MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MOLECULAR

Artur Alves, Isabel Henriques, Ana Santos, Marta Taco & Antnio Correia

Tipagem Gentica de Microrganismos

AVEIRO - 2003

A. ALVES, I. HENRIQUES, A. SANTOS, M. TACO & A. CORREIA

Tipagem Gentica de Microrganismos

Lab. de Diversidade Microbiana Centro de Biologia Celular Dep. de Biologia, U. de Aveiro 3810-193 Aveiro Tel: 234.370778 Fax 234.426408 http://sweet.ua.pt/~f426

ndice
Introduo 1 Protocolos experimentais 9 RFLP's - Ribotipagem 2 Extraco de DNA total bacteriano Digesto de DNA com endonucleases de Rep - PCR 3 restrio Transferncia por vcuo Electroforese em campo pulsado 4 Marcao por PCR da sonda de DNA 16S Hibridao e Deteco Sequncias nucleotdicas 6 Preparao de DNA em blocos de agarose Digesto de DNA embebido em agarose Electroforese em campo pulsado BOX-PCR Ligao de produtos de PCR a vector Transformao Extraco de DNA plasmdico Preparao de um gele de agarose 16 17 17 18 19 19 20 21 10 12 13 14 9

Referncias

23

Introduo
A correcta identificao e classificao de microrganismos de extrema importncia prtica, no s no aspecto clnico mas tambm na fitopatologia, biotecnologia e estudos ambientais. Os mtodos usados na discriminao de gneros, espcies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em mtodos fenotpicos e genotpicos. Os mtodos fenotpicos baseiam-se em fenmenos bioqumicos, fisiolgicos e biolgicos, enquanto os mtodos genotpicos detectam polimorfismos ao nvel dos cidos nucleicos, ou variao allica ao nvel de enzimas. A tipagem de microrganismos, i.e., a capacidade de os identificar ao nvel da espcie, e de discriminar entre indivduos da mesma espcie conheceu grandes avanos nos ltimos anos, tendo sido galvanizada por uma srie de novos mtodos que fazem uso da tremenda variao encontrada no DNA destes microrganismos. O desenvolvimento de tcnicas moleculares de tipagem de microrganismos, abriu novas possibilidades nos campos da classificao, identificao e diagnstico. O conhecimento sobre a filogenia e evoluo dos microrganismos foi tambm grandemente ampliado.

Figura 1: Capacidade discriminatria de diferentes mtodos de tipagem gentica de microrganismos.

Qualquer mtodo de tipagem gentica deve permitir a diferenciao clara de estirpes, e principalmente, deve ter uma elevada reprodutibilidade. Nem todos os mtodos moleculares de tipagem so igualmente eficazes, diferindo nomeaedamente na capacidade discriminatria em diferentes nveis taxonmicos (Fig 1). Como tal, a escolha do mtodo a ser aplicado deve ser feita de acordo com a finalidade pretendida (e.g. identificao, diferenciao), entre outros aspectos, (reprodutibilidade, poder discriminatrio, custos envolvidos, etc).

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RFLPs - Ribotipagem
RFLPs - Restriction Fragment Length Polymorphisms, polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrio Este mtodo tem por base a digesto de DNA com endonucleases de restrio (ERs), e posterior separao dos fragmentos obtidos por electroforese em gel de agarose, originando padres de restrio. Os padres de restrio obtidos podem ser caractersticos ao nvel da espcie ou mesmo da estirpe, dependendo do grau de heterogeneidade genmica intraespecfica. Este um dos primeiros mtodos de tipagem de DNA utilizado para avaliar a relao entre estirpes. A deteco de fragmentos comuns a estirpes pertencentes a uma mesma espcie, ou mesmo perfis tpicos de determinados grupos, tornam esta tcnica de grande interesse taxonmico. Assim, podem ser identificados fragmentos de restrio que passam a funcionar como marcadores moleculares diagnosticantes, por exemplo ao nvel da espcie. A tcnica de RFLPs apresenta como vantagens o facto de ser altamente reprodutvel e de no necessitar de informao prvia sobre a sequncia de DNA. Recorre-se designao de RFLPs directos quando se analisam directamente os perfis obtidos por electroforese. Embora esta anlise seja dificultada pelo elevado nmero de fragmentos, possvel restringi-la a uma gama de pesos moleculares correspondentes zona de maior resoluo do gel. Obviamente apresenta-se uma desvantagem, que o facto de apenas uma fraco do genoma ser analisada. A combinao da anlise de fragmentos de restrio com hibridao, usando sondas especficas de modo a reduzir o nmero de bandas a analisar, a verso mais utilizada desta tcnica. Como os genes de rDNA esto presentes em vrias cpias no genoma, a utilizao dos rDNAs como sondas permite detectar, aps hibridao, vrios fragmentos de restrio (Fig. 2). Algumas sequncias desta regio genmica so altamente conservadas que mesmo sondas heterlogas hibridam fortemente com elas, enquanto outras regies genmicas variam consideravelmente, mesmo entre nveis taxonmicos prximos. Esta variante dos RFLPs recebe a designao de ribotipagem.

Kb 23.1 9.4 6.6 4.4 2.3 2.0

M 1 2 3 4 5 6

0.6

Figura 2: Padres de bandas resultantes de ribotipagem. O DNA total das estirpes 1 a 6 foi digerido com EcoRI e os fragmentos resultantes, aps separao electrofortica, foram transferidos para uma membrana de nylon. A hibridao com uma sonda para rDNA 16S resultou nos padres da figura. 1 a 6 - estirpes de Brevibacterium linens; M - marcador de peso molecular.

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rep-PCR
Mtodo de tipagem baseado na amplificao via PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos. A tcnica de rep-PCR faz uso de primers complementares de sequncias de DNA repetitivas altamente conservadas, e presentes em mltiplas cpias nos genomas da maioria das bactrias Gram-negativas e vrias Gram-positivas. Trs famlias de sequncias repetitivas foram identificadas, incluindo a sequncia REP (Repetitive Extragenic Palindromic) de 35-40 pb, sequncia ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) de 124-127 pb, e o elemento BOX de 154 pb. Estas sequncias parecem estar localizadas em posies intergnicas distintas no interior do genoma. Os elementos repetitivos podem estar presentes em ambas as orientaes, e os primers foram desenhados de modo a promover a sntese de DNA a partir da repetio invertida nos REP e ERIC, e da subunidade boxA nos BOX, amplificando assim regies genmicas distintas localizadas entre os elementos repetitivos. Os protocolos correspondentes so designados REP-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR, e repPCR colectivamente. A amplificao com os primers REP ou ERIC pode ser efectuada com um s primer, ou com um ou vrios conjuntos de primers. No caso do elemento BOX utiliza-se um nico primer (Fig. 3). A aplicao de diferentes abordagens a uma amostra aumenta o poder de discriminao.

Kb
12.0 -

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5.0 -

2.0 1.0 -

0.5 -

Figura 3: Padres obtidos por ampliao de DNA total de vrias estirpes do gnero Brevibacterium com o primer BOX A1R. 1 a 6 - estirpes de B. linens; 7, 8 - estirpes de B. casei; 9, 10 - estirpes de B. iodinum; M marcador de peso molecular.

O mtodo de tipagem designado por rep-PCR extremamente fivel, reprodutvel, rpido e altamente discriminativo. Esta tcnica tornou-se uma ferramenta valiosa na identificao e classificao de bactrias, e em estudos epidemiolgicos de patognicos de humanos e fitopatognicos .

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Electroforese em campo pulsado

PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" Com o advento da tcnica de PFGE, que permite a separao de fragmentos de DNA de grande tamanho (desde as centenas de quilobases at s megabases), surgiram novas abordagens ao estudo da organizao de genomas. A electroforese convencional limita a anlise de DNA a fragmentos que podero ter no mximo, 20 a 50 kb, necessitando o uso de agarose a muito baixa concentrao para a separao de fragmentos de mais de 20 kb. Acima destes tamanhos, no h diferenas de mobilidade que permitam a separao de fragmentos de acordo com o peso molecular. Com a alternncia peridica do campo elctrico, as molculas so permanentemente foradas a modificar a orientao em que se movem. Quanto mais longa for a molcula, maior o tempo que necessita para que encontre uma orientao que favorea o movimento ao longo do gel. Estes so os princpios que determinaram a criao de configuraes que permitissem a aplicao de dois campos elctricos, com diferente orientao, a um gel de agarose. Foram desenvolvidos aparelhos com diversos tipos de configuraes de elctrodos. O sistema de campo elctrico homogneo, (CHEF, "contour-clamped homogeneous electrical field") actualmente o mais usado e apresenta uma srie de elctrodos dispostos nos lados de um hexgono e com os dois campos elctricos formando um ngulo de 120 (Fig. 4). Ao longo de cada um dos lados do hexgono forma-se uma distribuio gradual de potenciais, resultando num campo elctrico homogneo em todo o gel e, consequentemente, carris perfeitamente rectos. Este tipo de configurao actualmente muito usada para tipagem de estirpes bacterianas, nomeadamente bactrias entricas. Outras aplicaes, incluem a elaborao de mapas fsicos de pequenos genomas e a cariotipagem electrofortica de pequenos organismos eucariotas.

+ +

- --

- -

- -

-- --

+ + + +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ + + +

+ +

+ +

Figura 4: Funcionamento do sistema CHEF. Os campos elctricos funcionam alternadamente segundo cada uma das diagonais do gel. Como resultado, as molculas de DNA migram num percurso rectilneo ao longo do gel.

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Os perfis de restrio obtidos com endonucleases de baixa frequncia de corte (Fig. 5) tm sido usados por diversos autores para diferenciar estirpes da mesma espcie. O procedimento pode revelar-se interessante para anlise de estirpes com interesse comercial, para comparao de isolados ambientais com interesse agrcola, ou inclusivamente encontrar aplicaes na anlise epidemiolgica de isolados clnicos. A electroforese de campo pulsado utiliza uma matriz de agarose, com o gel submerso num tampo de alta fora inica, normalmente TBE. O ideal correr o gel a uma temperatura compreendida entre 12 e 15 C: temperaturas superiores originam bandas mal definidas e a temperaturas muito baixas so necessrias electroforeses muito prolongadas. A concentrao de agarose ideal de 1%, no apresentando concentraes superiores qualquer melhoria na resoluo.

Kb

600 365 200 -

100 50 -

Figura 5: Perfis de restrio PacI (TTAATTAA) de Corynebacterium lactofermentum (3) e C. glutamicum (4) resolvidos por PFGE. 1 Cromossomas de S. cerevisiae; 2 - concatmeros de DNA do fago .

Para molculas de tamanhos na ordem de vrias megabases, pode ser til baixar a concentrao de agarose para valores da ordem dos 0.5% de modo a diminuir o tempo de electroforese, embora com obteno de bandas menos definidas. Para separao de fragmentos lineares at 1 Mb, o potencial do campo elctrico em geral de 6 V/cm. Para molculas de grande tamanho como por exemplo cromossomas de fungos, usam-se valores de 2 a 2.5 V/cm. As molculas de DNA de topologia circular, apresentam uma mobilidade em campo elctrico pulsado que parece no depender directamente do tempo de alternncia de campo.

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Sequncias nucleotdicas
Discriminao e/ou identificao atravs de sequncias de DNA A discriminao entre microrganismos superficialmente semelhantes pode tambm ser efectuada atravs da determinao das sequncias nucleotdicas de genes evolutivamente conservados. Desta forma, possvel detectar diferenas subtis entre estirpes. A sequenciao de DNA tem vindo a ser aplicada por exemplo, na epidemiologia molecular de doenas bacterianas. Para esse efeito, utiliza-se a reaco de PCR para amplificar os genes a sequenciar. As sequncias alvo incluem genes para protenas de superfcie, genes de resistncia a antibiticos, "housekeeping genes" e mais frequentemente, os genes codificando para rRNA 16S. Para cada situao pode ser necessrio determinar empiricamente qual o gene cuja sequenciao mais indicada. Por vezes, a sequenciao usada em conjunto com outros mtodos de tipagem, nomeadamente PFGE, permitindo examinar a transferncia horizontal de genes entre estirpes da mesma espcie. Este mtodo, embora mais dispendioso muito til para identificar e discriminar microrganismos difcieis de cultivar. O mtodo pode ser aplicado a culturas complexas, em que por vezes alguns dos componentes da populao so difceis ou impossveis de cultivar. Para esse efeito, ujma coleco de fragmentos representando a sequncia-alvo e resultantes de amplificao por PCR a partir de uma populao mista, podem ser clonados num vector apropriado, introduzidos em E. coli e aps seleco dos transformantes, os insertos presentes em diferentes clones so sujeitos determinao da sequncia nucleotdica.
AMOSTRA Clnica, ambiental, industrial

PCR i)

ii)

Ligao ao Vector

Transformao de E. coli

Sequenciao directa

Sequenciao de insertos

Anlise de sequncias

Figura 6: Os dois procedimentos mais utilizados para caracterizar sequncias nucleotdicas com fins de identificao e/ou discriminao de microrganismos.

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Assim so possveis dois procedimentos alternativos (Fig. 6): i) amplificao por PCR e sequenciao directa dos fragmentos amplificados, sem necessidade de clonagem; ii) clonagem dos fragmentos amplificados procedendo-se depois determinao da sequncias de insertos individuais. O primeiro procedimento normalmente utilizado para microrganismos em cultura pura e abundante, o segundo, para culturas mistas ou para microrganismos de difcil cultivo.

LIGAO AO VECTOR

A ligao dos produtos de PCR feita na presenca de DNA ligase e de um vector apropriado. Existem vectores plasmdicos que replicam em E. coli particularmenbte adequados clonagem de fragmentos obtidos por amplificao por PCR A figura 7 apresenta o mapa de um desses vectores, pCR 2.1, da Invitrogen. O vector contm uma regioo com mltiplos locais de restrio, genes de resistncia a antibiticos para seleccionar os transformantes que adquiriram o plasmdeo e um gene lacZ, cuja sequncia interrompida pela presena de um inserto, passando o gene a ser no-funcional.

pCR 2.1: 3929 nucleotides Lac gene: 1-545 M13 Reverse priming site: 205-221 Multiple Cloning Site: 234-355 T7 promoter: 362-381 M13 (-20) Forward priming site: 389-404 f1 origin: 546-983 Kanamycin resistance ORF: 1317-2111 Ampicillin resistance ORF: 2129-2989 pUC origin: 3134-3807

Figura 7: Mapa do vector de E. coli pCR 2.1, para clonagem de fragmentos de DNA obtidos por PCR.

TRANSFORMAO

A transformao o tipo mais simples de transferncia de genes: uma clula receptora adquire genes de molculas de DNA solveis no meio. este o procedimento usado em laboratrio para transferir para E. coli o produto de uma reaco de ligao. O processo de transformao, embora ocorrendo nos ambientes naturais, optimizado no laboratrio com a preparao prvia das clulas: a cultura de E. coli a utilizar tratada de forma a ser tornada "competente", tornando-se mais eficiente na aquisio de DNA exgeno.

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Aps a transformao, as clulas so semeadas em placas de meio de cultura com agente selectivo adicionado (um antibitico, normalmente ampicilina ou canamicina, por vezes ambos) e incubadas durante cerca de 18 horas a 37 C. Neste tipo de meio, apenas se iro dividir as clulas que receberam vector. As clulas no transformadas, no tero oportunidade de formar colnias. A diferenciao entre colnias contendo plasmdeo com inserto das que contm plasmdeo sem inserto feita pela cor: branca e azul respectivamente (Fig. 8). A colorao azul resulta da presena do composto X-Gal, que alterado pelo gene LacZ, como se de lactose se tratasse. Por isso, nas colnias em que a presena de inserto interrompe o gene LacZ, no h lugar ao desenvolvimento de cor azul.

Figura 8: Colnias brancas e azuis resultantes do crescimento em meio selectivo de E. coli transformada com um vector com seleco pelo LacZ.

Protocolos Experimentais

Extraco de DNA total bacteriano

Genomic DNA purification kit MBI Fermentas

1.

Inocular meio TSB com uma colnia isolada e incubar a 37 C com agitao, durante 15 a 18 horas (overnight ). Transferir 2 ml de cultura para um microtubo e sedimentar as clulas centrifugando 5 min. velocidade mxima (13 200 rpm). Retirar todo o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 200 l de TE.

2. 3. 4.

Procedimento utilizado para bactrias Gram -. Para bactrias Gram +, adicionar lisozima (25 l de soluo stock a 10 mg/ml; 1 hora a 37C).

5. 6. 7. 8.

Adicionar 400 l de soluo de lise e incubar a 65 C durante 5 min. Adicionar 600 l de clorofrmio e misturar por inverso (3 a 5 vezes). Centrifugar durante 3 min. velocidade mxima. Preparar a soluo de precipitao misturando 720 l de gua desionizada com 80 l de soluo concentrada 10 vezes. Transferir a fase superior aquosa de DNA para outro tubo e adicionar 800 l de soluo de precipitao.

9.

10. Misturar suavemente temperatura ambiente durante 1 a 2 min.

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11. Centrifugar durante 2 min. velocidade mxima (13 200 rpm). 12. Remover o sobrenadante e dissolver o DNA em 100l de soluo de NaCl 1.2 M. 13. Adicionar 2 l de soluo de RNase e incubar a 37 C durante 10 min.

Soluo stock de RNase a 10 mg/ml, previamente fervida.

14. Adicionar 300 l de etanol absoluto, frio (-20 C). 15. Precipitar o DNA a 20 C durante 10 min. 16. Centrifugar durante 3 a 4 min. velocidade mxima. 17. Descartar o etanol. 18. Lavar o sedimento com etanol a 70 %, frio (centrifugar 3 min. velocidade mxima). 19. Desprezar o etanol e secar o DNA sedimentado. 20. Ressuspender o DNA em 100 l de TE.

Digesto de DNA com endonucleases de restrio

Que quantidade de DNA digerir?

O DNA digerido pode ter por destino apenas o registo da imagem do gel (gel analtico) ou pode ser usado para extrair uma banda do gel de agarose (gel preparativo). Em qualquer das situaes necessrio que a(s) banda(s) sejam visveis ao UV aps colorao pelo EtBr. Para este efeito, necessrio que cada banda contenha pelo menos 50 ng de DNA. Exemplo 1: digere um plasmdeo recombinante que inclui 3 kb de vector e 2 kb de inserto; usa uma enzima de cuja aco resultam trs fragmentos: o vector linearizado (3 kb), o extremo 5' do inserto (0.5 kb) e o extremo 3' do inserto (1.5 kb). A menor banda (0,5 kb) representa 1/10 do plasmdeo. Para visualizar esta banda ter que digerir 10 x 50 ng ou seja, 500 ng de DNA (0.5 g). As trs bandas presentes no gel contero 300 ng, 50 ng e 150 ng de DNA, respectivamente. Sero claramente visveis no gel e a banda maior dever ter uma intensidade 6 x superior da banda menor. Exemplo 2: digere o mesmo plasmdeo com uma enzima que efectua apenas um corte. Se digerir 500 ng de DNA obtm uma banda no gel demasiado intensa; o gel estar sobrecarregado. Demasiado DNA pode resultar num

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padro de migrao alterado, tornado difcil calcular as dimenses dos fragmentos.

A. Protocolo tpico:

1. 2.

Marque os microtubos onde vai efectuar as digestes. Em cada microtubo prepare uma reaco do tipo da indicada na tabela I.

Tabela I: Reaco tpica de digesto com enzima de restrio. Volume Tampo 10x ddH2O DNA a digerir Enzima 1 l 6.5 l 2 l 0.5 l

3.

Adicione primeiro o volume de gua, depois o tampo.

ddH 2O: gua bidestilada; conveniente misturar primeiro o tampo e a gua. Se a enzima for colocada directamente em gua, pode desnaturar irreversivelmente.

4. 5.

Dissolva bem o DNA a digerir. Adicione o volume de enzima.

Enzima: 0.5 a 1 l de enzima em geral suficiente; no se deve usar um volume de enzima superior a 10 % do volume final da reaco, j que as preparaes comercias de enzimas de restrio contm glicerol, o qual, em excesso, pode inibir a reaco.

6.

Incubar a 37 C durante 3 a 5 horas.

A maioria das enzimas de restrio tm uma temperatura ptima de 37 C; no entanto, existem enzimas que devem ser incubadas a temperaturas diferentes (25 C, 50 C, etc.); verificar as instrues do fabricante.
B. Precipitao do DNA aps a digesto (opcional)

1. 2. 3.

No final da incubao, adicione 2, 5 volumes de EtOH a 20 C. Misture bem. Coloque o tubo a 20 C durante pelo menos uma hora.

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As digestes podem ser conservadas por perodos longos em EtOH a 20 C.

4.

Centrifugue velocidade mxima durante 10 a 15 minutos para recolher o DNA precipitado. Seque totalmente de modo a eliminar todo o EtOH. Dissolva em TE.

5. 6.

Transferncia por vcuo

Adaptado de Sambrook et al., 1989.

1.

Tratar o gel com soluo despurinizante durante 10 minutos, com agitao suave.

O volume de soluo deve ser suficiente para manter o gel submerso.

2.

Retirar a soluo despurinizante e adicionar aproximadamente o mesmo volume de soluo desnaturalizante. Manter durante 30 minutos com agitao suave. Retirar a soluo anterior e adicionar o mesmo volume de soluo neutralizante. Manter durante 30 minutos com agitao suave. Entretanto cortar uma membrana de nylon cujas dimenses sejam superiores em 1 cm s dimenses do gel. Humedecer a membrana em gua destilada. Colocar a membrana na unidade de transferncia e efectuar a montagem do sistema de acordo com as instrues do fabricante. Colocar suavemente o gel sobre a membrana.

3. 4. 5. 6. 7. 8.

9.

Evitar que se formem bolhas de ar entre o gel e o filtro.

10. Com o auxlio de uma pipeta de vidro, deitar sobre o gel a soluo de transferncia (SSC 20X).

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11. Transferir durante 60 minutos aplicando uma presso de 50 mBar. 12. Retirar todo o lquido; remover o gel e, finalmente, a membrana. 13. Lavar o filtro em SSC 2X durante 5 minutos. 14. Secar e fixar o DNA durante 5 minutos num transiluminador de UV.

Soluo despurinizante: 0.25 N HCl Soluo desnaturalizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M NaOH Soluo neutralizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2; 1 mM EDTA SSC 20x: 3 M NaCl; 0.3 M Citrato de sdio; pH 7.0

Marcao por PCR da sonda de DNA 16S

Durante as reaces de PCR a enzima Taq DNA polimerase tem a capacidade de incorporar DIG-dUTP nas cadeias de DNA que so sintetizadas de novo.

1.

Preparar a reaco de PCR de acordo com a tabela II.

Tabela II: Reaco de marcao por PCR (50 l) Quantidade H2O Tampo de PCR 10X, sem MgCl2 Tampo de PCR 10X, com (NH4)2SO4 MgCl2 PCR DIG Labeling Mix Primer fd1 Primer rd1 DNA molde Taq polimerase 1U/l Varivel 2.5 l 2.5 l 6 l 5 l 1.5 l 1.5 l varivel, 50-100 ng 1 l 1U [ ] final -----0.5 X 0.5 X 3 mM 200 M 0.3 M 0.3 M

PCR DIG Labeling Mix (Roche): 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 1,9 mM dTTP e 0,1 mM DIG-11-dUTP; Primer fd1: 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' ; Primer rd1: 5' AAG GAG GTG ATC CAG CC 3' (Weisburg et al, 1991)

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2.

Aps a reaco de amplificao, carregar 5 l da reaco num gel de agarose, usando marcadores de peso molecular adequados.

Apenas uma banda deve estar presente no gel de agarose aps colorao com EtBr; quantidades mnimas de produtos secundrios podem resultar em sinais inespecficos na reaco de hibridao.

3. 4.

Verificar a qualidade da reaco de amplificao e quantificar o DNA obtido. Caso necessrio, purificar a banda a partir do gel de agarose.

Hibridao e Deteco

Pr-hibridao: O processo de pr-hibridao tem como objectivo bloquear locais de ligao inespecficos na membrana.

1. 2.

Colocar a membrana num tubo de hibridao. Adicionar 20 ml de soluo de hibridao por cada 100 cm2 de filtro.

Soluo de hibridao: SSC 5X; Agente bloqueador 1 %; Sarcosil 0,1 %; SDS 0,02 %.

3.

Manter temperatura de hibridao durante 2 horas.

Hibridao: A temperatura de hibridao estimada com base no tamanho da sonda marcada e da percentagem de homologia esperada entre o DNA do fragmento sonda e o DNA alvo. Geralmente para sondas 100 % homlogas, a hibridao dever decorrer a 6568 C na ausncia de formamida, ou a 42-45C na presena de 50 % de formamida.

4. 5. 6. 7.

Desnaturar a sonda, fervendo durante 10 minutos. Colocar em gelo o tubo contendo a sonda. Desprezar a soluo utilizada na pr-hibridao. Adicionar o mesmo volume de soluo de hibridao na qual foi previamente diluda a sonda marcada. Colocar no forno de hibridao, temperatura de hibridao, durante 14-16 horas.

8.

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9.

Aps a hibridao, retirar a membrana.

A soluo de hibridao pode ser reutilizada; para esse efeito, deve conservar-se a -20C.

10. Lavar a membrana em soluo I, duas vezes, durante 5 min. temperatura ambiente. 11. Lavar a membrana em soluo II, duas vezes, durante 15 min. temperatura de hibridao.

Soluo I: SSC 2 X; SDS 0.1 %. Soluo II: SSC 0.5 X; SDS 0.1 %.

12. Aps a hibridao e lavagens, equilibrar a membrana durante 5 minutos em tampo de cido maleico.

Deteco: A deteco de sequncias homlogas efectuada com o Sistema DIG de Marcao e Deteco No-radioactiva de cidos Nucleicos (Roche).

13. Bloquear a membrana em soluo bloqueadora durante 30 minutos. 14. Diluir o conjugado anti-digoxigenina-fosfatase alcalina (Roche) em soluo bloqueadora (1:5 000). 15. Remover a soluo bloqueadora. 16. Incubar a membrana com a soluo contendo anticorpos, durante 30 minutos. 17. Descartar a soluo de anticorpos. 18. Lavar a membrana duas vezes, durante 15 minutos com tampo de cido maleico.

Estas lavagens permitem remover o anticorpo no ligado.

19. Equilibrar a membrana em tampo de deteco durante 5 minutos. 20. Entretanto, preparar a soluo corante adicionando 200 l de soluo concentrada de NBT/BCIP (Roche) a 10 ml de tampo de deteco. 21. Incubar a membrana com soluo corante, na ausncia de luz. 22. Observar periodicamente para verificar o desenvolvimento das bandas. 23. Parar a reaco lavando a membrana com gua ou TE, quando o desenvolvimento do sinal for satisfatrio.

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Tampo de cido maleico: cido maleico 0.1 M; NaCl 0.15 M; pH 7.5 Soluo bloqueadora: 1% de Agente bloqueador (Roche) em Tampo de cido maleico Tampo de deteco: Tris-HCl 0.1 M; NaCl 0.1 M; MgCl2 50 mM; pH 9.5

Preparao de DNA em blocos de agarose

Adaptado de Gautom, 1997.

1. 2.

Crescer a estirpe em meio TSB a 30 C, com agitao. Determinar a DO da cultura, e calcular o volume a utilizar de modo a usar na preparao dos blocos 5 x 108 clulas/ml de agarose (considerar que no caso de bastonetes 1 DO = 8 x 108 clulas). Sedimentar as clulas por centrifugao. Lavar em 1/10 de TE. Ressuspender em 500 l de TE. Adicionar um volume de agarose de baixo ponto de fuso (preparada a 1 % em TE), previamente aquecida a 42 C. Misturar e distribuir imediatamente por moldes. Deixar solidificar a 4 C. Colocar os blocos de agarose em 10 volumes de soluo de lise. Incubar durante 24 horas a 37 C. Descartar a soluo de lise e adicionar 10 volumes de soluo EPS. Manter a 50 C durante 24 horas. Incubar os blocos em TE 2 x 1 hora, com agitao suave. Conservar os blocos em 20 mM Tris-HCl pH 8.0; 50 mM EDTA, a 4 C.

3.

4.

5. 6. 7.

8. 9.

Soluo de lise: Lisozima 1 mg/ml; Tris-HCl pH 7.2, 10 mM; NaCl 50 mM; EDTA 100 mM; Deoxicolato sdico 0.2 %; Sarcosil 0.5 % Soluo EPS: EDTA, pH 8.0, 100 mM; Sarcosil 1 %; Proteinase K 50 g/ml TE: Tris-HCl 10 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM

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Digesto de DNA embebido em agarose

Utilizam-se enzimas de restrio que reconhecem sequncias pouco frequentes, de modo a obter fragmentos de DNA de grande tamanho. Na preparao das reaces de hidrlise devem ser tomadas precaues de forma a evitar a quebra do DNA embebido em agarose.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Colocar o bloco a digerir em TE, durante 2 horas a 4 C. Retirar o TE e adicionar 1 ml de tampo de digesto; manter 2 horas a 4 C. Renovar o tampo de digesto at um volume final de cerca de 100 l. Adicionar 10 a 25 U de enzima. Manter 12 a 16 horas a 4 C. Incubar temperatura recomendada para cada enzima durante 3 horas. Retirar o tampo e adicionar 500 l de TE. Lavar durante 1 hora, temperatura ambiente, com agitao. Carregar o bloco tratado no gel ou renovar o TE e conservar a 4 C

Electroforese em campo pulsado

1. 2. Preparar o gel TBE 0.5 X e com uma concentrao de agarose de 1%. Ajuste a temperatura do sistema de arrefecimento do aparelho para uma temperatura entre os 10 e os 14 C. Carregue os blocos de agarose digeridos nos poos do gel, com o gel fora da tina. Selar os poos com agarose de baixo ponto de fuso. Coloque o gel na tina e ajuste as condies de electroforese. Verifique a temperatura do tampo e a sua circulao na tina. Inicie a corrida.

3. 4. 5. 6. 7.

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BOX-PCR
1. Preparar a reaco de amplificao de acordo com a tabela III:

Tabela III: Reaco para BOX-PCR (50 l) Volume H2O 10x PCR buffer sem MgCl2 10x PCR buffer com (NH4)2SO4 MgCl2 dNTPs Primer BOX A1R * DNA molde Taq polimerase 1 U/l
(Versalovic et al, 1994)

[ ] final

varivel 2.5 l 2.5 l 6 l 5 l 2 l varivel (50-100 ng) 1 l 1U 0.5 x 0.5 x 3 mM 200 M 0.4 M

* Primer BOX A1R - 5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3'

2.

Proceder amplificao por PCR.

Perfil de temperatura para a amplificao:

desnaturao inicial de 7 min. a 95 C; 30 ciclos: desnaturao a 94 C, 1 min.; annealing a 53 C, 1 min.; extenso a 65 C, 8 min; extenso final de 16 min. a 65 C. No final, manter os tubos a 4 C.

3.

Observar uma alquota de cada reaco de PCR num gel de agarose a 1% em TAE 1X.

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Ligao de produtos de PCR a vector

1. Num microtubo preparar a reaco de ligao, segundo a composio indicada na tabela IV.

Tabela IV: Reaco de ligao de produtos de PCR. Quantidade Vector pCR 2.1 (25 ng/l) Produto de PCR Tampo de ligase 10x Ligase do fago T4 dH2O estril 2. 3. 2 l 0.5 a 1 l 1 l 4U at volume final de 10 l

Incubar a reaco a 14 C durante 12 a 16 horas. A reaco pode ser imediatamente utilizada ou armazenada a -20 C.

Transformao
1. 2. Descongelar em gelo uma alquota (50-200 l) de clulas competentes de E. coli. Adicionar 2-10 l da reaco de ligao s clulas competentes misturando suavemente. Manter em gelo por 30 minutos. Submeter as clulas a um choque trmico durante 30 segundos a 42 C. Colocar novamente em gelo durante 2 minutos. Adicionar 250 l de meio SOC. Incubar durante 1 hora a 37 C e com agitao. Semear 10-200 l da transformao em placas de meio LA suplementado com o antibitico adequado, e quando necessrio X-Gal e IPTG. Incubar as placas a 37 C durante 15 a 18 horas.

3. 4. 5. 6. 7. 8.

9.

10. Com palitos estreis, replicar clones positivos para uma nova placa. 11. Proceder a caracterizao do DNA plasmdico dos transformantes.

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X-Gal: soluo stock preparada a 20 mg/ml em dimetil-formamida; usar a 40 g/ml IPTG: soluo stock preparada a 100 mM, em gua; usar a 0.05 mM

Extraco de DNA plasmdico

1. Inocular uma colnia com um palito estril em 1.5 ml de meio LB, suplementado com o antibitico adequado. Incubar a 37 C durante 15 a 18 horas, com agitao. Sedimentar as clulas por centrifugao, a 14 000 rpm, durante 5 minutos. Ressuspender em 350 l de STET. Adicionar 10 l de soluo de lisozima.

2. 3. 4. 5.

Soluo de lisozima preparada a 10 mg/ml

6. 7. 8. 9.

Deixar a lisozima actuar 1 minuto. Colocar o microtubo em gua a ferver durante 45 segundos. Centrifugar 5 minutos a 14 000 rpm. Retirar o sedimento com um palito estril.

O sedimento constitudo por resduos celulares e DNA cromossmico.

10. Adicionar 1 volume de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sdio 3 M, pH 5.2. 11. Misturar e manter temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar o DNA plasmdico. 12. Centrifugar a 14 000 rpm, 5 minutos. 13. Lavar o precipitado com etanol a 70 %. 14. Ressuspender em 30 l de TE.

STET: 0.1 M NaCl; 5 % Triton X-100; 10 mM Tris-Hcl, pH 8.0; 1 mM EDTA TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA

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Preparao de um gel de agarose

Para um gel a 0.7 % com um volume de 100 ml

1. 2. 3.

Pesar 0.7 g de agarose (Fig. 9-A). Com uma proveta (Fig. 9-B), medir 100 ml de tampo (TAE ou TBE). Num Erlenmeyer misturar a agarose e o tampo (Fig. 9-C).

Figura 9: A - Pesagem da agarose. B - Medio do volume apropriado do tampo. C - A agarose no solubiliza no tampo, formando uma soluo turva.

4. 5.

Ferver num forno de micro-ondas at clarear a soluo (Fig. 10-A). Entretanto, efectuar a montagem da plataforma do gel e do respectivo pente (Fig 10B).

Figura 10: A - Uso do micro-ondas para solubilizar a agarose; B- Preparao da plataforma para o gel, com o respectivo pente.

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6. 7. 8. 9.

Esperar que a temperatura da agarose baixe at cerca de 50 C. Verter a agarose na plataforma (Fig. 11-A). Deixar solidificar temperatura ambiente. Colocar o gel na tina, submergido em tampo.

Figura 11: A- Vertendo a agarose na plataforma; B - O pente retirado com o gel j submerso em tampo, dentro da tina (C).

10. Retirar o pente (Fig 11-B, C). 11. Adicionar tampo de carga s amostras (Fig. 12-A). 12. Carregar o gel, uma amostra em cada poo. (Fig 12-B).

Figura 12: A - Adio do tampo de carga, normalmente contendo corantes azuis; B - Carregando uma amostra.
13. Ligar a tina fonte, tendo em ateno a polaridade correcta. 14. Ajustar a voltagem e iniciar a corrida.

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15. Seguir a evoluo da corrida atravs da migrao dos corantes presentes no tampo de carga. 16. Terminada a electroforese, retirar o gel. 17. Corar com EtBr (5 g/ml) durante cerca de 15 minutos. 18. Observar num transiluminador de UV. 19. Registar os resultados, fotograficamente ou com um sistema de anlise de imagem.

TAE: 40 mM Tris-HCl; 5 mM acetato de sdio; 2 mM EDTA; pH 8.0 TBE: 90 mM Tris-HCl; 90 mM cido brico; 2 mM EDTA; pH 8.3 Tampo de carga (6X): 0.02 % azul de bromofenol; 0.02 % xileno cianol; 60 % sacarose; 0.025 M EDTA EtBr: Brometo de etdeo. Soluo stock a 500 g/ml, em gua.

Referncias
Gautom R.K. 1997. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia coli O157:H7 and other gram-negative organisms in 1 day. Journal of Clinical Microbiology 35:29772980. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning - a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Versalovic J.,Schneider M.,de Bruijn F.J., Lupski J.R. 1994. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in Molecular and Cellular Biology 5:25-40. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lupski J.R. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173:697-703.

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