CROMATINA

ADN de EUCARIOTAS, PROCARIOTAS, VIRUS CONDENSADO POR ASOCIACIN CON PROTENAS

ADN de X174

Cromosomas eucariticos en mitosis

La cromatina

Cromatina extrada con buffer de baja fuerza inica. (perlas de un collar)

Cromatina extrada con buffer de fuerza inica fisiolgica (fibra condensada)

La cromatina

Bucles de ADN

Armazn proteico de protenas no histonas

Micrografa electrnica de cromosoma en metafase sin histonas

CROMOSOMA EUCARITICO - CROMATINA

DIFERENTES NIVELES DE COMPACTADO 6 veces compactado

40 veces compactado

> 1000 veces compactado

> 10000 veces compactado

CROMATINA - NUCLEOSOMAS
Suspension de nucleos a baja fuerza ionica: lisis y liberacin de fibras de cromatina de 30 nm

FIBRA DE 30 nm fuerza inica

FIBRA DE 10 nm
collar de perlas

Nucleasa microcccica

Tratamiento ms drstico con nucleasa microcccica:

1) Se liberan mononucleosomas 2) Se liberan nucleosomas recortados

3) Se liberan cores de histonas

805 605 405 205

Digestin suave con nucleasa microcccica: se obtienen mltiplos de una determinada unidad de longitud: Repeticin nucleosomal

PARTCULA NUCLEOSMICA CENTRAL - 146 pb de ADN enrollados alrededor de la PARTCULA NUCLEOSMICA CENTRAL o CORE de histonas (2 vueltas)

-Tetrmero de H3 y H4
-2 dmeros de H2A y H2B
OCTMERO

HISTONAS DEL CENTRALES o del CORE

- Protenas pequeas (11- 15 Kda) - Muy conservadas - Alta carga + (ricas en Lys y Arg) - Dominio pliegue histnico - 3 hlices- separadas por asas cortas no estructuradas - Colas N-terminales

Cmo se disponen los nucleosomas en la fibra de 11 nm?

2 factores favorecen la ubicacin de un nucleosoma: 1) Facilidad para que se curve la doble hlice: secuencias ricas en AT en surco menor 2) Presencia de protenas no histonas unidas al ADN con gran afinidad

- Longitud variable en el genoma - Posicionamiento dinmico

Fibra de 30 nm:
Una vez que se forman los nucleosomas, la fibra de 10 nm se condensa en el siguiente nivel de compactado

2 modelos para la fibra de 30 nm:

SOLENOIDE ZIGZAG

ADN ligador

ADN ligador

Ambos modelos seran correctos. Dependen de: Longitud del ADN entre nucleosomas. 197 pb favorecera la forma solenoide (H1 estabiliza estructura) (Cromatina inactiva). Menor longitud entre nucleosomas (sin H1, cromatina activa)

Histona H1 o ligadora
- Protena pequea; un poco ms grande que las del core - Secuencia menos conservada

- Estructura tpica

Dnde se ubica en el nucleosoma?

Modelos:

Proteccin de 20 pb adicionales de ADN de digestin con nucleasa microcccica

Las colas N-terminales de las histonas intervienen en la formacin de la fibra de 30 nm

Recordar : Las colas de las histonas son blanco de modificaciones post-traduccionales

Compactado en la fibra de 30 nm, un cromosoma humano an medira 0.1 cm = 10 veces ms grande que el ncleo celular!!

Niveles de mayor compactado (?) que varan en el ciclo celular en respuesta a seales del ciclo celular
Cromatina saliendo de un ncleo lisado en interfase

Cromosoma mittico

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS DEL CORE -Lisinas y Serinas de histonas del core sufren acetilacin, metilacin, fosforilacin, ubiquitinacin.... - Mutaciones causan alteraciones de la expresin:
Ej. H4: *dominio R (aa 17 a 29) : implicado en represin

*dominio A (aa 1 a 16) : implicado en activacin

-Modo de accin: 1) modificacin de la interaccin con ADN (carga)

2) Lugares de unin para protenas

Histonas modificadas en las colas

Cdigo de histonas

Cdigo de histonas
No est claro si algo as existe An si existiera, no es universal Sin embargo, estudios de todo el genoma si detectan patrones Una modificacin no conduce inevitablemente a un resultado

Favorecen la for macin y mantenimiento de un dominio trans cripcionalmente activo Secuencias MAR (Regiones de unin a la matriz); SAR (Regiones asociadas a andamiaje). Ricas en AT.

LCR (Locus control region): Elemento de regulacin formado por un sitio o grupo de sitios de hipersensibilidad a la DNasa I

Relacin entre dominio estructural y dominio funcional

Dominio funcional: Regin de cromatina sensible a DNAsa I, alrededor de un gen o grupo de genes. Algunas MAR se encuentran en los lmites de un dominio funcional, aunque no siempre.

EN VIRUS: ADN o ARN condensado dentro de las partculas virales por interacciones inespecficas con protenas de la cpside

VMT: ARN en hlice dentro de la cpside

CROMOSOMA EN PROCARIOTAS
Cromosomas circulares (la mayora)

LISIS

E.coli

Lisis: fibras en forma de bucles unidas a la envoltura rota de la clula. El ADN se une a protenas bsicas.

Clula de mamfero visualizada mediante microscopio ptico (contraste de fases)

A diferencia de lo que ocurre en las clulas procariotas, el ncleo permite un mecanismo de regulacin de la expresin gnica ms complejo
ARNm ARNt premiRNA preribosomas ARNsn Protenas ribosmicas snRNP

Protenas nucleares

El ncleo en interfase
La envoltura nuclear separa el contenido del ncleo del citoplasma y proporciona un armazn estructural al ncleo.

Envoltura nuclear
Es una membrana doble que rodea al ncleo. La membrana nuclear tiene poros por donde pasan algunas molculas desde el ncleo al citoplasma y viceversa. Los poros nucleares son estructuras complejas que contienen por lo menos ocho subunidades proteicas con un canal pequeo en el centro.

Componentes de la envoltura nuclear

Lmina Nuclear
Red de protenas fibrosas Modelar y reforzar la Membrana Interna Reforzar los complejos de poro nuclear Fijar la cromatina a la Membrana Interna

Complejo del poro nuclear

Hay aproximadamente 2.000 complejos de poro en un ncleo

cyt. coaxial ring

thin ring

star ring

spoke ring

nuc. coaxial ring

NPC basket

cytoplasm outer nuclear membrane

perinuclear space
inner nuclear membrane nucleoplasm

Bagley, S. et al

Transporte selectivo de protenas a travs del poro nuclear

Las protenas que se dirigen al ncleo. Histonas, ADN polimerasas, ARN polimerasas, factores de transcripcin, etc.

contienen una corta secuencia de aminocidos: la seal de localizacin nuclear.

Las seales de localizacin nuclear son reconocidas por protenas que funcionan como receptores de transporte nuclear. La mayora son miembros de la familia de protenas de la carioferina y funcionan como: Importinas (transportan macromolculas al interior del ncleo) Kap/Kapb1 Esnurportina/Kapb1 Kapb1 Kapb2 Importina 7/dmero Kapb1
Exportinas (exportan citoplasma) Crm1 CAS Exportina-t Exportina-4 macromolculas desde el ncleo al

Las pequeas protenas Ran unen GTP, se necesita para la traslocacin a travs del complejo del poro nuclear y determina la direccin del transporte. Ran es una GTPasa (superfamilia Ras) 2 formas: unida a GTP (principalmente en el nucleoplasma) unida a GDP (predonima en el citoplasma) La transicin entre las dos formas est mediada por 2 protenas: En el nucleoplasma: RanGEF (Factor intercambiador de guanina de Ran) En el citoplasma: RanGAP (Protena activadora de la Ran-GTPasa) Existe una elevada concentracin de Ran/GTP en el ncleo y una elevada concentracin de Ran/GDP en el citoplasma. Se cree que este gradiente de Ran/GTP determina la direccionalidad del transporte nuclear.

Distribucin de Ran/GTP a travs de la envoltura nuclear

PI RanGAP Ran GTP Ran GDP

Cytoplasm
Export NTF2

Nucleoplasm

GDP Ran GTP RanGEF

GTP Ran GDP

Importe de Protenas
Pasos: 1- Unin ImportinaRan/GDP a Protena 2- Unin a filamentos citoplasmticos del poro 3- En el ncleo el GDP es cambiado a GTP y se libera la protena 4- Complejo Importina Ran/GTP se exporta 5- Regeneracin del Ran/GDP

Exportacin de Protenas

Regulacin del transporte de Protenas

Transporte de ARN
pre-miRNA snRNA Exportin5 cap, CRM1 (Exportin1), PHAX

snRNP
ribosomal subunits

Importin
CRM1 (Exportin1)

Transporte de ARN
Proceso activo, depende de Energa Exportados como complejos ribonucleoprotenas (RNPs). Protenas del complejo poseen seales de exportacin nuclear reconocidas por receptores. ARNr se asocian a protenas ribosmicas y especficas. Las subunidades nacientes se exportan. Los ARNsn se exportan y luego se importan

Transporte de ARN mensajero En este caso, Ran no es necesaria

se utiliza una protena heterodimrica exportadora de mRNA
Por qu se necesita de otro sistema de transporte para los ARNm? Antes de ser exportado deben ocurrir: Adicin del capuchn 5 Adicin de la cola poli A Corte y empalme El ARN inmaduro no debe ser enviado al citoplasma Por lo tanto, la exportacin de ARNm est ligada a: transcripcin procesamiento Cmo se encuentra el ARNm en el ncleo?

Transporte de ARN mensajero

El ARNm est asociado a:
Protenas de unin a 5 cap

Protenas de unin a cola 3 poliA splicing factors Factores generales de unin a RNA (protenas de unin a exones) Otros factores involucrados en el procesamiento de premRNA

Transporte de ARN mensajero

El transporte se puede resumir en tres pasos: 1. Ensamblaje de complejos mRNP de exportacin
- control de calidad

2. Translocacin a travs de NPC 3. Desarmado de complejos mRNP de exportacin

Transporte de ARN mensajero

translation

3. mRNP disassembly
mature mRNP

dissociate Mex67

Cytoplasm 2. translocation Nucleoplasm

mature mRNP attach Mex67

1. mRNP assembly

processing splicing transcription gene

Transporte de ARN mensajero

Dbp5

x
x Mex67p Mtr2 Mtr2 Mex67p x Mex67p Mtr2 CBC 55

Ensamblaje

Estructura del ncleo de la clula

Organizacin interna del ncleo

Transcripcin de ARNr: organizador nucleolar

Transcripcin de ARNr: organizador nucleolar

Los organizadores nucleolares se encuentran en los satlites de los cromosomas acrocntricos humanos

El ADN para el ARNr 5S se encuentra en una secuencia repetida en el cromosoma 1 y se transcribe por separado

Organizacin Interna del ncleo En el nuclolo se distinguen.

F: FC: Centro fibrilar D: DFC: Componente fibrilar denso G: Componente granular

Organizacin Interna del ncleo

El ncleo eucariota contiene adems de nuclolo una variedad de estructuras subnucleares dinmicas Cuerpos de Cajal
-Protena coilina -Ensamblaje de snRNP -Modificacin de U snRNA -Procesamiento del extremo 3 de mRNA de histonas -Regulacin del ciclo celular -Ensamblaje de factores de transcripcin -Sealizacin en apoptosis

Organizacin Interna del ncleo

Cuerpos PML -Aumentan de 2 a 10 cuerpos hasta 50 en clulas neoplsicas. -Protena promieloctica + factores implicados en regulacin transcripcional (factores de transcripcin). - Funcin desconocida. -La protena PML se une al receptor de cido retinoico en la leucemia PML, marcador tumoral.

Organizacin Interna del ncleo

Cuerpos PML y Cuerpos de Cajal se asocian

Cuerpos PML y Cuerpos de Cajal se asocian Coilina-GFP (fluorescencia verde en Cuerpos de Cajal) + Anticuerpo anti PML (Fluorescencia roja)

Organizacin Interna del ncleo

Cuerpos PML y Cuerpos de Cajal se asocian entre s y con el locus U2

Anticuerpo anti Coilina (fluorescencia roja en Cuerpos de Cajal) + Anticuerpo anti PML (Fluorescencia azul) + sonda que hibrida con gen U2 (verde).

Organizacin Interna del ncleo

Organizacin de los cromosomas en el ncleo