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Anlisis de Lpidos Simples o Neutros

Cap. 6

Anlisis de Lpidos Simples o Neutros


Gliceridos: triglicridos y que pueden contener mono- y diglicridos

determinacin de gliceridos mediante cromatografa en capa fina isomerizacin de los glicridos (presencia de cido en la fase mvil) impregnar las placas con una disolucin de cido brico en etanol

Cap. 6

HC: hydrocarbons, CE: cholesterol esters, TG: Triacylglycerols, FFA: free fatty acids, 1,3-DAG: 1,3-diacylglycerols, 1,2-DAG: 1,2-diacylglycerols, Chol: cholesterol, MG: monoacylglycerols

Cap. 6

Monoglicridos
Emulsificantes Determinacin de la composicin en cidos grasos en los 2- monoglicridos Cromatografa en capa fina Anlisis de los acidos grasos de la fraccin de monoglicridos Las bandas de monoglicridos obtenidas tras la elucin por TLC son raspadas de la placa y se eluyen con etil ter Los monoglicridos son metilados y los cidos grasos metil steres resultantes son analizados por cromatografa de gases HPLC
fase mvil acetonitrilo/ agua acidificada (99/1) columna de fase reversa detector de light scattering (evaporativo de dispersin de luz) separa los distintos 2-monoglicridos presentes en la muestra
1 = 2-monolinolenina 2 = 2-monomyristina 3 = 2-monolinoleina 4 = 2-monooleina 5 = 2-monopalmitina

Cap. 6

Diglicridos
Separacin por TLC y posterior anlisis de su composicin en cidos grasos (derivatizacin) Determinacin de diglicridos (derivatizacin con naproxeno)
purificacin por TLC anlisis por HPLC fase mvil: hexano / isopropanol 99.4/0.6 columna de slice (fase normal) detector de fluorescencia

A: El segundo pico corresponde a dioleina B: Los tres ultimos picos corresponden a las distintas especies moleculares presentes en la muestra. La cuantificacion se estima midiendo el area de los tres picos y la curva de calibrado del standard.

Cap. 6

Triglicridos
Determinados por TLC seguido de derivatizacin y anlisis de los cidos grasos por GC Determinar triglicridos directamente mediante HPLC

CE: steres de colesterol TG: triglicridos CHOL: colesterol

Columna: slice CN Fase mvil: hexano/diclorometano 93/7 Detector evaporativo de dispersion de luz (light scattering)
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Cap. 6

Anlisis Estructural de Triglicridos


Analizar la composicin de los acidos grasos del triglicrido en posiciones 1,3 y en posicin 2. 2 mtodos: A. mtodo qumico B. mtodo enzimtico Mtodo enzimtico: basado en la selectividad de la lipasa pancreatica de cerdo simular las condiciones en las que tiene lugar la digestin de lpidos in vivo la reaccin se detiene con la adicin de cido HCl los lpidos hidrolizados se extraen con ter purificar la fraccin de 2-monoglicridos mediante TLC impregnada en cido brico la banda de 2-monoglicridos se raspa y se derivatiza la composicin en cidos grasos del triglicrido es tambin determinada tras derivatizacion y anlisis mediante GC composicin de cada cido graso en las posiciones 1 y 3: posicin 1,3 = [3 x triglicrido)-(position 2)] / 2

Cap. 6

Anlisis de los Triglicridos Intactos


Problema muy complejo Separacin de triglicridos en HPLC usando una columna de fase reversa (RP18) Diversas fases mviles Cromatografa con sales de plata y posterior HPLC Ejemplo: columna fase reversa (RP-18) fase movil diclorometano/acetonitrilo 45/55 detector evaporativo de dispersin de luz

Cap. 6

Nmero de tomos de Carbono Equivalente


Relacin entre el nmero de tomos de carbono equivalente (ECN) y el tiempo de retencin

ECN = NC nDB

NC DB

nmero de tomos de carbono del triglicrido nmero de dobles enlaces presentes en el triglicrido coeficiente de contribucin por doble enlace que suele ser cercano a 2.
TAGs RT (min) Log RT CN Tricaprylin (8:0) 2,0696 0,31589 Tricaprin (10:0) 4,1548 0,61855 Trilaurin (12:0) 11,5524 1,06267 Trimyristin (14:0) 21,699 1,33644 Tripalmitin (16:0) 35,3044 1,54783 Tristearin 50,8522 1,70631 1,2-Dioleoyl-3-palmitoyl-rac-glycerol (18:1,18:1,16:0) 32,7428 1,51512 1,2-Dioleoyl-3-stearoyl-rac-glycerol (18:1,18:1,18:0) 37,9958 1,57974 Triolein(18:1) 31,5998 1,49968 1,2-Dilinoleoyl-3-oleoyl-rac-glycerol (18:2,18:2,18:1) 23,1543 1,36463 Trilinolein (18:2) 19,5912 1,29206 Trilinolenin (18:3) 11,4022 1,05699 22,82443 1,3584 52 Palmitin, 2 linolein The regression equation is Log k = - 0.718 + 0.0463 CN - 0.0828 DB Predictor Coef StDev T P Constant -0.7180 0.1032 -6.96 0.000 CN 0.046310 0.002398 19.31 0.000 DB -0.082845 0.008650 -9.58 0.000 S = 0.07029 R-Sq = 97.7% R-Sq(adj) = 97.1% coeficientes CN DB DB 24 30 36 42 48 54 52 54 54 54 54 54 4 0 0 0 0 0 0 2 2 3 5 6 9 2 NUFA 0 0 0 0 0 0 2 2 3 3 3 3 ECN 24,0 30,0 36,0 42,0 48,0 54,0 48,4 50,4 48,6 45,1 43,3 37,9 44,8

2 1,5 1 0,5 0 0,0 20,0 40,0 60,0 y = 0,0463x - 0,718 R2 = 0,9766

1 -1,78834

Cap. 6

Anlisis de cidos Grasos por HPLC


Preparacin de la muestra
cidos grasos libres: purificar por TLC, extraccion en fase solida, etc Anlisis de cidos grasos por HPLC:
derivatizacion con distintos cromforos

steres de fenacilo
fluoroforos (bromometilmetoxicumarina) columnas de fase reversa (RP18)

Separacin de una mezcla standard de cidos grasos en forma de steres de fenacilo mediante HPLC de fase reversa. Deteccin espectrofotomtrica a 254 nm. Columna (900 x 6.4 mm) Bondapak C-18, y las condiciones de elucin pasaron de acetonitrilo-agua 76-33 (v-v), a 74:26 en "a", 4:1 en "b", y 97:3 en "c", a un flujo de 2 mL/min.

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Cap. 6

Anlisis de cidos Grasos por Cromatografa de Gases


Derivatizar la muestra Preparar steres metlicos de los cidos grasos cidos grasos libres y esterificados: esterificacin catalizada por cidos (HCL, tricloruro de boro, sulfrico, etc.,) cidos grasos esterificados: esterificacin catalizada por bases (NaOH, KOH) en metanol columnas con relleno polar como polietilenglicol (Carbowax) identificacin de los cidos grasos se realiza en funcin de su tiempo de retencin predecir el tiempo de retencin mezclas Standard de cidos grasos metil esteres comercialmente disponibles Cromatografa de gases:

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Cap. 6

Mtodos Generales para el Anlisis de cidos Grasos


Concentracin de cidos grasos es superior a 1 mM valoracin volumtrica con una disolucin de KOH Mtodos enzimticos con acyl coenzima A sintetasa Unin de cidos grasos a protenas

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Cap. 6

Anlisis de Esteroles
El principal esterol es el colesterol Metodologa de anlisis depende de la cantidad presente en el extracto Determinacin simultnea con otros componentes de la muestra (fosfolpidos, triglicridos, etc.,) Separar previamente por TLC Los esteroles pueden estar libres y esterificados Saponificar previamente el estracto lipdico con KOH etanlica Estrategias de anlisis:
cantidad de esteroles superior a 1 microgramo metodo colorimtrico cantidades inferiores a 1 microgramo HPLC: columnas de fase reversa (RP18) fase movil acetonitrilo/ metanol 50/50 (3 % de agua) detector evaporativo de dispersin de luz (light scattering)

Cuantificar los esteroles esterificados:



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purificacin por TLC analizados por GC transmetilados para conocer su composicin en cidos grasos

Cap. 6

Anlisis de vitamina E
Se encuentra en numerosos extractos de origen lipdico Conviene saponificar la muestra primero Coelucin de esteroles y tocoferoles en TLC y extraccin en fase slida HPLC fase reversa, fase mvil metanol/agua 98/2, deteccin UV, fluorescencia o light scattering Adicin de un antioxidante Analizar simultneamente tocoferoles y colesterol, fase normal, fase mvil isoctano/tetrahidrofurano 90/10, detector de fluorescencia para los tocoferoles y detector evaporativo de dispersin de la luz para el colesterol

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