius, misal selama suatu benda/ substrat sedang disterilkan. Ketahanan ini umumnya kalau mereka sedang berada di dalam fase spora. Ini terbukti bahwa walaupun suatu substrat sudah di sterilkan, tetapi di dalamnya setelah melewati waktu tertentu kemudian tumbuh dan berkembang pula bakteri ataupun jamur tanpa diharapkan sebelumnya. Ruangan tempat pembedahan di rumah-rumah sakit sangat dihindari sekali kehadiran mikroba kontaminannya, karenanya ruangan tersebut akan di jaga kebersihannya sebelum dipergunakan untuk keperluan operasi secara menyeluruh. Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat mnebarkan beriburibu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupunudara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk

memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni in teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar, 1986). Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992). Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kkontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1990). Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) : 1.Dengan pengenceran Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

2. Dengan penuangan Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikti sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin. Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) : 1.Metode cawan gores Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaikbaiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores. 2.Metode cawan tuang Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Admin, 2008) : 1) Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel. Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalamcawan. 2) Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. 3) Isolasi sel tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis. Bakteri adalah salah satu contoh mikroorganisme yang penting dan memiliki bentuk yang beragam. Pada umumnya bakteri berhubungan dengan makanan. Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang tidak diinginkan atau menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan. Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Terhadap bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka cawan Petri yang berisi media agar steril beberapa saat.

Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat- alat yang ada sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikkroorganisme yang tidak diinginkan. Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Hadioetomo, 1993). Sifat organisme dalam suatu biakan murni dapat dipelajari dengan metode yang amat keras dengan hasil yang sangat akurat karena pengaruh sel hidup yang lain dapat ditiadakan. Dilakukan serangkaian pengenceran terhadap zat tersebut untuk mengisolasi bakteri dari tanah/benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut atau zat cair. Misalnya suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran diencerkan dalam suatu tabung tersendiri secara berkelanjutan dari suatu tabung ke tabung lain (Dwidjoseputro, 1994). Pertumbuhan bakteri pada medium agar pada umumnya berbentuk koloni berupa lendir dan mengkilap. Pemurnian dengan suhu inkubasi 30C selama 2 x 24 jam. Selain bakteri, di alam masih terdapat mikroorganisme lain seperti khamir dan fungi. Khamir termasuk fungi, tetapi dapat dibedakan dari kapang karena bentuknya yang uniseluler, dan memiliki ukuran 5 dan 20 mikron (Fardiaz, 1992). Biasanya berukuran 5 sampai 10 kali lebih besar dari bakteri. Sumber khamir terutama terdapat pada daun-daun, bunga-bunga, eksudat dari tanaman, buah lewat masak, tanah kebun buah, serta khamir yang banyak di jual dipasaran. Khamir/yeast dapat tumbuh dalam media cair dan pada dengan cara yang sama dengan bakteri. Penampakan pada medium akan tampak seperti koloni bakteri, hanya saja koloninya tidak mengkilap. Fungi/kapang sangat berlawan dengan bakteri dan khamir/yeast, seringkali dapat dilihat oleh mata. Bentuk khas yang dimiliki oleh kapang adalah adanya filamen (miselium) (Fardiaz, 1992). Inilah yang membedakannya dengan mikroorganisme lainnya. Fungi mempunyai bentuk seperti kapas dan biasanya terlihat pada kertas- kertas koran basah, kulit yang sudah usang, dinding basah, buah-buahan yang membusuk dan bahan pangan lain seperti keju dan selai. Sumber fungi hampir sama dengan bakteri, hanya saja perbedaannya populasi fungi di air lebih sedikit dan fungi lebih menyukai pH lingkungan yang rendah.

Pengukuran kuantitatif populasi suatu mikroba dapat dilakukan dengan penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel (Fardiaz, 1992). Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan hitungan cawan, hitungan mikroskopis langsung, atau dengan alat colony counter.

6.

Kesimpulan Dari praktimum yang dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa mikroba itu ada dimanamana termasuk di udara, dapat dilihat dari hasil petridish yang diletakkan di toilet, ada medium PDA dan medium NA, dan bentuk, jumlah mikroorganisme tersebut berbeda-beda pula.

7. -

Saran Pastikan peralatan dan bahan yang digunakan dalam keadaan steril Harus berhati-hati dalam menuangkan medium ke dalam petridish Dan selalu menggunakan jas labor

DAFTAR PUSTAKA

Admin., 2008, http://www.ubb.ac.id/menulengkap.php?judul=Sejarah- PerkembanganMikrobiologi. Diakses pada tanggal 05 Januari 2011 Dwidjoseputro, S., 1992, Mikrobiologi Pangan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Ferdias, S., 1992, Mikrobiologi Pangan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Lay, B., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo Persada, Jakarta. Pelczar, Michael, J., 1986, Dasar- Dasar Mikrobiologi, Universitas Indonesia, Jakarta

Kamis, 15 Januari 2009

jurnal mikrobiologi Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat 67 Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004) ISSN 1410-9379 PENDAHULUAN Pencemaran logam berat merkuri (Hg) pada tanah dan air sangat membahayakan lingkungan dan kesehatan manusia. Senyawa merkuri dalam bentuk Hg(II) dapat terikat pada residu sistein protein/enzim manusia/binatang sehingga protein/enzim kehilangan aktivitasnya. Selain Hg(II), senyawa merkuri paling berbahaya bagi kesehatan manusia adalah senyawa organomerkuri, khususnya metilmerkuri dan fenilmerkuri. Senyawa ini bersifat sangat reaktif dan mempunyai mobilitas tinggi dibanding dengan Hg(O) atau Hg(II). Hal ini disebabkan gastrointestine manusia dapat menyerap sekitar 95% senyawa metilmerkuri (Rugh et al, 2000), dan senyawa ini juga dapat menyerang syaraf manusia melalui peredaran darah (Bizily et al, 2000). Pada lingkungan perairan (aquatic) atau laut (marine) senyawa metilmerkuri mengalami biomagnification melalui jaringan makanan, khususnya untuk jaringan makanan di air (Bizily et al, 2000). Biomagnification terjadi jika metilmerkuri mencemari perairan atau laut. Sumber pencemaran merkuri dapat disebabkan oleh proses geologi dan biologi. Senyawa merkuri yang terdapat pada batu dan tanah dikikis oleh hujan dan angin. Meskipun demikian, hal itu tidak sebanding jumlahnya bila dibandingkan dengan pencemaran merkuri yang disebabkan oleh aktivitas manusia, seperti: pembakaran batubara, beberapa jenis produk minyak bumi, penggunaan fungisida merkuri, katalisator merkuri dan penambangan emas yang menggunakan merkuri untuk ekstraksi partikel emas. Salah satu usaha untuk detoksifikasi merkuri dapat dilakukan menggunakan mikroorgansime resisten merkuri, misalnya bakteri resisten merkuri. Detoksifikasi merkuri oleh bakteri resisten merkuri terjadi karena bakteri resisten merkuri memiliki gen resisten merkuri, mer operon (Silver & Phung 1998). Struktur mer operon berbeda untuk tiap jenis bakteri. Umumnya struktur mer operon terdiri dari gen

metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan organomerkuri liase (merB). Menurut Liebert et al, (1999), model mekanisme resisten merkuri bakteri gram negatip adalah sebagai berikut Hg(II) yang masuk periplasma terikat ke pasangan residu sistein MerP. Selanjutnya MerP mentransfer Hg(II) ke residu sistein MerT atau MerC. Akhirnya ion Hg menyeberang membran sitoplasma melalui proses reaksi pertukaran ligan menuju sisi aktif flavin disulfida oksidoreduktase, merkuri reduktase (MerA). Merkuri reduktase mengkatalisis reduksi Hg(II) menjadi Hg(0) volatil dan sedikit reaktif. Akhirnya Hg(0) berdifusi dilingkungan sel untuk selanjutnya dikeluarkan dari sel. Bakteri yang hanya memiliki protein merkuri reduktase (MerA) disebut dengan bakteri resisten merkuri spektrum sempit. Beberapa bakteri selain memiliki protein merkuri reduktase (MerA) juga memiliki protein organomerkuri liase (MerB). MerB Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari Daerah Bekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat Risa Nofiani, Gusrizal Jurusan Kimia, FMIPA (Persiapan), Universitas Tanjungpura, Pontianak 78124 Diterima 04-02-2004 Disetujui 03-03-2004 ABSTRACT There are 18 mercury-resistant bacterias narrow spectrum have been isolated from ex illegal gold mining area with tailing 6 years. This isolation was carried out in September 2002. Mercury-resistant bacterias narrow spectrum is cultivated on solid selected medium refer to Canstein et al, (2002) which is added with 10 mikrogram/mL HgCl2. After identified followed Bergeys Manual of Determinative Bacteriology System, there were found 14 mercury-resistant bacterias narrow spectrum as Enterobacter hafniae and 4 of them as Enterobacter cloacae. Based on antibiotic resistance assay, there were found 8 isolates are resistant ampicillin, 7 isolates are resistant chloramphenicol, 17 isolates are resistant tetracycline, and 18 isolated are sensitive rifampicin. Keywords: Enterobacter hafniae, Enterobacter cloacae, mercury, organomercury 68 Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004) Nofiani & Gusrizal. berfungsi dalam mengkatalisis pemutusan ikatan merkuri-karbon sehingga dihasilkan senyawa organik dan ion Hg yang berupa garam tiol. Bakteri yang memiliki kedua protein merkuri reduktase (MerA) dan

organomerkuri liase (MerB) disebut dengan bakteri resisten merkuri spektrum luas. Mikroorganisme yang terdapat pada daerah tercemar merkuri berperan utama untuk detoksifikasi merkuri. Oleh karena itu, mikroorganisme yang terdapat pada daerah tercemar merkuri merupakan sumber untuk isolasi bakteri resisten merkuri. Adapun tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri resisten merkuri spektrum sempit dari daerah tercemar merkuri yaitu penembangan emas tanpa izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. Strain yang menunjukkan resiten merkuri dengan konsentrasi tertinggi selanjutnya diidentifikasi dan diuji resistensinya terhadap antibiotik ampisilin, rifampisin, tetrasiklin dan klorampenikol. Pengujian resistensi bakteri resisten merkuri terhadap antibiotik dilakukan untuk mengetahui fenotipe setiap bakteri resisten merkuri. Pada penelitian berikutnya, fenotipe ini akan digunakan sebagai marka untuk mengetahui kemungkinan lokasi gen mer operon bakteri resisten merkuri dengan mengunakan metode mating. dan 6S digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri pada tahap berikutnya. Media seleksi padat yang digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri adalah media seleksi padat yang digunakan oleh Canstein et al, (2002) dengan variasi konsentrasi HgCl2. Komposisi media seleksi Canstein et al. (2002) terdiri dari NaCl 15 g/L, sukrosa 4 g/L dan yeast extract 2 g/L. Variasi konsentrasi HgCl2 yang digunakan adalah 1 g/mL, 5 g/mL, dan 10 g/mL. BAHAN DAN METODE Sampling dilakukan dengan mengambil sedimen 1-5 cm dari permukaan tanah pada bulan September 2002 dari daerah bekas penambangan emas tanpa izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. Sampel sedimen diambil pada 3 lokasi, yaitu: lokasi I dengan lama penambangan 1 tahun (1S), lokasi II dengan lama penambangan 3 tahun (3S), dan lokasi III dengan lama penambangan 6 tahun (6S). Setiap lokasi, sedimen diambil pada 3 titik. Jumlah sedimen yang diambil pada setiap titik kira-kira 2 kg. Sampel sedimen setiap titik pada lokasi 1S dicampur sehingga diperoleh sampel komposit. Sampel komposit disuspensikan ke dalam bufer salin

0,9%. Sebanyak 100L larutan jernih sampel yang telah disuspensi dalam buffer salin diinokulasi pada media nutrient broth (yeast extract 2 g/L, bacto pepton 5 g/L, NaCl 5 g/L) dan diinkubasi pada temperatur 30 oC selama 12-16 jam. Teknik perbanyakan kultur bakteri 1S digunakan juga untuk perbanyakan kultur bakteri 3S dan 6S. Selanjutnya kultur bakteri 1S, 3S, Sebelum dilakukan isolasi bakteri resisten merkuri maka dilakukan seleksi kultur bakteri yang akan digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri. Seleksi ini dilakukan dengan cara inokulasi 100 L kultur bakteri 1S dalam media seleksi padat yang mengandung HgCl2 1 g/mL dan diinkubasi pada temperatur 30oC selama 16-24 jam. Kultur bakteri 1S juga diinokulasi pada media seleksi padat yang mengandung HgCl2 5 g/mL dan 10 g/mL. Selanjutnya diamati jumlah koloni yang tumbuh. Sebagai kontrol kultur bakteri 1S ditumbuhkan pada media seleksi padat tanpa penambahan HgCl2. Setiap tahap seleksi kultur bakteri ini dilakukan triplo. Selain kultur bakteri 1S, seleksi ini dilakukan juga untuk kultur bakteri 3S dan 6S. Kultur bakteri yang tumbuh dalam media seleksi padat yang mengandung HgCl2 dengan konsentrasi paling tinggi akan diisolasi untuk memperoleh isolat bakteri resisten merkuri. Hal ini dilakukan dengan cara kultur bakteri yang dapat tumbuh pada media seleksi dengan konsentrasi HgCl2 tertinggi diencerkan 10 kali. Selanjutnya 100 L kultur bakteri yang telah diencerkan diinokulasi triplo pada media seleksi padat dengan konsentrasi HgCl2 tertinggi dan diisolasi secara acak untuk memperoleh isolat bakteri resisten merkuri. Isolat bakteri resisten diberi kode RG1. Untuk isolat bakteri resisten merkuri selanjutnya diberi kode RG2, RG3, dan seterusnya. Identifikasi bakteri dilakukan di Unit Laboratorium Kesehatan Propinsi Kalimantan Barat dengan sistem Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Pada tahap awal identifikasi, bakteri resisten merkuri dilakukan uji morfologi dengan pewarnaan gram (Cappuccino & Sherman 1983). Isolat bakteri resisten merkuri dioles pada kaca slide dan ditambahkan 1 tetes kristal violet selama 1 menit kemudian dicuci dengan air mengalir. Isolat bakteri ditambahkan 1 tetes Grams iodine mordant (Emerck) Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat 69

selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya isolat bakteri ditambah etil alkohol 95% sampai kristal violet tidak larut lagi dan dicuci dengan air mengalir kembali. Akhirnya isolat bakteri ditambahkan safranin selama 45 detik dan dicuci dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dan diperiksa dengan mikroskop. Uji biokimia yang dilakukan meliputi tes fermentasi karbohidrat, tes pembentukan indol, tes produksi H2S, tes penggunaan sitrat, tes urease, tes dekarboksilase dan tes ONPG. Substrat yang digunakan untuk tes fermentasi karbohidrat adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sakarosa. Tes fermentasi karbohidrat dengan substrat glukosa dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke 50 mL media pepton water (Kia Difco) yang mengandung 0,5 mL bromthymol blue 0,4% dan glukosa 1%, diinkubasi 24-48 jam pada temperatur 300C (Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuk warna kuning dan tes negatif ditandai dengan warna biru. Hal yang sama dilakukan juga untuk tes fermentasi karbohidrat dengan substrat laktosa, manitol, maltosa dan sakarosa. Konsentrasi substrat yang digunakan adalah laktosa 0,5%, manitol 0,5%, maltosa 1%, dan sakarosa 2%. Tes pembentukan indol dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media water pepton selama 24-48 jam pada temperatur 300C selanjutnya ditambah 0,5 mL Kovacs reagent (Emerck) (Cappuccino & Sherman 1983; Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna merah. Tes produksi H2S dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media SIM (pepton 30 g/L, beef extract 3 g/L, fero amonium sulfat 0,2 g/L dan natrium tiosulfat 0,025 g/L, agar 3 g/L) selama 24-48 jam pada temperatur 300C (Cappuccino & Sherman 1983). media padat urea Christensen (Sigma) selama 2448 jam pada temperatur 300C (Cappuccino & Sherman 1983). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna merah. Tes dekarboksilase dengan substrat DL-lisin dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media Decarboxylase broth base Moeller (Sigma) yang mengandung DL-lisin 2% dan diatur pH = 8 dengan penambahan NaOH 0,1 N selanjutnya

diinkubasi selama 24-48 jam pada temperatur 300C (Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu. Hal yang sama juga dilakukan untuk tes dekarboksilase dengan substrat DL-arginin dan DL-ornithin dengan konsentrasi 2% dan 2% secara berturut-turut. Tes ONPG dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media ONPG broth selama 24 jam pada temperatur 300C (Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna kuning. Uji resisten antibiotik dilakukan dengan menginokulasi 18 bakteri resisten merkuri spektrum sempit pada 2 macam media seleksi padat. Pertama, media seleksi padat yang mengandung antibiotik dan diinkubasi pada suhu 300C selama 16-24 jam. Kedua. media seleksi padat yang mengandung antibiotik dan HgCl2 10 g/mL dan diinkubasi pada suhu 30 0C selama 16-24 jam. Antibiotik yang digunakan untuk uji resisten antibiotik pada kedua media adalah: ampicillin dengan konsentrasi 50 g/mL (Ausubel et al, 1995), tetracyclin dengan konsentrasi 200 g/mL (Smit et al, 1998), chloramphenicol dengan konsentrasi 50 g/mL (Smit et al, 1998) dan rifampicin dengan konsentrasi 150 g/mL (Smit et al, 1998) . Tes positif ditandai dengan terbentuknya endapan hitam. Hasil tes ini dapat juga digunakan untuk tes motilitas. Bakteri motil ditandai dengan bentuk koloni yang lebih besar dan keruh jika dibandingkan dengan koloni tidak motil. Tes penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media Simmons citrate agar (Sigma) dan diinkubasi 24-48 jam pada temperatur 300C (Cappuccino & Sherman 1983). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna biru. Tes urease dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit. Media seleksi yang digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri spektrum sempit adalah media seleksi menurut Canstein et al, (2002). Media selaksi ini dapat mengurangi penggunaan konsentrasi HgCl2 dibandingkan dengan penggunaan media kaya lain seperti media Luria Bertani (LB). Hal ini disebabkan media seleksi Canstein et al. (2002) tidak

mengurangi toksisitas Hg terhadap sel bakteri. Pada media kaya asam amino terutama asam amino sistein, toksisitas Hg berkurang, karena gugus sulfihidril sistein dapat mengikat Hg. 70 Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004) Nofiani & Gusrizal. Isolasi bakteri resisten merkuri spektrum sempit diawali dengan menginokulasi kultur bakteri 1S, 3S, dan 6S pada media seleksi padat dengan variasi konsentrasi HgCl2. Hasil inokulasi menunjukkan 6S tumbuh paling cepat pada media seleksi padat dengan konsentrasi HgCl2 tertinggi yaitu 10 g/mL (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa bakteri 6S yang tumbuh pada media seleksi diduga adalah bakteri dibandingkan dengan 6S. Kemungkinan kultur bakteri 1S dan 3S hanya memiliki mekanisme respon dengan cara menghambat metabolisme sel (Smit et al, 1998) atau dengan sistem multidrug, multication, atau nodulation signal efflux complexes (Nikaido 1996) sehingga kultur bakteri 1S dan 3S masih dapat hidup pada konsentrasi HgCl2 1 dan 5 g/mL. Sistem multidrug, multication, atau nodulation signal efflux complexes merupakan system yang dapat memompa keluar beberapa jenis obat-obatan, kation divalent atau nodulationsiganal lipooligosakarida. Pada konsentrasi lebih besar atau sama dengan HgCl2 10 g/mL kultur bakteri 1S dan 3S tidak dapat mentelorir keberadaan HgCl2. Bakteri yang dapat hidup untuk konsentrasi HgCl2 10 g/mL diduga hanya bakteri Jumlah koloni rata-rata yang tumbuh dalam media seleksi padat yang mengandung HgCl2 Stok Bakteri Kontrol 1 g/mL 5 g/mL 10 g/mL 1S >500 >500 >500 Negatip 3S >500 >500 6 koloni Negatip 6S >500 >500 >500 >500 Tabel 1. Kemampuan tumbuh kultur bakteri dalam media seleksi padat dengan variasi konsentrasi HgCl2. Negatip: tidak ada koloni yang tumbuh. resisten merkuri dengan tingkat ketahanan merkuri yang tinggi. Hal ini berdasarkan hasil penelitian Canstein et al, (2002) yang menyatakan bahwa isolat bakteri resisten merkuri yang dapat tumbuh pada media seleksi padat dengan konsentrasi HgCl2 5 g/ mL dapat dikatakan bahwa bakteri tersebut memiliki

tingkat ketahanan merkuri yang tinggi. Beberapa isolat bakteri resisten merkuri dengan tingkat ketahanan merkuri yang tinggi yaitu HgCl2 5 g/mL adalah Pseudomonas stutzeri Ibu8, Pseudomonas putida Spi3, Psedomonas putida Spi4, Pseudomonas putida Elb2, Pseudomonas putida Kon12, dan Pseudomonas aeruginosa Bro12 (Canstein et al, 2002). Hasil inokulasi bakteri resisten merkuri dari kultur bakteri 6S yang telah diencerkan 10 kali diperoleh kira-kira 50 koloni/cawan petri. Tiap cawan petri diisolasi secara acak sebanyak 7 koloni sehingga diperoleh 18 isolat bakteri resisten merkuri. Resistensi kultur bakteri 1S, 3S, dan 6S terhadap merkuri anorganik berbeda. Menurut Smit et al, (1998), perbedaan resistensi ini berhubungan dengan mekanisme respon populasi bakteri terhadap merkuri. Ada 3 mekanisme respon terhadap stres merkuri. Pertama, dengan cara menghambat metabolisme sel sehingga pertumbuhan sel lambat atau sel mati. Kedua, menginduksi sistem operon resisten merkuri untuk bekerja sehingga sel tetap hidup dalam kondisi stres. Ketiga, adanya plasmid yang mengandung gen resisten merkuri yang masuk ke dalam sel. Kultur bakteri 1S dan 3S menunjukkan resistensi merkuri anorganik lebih rendah yang mengandung gen resisten merkuri. Oleh karena itu, diduga kultur bakteri 6S mengandung gen resisten merkuri spektrum sempit. Keberadaan gen resisten merkuri sampel bakteri 6S diduga berhubungan langsung dengan lamanya kandungan Hg pada lokasi penambangan. Tingginya kontaminasi Hg pada daerah tersebut akan menginduksi sel bakteri untuk menerima gen resisten merkuri dari lingkungan (Smit et al, 1998). Identifikasi Bakteri Resisten Merkuri. Delapan belas isolat bakteri resisten merkuri diidentifikasi dengan sistem Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Identifikasi dilakukan dengan uji morfologi dan aktivitas biokimia. Uji morfologi dilakukan dengan tes pewarnaan gram dan tes motilitas. Hasil pewarnaan gram delapan belas bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG4, RG5, RG6, RG7, RG8, RG9, RG10, RG12, RG13, RG16, RG17, RG19, RG20, RG21, dan

RG22 yang diperiksa dengan mikroskop menunjukkan sel bewarna merah sehingga semua sel bakteri dikategorikan bakteri gram negatif (Tabel 2). Delapan belas bakteri resisten merkuri berbentuk batang (Tabel 2). Uji motilitas dengan menggunakan Hasil Uji Morfologi Kode Isolat Pewarnaan Gram Bentuk Sel Motilitas RG1, RG2, RG3, RG4, RG5, RG6, RG7, RG8, RG9, RG10, RG12, RG13, RG16, RG17, RG19, RG20, RG21, RG22 Bakteri Gram Negatip Batang Motil Tabel 2. Uji morfologi bakteri resisten merkuri. Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat 71 media semipadat SIM menunjukkan 18 bakteri resisten merkuri adalah motil (Tabel 2). Motilitas bakteri resisten merkuri disebabkan karena sel bakteri memiliki flagela. Identifikasi bakteri berdasarkan uji aktivitas biokimia dilakukan dengan cara membandingkan aktivitas biokimia setiap bakteri. Aktivitas biokimia setiap jenis bakteri berbeda. Hal ini disebabkan karena setiap bakteri mempunyai akivitas enzimatik yang berbeda. Tes fermentasi karbohidrat menunjukkan 4 bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 mampu melakukan fermentasi karbohidrat dengan substrat glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sakarosa tetapi 14 isolat bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21, dan RG22 hanya mampu melakukan fermentasi karbohidrat dengan substrat glukosa, manitol, maltosa dan sakarosa (Tabel 3). menyebabkan pH media fermentasi menurun sehingga indikator bromthymol blue yang terdapat pada media berubah dari biru menjadi kuning. Tes produksi indol bakteri bertujuan untuk memeriksa kemampuan bakteri mendegradasi asam amino esensial triptopan (Cappuccino & Sherman

1983). Enzim yang berperan dalam proses ini adalah triptopanase. Produk metabolit triptopan adalah indol, asam piruvat dan amonia. Keberadaan indol dideteksi dengan Kovacs reagent yang menyebabkan terbentuknya warna merah. Warna merah terjadi karena terbentuknya komplek antara indol dan pdimetilaminobenzaldehid dari Kovacs reagent. Delapan belas bakteri resisten merkuri menunjukkan bakteri tersebut tidak mampu mendegradasi triptopan atau tes negatif (Tabel 3). Beberapa bakteri mampu mereduksi sulfur organik yang terdapat pada asam amino sistein. Reaksi ini dibantu oleh enzim sistein desulferase Tabel 3. Uji biokimia bakteri resisten merkuri. (+): hasil tes positif; (-): hasil tes negatif. Kemampuan bakteri resisten merkuri melakukan fermentasi karbohidrat ditandai dengan adanya produksi asam organik (asam asetat, asam laktat, asam formiat dan asam suksinat) dan gas (karbon dioksida dan hidrogen) (Cappuccino & Sherman 1983). Produksi asam organik (Cappuccino & Sherman 1983). Kemampuan bakteri menghasilkan H2S digunakan juga untuk melihat aktivitas biokimia bakteri resisten merkuri. Hasil tes produksi H2S pada 18 isolat bakteri resisten merkuri menunjukkan bakteri resisten merkuri tidak memiliki enzim sistein desulferase sehingga tidak mampu menghasilkan H2S atau tes negatif (Tabel 3). Hasil Uji Biokimia Fermentasi Karbohidrat Dekarbok silase ON PG Kode Isolat Glukosa Lak tosa Mani tol Mal tosa Saka rosa Pemben tukan

Indol Pro duksi H2S Urease Penggu naan Sitrat Lisin Arginin Orni thin Kesimpulan RG1 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG1 RG2 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG2 RG3 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG3 RG4 +, gas + + + + - - +, lambat + - + + + E. cloacae RG4 RG5 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG5 RG6 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG6 RG7 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG7 RG8 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG8 RG9 +, gas + + + + - - +, lambat + - + + + E. cloacae RG9 RG10 +, gas + + + + - - +, lambat + - + + + E. cloacae RG10 RG12 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG12 RG13 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG13 RG16 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG16 RG17 +, gas + + + + - - +, lambat + - + + + E. cloacae RG17 RG19 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG19 RG20 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG20 RG21 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG21 RG22 +, gas - + + + - - - + + - + + E. hafniae RG22 72 Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004) Nofiani & Gusrizal. Bakteri coliform dapat meggunakan sitrat sebagai sumber energi apabila tidak ada glukosa atau laktosa. Hal ini dapat terjadi jika bakteri coliform memiliki enzim sitrat permease (Cappuccino & Sherman 1983; Barnet & Venghaus 1989). Sitrat permease berperan dalam membawa sitrat dari luar sel ke dalam sel. Sitrat yang telah berada di dalam sel akan masuk ke dalam siklus Krebs. Sitrat merupakan intermediet utama siklus Krebs. Pada siklus Krebs, sitrat akan diubah menjadi asam oksaloasetat dan asam asetat dengan bantuan enzim sitrase. Selanjutnya asam oksaloasetat dan asam asetat dirubah menjadi asam piruvat dan karbon dioksida. Karbon dioksida bereaksi dengan air dan natrium yang terdapat pada media Simmons citrate agar sehingga membentuk natrium bikarbonat.

Keberadaan natrium bikarbonat mengakibatkan media bersifat basa sehingga merubah warna indikator bromthymol blue dari hijau menjadi biru. Tes penggunaan sitrat positif ditandai dengan adanya enzim sitrat permease pada bakteri. Hasil tes penggunaan sitrat menunjukkan bahwa 18 isolat bakteri resisten merkuri memiliki enzim sitrat permease atau tes positif (Tabel 3). Urease merupakan suatu enzim pemecah ikatan karbon dan nitrogen pada senyawa amida. Senyawa amida yang dapat digunakan untuk tes urease adalah urea (Cappucino & Sherman 1983; Barnett & Venghaus 1988). Urea dengan adanya enzim urease akan diubah menjadi karbon dioksida dan amoniak. Keberadaan enzim dideteksi dengan berubah warna media cair urea menjadi merah. Hasil tes urease untuk 18 bakteri resisten merkuri menunjukkan 4 bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 memiliki enzim urease tes positip dan 14 bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21, dan RG22 tidak memiliki enzim urease atau tes negatif (Tabel 3) Reaksi dekarboksilasi dari suatu asam amino merupakan reaksi pemecahan gugus karboksil oleh enzim dekarboksilase, sehingga dihasilkan amin dan karbon dioksida (Collin & Lyne 1985). Keberadaan amin menyebabkan warna media dekarboksilasi Moeller menjadi warna ungu (tes positif). Tes dekarboksilasi asam amino dilakukan dengan menggunakan 3 substrat asam amino yaitu lisin, arginin, dan ornithin. Tes dekarboksilasi lisin negatif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 dan positif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22 (Tabel 3). Tes dekarboksilasi arginin positif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 dan negatif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22 (Tabel 3). Tes dekarboksilasi ornithin positif untuk 18 bakteri resisten merkuri (Tabel 3). Keberadaan enzim -galaktosidase pada bakteri dapat dideteksi apabila bakteri diinokulasi

dalam media cair ONPG. Bakteri yang mengandung -galaktosidase dapat menghidrolisa o-nitrofenil-Dgalaktopiranosida (ONPG) sehingga dihasilkan onitrofenil yang bewarna kuning (Collins & Lyne 1985; Barnett & Venghaus 1988). Tes ONPG 18 bakteri resisten merkuri menunjukkan 18 bakteri resisten merkuri positip memiliki enzim -galaktosidase. Identifikasi spesies dari 18 bakteri resisten merkuri dilakukan dengan cara mencocokkan hasil uji morfologi dan uji aktivitas biokimia 18 bakteri resisten merkuri dengan tabel uji morfologi dan uji aktivitas biokimia spesies yang terdapat pada Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Hasil identifikasi 18 bakteri resisten merkuri menunjukkan bahwa 4 bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 diduga adalah bakteri jenis Enterobacter cloacae dan 14 bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22 diduga adalah bakteri Enterobacter hafniae (Tabel 3). Uji Resistensi Antibiotik Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit. Hasil uji resisten antibiotik dengan dua jenis media seleksi yang mengandung antibiotik dan media seleksi yang mengandung antibiotik dan HgCl2 menunjukkan tidak ada perbedaan (Tabel 4). Strain bakteri yang resisten terhadap ampicillin dalam media seleksi yang mengandung ampicillin menunjukkan resisten ampicillin juga terhadap media seleksi yang mengandung HgCl2 10 g/mL dan ampicillin. Hasil uji resisten antibiotik menunjukkan bahwa 9 isolat resisten terhadap ampicillin, 7 isolat resisten terhadap chloramphenicol, dan 17 strain Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat 73 resisten terhadap tetracycilin tetapi semua strain sensitif terhadap antibiotik rifampicin (Tabel 4). Tujuh belas bakteri resisten merkuri spektrum sempit resisten terhadap tetracyclin. Resistensi ini kemungkinan disebabkan karena jenis bakteri yang Tabel 4. Uji resistensi antibiotik beberapa strain bakteri resisten merkuri. diperoleh adalah bakteri gram negatif yaitu genus Enterobacter. Menurut Nikaido (1996) dan Hernandez et al, (1998), bakteri gram negatif lebih resisten terhadap obat-obatan dibandingkan dengan bakteri gram positip. Karena bakteri gram negatif mempunyai

sistem efflux aktif untuk obat-obatan, yaitu multidrug, multication, atau nodulation signal efflux complexes. Kemungkinan lain adalah adanya gen resisten tetracyclin yang terdapat di dalam sel. Gen ini masuk ke dalam sel bersamaan dengan mer operon (Liebert et al, 1999). Contoh plasmid NR1 yang membawa mer operon dan bermacam-macam gen resisten antibiotik. Dari hasil penelitian ini ternyata isolat yang berasal dari spesies yang sama menunjukkan resistensi yang berbeda terhadap antibiotik chloramphenicol dan ampicillin. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya perbedaan jenis plasmid yang masuk ke dalam sel. Perbedaan jenis plasmid yang masuk biasanya ditandai dengan adanya penanda berupa antibiotik. E. cloacae RG9 menunjukan fenotipe resisten terhadap merkuri spektrum sempit tetapi sensitif terhadap semua jenis antibiotik yang diuji. Hal ini KESIMPULAN Bakteri resisten merkuri telah diisolasi dari daerah bekas penambangan emas tanpa izin (PETI) yang berumur 6 tahun dari daerah Mandor, Kalimantan Barat. Media seleksi yang digunakan isolasi bakteri resisten merkuri adalah media seleksi padat Canstein et al, (2002) yang mengandung HgCl2 10 g/mL. Hasil isolasi bakteri resisten merkuri diperoleh 18 isolat bakteri resisten merkuri spektrum sempit. Hasil identifikasi 18 bakteri resisten merkuri spektrum sempit diperoleh 2 spesies bakteri, yaitu: E. cloacae untuk kode strain RG4, RG9, RG10, dan RG17, dan E. hafniae untuk strain RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22. Uji resistensi antibiotik terhadap 18 bakteri resisten merkuri spektrum sempit menunjukkan 17 bakteri resisten terhadap tetracyclin 100 g/mL , yaitu E. hafniae RG1, E. hafniae RG2, E. hafniae RG3, E. cloacae RG4, E. hafniae RG5, E. hafniae RG6, E. hafniae RG7, E. hafniae RG8, E. cloacae RG10, E. hafniae RG12, E. hafniae RG16, E. cloacae RG17, E. hafniae RG19, E. hafniae RG20, E. hafniae RG21 dan E. hafniae RG22. Semua bakteri sensitif terhadap rifampicin 150 g/mL. Sembilan diduga karena E. cloacae RG9 mengandung plasmid yang tidak mengandung gen resisten antibiotik atau

E. cloacae RG9 tidak mengandung plasmid. Jika E. cloacae RG9 tidak memiliki plasmid berkemungkinan besar mer operon bakteri ini terletak pada kromosom. Resistensi Strain Amp Tet Rif Chlo HgCl2 +Amp HgCl2 + Tet HgCl2 + Rif HgCl2 + Chlo E. hafniae RG1 - + - - - + - E. hafniae RG2 - + - - - + - E. hafniae RG3 + + - + + + - + E. cloacae RG4 + + - + + + - + E. hafniae RG5 + + - + + + - + E. hafniae RG6 - + - - - + - E. hafniae RG7 - + - - - + - E. hafniae RG8 + + - - + + - E. cloacae RG9 - - - - - - - E. clacaae RG10 + + - + + + - + E. hafniae RG12 + + - + + + - + E. hafniae RG13 - + - - - + - E. hafniae RG16 - + - + - + - + E. cloacae RG17 + + - - + + - E. hafniae RG19 + + - + + + - + E. hafniae RG20 - + - - - + - E. hafniae RG21 - + - - - + - E. hafniae RG22 + + - - + + - Amp: ampicillin, Tet: tetracyclin, Rif: rifampicin, Chlo: chloramphenicol, +: resisten terhadap antibiotik, -: sensitif terhadap antibiotik. 74 Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004) Nofiani & Gusrizal. strain resisten merkuri menunjukkan resisten terhadap ampicillin 50 g/mL, yaitu: E. hafniae RG3, E. cloacae RG4, E. hafniae RG5, E. hafniae RG8, E. cloacae RG10, E. hafniae RG12, E. cloacae RG17, E. hafniae RG19 dan E. hafniae RG22. Tujuh bakteri menunjukkan resisten terhadap chloramphenicol 25 g/mL, yaitu E. hafniae RG3, E. cloacae RG4, E. hafniae RG5, E. cloacae RG10, E. hafniae RG12, E. hafniae RG16 dan E. cloacae RG19. Cappuccino, J.G. & Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. California: Addison-Wesley. Collins, C.H. & Lyne, P.M. 1985. Microbiological Methods. London: Butterworth & Co. Hernandez, A., Mellado, R.P. & Martinez, J.L. 1998. Metal accumulation and vanadium-induced multidrug resistance by environmental isolates of Escherichia hermanii and Enterobacter cloacae. Appl. Environ. Microbiol. 64: 43174320.

Liebert, C.A., Hall, R.M. & Summers, A.O. 1999. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 63: 507-522. Nikaido, H. 1996. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 178: 5853-5859. Rugh, C.L., Bizily, S.P. & Meagher, R.B. 2000. Phytoreduction of Environmental Mercury Pollution. New York: John Wiley and Sons. Smit, E., Wolters, A. & Elsas, J.D.V. 1998. Self-transmissible mercury resistance plamids with gene mobilizing capacity in soil bacterial populations: influence of wheat roots and mercury addition. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1210-1219. Silver, S. & Phung, L.T. 1996. Bacterial heavy metal resistance: new suprises. Annu. Rev. Microbiol. 50: 753-789. DAFTAR PUSTAKA. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Sith, J.A. & Struhl, K. 1995. Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley. Barnet, M.E. & Venghaus, J.D. 1989. Microbiology Laboratory Exercise. Lowa: Brown Publisher Bizily, S.P., Rugh, C.H. & Meagher, R.C. 2000. Phytodetoxification of hazardous organomercurials by genetically engineered Plants. Nat. Biotechnol. 18: 213-217. Buchanan, R.E. & Gibbons, N.E. 1974. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: The William and Wilkins. Canstein, H.V., Li, Y., Leonhauser, J., Haase, E., Felske, A., Deckwer, W.D. & Dobler, I.W. 2002. Spatially oscillating activity and microbial succession of mercury-reducing biofilms in a technical-scale bioremediation system. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1938-1946. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini di danai oleh Proyek Pengembangan Diri Forum HEDS tahun 2002. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Fadjar Riyanto dan Harald von Canstein atas saran yang diberikan pada penelitian ini.