INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN

"EFECTO DEL ESTRS AGUDO POR RESTRICCIN DE

MOVIMIENTO EN LA PRODUCCIN DE IgA Y EN EL NUMERO DE LINFOCITOS T Y B DEL NALT DE RATONES Balb/c

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD REA: INMUNOLOGA PRESENTA:

M. C. y P. HAYDE IRAIS LEN CHVEZ

DIRECTORES DE TESIS

DR. SAL ROJAS HERNNDEZ M. EN C. MARYCARMEN GODNEZ VICTORIA

MXICO, D. F.

DICIEMBRE 2009

El presente trabajo se realizo en el laboratorio de Inmunologa de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politcnico Nacional, con apoyo de la CGPI con beca institucional de escolaridad durante el periodo de Enero/2008 a Diciembre/2009.

DEDICATORIA
A DIOS: POR QUE ES QUIEN ME PERMITIO ESTE LOGRO POR QUE ES EL AMIGO MS FIEL POR QUE AL VOLVER A L SE ENCUENTRA NUEVAMENTE LA FUERZA, LA SERENIDAD Y LA TRANQUILIDAD PARA ACEPTAR LAS SITUACIONES Y POR QUE NOS PERMITE DARNOS CUENTA QUE TODOS LOS SERES HUMANOS TENEMOS IGUALDAD Y QUE ESTAMOS EN ESTE MUNDO PARA COMPARTIR. A MI MAMA POR EL DON DE LA VIDA ERES POR QUIEN SOY LO QUE SOY, SIN TI ESTO NO ESTARA ESCRITO AS DE SIMPLE, ERES EL EJEMPLO DE BONDAD E INOCENCIA Y POR QUE EL ENSEARME A SER TOLERANTE Y PERSEVERANTE HA PERMITIDO QUE ESTO SE LOGRE A MI PAPA POR DARME LA VIDA POR QUE NO HAY FUERZA SIN TI POR QUE LOS MUROS NO ME PARECEN GRANDES SI TE ESCUCHO HABLAR POR QUE ME ENSEASTE A LUCHAR HASTA QUE MS NO SE PUEDA Y POR QUE FORJASTE MI PERSONALIDAD DANDO VALOR ASTUCIA PERO SOBRE TODO SENCILLEZ Y HUMILDAD A MI HERMANO POR QUE ME MOTIVAS ME ELEVAS EL NIMO ME ALEGRAS LOS DAS POR QUE ME HACES MS FUERTE POR QUE A PESAR DE TODO SIEMPRE ESTAS A MI LADO Y POR COMPARTIR MI SANGRE EN TODA LA EXPRESIN DE LA PALABRA A EDER POR EXISTIR POR APARECER EN MI CAMINO POR EL APOYO RECIBIDO, POR MOTIVAR MIS DAS CON TANTO AMOR Y ALEGRIA HACIENDO FELICES MIS DIAS POR QUE ME HAS ENSEADO QUE EL QUE PERSEVERA ALCANZA, POR RECORDARME DIA A DIA LA CAPACIDAD QUE TENGO, POR HACERME SENTIR PRESENTE EN LA MENTE SE POR ESTAS PERSONAS QUE NUNCA ESTOY SOLA Y QUE NO LO ESTAR POR QUE SON QUIENES ME LEVANTAN EN LOS TROPIEZOS POR QUE SON QUIENES CONFIAN EN MI Y POR QUE SON LOS QUE ME MOTIVAN Y ME LLEVAN ADELANTE SIEMPRE Y A PESAR DE TODO

AGRADECIMIENTOS
DR SAUL: POR TODA LA CONFIANZA BRINDADA, POR EL APOYO RECIBIDO, LA TOLERANCIA, POR PERMITIRME LA REALIZACION DE LA MAESTRIA, POR SU BUEN SENTIDO DEL HUMOR Y POR SU AMISTAD MARICARMEN: POR TODO EL APOYO Y ATENCION RECIBIDA POR HACERME SENTIR PRESENTE, PORENSEARMELAPARTEAGRADABLEDELAMAESTRIAYPORSUAMISTAD DRA CAMPOS: POR EL APOYO BRINDADO, POR LAS ENSEANZAS POR HACERME SENTIR PRESENTEYPORTODASLASGRANDESIDEASQUESURGENDESUGRANCEREBRO DR.ALDO:PORSUSENSEANZAS,TOLERANCIAYELTIEMPODEDICADO DR.LARA:PORSUTIEMPO,DEDICACINENTREGAYSENTIDODELARESPONSABILIDAD DRANORMA:PORSUTIEMPOYDEDICACION DRA.JARILLO:PORSUGRANDEDICACIONYTOLERANCIAPACIENCIAYPORSUSCONSEJOS DRAMAELENA:PORELTIEMPOCOMPARTIDOYDEDICADOAQUETODOESTOSEPUEDALOGRAR PORSUTENACIDAD

A DAVID POR ENSEARME A GIRAR HACIA EL OTRO LADO AGRADABLE DE LA MEDICINA, SU APOYOYSUSCONSEJOS A MIS PRIMOS: JAVI, KANDIEE Y GIS POR SU AMISTAD APOYO Y LA PARTICIPACIN PARA QUE ESTOSELLEVEACABO AMISAMIGOS: JESSY,PORMOTIVARMELAREALIZACINDELAMAESTRA AKARLAPORACOMPAARMEENESTELOGROYPORQUEENVERDADESTOSINOSERAPOSIBLE SI NO CONTARA CON TU COMPAA POR QUE HACES LOS DAS AGRADABLES, POR LA GRAN AMISTADQUEMEBRINDASYPORTODOELAPOYOENTODOMOMENTO A ERIKA POR COMPARTIR UNA VEZ MAS OTRO PASITO POR TODO SU APOYO, SU COMPAA Y PORLAFUERTEAMISTADBRINDADAENVERDADQUEHACESMEJORLOSDAS A ELVA POR LOS MOMENTOS COMPARTIDOS, PORQUE ME ENSEASTE QUE AN EN LA ADVERSIDADSEPUEDESALIRADELANTEYPORLALINDAAMISTADQUEMEBRINDAS AANTONIOPORALEGRARLOSDASDETRABAJO,PORLOSCONSEJOS,PORELAPOYOYLAGRAN AMISTADQUEENCONTRENTI AMARCOPORSUAPOYO,SUSCONSEJOSYESTARPENDIENTESIEMPRE,PORLALOCAAMISTAD JESSPORTODOELGRANAPOYOLACOMPAAYLOSMOMENTOSCOMPARTIDOS MANUEL, POR APARECER EN EL MOMENTO JUSTO POR ENSEARME UNA PARTE LINDA DE LA VIDA. Y A TODOS MIS AMIGOS QUE ME ACOMPAARON EN ESTA PARTE DE LA FORMACIN ALEGRANDOLOSDASYAPOYANDOMECONSUAMISTAD

 ALSR.JOSELUIS:PORFACILITARNOSELTRABAJOPORSUTIEMPO,EMPEOYPORSUENTREGAEN ELTRABAJO ALDRLIRA:PORQUETODOESTOSEPUDOLLEVARACABOPORSUPACIENCIATOLERANCIAPERO SOBRETODOPORSUSENTIDODECORDURAPORSUAPOYO,CONFIANZAYCONSEJOS LILIANA/OSIRIS: POR EL APOYO QUE ME DIERON POR SU AMISTAD Y POR LA GRAN AYUDA QUE MEBRINDARON TERESITA:PORSUDEDICACINSUORDENYSUBUENHUMOR DRKORMANOVSKY:PORSUAPOYO,ATENCINYTIEMPOBRINDADOS JAVIER/RUTH: POR SU AMISTAD, ENTREGA EN EL TRABAJO POR SU DISCIPLINA Y POR TODA LA AYUDAFACILITANDOASESTELOGRO ARACELI:PORSUTIEMPO,AYUDAYAMISTAD DRA.ELVIA:PORLAAYUDARECIBIDA,SUTIEMPOYDEDICACINYPORSUPERSEVERANCIA CECI:PORTRABAJARCONAMORALOQUESEHACEYPORLAAMISTADBRINDADA DR. ZEPEDA: POR SU AMISTAD Y POR SU PERSEVERANCIA EN EL RECONOCIMIENTO DE ESTA MAESTRA AGRADECERAQUIENLOMERECEESLOJUSTOPERONUNCAESSUFICIENTE.SINEMBARGOMIL GRACIAS

NDICE

1. INTRODUCCIN Estrs Relacin del sistema inmune con el sistema neuroendcrino Sistema inmune de mucosas Tejido linfoide asociado a nariz 2. PLANTEAMIENTO PROBLEMA 3. JUSTIFICACIN 4. HIPTESIS 5. OBJETIVOS 6. MATERIAL Y MTODOS 7. RESULTADOS 8. DISCUSIN 9. CONCLUSIONES 10. PERSPECTIVAS 11. BIBLIOGRAFIA

1 1 7 19 22 27 28 29 30 31 39 44 48 49 50

RESMEN

El estrs se ha convertido en un problema de salud pblica; se trata de un proceso fisicoqumico y emocional inductor de una tensin que favorece la liberacin de citocinas, hormonas, neurotransmisores y cortisol, dando como resultado alteraciones conductuales e inmunolgicas mediante las que se prepara para hacer frente a las posibles demandas que se generan como consecuencia del agente estresor, que ponen en riesgo la integridad de los individuos. Sin embargo las alteraciones causadas por el estrs en la secrecin de IgA y la composicin celular en NALT an no han sido estudiadas.

El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) en roedores, se ha relacionado con estructura bilaterales que se encuentran dorsalmente en el piso de la cavidad nasal, consta de un encapsulado de clulas linfoides que contiene un epitelio que semeja la cubierta de las clulas M en el intestino y es considerado como un sitio inductor y secretor de anticuerpos como la IgA secretora. La IgA juega un importante papel en la repuesta inmune del hospedero como primera lnea de defensa, comprende mecanismos de defensa bioqumicos y celulares preparados para responder con rapidez ante organismos patgenos.

En el presente estudio se determin el efecto del estrs agudo inducido por la restriccin de movimiento, sobre la produccin de los niveles de IgA en lavados nasales y las poblaciones celulares de linfocitos T y B en tejido linfoide asociado a nariz de ratones Balb/c; como control del efecto del estrs a nivel sistmico, se determinaron niveles de IgA en suero, poblaciones linfoides en bazo. Se determin corticoesterona en suero para corroborar que se

II

indujo estrs con el modelo de restriccin utilizado y para demostrar la asociacin del estrs con el sistema inmunolgico. Se utilizaron ratones sanos como control negativo. Los ratones sometidos a la restriccin de movimiento aumentaron los niveles de corticoesterona en comparacin con los ratones control, lo que valida el modelo utilizado. Se encontr un aumento significativo en la produccin de IgA en suero y lavados nasales En bazo, se observ un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos T CD4+, lo cual confirma la relacin psico-neuro-endocrino-inmunolgica, a nivel sistmico. En el NALT, se observ una disminucin de linfocitos T CD4+ y de clulas B CD19+ y B220+/CD19+, lo cual demuestra que el estrs tambin juega un papel importante en la integridad del sistema inmunolgico en las mucosas y tambin explica su relacin con la mayor prevalencia de enfermedades infecciosas en personas sometidas a este tipo de estrs.

III

ABSTRACT

Stress, which has become a public health problem, is an emotional and physical-chemical process inducing a tension that favors the release of cytokines, hormones, neurotransmitters and cortisol. As a result of meeting the possible demands that are generated as a result of the stressor agent, behavioral abnormalities and immunological alterations threaten the integrity of individuals. The effects of acute stress on the cellular composition and secretion of IgA in NALT has not yet been described.

The nose-associated lymphoid tissue (NALT) in rodents has been associated with bilateral structures that are found dorsally in the floor of the nasal cavity, consists of a package of lymphoid cells containing a cover resembling epithelial M cells in the intestine, and is considered an inductor and secretory site of antibodies such as secretory IgA. The latter antibody plays an important role in host immune response as a first line of defense, including biochemical and cellular defense mechanisms capable of responding rapidly to pathogens.

In the present study, acute stress was induced by the restriction of movement, and its effect was evaluated in relation to the levels of IgA in nasal washes and cell populations of T and B lymphocytes in associated nose-associated lymphoid tissue of Balb/c mice. As a control for the effect of stress at the systemic level, IgA levels were determined in serum and spleen lymphoid populations.

IV

Serum corticosterone levels were determined to confirm that stress was induced with the model of restraint used and to demonstrate the association of stress to the immune system. Healthy mice were used as a negative control.

Corticosterone levels increased in restraint stress compared to healthy mice, thus validating the model. Significative increase was found in the levels of serum IgA and IgA nasales washings. In the spleen, there was an increase in the percentage of CD4+ T lymphocytes, confirming the psycho-neuro-endocrine-immune relationship at the systemic level. In the NALT, a decrease was observed in CD4+ T cells, CD19+ B cells, and the B220+/CD19+ relation, demonstrating the important role that stress plays in the integrity of the mucosal immune system, as well as its relationship to an increased prevalence of infectious diseases.

INTRODUCCIN

I. Estrs

Desde 1935, Hans Selye, considerado padre del estrs, introdujo el concepto de estrs como sndrome o conjunto de reacciones fisiolgicas no especificas del organismo, a diferentes agentes nocivos del ambiente, de naturaleza fsica o qumica.1

El estrs es una reaccin normal de la vida en cualquier edad, producido por el instinto del organismo de protegerse de las presiones fsicas o emocionales o, en situaciones extremas, del peligro, alternativamente para precisar conceptos, se utiliza el trmino "respuesta de estrs" al referirse a la respuesta inespecfica del organismo a cualquier demanda, y el trmino de "estresor" o "situacin estresante" referida al estmulo o situacin que provoca una respuesta de estrs.2

Es un proceso fisicoqumico y emocional inductor de una tensin, que favorece la liberacin de citocinas proinflamatorias, la hormona liberadora de corticotrofina (CRH) y el cortisol, as como de un amplio grupo de neurotransmisores que inducen en su conjunto, la aparicin de alteraciones conductuales.

La respuesta de estrs es una respuesta automtica del organismo a cualquier cambio ambiental, externo o interno, mediante la cual se prepara para hacer frente a las posibles demandas que se generan como consecuencia de la nueva situacin, la respuesta ante el estrs fsico o psicolgico que el organismo elabora es equivalente.3

Los estmulos estresantes agudos tienen efectos que pueden considerarse como veniales. Sin embargo cuando estos se mantienen por un periodo prolongado se vuelven nocivos y generan la aparicin de alteraciones indeseables. Por tanto, ello no es algo "malo" en s mismo, al contrario; facilita el disponer de recursos para enfrentarse a situaciones que se suponen excepcionales.4

Clasificacin Dependiendo el autor y con base a la duracin del estresor, el estrs se puede dividir en estrs agudo, agudo episdico y crnico.

Estrs Agudo: El estrs agudo es la forma de estrs ms comn. Proviene de las demandas y las presiones del pasado inmediato y se anticipa a las demandas y presiones del prximo futuro. Los estmulos estresantes agudos tienen efectos que pueden considerarse como veniales. Un elevado nivel de estrs agudo puede producir molestias psicolgicas.

El estrs agudo puede aparecer en cualquier momento de la vida de todo el mundo. Es breve y no tiene tiempo suficiente para producir las grandes lesiones. Puede consistir en:

Desequilibrio emocional: una combinacin de ira o irritabilidad, ansiedad y depresin. Problemas musculares: el dolor, tensiones musculares, contracturas y lesiones en tendones y ligamento.

Problemas digestivos: en estmago o en intestino, acidez, flatulencia, diarrea, estreimiento y sndrome del intestino irritable.

Manifestaciones generales transitorias: elevacin de la presin arterial, taquicardia, sudoracin, palpitaciones cardacas, mareos, migraas, hipotermia, dificultad respiratoria y dolor torcico.

Estrs Agudo Episdico: Es la presencia de un estrs agudo frecuente, personas con demasiado trabajo, compromisos y cosas por hacer, o personas que tienen preocupaciones excesivas, que se preocupan por casi todo y tienen una vida catica, existen individuos que padecen de estrs agudo con frecuencia, estn inmersos en la crisis y en el caos. Con frecuencia, los que padecen estrs agudo reaccionan de forma descontrolada, muy emocional, estn irritables, ansiosos y tensos. A menudo se describen a s mismos como personas que tienen "mucha energa nerviosa". Siempre tienen prisa, tienden a ser bruscos y a veces su irritabilidad se convierte en hostilidad. Las relaciones interpersonales se deterioran rpidamente cuando los dems reaccionan con hostilidad real.5

Estrs crnico: Estrs crnico es cuando la accin de respuesta y el estimulo estresor que el sujeto enfrenta se prolonga en el tiempo y con una sensacin de amenaza que es constante, ocasiona agotamiento de la respuesta del sistema nervioso, este agotamiento puede debilitar al sistema inmunolgico siendo ms vulnerable a las enfermedades (inmunolgicas, crnico degenerativas y transtornos psicolgicos). Es el estrs agotador destruye al cuerpo, la mente. Hace estragos mediante el desgaste a largo plazo, por exigencias y presiones implacables.5,6

En caso de estrs, el organismo inicia una respuesta adaptativa ante los estmulos estresantes que consiste en una elevacin de los niveles circulantes de citocinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNF-), interleucina (IL)-6 e IL-1, al alcanzar una concentracin de 10nM, estas citocinas proinflamatorias son capaces de unirse a sus receptores y estimular al sistema nervioso central (SNC).

El cerebro tiene receptores para estas molculas distribuidos en diferentes regiones anatmicas, aunque la mayora se localizan en el hipocampo. Adems de que se ha identificado que en el cerebro hay una gran variedad de receptores de citocinas, ste tiene la capacidad de sintetizar y secretar in situ una amplia gama de citocinas, lo que lo convierte en un rgano susceptible de ser estimulado tanto por las citocinas sistmicas como las producidas in situ.

Las citocinas se unen a sus receptores en el cerebro e inducen la generacin de los siguientes procesos: 1) neuroinmunolgicos, que activan la liberacin de citocinas en el cerebro mismo; 2) neuroqumicos, que empiezan con la liberacin de neurotransmisores, como la norepinefrina y la serotonina; 3)neuroendocrinos, que se inician con la secrecin de la CRH, la cual activa el eje hipotlamo-hipfisis adrenales (HHA), lo que a su vez induce la liberacin de cortisol y andrgenos anablicos, como la dehidroepiandrosterona (DHEA), los cuales en su conjunto llevan a 4) cambios conductuales denominados conducta de enfermedad.

Tanto el cortisol como la dehidroepiandrosterona (DHEA) tienen receptores especficos en casi todas las clulas del organismo, como linfocitos T los cuales son altamente susceptibles a las variaciones de los niveles circulatorios del cortisol y de la dehidroepiandrosterona (DHEA). El cortisol acta como inmunoestimulante a concentraciones bajas durante lapsos cortos, estimulando una subpoblacin especfica de linfocitos T cooperadores tipo 2 (TH2), que participan en una respuesta inmunolgica de tipo humoral principalmente mediada por anticuerpos.

La dehidroepiandrosterona (DHEA) estimula de forma positiva las clulas T que pertenecen a una subpoblacin linfocitaria denominada linfocitos cooperadores tipo 1(TH1), que favorecen una respuesta inmunolgica de tipo celular. La diferencia entre las subpoblaciones TH1 y TH2 radica en el perfil de citocinas secretadas por cada una de ellas. Las clulas TH1 secretan citocinas proinflamatorias como la IL-1, TNF- e IL-6 en tanto que las TH2 secretan citocinas antiinflamatorias como la IL-4, IL-10 e IL-13.

El cortisol tiene una alta densidad de receptores en el cerebro ubicados principalmente en el hipocampo, mismos que son sensibles a las variaciones de los niveles en circulacin de este glucocorticoide. En condiciones normales, al desaparecer el estmulo estresante disminuye la produccin de citocinas proinflamatorias y el cortisol lleva de nuevo, a travs de sus receptores especficos, las interacciones neuroendocrinoinmunolgicas a su estado basal.7

Fisiopatologa del estrs Se identifican las siguientes fases en el modo de produccin del estrs: 1) Reaccin de Alarma: El organismo, amenazado por diferentes circunstancias, se altera fisiolgicamente por la activacin de una serie de glndulas, especialmente el hipotlamo y la hipfisis, y por las glndulas suprarrenales. El hipotlamo tras su activacin, produce factores liberadores que actan como mensajeros. Una de estas sustancias es la hormona denominada Hormona corticotrfica adrenal (ACTH por sus siglas en ingls Adrenal Cortico Trophic Hormone) que viaja por el torrente sanguneo hasta la corteza de la glndula suprarrenal, quien bajo el influjo de tal mensaje produce la cortisona u otras hormonas llamadas corticoides. A su vez otro mensaje que viaja por la va nerviosa desde el hipotlamo hasta la mdula suprarrenal, activa la secrecin de adrenalina. Estas hormonas son las responsables de las reacciones orgnicas en toda la economa corporal.

2) Estado de Resistencia: Cuando un individuo es sometido en forma prolongada a la amenaza de agentes lesivos fsicos, qumicos, biolgicos o sociales el organismo prosigue su adaptacin a dichas demandas de manera progresiva, pero puede ocurrir que disminuyan sus capacidades de respuesta debido a la fatiga que se produce en las glndulas del estrs. Durante esta fase suele ocurrir un equilibrio dinmico u homeostasis entre el medio ambiente interno y externo del individuo. De esta manera, si el organismo tiene la capacidad para resistir mucho tiempo, no hay problema alguno, en caso contrario sin duda avanzar a la fase siguiente.

3) Fase de Agotamiento: La disminucin progresiva del organismo frente a una situacin de estrs prolongado conduce a un estado de gran deterioro fsico con prdida importante de las capacidades fisiolgicas, en la cual el sujeto suele sucumbir ante las demandas pues se reducen al mnimo sus capacidades de adaptacin e interrelacin con el medio.5

La relacin del estrs con el sistema inmune

A fines de 1950 y principios de 1960, experimentos con animales concluyeron que el estrs podra afectar la inmunidad humoral y celular. Rasmussen, Marsh y Brill encontraron que ratones expuestos a estrs fueron ms susceptibles a contraer infeccin por el virus del herpes simple. Por otra parte Wistar y Haldemann encontraron que el estrs prolong la retencin de autoinjertos. La primera evidencia experimental directa de los efectos de estrs en la inmunidad fue el trabajo de Vessey y por Solomon (1960), en roedores donde demostraron que la reduccin de los niveles de anticuerpo favorece la accin de un antgeno, como resultado de la tensin.8 7

Aproximadamente por el mismo tiempo, Solomon, Levine, y Kraft demostraron que las experiencias en los primeros aos de vida podran afectar la respuesta mediada por anticuerpos en la vida adulta.

El rea ms extensa de anormalidades inmunolgicas que ocurren junto con las enfermedades mentales empez con el trabajo de Solomon y Fessel sobre los niveles anormales de inmunoglobulinas y la reaccin de los anticuerpos en el cerebro en algunos pacientes con esquizofrenia. Investigaciones, de Korneva y Khai, en Leningrado, en 1963, informaron que lesiones electrolticas destructivas en el hipotlamo dorsal de conejos, llevaban a la supresin de la fijacin del complemento al anticuerpo y la retencin prolongada de antgenos en la sangre. As, demostraban que el cerebro estaba envuelto en inmunoregulacin, un tema sobre el que se especulaba en el trabajo de Solomon y Moos de 1964. Se publicaron varios trabajos en los aos 1960 y 1970 por el inmunlogo yugoslavo B. D. Jankovic; l seal, por ejemplo, las similitudes del antgeno entre cerebro y protenas inmunolgicas. Sin embargo el trabajo ms crtico para establecer la credibilidad e importancia de la comunicacin cerebroinmunidad, fue el de Robert Ader y Nicholas Cohen en 1975 sobre que el sabor aversivo condicion la inmunosupresin. Encontr que si un estmulo condicionado (la sacarina) poda producir la inmunosupresin de un estmulo no condicionado (la droga ciclofosfamida), concluyo entonces que el cerebro presentaba un aprendizaje que deba relacionarse con las respuestas inmunolgicas.9

Como consecuencia, Ader y Cohen descubrieron que existe una respuesta a placebo que permite utilizarlo para prolongar la vida de ratones con una enfermedad autoinmune, el lupus, con el tratamiento con sacarina principalmente.10

Desde hace aproximadamente 20 aos existen evidencias experimentales y clnicas que han demostrado la existencia de una comunicacin constante y bidireccional entre el sistema neuroendcrino y la respuesta inmunolgica (interacciones neuroendocrinoinmunolgicas), que nos permiten mantener la homeostasis ante los estmulos estresantes, de tipo sistmicolesiones tisulares, infecciones- como de tipo psicolgico, secundarios a la percepcin y procesamiento del estmulo por cada individuo.9

II. Psiconeuroinmunomodulacin

En la actualidad es claro que los sistemas inmune y neuroendocrino comparten muchos receptores, citocinas, hormonas peptdicas y neurotransmisores, por lo tanto las interacciones entre los sistemas inmune y neuroendocrino son bidireccionales, esto por inervacin directa de compartimientos linfoides (paracrina) por liberacin de mediadores por nervios situados en la cercana a las cels del sistema inmune (o viceversa) de forma endocrina por accin de hormonas y citocinas.11

Se ha atribuido al sistema inmune la funcin de defensa frente a la lesin por agentes extraos (infecciosos, fsicos, qumicos, e incluso clulas propias que han sufrido transformacin). Sin embargo, errneamente suele no considerarse al sistema neuroendocrino como protagonista de los mecanismos de defensa. 9

El estudio de la inmunologa requiere pues, considerar la funcin del sistema inmune dentro del amplio contexto de la fisiologa humana, fundamentalmente de la neuroendocrinologa.

Tras una lesin tisular, el organismo lleva a cabo una serie de reacciones complejas (Inflamacin): 1. Aislamiento e inactivacin de agentes causales 2. Prevencin del dao tisular 3. Activacin de los mecanismos de reparacin necesarios para retomar la normalidad

Las reacciones inmediatas que se llevan a cabo despus de la lesin, constituyen la respuesta de fase aguda, que es una reaccin sistmica con 5 componentes relacionados: A. Neurolgico B. Endcrino C. Metablico D. Cardiovascular E. Conductual

La respuesta de fase aguda se considera como una reaccin neuroinmunoendocrina, gran parte de los efectos conductuales y cardiovasculares son resultado de cambios neuroendcrinos por citocinas producidas en el foco inflamatorio. 10

Sistema de estrs.

Constituido por el eje hipotlamo-hipfisis-adrenal (HHA) y el sistema simptico sistmico, cada uno tiene componentes centrales de regulacin, localizados en el hipotlamo y el tronco enceflico, respectivamente. Los componentes del sistema de estrs son:

1) Las neuronas parvocelulares del ncleo paraventricular secretoras de hormona liberadora de corticotropina (CRH) y argininavasopresina (AVP), que ejercen sus acciones a travs de la hipfisis anterior y la corteza suprarrenal.

2) Las neuronas adrenrgicas centrales localizadas en el locus ceruleus, que actan a travs del sistema simptico sistmico y la mdula suprarrenal.

Las neuronas parvocelulares productoras de CRH y las neuronas noradrenrgicas centrales estn conectadas entre s. As, las neuronas productoras de CRH estimulan la secrecin de noradrenalina por las neuronas noradrenrgicas centrales, y a su vez, la estimulacin adrenrgica de las neuronas parvocelulares estimula la secrecin de CRH; adems, la CRH y la norepinefrina inhiben su propia produccin, establecindose un mecanismo de retroalimentacin negativa. De este modo, si bien las neuronas adrenrgicas centrales y las neuronas parvocelulares del ncleo paraventricular tienen sus propias "ramas" perifricas, el sistema de estrs es uno solo, ms an si se considera que estas "ramas perifricas" estn interconectadas entre s.

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El sistema de estrs est controlado por seales lmbicas, circadianas, neurosensoriales y hormonales (incluyendo citoquinas como el TNF, IL-1 e IL-6). Las situaciones de estrs, tales como la hipoglicemia, la ciruga, los problemas psquicos y la inflamacin estimulan este sistema.

Eje hipotlamo-hipfisis-adrenal. El llamado eje HHA se establece gracias a las conexiones entre las neuronas hipotalmicas del ncleo paraventricular, las clulas corticotropas de la hipfisis y las clulas secretoras de cortisol de la corteza suprarrenal. Debe recordarse adems que la hipfisis anterior tiene un rol menos importante sobre las clulas corticosuprarrenales secretoras de mineralocorticoides.

Neuronas parvocelulares hipotalmicas. En cada ncleo paraventricular existen tres divisiones de neuronas parvocelulares: una lateral, una intermedia, y una medial. Tanto las neuronas del grupo lateral como medial producen principalmente CRH; la diferencia est en que las neuronas del grupo medial secretan la hormona en el sistema portal hipotlamohipofisiario, en tanto que las del grupo lateral se encargan de estimular las neuronas noradrenrgicas del tronco enceflico. Finalmente, las neuronas del grupo intermedio producen AVP y la secretan en el sistema porta hipotlamo-hipofisiario.

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La argininavasopresina es, el mismo mediador qumico que la hormona antidiurtica (ADH). Sin embargo, estrictamente es correcto aplicar este nombre para designar a la AVP producida por las neuronas magnocelulares del hipotlamo anterior y liberada en la hipfisis posterior, y no para designar a la AVP producida por las neuronas parvocelulares hipotalmicas y liberada en la eminencia media, ya que obviamente, los efectos del mediador son muy distintos cada uno de estos y otros casos. En resumen, la AVP liberada en pequeas cantidades en el sistema porta hipotlamo-hipofisiario est encargada, al igual que la CRH, de estimular la secrecin de ACTH; por otro lado, la AVP liberada en grandes cantidades por la hipfisis posterior est encargada de regular los mecanismos renales de conservacin de agua.

Esto ayudar a comprender por qu durante la respuesta de fase aguda disminuye la conservacin renal de agua, a pesar de estimularse la liberacin de AVP por las neuronas parvocelulares.

Clulas corticotropas de la hipfisis anterior. La ACTH es producida por las clulas basfilas corticotropas de la hipfisis anterior, localizadas en la porcin central de la glndula. La secrecin hipofisiaria de ACTH est gobernada por las hormonas hipotalmicas CRH y AVP. Sin duda, el principal estimulante de la secrecin de ACTH es la CRH, aunque la AVP potencia notablemente su efecto.

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La ACTH estimula la sntesis de cortisol, y ste inhibe la liberacin de ACTH, tanto directamente como disminuyendo la liberacin de CRH y AVP.

El ciclo sueo-vigilia influye tambin sobre la secrecin de ACTH: sta es mxima en las primeras horas de la maana (4 am) y mnima al final de la tarde siempre que se mantenga un patrn normal de sueo.

Clulas secretoras de cortisol en la corteza suprarrenal. El cortisol es producido por las clulas de las capas fascicular y reticular de la corteza suprarrenal bajo el control de diversos mediadores. El principal estmulo para la produccin de cortisol es la ACTH (que tambin estimula levemente la produccin de aldosterona).

Accin del sistema de estrs sobre el sistema inmune. Tanto la activacin del eje HHA como la del sistema simptico influyen sobre el proceso inflamatorio que se est llevando a cabo. Las neuronas simpticas postganglionares y las neuronas sensitivas aferentes secretan sustancias moduladoras de la inflamacin, tales como la sustancia P y la somatostatina.

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No obstante, la importancia de estos mecanismos es pequea en comparacin a los profundos efectos que los productos del eje HHA (principalmente el cortisol) ejercen sobre el sistema inmune. De hecho, los glucocorticoides son ampliamente utilizados en clnica como agentes antiinflamatorios e inmunosupresores. A continuacin se mencionan los principales efectos de los productos del eje HHA sobre el sistema inmune y la respuesta inflamatoria.

Glucocorticoides. Los glucocorticoides ejercen efectos sobre prcticamente todas las clulas del sistema inmune. El cortisol es el principal glucocorticoide involucrado en la inmunomodulacin fisiolgicamente. Esta hormona acta unindose a receptores

citoplasmticos, formando complejos hormona-receptor que entran al ncleo y regulan la transcripcin gentica en diversos tipos celulares. Gran parte de los efectos inmunosupresores y antiinflamatorios de los glucocorticoides (independientemente del tipo celular) resulta de uno de los siguientes mecanismos: 1) Inhibicin de la sntesis de citoquinas (IL-1, TNF, IL-2, entre otras) o sus receptores; 2) Induccin de la produccin de lipocortina-1, que inhibe la sntesis de eicosanoides; 3) Inhibicin de la sntesis de molculas MHC de clase II y molculas de adhesin intercelular, involucradas en la interaccin directa entre las diversas clulas del sistema inmune.

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Efecto sobre Linfocitos. Los glucocorticoides suprimen potentemente la funcin de los linfocitos Th1 (que favorecen la inmunidad celular), sin un efecto directo inhibitorio notable sobre los linfocitos Th2 (que favorecen la inmunidad humoral y las reacciones de hipersensibilidad inmediata). Sin embargo, esta solo es parte de su accin sobre el sistema inmune, de modo que los glucocorticoides inhiben las reacciones alrgicas por sus efectos sobre otras clulas, como los eosinfilos, basfilos, mastocitos y clulas endoteliales.

CRH, AVP y ACTH. La CRH suprime la actividad NK, y estimula la adenilciclasa de los linfocitos T, evento que parece relacionarse a la inhibicin del subtipo Th1, pero no del Th2; en concordancia con ello, esta hormona ha mostrado inhibir la sntesis de IL-2 (producto Th1). Es necesario sealar que, casi con seguridad, las pequeas cantidades de CRH y AVP hipotalmicas son incapaces de afectar la reaccin inflamatoria local; en cambio, la CRH y AVP producidas en el foco inflamatorio parecen ser reguladores fisiolgicos de la inflamacin.

La ACTH inhibe la produccin de IFN y el nmero de clulas plasmticas, estimulando en cambio la actividad de las clulas NK. Se desconoce si las formas circulantes tienen algn efecto sobre el foco inflamatorio, y parece ms probable que la produccin local (en el foco inflamatorio) de este mediador sea mucho ms importante, tal como sucede con la CRH y la AVP.

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Neuronas noradrenrgicas del tronco enceflico y sus ramas perifricas.

Durante la respuesta de fase aguda se dan una serie de eventos autonmicos especiales, resultantes en gran parte de la activacin del sistema simptico, rama perifrica de las neuronas noradrenrgicas centrales: 1) Una redistribucin del flujo cutneo hacia zonas profundas, para minimizar la prdida de calor por la piel y contribuir a la respuesta febril. 2) Sudoracin disminuida. 3) Un incremento de la frecuencia cardiaca y la presin arterial.

Otros eventos endocrinos Adems de la elevacin de CRH, ACTH y glucocorticoides, la respuesta de fase aguda se acompaa de otros cambios endocrinos: 1) Una elevacin de la secrecin de hormona del crecimiento. 2) Un incremento de la secrecin de aldosterona. 3) Una disminucin de la secrecin de argininavasopresina por la hipfisis posterior, a fin de reducir el volumen de fluidos corporales que deben ser calentados, contribuyendo as a la fiebre. Como vemos, las interacciones entre los elementos reguladores de la osmolaridad de los lquidos corporales establecen un juego muy especial durante la respuesta de fase aguda, que conduce a un incremento de la osmolaridad del LEC.

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Paradjicamente, algunos pacientes con enfermedades infecciosas o inflamatorias pueden presentar el sndrome de secrecin inapropiada de ADH. Es probable que la IL6 juegue algn papel en estos casos, ya que a grandes dosis, la IL-6 causa una elevacin de la concentracin de ADH, lo que indica que esta citocina puede tambin activar las neuronas magnocelulares del hipotlamo. 4) Inhibicin de la funcin tiroidea, que resulta del efecto inhibitorio de la sntesis hipotalmica de TRH por parte de las citoquinas IL-1 y TNF. Adems, el cortisol inhibe la respuesta hipofisiaria a la TRH, contribuyendo a la inhibicin tiroidea. 5) Inhibicin de la funcin sexual: nuevamente, este efecto se debe principalmente a la accin de citocinas sobre el hipotlamo. La IL-1 inhibe la liberacin hipotalmica de GnRH (LHRH), y la IL-2 inhibe la liberacin de FSH y LH actuando directamente sobre la hipfisis. Se especula que estos fenmenos existen para evitar que individuos enfermos se reproduzcan.12

Podemos hablar entonces que gracias a esta fisiopatologa, el individuo puede desarrollar enfermedades dependiendo del estado de estrs en que se encuentre y algunas de ellas se encuentran relacionadas con la inmunidad en donde es de gran importancia la participacin de las mucosas, algunas de ellas son: a.- Enfermedades por estrs agudo: Ulcera por Estrs, resfriado comn, etc. b.- Enfermedades por estrs crnico: Rinitis alrgica, dispepsia, gastritis, colitis Nerviosa, etc.

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El estrs, tiene una gran relacin con la respuesta inmune y afecta no slo el proceso de infecciones recurrentes, sino tambin el desarrollo de procesos autoinmunes, desarrollo o mantencin de procesos tumorales y desarrollo o mantencin de alergia.

III. Sistema inmune de mucosas

El sistema inmune en tejido mucoso es definido como tejido linfoide asociado a mucosa (MALT); se encuentra de forma organizada, y se presenta como folculos linfoides aislados o folculos que se agregan para formar unidades ms grandes, o en coleccin difusa de linfocitos y clulas accesorias; el tejido linfoide asociado a mucosas se encuentra en epitelio, encima de la membrana basal, en la lamina propia o intersticio; incluyen los linfocitos intraepiteliales, sobre todo linfocitos T, y colecciones organizadas de linfocitos, a menudo ricas en linfocitos B; se ha descrito la presencia de folculos linfoides subepiteliales caractersticos de superficies epiteliales que cubren glndulas de secrecin mucosa.13, 14 Los compartimientos del sistema inmune de mucosas estn divididos en sitio inductor, donde los antgenos realizan una estimulacin en la superficie mucosa a clulas T naive y linfocitos B; y sitio efector, donde las clulas efectoras despus de la extravasacin, retencin y diferenciacin realizan su accin, para poder contribuir a la formacin de IgA. Los sitios de induccin estn constituidos por MALT, ganglios locales y regionales del drenaje linftico de mucosa, mientras que los sitios efectores consisten en diferentes compartimentos histolgicos donde se incluye la lmina propia de diversas mucosas, estroma de las glndulas exocrinas, y epitelios de superficie. (Fig. 1)

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Figura 1. Sistema inmunitario de mucosas. Los antgenos son transportados en el sitio inductor para producir una respuesta en el sitio efector.15 El MALT se subdivide de acuerdo con las regiones anatmicas, la distribucin y la composicin de estructuras linfoides que varan considerablemente entre las especies, la edad y el estado del tejido (normal o inflamacin crnica). Otras estructuras del MALT en el humano de MALT no parecen desarrollarse en etapa prenatal y su existencia y tamao en general dependen de la induccin por estmulos exgenos.15

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CUADRO 1. Nomenclatura recomendada para compartimentos de clulas inmunes asociadas a mucosa.16 Abreviatura Descripcin Tejido linfoide asociado a mucosa Tejido linfoide asociado a nariz Tejido linfoide asociado a bronquios Ndulos linfticos cervicales superficiales o profundos Tejido linfoide asociado a intestino Placas de Peyer Lmina propia Generalmente se refiere a la del tejido de la mucosa intestinal, limita al estroma por encima de la muscularis mucosae (excluyendo as la submucosa), pero tambin se puede utilizar en relacin con otras mucosas Compartimento IEL Epitelio de superficie Generalmente se refiere al epitelio del intestino delgado donde se localizan la mayora de linfocitos intraepiteliales (IELs) ILF Folculo linfoide aislado (solitario) ILF y PPs constituyen la mayor parte de GALT, pero tambin es incluido apndice, aunque ha sido poco explorado funcionalmente MLN Ndulos linfticos mesentricos Epitelio asociado a folculos

MALT NALT BALT CLN GALT PP LP

FAE

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IV. Tejido linfoide asociado a nariz (NALT)

Las vas respiratorias superiores e inferiores estn continuamente expuestas a agresiones antignicas. Esto se refleja en presencia de clulas especializadas y rganos linfoides en la mucosa nasal bucal y en pulmones; sin embargo la organizacin de estas estructuras puede variar en diferentes especies.

En la faringe humana, un conjunto de tejidos linfoides rodea las fosas nasales y orales en la faringe, ellos son colectivamente llamados anillo de Waldeyer, incluyendo adenoides (amgdalas nasofarngeas) y amgdalas palatinas.17

El BALT, ubicado principalmente en las bifurcaciones de los bronquios en los animales y los seres humanos, est presente en el feto y se desarrolla rpidamente despus del parto, especialmente en la presencia de antgenos.18 Las especies que muestran buen desarrollo en BALT, generalmente no tienen una red compleja de Waldeyer, y presentaran agregados linfoides en la entrada del conducto farngeo en la cavidad nasal, agregados denominados tejido linfoide asociado a nariz NALT. 19

Los animales con respiracin nasal predominante o exclusiva como roedores han desarrollado NALT y BALT; la organizacin y estructura del NALT ha sido estudiada ms ampliamente en pequeos roedores como ratas y ratones. 20

22

Los roedores carecen de amgdalas, pero han asociado el NALT a estructuras bilaterales que se encuentran dorsalmente en el piso de la cavidad nasal en tiras de tejido linfoide justo en la entrada del conducto farngeo.13 Las regiones ms proximales de la cavidad nasal en los roedores estn revestidos de epitelio escamoso estratificado; en las cavidades, el epitelio pseudoestratificado se encuentra en la superficie ventral de la lnea de entrada y en la longitud del conducto nasofarngeo, adems de clulas ciliadas columnares, ste epitelio respiratorio tambin contiene numerosas clulas caliciformes, que estn involucrados en la produccin de glucocalix. En aquellos sitios donde el epitelio respiratorio cubre el NALT, se caracteriza por la presencia de micropliegues especializados, clulas M
21

. Las clulas M se encuentran en

todas las mucosas del epitelio de revestimiento de agregados linfoides, tales como las amgdalas, placas de Peyer y BALT. Estos epitelios son algunas veces denominados epitelio asociado a folculos (FAE) 22 . Adems de las clulas M, que se pueden encontrar en pequeos grupos o aislados, el epitelio que cubre el NALT tambin contiene algunas clulas mucosas caliciformes.

Considerando que la mayora de las clulas epiteliales recubren la cavidad nasal, estn determinadas a guardar antgenos y expulsar microorganismos, estn protegidas por una capa de moco y presentan una actividad constante de sus microvellosidades, las clulas M han desarrollado un mecanismo especial para el transporte de macromolculas y partculas a travs del epitelio. La superficie basolateral de las clulas M, est profundamente invaginada mediante la cual se forman grandes bolsillos intraepiteliales, que sirven como un sitio de recoleccin inicial para material de transcitosis. Junto con amplios arreglos de filamentos intermedios, este domo constituye la caracterstica primordial de las clulas M.

23

Dentro del domo, los linfocitos, as como macrfagos se pueden encontrar en estrecha asociacin con la membrana de la clula M, sugiriendo algn tipo de interaccin.

Adems, las clulas M forman largos procesos basales que se ubican para extenderse en la profundidad del tejido linfoide, tejido debajo del epitelio, donde pueden asociarse con otras clulas, como clulas presentadoras de antgeno. La mayora de los conocimientos que se tienen sobre las clulas M se basan en observaciones hechas en epitelio linfoide que recubre el domo de las placas de Peyer. Sin embargo, basado en las similitudes de la estructura, es probable que la mayora de las caractersticas encontradas para las placas de Peyer son atribuibles en las clulas M en NALT
23

, con leves diferencias regionales. Las clulas M

parecen estar especializadas en transcitosis 24. Sin embargo parece que existe una interaccin activa entre las clulas M y los linfocitos subyacentes porque despus de una disminucin de linfocitos por irradiacin de los bolsillos intraepiteliales de las clulas M se presenta una prdida de linfocitos en las placas de Peyer
25

. La actividad de clulas en el NALT, est

influenciado por estmulo antignico en comparacin con ratas libres de patgenos. Primero, el nmero de clulas M disminuye y se mantiene bajo en ratas libres de patgenos especficos (SPF), pero las clulas tambin mostraron una morfologa ms uniforme 22.

En animales convencionales, el nmero de clulas M aumenta con la edad, y su morfologa est alterada, dando lugar a citoplasma amplio y grandes espacios intercelulares llenos de material amorfo. Datos sobre el fenotipo de los linfocitos que residen en los bolsillos de las clulas M en NALT estn limitados26 pero en las placas de Peyer la mayora de las clulas que se localizan en el domo de las clulas M son clulas T CD4+.

24

Que tienen caractersticas de clulas T naive, pero tambin se encuentran marcadores de activacin como CD69 y CD45 RO. Tambin fueron encontrados en el domo clulas B naive, con expresin de CD45 RA, describiendo mayor activacin celular27. La presencia de clulas B han llevado a la especulacin de que ests clulas estn involucradas en la presentacin de antgenos a clulas T en estos sitios del epitelio. La composicin global del NALT en ratones con respecto a la distribucin de linfocitos ha sido descrita con mayor detalle 28 . El nmero de linfocitos B en el NALT ha igualado aproximadamente el nmero de clulas T, o se han encontrado el doble, probablemente debido al reto antignico al que estn expuestos los animales. Cuando se compar la proporcin de las clulas T CD4+ y CD8+, se encontr una mayora de clulas T CD4, que refleja la distribucin normal de este tipo de clulas en el tejido linfoide del ratn29.

Hace menos de 2 dcadas fue descrito por primera vez, y la aparente semejanza con la estructura con placas de Peyer del intestino delgado30. Ambos rganos se sitan directamente por debajo de la capa epitelial y se caracterizan por la ausencia de vasos linfticos aferentes. Ambos estn compuestos por folculos de clulas B alternando los compartimentos de linfocitos T 31.

Vnulas del endotelio alto HEV

En las reas de las clulas T, pueden observarse discretamente vnulas endoteliales altas donde se lleva a cabo la migracin de linfocitos. En el caso de NALT el drenaje linftico eferente drena hacia los ndulos linfticos cervicales de la regin superior del trax, mientras 25

que en las placas de Peyer drena hacia los ndulos linfticos mesentricos. Estudios sobre el trnsito de linfocitos puso de manifiesto diferencias interesantes entre NALT y las placas de Peyer13, 32.

Cuando la expresin de adresinas vasculares fue estudiada en vnulas del endotelio alto (HEV) en NALT de ratones, se encontr una expresin predominante del ligando de la Lselectina, adresina del ndulo perifrico (PNAd) y menor expresin de la molcula de

adhesin de clula de adresina de mucosa-1 (MAdCAM). En las placas de Peyer, todos VHE expresan adresinas. Esto se refleja en la capacidad de unin de los linfocitos en el NALT que era principalmente mediada por la interaccin de la L-selectina PNAd13. Adems, se constat que en el NALT las vnulas del endotelio alto tambin se encuentran en las reas de clulas B, a diferencia de placas de Peyer donde VHE son ms restringidas al compartimento T interfolicular. Estos resultados apuntan a claras diferencias en la organizacin entre NALT y placas de Peyer, y se refleja tambin en el desarrollo ontogentico de los dos rganos.

Funciones del NALT

El NALT, acta como un sitio inductor y una fuente de anticuerpos IgA secretora15. Participa en el sistema de defensa del tracto respiratorio alto en los roedores, ya que se ha demostrado que puede provocar respuestas inmunitarias, tanto locales como sistmicas, por lo que se ha considerado un modelo muy efectivo para inducir inmunidad 33.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El estrs agudo por restriccin de movimiento modifica la produccin de IgA y el nmero de linfocitos T y B en el NALT de ratones Balb/c

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JUSTIFICACION

Actualmente hay pocos estudios que describan la organizacin y funcin del NALT. Se sabe que el sistema nervioso se encuentra estrechamente relacionado con el sistema endcrino a travs de la secrecin de corticosterona y catecolaminas y con el sistema inmune a travs del efecto de estas hormonas y su inervacin (relacin psico.neuro-endcrina). Se ha demostrado que el estrs es capaz de alterar el sistema psico-neural y con ello al sistema endocrino y el inmune causando diferentes alteraciones bioqumicas, endocrinolgicas e inmunolgicas.

Las alteraciones inmunolgicas causadas por el estrs han sido estudiadas en diferentes rganos linfoides sin embargo a nivel celular (poblaciones de linfocitos T y clulas B) y humoral (secrecin de IgAs) no se conocen sus efectos.

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HIPOTESIS

Puesto que el estrs es capaz de aumentar la secrecin de corticosterona, la cual tienen un efecto estimulante sobre el sistema inmune durante el estrs agudo, por lo tanto en ratones sometidos a un periodo de estrs agudo, el aumento de sta hormona aumentara el porcentaje de las poblaciones de linfocitos T y B as como los niveles de IgA en tejido linfoide asociado a mucosa nasal.

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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar si el estrs agudo inducido por restriccin de movimiento modifica los niveles de IgA en lavados nasales y las poblaciones de linfocitos T y B en tejido linfoide asociado a nariz de ratones Balb/c

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar si el estrs agudo inducido por restriccin de movimiento modifica los niveles de corticosterona de ratones Balb/C.

Determinar si el estrs agudo inducido por restriccin de movimiento modifica los niveles de IgA en lavado nasal de ratones Balb/C.

Determinar si el estrs agudo inducido por restriccin de movimiento modifica las poblaciones linfoides en NALT y bazo de ratones Balb/C.

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MATERIAL Y METODOS

I. Animales de experimentacin

Se utilizaron ratones de la cepa Balb/c machos de 8 a 12 semanas de edad, de 20 a 25 g de peso, mantenidos en jaulas de plstico en grupos de cinco, a una temperatura de entre 20 y 25 C, con una humedad entre el 40 y 70%, con ciclos de luz oscuridad de 12 horas, bajo condiciones libres de patgenos y con alimento Lab Diet 503 de PMI International, proporcionados en el bioterio de la Escuela Superior de Medicina (ESM) del Instituto Politcnico Nacional (IPN). Se excluyeron ratones que tuvieron menos de 8 semanas y/o aquellos que presentaron

infecciones o variaciones durante el desarrollo de la investigacin. El tamao de la muestra por grupo y por experimento fue de 10 ratones cada uno.

Grupos mustrales

Grupo I (Control): Los ratones se mantuvieron en movimiento dentro de sus jaulas. Este grupo fue sometido a ayuno con restriccin de agua durante 4 horas continuas y se tomo como grupo control.

Grupo II (Restriccin de movimiento): Los ratones fueron sometidos a un periodo de estrs agudo, por restriccin de movimiento, durante 4 horas continuas. 31

II. Modelo de estrs Los ratones se colocaron cada uno durante 4 horas dentro de un tubo cnico de plstico de 9 cm de ancho X 3 cm de altura X 3,5 cm de dimetro con pequeos orificios de ventilacin en las paredes para evitar la hipertermia, ste tubo les permite mantener movimiento de sus extremidades y girar pero no presentaban movimiento longitudinal34.

III. Obtencin de material biolgico Despus del periodo de estrs, ambos grupos de ratones fueron anestesiados con ter dietlico, y luego sacrificados por dislocacin cervical, colocndolos en una base de hielo, para la obtencin de muestras de sangre. Posterior a la dislocacin cervical, se abri la cavidad torcica se localizo y diseco la trquea, se corto la cabeza con la parte proximal de la trquea. Posteriormente se introdujo una cnula a travs de la trquea para realizar el lavado nasal, para la cuantificacin de los anticuerpos IgA por ELISA; se diseco el NALT y se abri la cavidad abdominal, para obtener el bazo, ambos se analizaron por citometra de flujo. Suero Por puncin cardiaca, se extrajo aproximadamente 1 mL de sangre del ventrculo izquierdo con jeringa de insulina, se retiro la aguja y se verti la sangre deslizando por la pared del tubo para que se deposite en tubos ependorff previamente rotulados, y se centrifugo a 5000 rpm durante 5 min, para obtener el suero y fue almacenando el suero a -70 C hasta el da de su anlisis.

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Lavado nasal Se identifico la trquea, una vez identificada la trquea, se introduce una cnula acoplada a una jeringa cargada con 1.5mL de RPMI, pasar lentamente el medio de cultivo, por la nariz, se coloc la cabeza en posicin vertical con la nariz hacia abajo. Repitiendo el procedimiento 2 veces ms, se recapturo el lavado se filtran con organza y se centrifugan a 1500rpm durante 10 minutos a 4C. Se recupera el sobrenadante y se almacena en alcuotas de 1ml en tubos ependorff limpios a -70C hasta el da de su anlisis.

Tejido linfoide nasal asociado a nariz (NALT) Para obtener el NALT se cort la mandbula con el fin de dejar expuesto el paladar. (Fig. 2) Con el uso de un estereoscopio se desprende el NALT, se coloco en caja Petri (10 NALT) con 1.5 ml de RPMI y se disgrego al microscopio con un portaobjetos, se recupero en un tubo cnico y se llevo a un volumen de 10 ml se filtro con organza y se paso a otro tubo cnico, en tubos ependorff previa filtracin con organza y el tubo se centrifugo, 1200RPM/5MIN/4C. se decanto el sobrenadante y se dejo el Pellet, al cual se agregaron 500 L de RPMI 1X y se homogenizo la suspensin con una micropipeta, colocar en hielo, y se cuantificaron las clulas en microscopio con cmara de Neubauer, se realizo obtencin de clulas y se colectaron en esterilidad, para obtener la suspensin celular de tejido linfoide nasal. Se ajusta a 1X106clulas/mL. para su tincin fenotpica y anlisis CFM. Para obtener un nmero de clulas adecuado se realiz un pool de 10 ratones por grupo y por experimento

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Figura 2. Eliminar paladar e identificar NALT. A) Se abre la boca despus de cortar los msculos de la mandbula, las flechas indican la direccin del corte en el paladar. B) Se muestra la exposicin de las cavidades nasales despus de retirar el paladar, el segmento entre las dos flechas a cada lado indica la ubicacin del NALT antes de la diseccin del paladar. C) El paladar con la cara hacia arriba, muestra las 2 tiras del el NALT que se ubican entre los espacios de las flechas de cada lado35.

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Bazo Se disec el bazo, y se coloco en una caja Petri (5 bazos) con RPMI y se disgrego cada bazo sobre una malla con un embolo, con 5 ml de RPMI en la malla por donde pasa toda la suspensin celular, se recapturo la suspensin y se filtro por organza, se coloco la suspensin en tubos cnicos de 15 ml y se aforo a 10 ml, se coloco el tubo recto en hielo 10 minutos para obtener eritrocitos y retirarlos, pasando el sobrenadante a otro tubo y centrifugar 5 min. 4C a 1200 rpm, se decanto y se obtuvo el pellet y se colocaron 3 ml de PBS 1X, se obtuvo la suspensin celular del bazo

IV. Determinacin de corticosterona Los niveles de corticosterona fueron determinados en suero por inmunoensayo enzimtico (EIA, por sus siglas en ingles enzyme immunoassay) utilizando un kit de la marca Stressgen36 (Catlogo 901-097 480), con base a las instrucciones del fabricante. La lectura de placa se llev a cabo en un lector de ELISA (BIO-RAD), a una longitud de onda de 405 nm. Se realiz una curva estndar para conocer la concentracin de corticosterona en ng/ml.

V. Cuantificacin de anticuerpos IgA por ELISA Se determin la absorbancia de anticuerpos IgA en lavado nasal de ratones Balb/C del grupo I y grupo II mediante ELISA37. Se empleo una placa de ELISA de 96 pozos de poliestireno (Costar). El anticuerpo Ag-especfico (anticuerpo de conejo IgA de mieloma ratn M 62), se diluy en buffer de carbonatos a una dilucin de 1:100 quedando una concentracin final de 1g/pozo.

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La tcnica de ELISA se llev a cabo de la siguiente manera: 1) La placa se cubri con 100l de la solucin de anticuerpo -IgA en cada pozo, se dejo incubar 24 hrs. a 4C. 2) Se lavo la placa 3 veces con PBS-Tween, y 1 vez con PBS 1X. 3) Se bloqueo con leche Svelty al 6% colocando 100L por pozo y se dejo a 37C por 2 horas. 4) Nuevamente se lav con PBS-Tween, y 1 vez con PBS 1X 5) Se agregaron las muestras de lavado nasal y suero obtenidos previamente por triplicado, se diluyo el suero 1:200 y el lavado nasal 1:2 ambos con PBS-Tween; se dejo una fila vaca por que van a ser los blancos y se incubaron 24 hrs. 4C; posteriormente se lavo la placa 3 veces con PBS-Tween, dejando la placa 1 min. con PBS-Tween entre cada lavado; se agrego el anticuerpo Anti-IgA de ratn peroxidado diluido 1:2000 con PBS-Tween se incubo 24 hrs.4C se lavo la placa 3 veces con PBS-Tween, dejando la placa 1 min. con PBS-Tween entre cada lavado; se agrego la solucin de sustratos, se cubri la placa, y se incubo 20 min a temperatura ambiente en oscuridad, se detuvo la reaccin con 25 l de H2SO4 , y se ley la reaccin en el lector de ELISA a 492nm.

VI. Determinacin de las poblaciones linfoides

Se determinaron los porcentajes de las subpoblaciones de linfocitos T y B localizados en tejido linfoide asociado a mucosa nasal y bazo por citometra de flujo37. Se agregaron10 l de cada muestra en tubos ependorff para ver viabilidad y se agregaron 90l de azul tripano, se mezclaron y se colocaron las muestras en la cmara si no se vea nada se tena que centrifugar 1 min a 3000 rpm ( de 800 a 1200 rpm 5 min), se contabilizaron las clulas. 36

Una vez contadas las clulas y ajustadas 1X106 clulas/muestra en un volumen de 50L mximo se procedi a su tincin. Las poblaciones celulares se determinaron utilizando una anticuerpos (Ac) dirigidos contra antgenos de superficie celular, los cuales se encuentran acoplados a un fluorocromo para ser detectados por citofluorometra.

Para identificar la poblacin de linfocitos T cooperadores (CD4+/CD8-) y T citotxicos (CD4/CD8+), las clulas fueron marcadas con un anticuerpo (Ac): anti-CD4/FITC (BD Biobienses) y anti-CD8/PE (Caltag). Para identificar a las clulas B se uso un doble marcaje con anticuerpos anti-CD19/APC (BD Biobienses) y anti-B220/PerCP (BD Biobienses). Las clulas CD 19+/B220+ involucran a las clulas pro B, pre B inmaduras y B naive.

Una vez teidas las clulas, fueron fijadas en una solucin de para-formaldehido/PBS al 2% y adquiridas en un citmetro FASC Calibur (Becton Dickinson, San Jos, CA) utilizando el software Cell Quest-Pro, versin 4.0. En el diagrama de puntos de tamao (FSC) vs. Granularidad (SSC) se delimito la regin correspondiente a las clulas en estudio (regin de linfocitos) y se adquirieron 10,000 eventos en dicha regin por muestra. Los archivos fueron analizados con el software Summit v4.3. Los datos representan el porcentaje de clulas positivas tomadas de la regin de linfocitos totales.

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VII. Anlisis estadstico

El anlisis estadstico se realiz utilizando el paquete estadstico Sigma Plot, versin 11.0 En todos los casos se compararon las medias de los resultados obtenidos entre el grupo control y el grupo de estrs (t de student).La significancia estadstica se considero cuando el valor de p fue de < 0.05. Para la tincin fenotpica, se hizo un concentrado de los rganos de estudio de los 10 ratones que conformaban cada grupo y se realizaron tres experimentos independientes entre s.

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RESULTADOS

Efecto del estrs agudo por restriccin de movimiento sobre los niveles de corticosterona en suero

La concentracin de corticosterona en suero se determin por ensayo inmunoenzimtico (EIA), tanto en el grupo control como el grupo sometido a estrs. De acuerdo a los resultados obtenidos se observ un aumento significativo (p< 0.001) de la concentracin de corticosterona en el grupo de ratones sometidos a estrs (141.769 ng/ml), en comparacin con los ratones del grupo control (18.584 ng/ml). Se muestra la media + D.S. de las concentraciones de corticosterona en suero de ambos grupos de ratones (Fig.3)

Figura 3. Efecto de estrs agudo sobre la concentracin srica de corticosterona. Los datos son la media + D.S. de al menos 3 experimentos independientes entre s. * p=< 0.001(t de student).

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Efecto del estrs agudo inducido por restriccin de movimiento sobre los niveles de IgA Los niveles de IgA en suero y lavados nasales fueron determinados por enzimo-inmunoanlisis, en ambos grupos (control y estrs) El estrs inducido por restriccin de movimiento incrementa de manera significativa los niveles de IgA (p< 0.004) en suero en el grupo de ratones sometidos a estrs en comparacin con los niveles observados en el grupo control (Fig.4) La restriccin de movimiento aumenta de manera significativa (p< 0.001) los niveles de IgA en lavados nasales, en lo los ratones sometidos a estrs en comparacin con los niveles observados en el grupo control (Fig.4)

Figura 4. Efecto del estrs agudo inducido por restriccin de movimiento sobre los niveles de IgA en suero y lavados nasales. Los resultados son la media + D.S. de al menos 3 experimentos independientes entre s. * p< 0.004; ** p< 0.001 (t de student).

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Efecto del estrs agudo inducido por restriccin de movimiento sobre las diferentes poblaciones linfoides T y B en bazo y NALT de ratones Balb/c

Los porcentajes de linfocitos fueron determinados por citometra de flujo. En el histograma de tamao (FSC) contra granularidad (SSC) se seleccin la regin de linfocitos y se adquirieron 10,000 eventos de dicha regin.

1) Bazo En bazo, el estrs inducido por restriccin de movimiento incrementa de manera significativa (p=0.034) el porcentaje de linfocitos T CD4 de 33.73 0.09 en los ratones sometidos a estrs comparados con 28.44 % 2.88 de los ratones control, el porcentaje de linfocitos T CD8 del grupo control fue de 10.99 + 2.74 mientras que el grupo sometido a estrs present un porcentaje de 11.75 + 0.08, en el porcentaje de linfocitos B CD19 los ratones control presentaron un porcentaje de 43,73 3.83 mientras que los ratones sometidos a estrs presentaron un porcentaje de 38,38 0.13; los linfocitos B220/CD19 de ratones control presentaron un porcentaje de 41,81 5.25 y los linfocitos de ratones

sometidos a estrs un porcentaje de 34,39 1.87 (Fig. 5).

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Figura 5. Efecto del estrs causado por la restriccin de movimiento sobre las diferentes poblaciones linfoides de bazo. Los resultados representan la media D.S. de al menos 3 experimentos independientes entre s. * p= 0.034 (t de student).

42

2) Tejido linfoide asociado a mucosa nasal (NALT)

En el tejido linfoide asociado a nariz (NALT), se observ una disminucin significativa (p=0.038)de linfocitos T CD4+ en ratones sometidos a estrs con un porcentaje de 20.69 1.19 comparados con un porcentaje de 30.13 5.22 en el grupo de ratones control, as como de linfocitos B CD19+ (p=0.009) donde el porcentaje en el grupo control fue de 35.64 3.54 mientras que en el grupo de ratones sometidos a estrs el porcentaje fue de 24.93 1.58 y en linfocitos B220+/CD19+ el porcentaje de clulas en los ratones control fue de 29.81 1.11, mientras que el grupo de los ratones sometidos a estrs presentaron un porcentaje de 6.42 4.84 manifestando as una disminucin significativa (p=0.001); los linfocitos T CD8 presentaron un porcentaje de 10.90 + 6.05 en el grupo control y un porcentaje de 3.69 + 0.33 en el grupo de ratones sometidos a estrs sin diferencia significativa (Fig. 6).

Figura 6. Efecto del estrs causado por la restriccin de movimiento sobre las diferentes poblaciones de linfocitos en NALT. Los resultados representan la media + D.S. de al menos tres experimentos independientes entre s. *p=0.038, **p=0.009, ***p=0.001 (t de student).

43

DISCUSIN

Los organismos llevan a cabo sus funciones de manera coordinada para mantener su homeostasis. Las interacciones neuroendocrinoinmunolgicas son una compleja red de molculas mediada por citocinas, hormonas y neurotransmisores, por lo que queda claro que los sistemas inmune y neuro endocrino son bidireccionales manteniendo as la homeostasis ante estmulos estresantes, tanto fsicos como psicolgicos, siendo el eje hipotlamo-hipfisisadrenales, la columna vertebral de estas interacciones38, 39.

El estrs causo un aumento significativo en los niveles de corticosterona sricos.

Durante el estrs agudo y crnico se ha reportado un aumento en las concentraciones de corticosterona40, 41 , por activacin del eje hipotlamo-hipfisis-adrenal.

En este estudio se determin la concentracin de corticosterona en suero, encontrando un aumento significativo en el grupo de ratones sometidos a estrs (Fig. 3). Esto nos permite asegurar que el modelo y tiempo empleados fueron adecuados para inducir estrs en los animales.

44

El estrs modific la cantidad de IgA tanto a nivel srico como en los lavados nasales.

Los resultados mostraron un aumento significativo de los niveles de IgA tanto en suero como en lavados nasales en el grupo de ratones sometidos a estrs en comparacin con el grupo control. Estos cambios pueden relacionarse con los cambios tempranos que ocurren durante el periodo de adaptacin o modulacin inmunolgica y como un mecanismo de alerta para el organismo, Contrario a lo que se observa en el estrs crnico, donde los niveles de IgA disminuyen ya que el agotamiento ocurrido en un estrs crnico provocara por efectos de inmunosupresin un decremento en el nmero de clulas42.

El estrs modific la cantidad de los linfocitos T CD4+ en bazo.

Los resultados demuestran que los linfocitos T cooperadores (CD4+) en bazo presentaron un incremento en su porcentaje, sin cambio en los linfocitos T citotxicos (CD8+) algunos estudios a nivel sistmico, Pero adems, se encontr que sujetos sometidos a entrenamiento fsico moderado por 4 semanas , presentaron un aumento de los linfocitos CD4+ circulantes, as como un aumento en la excrecin renal de cortisol y de la tasa adrenalina / noradrenalina urinaria 43 y que la adrenalina a dsis fisiolgicas , ocasiona una disminucin de la relacin CD4+/CD8+ , en sangre perifrica a los 60 minutos de aplicado el frmaco 44 se reporta que en pacientes asmticos, a los que se les aplicaron glucocorticoides sistmicos, presentaron a las 3 horas cambios en el nmero de linfocitos circulantes, mientras que los CD8+ no sufrieron modificaciones45.

45

Se sabe que quiz debido a que existen poblaciones de linfocitos T en timo, algunas de estas clulas inmaduras, son exportadas desde el timo hacia otros rganos linfoides secundarios como el bazo y ndulos linfoides.46 Por lo que, tanto los glucocorticoides como las catecolaminas secretadas durante el estrs pudieron ocasionar que los linfocitos CD4+ fueran movilizados desde otros rganos hacia el bazo.

El estrs modific la cantidad de los linfocitos T CD4+, linfocitos B CD19+ y B220+/CD19+ en el NALT El resultado obtenido en el NALT reporta que la cantidad de linfocitos CD4+ es mayor que la de linfocitos CD8+, esto concuerda con la literatura reportando que la cantidad de linfocitos T CD4+ en el NALT murino, es aproximadamente cuatro veces mayor que los linfocitos T CD8+47. Los resultados en el grupo de ratones sometidos a estrs presentan una disminucin significativa de linfocitos T cooperadores (CD4+), mientras que el porcentaje de linfocitos T citotxicos (CD8+) no presentaron cambios significativos; mostrando que existe una gran susceptibilidad de CD4+ comparada con linfocitos CD8+ por efecto del estrs empleado en el protocolo. Nuestros resultados concuerdan con estudios previos que reportan que someter a una rutina aguda de ejercicios disminuye el nmero de clulas T CD4+ en ndulos linfticos submandibulares48. En otro estudio de retencin estrs crnico causado una disminucin en el nmero total de circulacin de CD4 + y CD8 + T, pero neutrfilos y clulas NK se aument notablemente49 . Suponemos que la sesin de estrs en el presente estudio no alcanz el umbral de estrs que puede afectar a las clulas CD8 + lo que puede indicar que esta poblacin en el NALT es ms resistente a los efectos del estrs o sus hormonas

46

Se sabe que los linfocitos T responden a glucocorticoides mediante los receptores tipo 2 para glucocorticoides, los cuales al ser de baja afinidad y solo verse involucrados en situaciones de estrs, median una respuesta importante sobre estas clulas50. En los resultados se obtuvo tambin una disminucin significativa de linfocitos B (CD19+ y B220/CD19+), existen reportes de que los glucocorticoides inhiben la activacin de los linfocitos B, aunque una vez activados, son resistentes a estos efecto12. Esto quiz provoque una disminucin en los linfocitos B Otra posible causa de los cambios celulares sera la apoptosis ocasionada por el aumento de los glucocorticoides durante el estrs. De acuerdo con la literatura, las catecolaminas pueden causar apoptosis de clulas B. 48,
51, 52, 53

Estos cambios pueden depender de modificaciones en la expresin de molculas de adhesin y/o de sus ligandos que permiten el alojamiento y la organizacin de los linfocitos en los rganos linfoides, entre ellos el NALT.54

47

CONCLUSIONES
.

1.- De acuerdo a los niveles de corticosterona ledos podemos concluir que el modelo de restriccin de movimiento empleado provoca un efecto de estrs

2.-Observamos que este modelo de estrs acta como un factor inmunoestimulante en los niveles de IgA tanto en lavados nasales, como en suero, quiz debido a un fenmeno de adaptacin

3.- El modelo de estrs utilizado provoc en bazo, de ratones estresados, un aumento en el porcentaje de linfocitos T CD4, linfocitos citotxicos y linfocitos B, no mostraron ningn cambio significativo; en NALT se presento una disminucin tanto de linfocitos T CD4+, as como de B CD19+ y CD19+/B220+; se propone que los efectos del estrs sobre las poblaciones celulares, se ejercen a travs de la influencia de las hormonas glucocorticoides por mecanismos como apoptosis o a su redistribucin en la expresin de molculas de adhesin.

48

PERSPECTIVAS

1.- Analizar la expresin del componente secretor en clulas epiteliales del NALT, para relacionarlo con los niveles de IgA as como de la cuantificacin de IL.

2.- Analizar las clulas productoras de IgA en sitios inductores y efectores a nivel de la mucosa respiratoria.

3.- Analizar los niveles de catecolaminas (Adrenalina, noradrenalina).

4.- Analizar la expresin de molculas de adhesin a nivel del NALT. Estos datos muestran que el estrs agudo induce aumento de la quimiotaxis y de expresin de la CA que pueden contribuir a la creciente migracin y el reclutamiento de clulas inmunes a los sitios de infeccin y / o inflamacin.55

5.- Analizar la expresin de TGF- e IL-5, IL-6 involucradas en el cambio de isotipo para IgA en clulas productoras de anticuerpos (lgA+)

49

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