MTODOS

DE
SEPARACI
N
QFB.EBC. DAVID GUSTAVO GARCA GUTIRREZ
1
Generalidades
2
Separar componentes de una muestra (mezcla)
Previos a la determinacin
Anlisis cualitativo y cuantitativo
Cromatografa de gases
Cromatografa de lquidos de alta eficacia
Cromatografa de fluidos supercrticos
Electroforesis
Generalidades
3
Mtodos para el anlisis qumica
Selectividad
Especificidad

Separacin del analito de posibles
interferencias


Mtodos clsicos
4
Hasta mediados del siglo XX
Precipitacin
Destilacin
Extraccin

En la actualidad
Cromatografa
Electroforesis
Introduccin a las
separaciones
cromatogrficas

5
Definicin
6

Mtodo fsico de separacin en donde los
componentes a separar se distribuyen entre
dos fases, una que permanece estacionaria
y otra la atraviesa.

Historia de la cromatografa
7
Botnico Mikhail Tswett (Rusia), 1903.
Cromatografa (chroma-graphein) = Escritura a
color
Separo pigmentos de extracto de hojas verdes:
Utilizando ter de petrleo, un disolvente no polar.
Una columna de vidrio
Carbonato de calcio
Utiliz como detector la simple observacin.
Historia de la cromatografa
8
Finales de los 30 y principio de los 40 se desarrollo
la tcnica.

1952, Premio Nobel, por sus descubrimientos en
este campo a:
A. J. P. Martin
R. L. M. Synge

Entre 1937 y 1972, doce premios Nobel

Descripcin general
9
Proceso de separacin que involucra la
interaccin de uno o ms solutos y dos fases.

Fase mvil:
Un gas, lquido o fluido supercrtico que pasa a
travs de una fase estacionaria con la que es
inmiscible.

Fase estacionaria
Un slido o lquido el cual no se mueve fijandose
a una columna o superficie solida.

Descripcin general
10
La muestras se introduce en la fase mvil
Es transportada a lo largo de la columna-fase solida
Las especies de la muestra experimentan interacciones
repetidas (repartos) entre ambas fases.
Componentes fuertemente retenidos
Componentes que se unen dbilmente a la f.
estacionaria
A consecuencia de la distinta movilidad
Los componentes se separan en bandas o zonas discretas
Estas pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Clasificacin
11
1. La forma en que se ponen en contacto las fases
Cromatografa en columna
Cromatografa en plano
2. Tipo de fases
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
Cromatografa de fluidos supercrticos
Clasificacin por mecanismo de separacin:
12
C. de reparto: separa los solutos basndose en la
solubilidad.
C. de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin.
C. de exclusin: separa solutos segn el peso molecular.
C. de intercambio inico: separa solutos segn la carga
inica.
Clasificacin por la fase mvil
13
C. de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos
sistemas:
C. gas-liquido
C. gas-slido

C. lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser:
C. liquido-liquido
C. liquido-slido
C. de exclusin
C. de intercambio inico

Las sustancias que no pueden ser examinadas son las insolubles y
aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase
estacionaria.

Clasificacin
14
Teoras
15
El proceso cromatogrfico - unin de fenmenos tales como:
Hidrodinmica,
Cintica,
Termodinmica,
Qumica de superficie
Difusin.

Para explicar el comportamiento de los solutos en las columnas:
Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge).
Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg &
Sjenitzer).
Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

Cromatografa de elucin en
columna
16
Se introduce en la columna la muestra (t0).
La introduccin de fase mvil hace que la muestra avance
Tienen lugar el reparto entre la f. mvil y las porciones de f.
estacionaria (t1).
Las adiciones de la fase mvil hacen avanzar las molculas
de soluto en una serie de continuas transferencias entre las
fases estacionaria y mvil.
Cromatografa en columna
17
La velocidad media a la que migra el soluto
depende de la fraccin de tiempo que reside en la
f. movil

Las diferencias de velocidad hacen que se
separen los componentes de la mezcla (t
2
).

El aislamiento de las especies se realiza haciendo
pasar suficiente fase mvil hasta que las bandas
individuales salen de ella (t
3
y t
4
).

18

Cromatografa en columna
19
Anlisis cualitativo
Tiempo de retencin
Posicin en la fase estacionaria tras el periodo de
elucin.
No aporta mucha informacin qumicas
Buen mtodo para evidenciar ausencia de
compuestos.
Informacin cuantitativa
Comparacin de altura o rea del pico con patrones.
Mediante el mtodo de calibrado y patrones,
El mtodo del patrn interno, y
El mtodo de la normalizacin de las reas.
Cromatografa en columna
20
Durante la elucin ocurre la dilucin del analito

Se produce una importante dilucin de los
analitos (su concentracin disminuye) mientras
estn siendo separados.

El avance por la columna aumenta la distancia
entre las bandas

Hay un ensanchamiento de ambas bandas
Cromatografa de elucin en
columna
21

Extraccin liquido - liquido
22
Es el reparto preferencial entre dos fases
inmiscibles: F ac y F org,

K = ________

nt = norg + nac

p + q = 1
Distribucin binomial
23
# TUBO
Transfer
.
0 1 2 3 4
0 1
1 p q
2 q2 2pq p2
3 q3 3pq2 3p2q p3
4 q4 4pq3 6p2q2 4p3q q4
Ejemplo 1
24
1. Verificar la cantidad de cada soluto en el tubo
1 despus de dos transferencias con
coeficientes de distribucin:

KA= 4

KB= 1
Ejemplo 2
25
Se considera para el inicio de una extraccin mltiple
1 mmol de A y 1 mmol de B, despus de 5
transferencias se vaca el contenido de los tubos
0, 1, 2 en un frasco as como el contenido 4 y 5
en otro.

Calcule el contenido de A y B en cada uno de los
frascos

Equilibrios
26
3.12
3.12
12.5
12.5
18.75
18.75
12.5
12.5
3.12
3.12
Terminologa
27
Absorcin:
La retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la
tendencia que tiene sta a formar mezcla o a reaccionar qumicamente con la
misma.

Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de reparto.

Adsorcin:
Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de
un slido, quedando limitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o
superficie interfacial, esta retencin superficial puede ser fsica o qumica.

C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar.

C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar.
Terminologa
28
Disolvente : Cualquier fase mvil.

Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.

Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna.

Fase estacionaria:
Material que permanece dentro de la columna cromatogrfica
durante la cromatografa y que retiene algn componente de la
muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido
o un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte.



Terminologa
29
Fase mvil:
Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico
que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar
a travs de la columna cromatogrfica y la fase estacionaria.

Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio.

Soporte:
El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para
sostener la fase estacionaria lquida en su sitio.

Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

Parmetros cromatograficos
30
Pico de aire

Lnea base

Altura de pico (h)

Anchura del pico w (4o)

rea del pico
Terminologa
31
Cromatograma:
Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la
concentracin del soluto y se registra su seal en funcin del tiempo (o del
volumen de fase mvil aadido) se obtiene una serie de picos que
representan un grafico denominado cromatograma.

Grafico til para el anlisis cualitativo y/o cuantitativo.
La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra
Las reas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de
cada componente.
Terminologa
32
Tiempo de retencin:
Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de
la muestra hasta que el pico de concentracin del
analito alcanza el detector;
Es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la
columna;
Es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un
pico,
Se representa con el smbolo tR.

Volumen y tiempo de retencin
33
Volumen de retencin, V
R
: Volumen de fase
mvil requerida para eluir un soluto de la
columna

Tiempo de retencin, t
R
: Tiempo requerido para
cada componente para recorrer toda la columna.
Volumen y tiempo de retencin
34
V
R
= t
R
flujo
t
Rb
t
Ra
A
B
s
e

a
l

Terminologa
35
Tiempo muerto tM:

Es el tiempo necesario para que la especie no retenida
alcance el detector;

Es el tiempo de migracin de la especie no retenida;

Es el tiempo necesario para que, por termino medio,
una molcula de la fase mvil pase a travs de la
columna
Terminologa
36
Terminologa
37
La velocidad lineal promedio de migracin del soluto es:




Terminologa
38
Velocidad lineal promedio u del movimiento de las
molculas de la fase mvil es:



Plato terico
Sistema ESTATICO en equilibrio

Cada especie presenta un equilibrio entre la
fase mvil y la fase estacionaria
A A
fase movil fase estacionaria

Terminologa
40
Constante de distribucin:
Los equilibrios de distribucin suponen la transferencia de una analito entre
las fases.
A mvil A estacionaria
La constante de equilibrio para este proceso se denomina:
Constante de distribucin
Razn de distribucin o
Coeficiente de distribucin
Mide la distribucin del analito entre la fase estacionaria y la fase mvil.



CS es la concentracin molar del soluto en la fase estacionaria (mol/L)
CM es la concentracin molar en la fase mvil (mol/L)

Coeficiente de reparto
41
K es independiente de la concentracin. Puede
afectarse por factores como la temperatura.

Cuando K se incrementa el soluto tarda ms
tiempo en pasar a travs del sistema
movil fase la en soluto del ion Concentrac
ia estacionar fase la en soluto del ion Concentrac
K =
Factores que influyen en la
separacin
42
Valores de K suficientemente diferentes.

Tener el suficiente # de equilibrios

Eficiencia en la columna:
tR mas cortos
Picos mas angostos
Coeficiente de reparto
f es la fraccin de tiempo que el soluto pasa en
la fase mvil.
Puesto que las fases estacionaria y mvil, tienen
volmenes conocidos; V
e
, V
m
. A partir de esto,
se puede calcular el coeficiente de particin.
v
u
L
t
L
t
t
t
f
n
n
R
R
soluto
soluto
M
T
= = = =
0
0
Coeficiente de reparto
44
Dividiendo entre: C
M
V
M
v u
C V
C V C V
M M
M M E E
=
+

`
)
v u
C V
C V
E E
M M
=
+

1
1
Coeficiente de reparto
Como:
v u
K
V
V
E
M
=
+

1
1
K
C
C
soluto
soluto
E
M
=
K
V
V
u
v
M
E
=

`
)
1
Coeficiente de reparto
Cuando se incrementa:
V
E
: Se incrementa la retencin.
V
M
: Disminuye la retencin.
K
V
V
u
v
M
E
=

`
)
1
Coeficiente de reparto
V
E
y V
M
, pueden alterarse cambiando el
dimetro y la longitud de la columna
u y v, puede modificarse al variar el flujo.
K
V
V
u
v
M
E
=

`
)
1
Factor de capacidad
48
La razn de la cantidad de soluto en la fase
estacionaria y la cantidad en la fase mvil.

Es caracterstico de un compuesto especifico
en una composicin de fase mvil a una
temperatura y en un tipo de columna
Factor de capacidad
49
M
E
n
n
k = '
Terminologa
50
Factor de retencin o factor de capacidad:
Describe la velocidad de migracin de los solutos en la columna. Para una
especie A, el factor de capacidad kA se define como:






kA es el coeficiente de distribucin de la especie A,
VS es el volumen de la fase estacionaria y
VM es el volumen de la fase mvil.
Terminologa
51
Factor de retencin o factor de capacidad:
Medida de tiempo transcurrido en la f. estacionaria en relacin con el
tiempo transcurrido en f. mvil.

Es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir,
dividido entre el tiempo de elucin de una banda no retenida (k=0)

La relacin establece cuantos volmenes muertos (o tm) se necesitan
para alcanzar a Vol. de retencin (o tr)

Cuando el factor de capacidad es menor que la unidad, la elucin es tan
rpida que es difcil determinar con exactitud los tiempos de retencin.
Cuando el factor es del orden de 10 o mayor, los tiempos de retencin son
excesivamente largos.


Factor de capacidad
k K
V
V
E
M
' =
v u
K
V
V
E
M
=
+

1
1
v
L
t
R
= u
L
t
=
0
v u
k
=
+ '

`
)
1
1
Factor de capacidad
L
t
L
t k
R
=
+ '

`
)
0
1
1
k
t t
t
R
' =

0
0
Magnitudes corregidas
54
Tiempo de retencin ajustado
k
t
t
R
' =
'
0
tiempo
t
0
t
A
t
B
t
A
'
t
B
'
0.0
3 ' 1 s s k
Factor de selectividad
55
Medida de separacin relativa entre dos picos

Medida de la interaccin relativa de los solutos
con la fase estacionaria
Terminologa
56
Factor de selectividad:
El factor de selectividad de una columna para dos
especies:




KB es el coef. de distribucin para la especie mas retenida
KA es el coeficiente para la menos retenida

Depende de la naturaleza de la fase estacionaria y
mvil, y
La temperatura de operacin de la columna
Factor de selectividad
Se puede evaluar la selectividad en base a los
tiempos de retencin para cada soluto.
o = =

=
'
'
'
'
k
K
t t
t
t t
t
t t
t t
t
t
A
B
R
R
R
R
R
R
A
B
A
B
A
B
0
0
0
0
0
0
2 1 s so
Terminologa
58
Resolucin cromatogrfica:
La resolucin cromatogrfica RS de una columna es una medida
cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.




WA y WB son la anchura de los picos A y B.
Si R > 1.5 la separacin de los componentes es completa
La resolucin puede mejorarse alargando la columna, aumentando
as el nmero de platos. Una consecuencia negativa es el
incremento del tiempo requerido para la separacin.
Resolucin
60

Terminologa
61
Eficiencia en cromatografa
La eficiencia se define en base a dos trminos
1 La altura del plato H
2 El nmero de platos N.




La eficacia de la columna a mayor nmero de platos, y
A menor altura de plato.
Las eficacias en trminos de nmero de platos varan de cientos a
miles, y
Las alturas de plato de unas pocas dcimas a milsima de
centmetro.
Nmero de plato terico
62
En extraccin con disolvente, un plato es
representado por cada equilibrio (extraccin).
En una destilacin fraccionada, un plato es
representado por cada destilacin.
En una columna cromatografca se puede aplicar el
concepto de plato terico (cada evento de separacin
realizado).
Se puede estimar el nmero de platos tericos en la
columna basado en los tiempos de retencin y ancho
de las seales de cada compuesto.
Altura equivalente a un plato
terico
63
Longitud de columna en que se lleva a cabo una
separacin.
H
L
N
=
Equilibrios
64
Terminologa
65
Nmero de platos N:









Terminologa
66
Las bandas cromatogrficas tienen una forma gaussiana,
Definir eficacia de una columna en trminos de varianza por unidad de
longitud.







La curva es gaussiana, y la ubicacin de L -1 y L +1 se indica
mediante lneas verticales discontinuas.



Nmero de plato terico
67
Mtodo de las tangentes.
N
t
W
R
tan
=
|
\

|
.
| 16
2
Nmero de plato terico
68
Resolucin
70
71
Teora de la separacin
Como se lleva a cabo la separacin.
Como son las seales analticas.
72
Factor de Asimetra
AF = b / a
AF = 1
AF > 1
AF < 1
10%
a
b
73
Pico simtrico
Pico coleado
Pico cabeceado
Factor de asimetra
74
Cs
C
M
Asimetra de la banda
75
Si k es mayor a concentraciones mas bajas de soluto
La zona de baja concentracin del pico eluye mas
lentamente.
Por lo tanto la seal del pico ser coleada
Combinacin equivocada de muestra y empaque de columna

El tipo inverso de asimetra se conoce como
cabeceado
k` es mayor a concentraciones mas altas de soluto.
Solucin :
Disminuir el tamao de la muestra hasta que las bandas sean
simtricas y tR constantes.




Resolucin
76
Ecuacin fundamental de la resolucin
R
k
k
L
H
=

|
\

|
.
|
'
+ '
|
\

|
.
|
|
\

|
.
|
1
4
1
1
1
2
o
o
( ) R
k
k
N =

|
\

|
.
|
'
+ '
|
\

|
.
|
1
4
1
1
1
2
o
o
Donde k es un promedio entre k
2
y k
1
si k
2
~ k
1
, entonces k = k
2
Eficiencia de la columna
77
Empleo de columnas mas largas
incrementamos N

Trabajar con condiciones optimas de flujo y
temp.

k incrementa disminuyendo la temperatura

Alfa se aumenta:
Sustituyendo la fase estacionaria.


Variables cinticas
78
Variable Smbol
o
Unidade
s
Vel. Lineal de la fase mvil u cm/s
Coeficiente de difusin en la fase mvil Dm cm
2
/s
Coeficiente de difusin en la fase estacionaria Ds cm
2
/s
Factor de retencin k -
Dimetro de la partcula de relleno dp cm
Espesor del recubrimiento liquido en la fase
estacionaria
df cm
Variables cinticas
79
Efecto del caudal de la fase mvil sobre la altura de plato. Gas/Liq
(-1)
v = cm/s
H = mm
Variables cinticas
80
Efecto del caudal de la fase mvil sobre la altura de plato. Gas/Liq
(-1)

Velocidades lineales menores en lquidos.

Las separaciones cromatograficas en gases son en menor tiempo

Las alturas de plato son por lo menos un orden de magnitud menor
en lquidos.

Columnas
En lquidos 25 a 50 cm (cada de presin)
En gases 50 m o ms
Teora Cintica
81
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y
Sjenitzer:
Dinmica de la separacin.

Ecuacin de van Deemter
( )u C C
u
B
A Cu
u
B
A H
M S
+ + + = + + =
Difusin de Eddy
82
Cu
u
B
A H + + =
Termino del camino libre
Difusin en remolino
Difusin parasita
Difusin parsita
83
N
v
A
A d
p
= 2
: Constante del empaque dada por la calidad del relleno
d
p
: diametro de la partcula
H = cm
Difusin longitudinal
84
Cu
u
B
A H + + =
Difusin longitudinal
85
N
v
B/v
A
M
D B 2 =
: Cte. del empaque, factor de obstruccin.
Columnas rellenas = 0.6
Columnas capilares = 1

D
M
: Difusin de soluto en la f. mvil
Velocidad de migracin por gradiente
H = cm
Resistencia a la transferencia de masa
86
Cu
u
B
A H + + =
Transferencia de masa
87
N
v
Cv
B/v
A
( )
(
(

' +
'
=
E
f
D k
d k
C
2
2
1
8
t
d
f
: Grosor de la fase estacionaria.

D
E
: Coef. de difusin del soluto en la fase estacionaria
H = cm
Efecto global
88
N
H ptimo
v
Vel. lineal
ptima
Cu
B/u
A
Global
Cu
u
B
A H + + =
v = cm/s
H = cm
Teora Cintica
89
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y
Sjenitzer: Dinmica de la separacin
( )
u
D k
d k
u
D
d H
E
f
M
p
(
(

' +
'
+ + =
2
2
1
8
2
2
t

Anlisis cualitativo y
cuantitativo
90
Cualitativo
Parmetros de retencin
Detectores selectivos
EM, FTIR, RMN, UV

Cuantitativo
Altura de pico
rea de pico

Buena resolucin
Respuesta en el rango de linealidad del detector

Anlisis cualitativo y
cuantitativo
91
Anlisis cuantitativo

Altura de pico o rea de pico?

El rea debe utilizarse para picos con colas pronunciadas
Ambos son imprecisos, con un volumen de inyeccin
irreproducible.
La altura de pico puede usarse si el ancho del pico de los
compuestos es el mismo para estndares y muestra.


Anlisis cuantitativo
92
Normalizacin de reas

Normalizacin de reas con factores de
respuesta

Estndar externo

Estndar interno
Anlisis cuantitativo
93
Normalizacin de rea o altura de pico
Limitacin: todos los componentes deben eluir.



100 %
3 2 1
1

+ + +
=
n
A A A A
A
x
Anlisis cuantitativo
94
Normalizacin de rea con factor de respuesta



100 %
3 3 2 2 1 1
1 1

+ + +
=
n n
A F A F A F A F
A F
x
area
conc
F =