Brucelosis un problema presente para la Salud Publica

Genero Taxonoma Genoma Caractersticas metablicas Relacin MO-husped Relacin MO-ambiente

Especializacin en Seguridad Alimentaria

Martinez, 15 de junio de 2012

Prof. MV Bact. Cecilia Di Lorenzo . Catedra de Inmunologa I parte. Carrera de Microbiologa Clnica e Industrial .

Conceptos para recordar: Un solo mundo de medicina veterinaria, OIE Un mundo una salud
(OIE,OMS,FAO)

Enfoque interdisciplinario no multidisciplinario

Notas para recordar

La brucelosis, tambin llamada fiebre malta o fiebre ondulante, es una enfermedad bacteriana (infecciosa) que afecta a varias especies de mamferos dentro de los cuales se encuentra el hombre, causando la brucelosis humana. El capitn David Bruce fue enviado a Malta y condujo una investigacin a partir de 1884. El aisl un agente llamado Micrococcus melitensis de bazos humanos de pacientes hospitalizados que haban consumido leche de cabra cruda. El profesor L.F. Benhard Bang, patlogo veterinario y bacterilogo Dans, describi un organismo causante de abortos en ganado en 1895 llamado Bacillus abortus. En 1914 en Estados Unidos, fue aislada la especie Brucella de un feto de cerdo abortado la cual fue llamada B. suis

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-1887, David Bruce aisla una bacteria a partir del bazo de un soldado ingls muerto en Malta tras sufrir una enfermedad caracterizada por un cuadro febril ondulante. Bruce denomina a esta bacteria Micrococcus melitensis

1897 Bernhard Bang descubre una bacteria causante de abortos en vacas a la que denomina Bacillus abortus

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1914 Temistocles Zammit demuestra que la brucelosis se transmite por el consumo de leche de cabra

1917 Alice Evans demuestra que la leche de vaca tambin transmite la brucelosis. Asocia la enfermedad al Bacillus abortus de Bang al que renombra como Brucella abortus

1931 Forrest Huddleson reconoce el microorganismo causante de la brucelosis en cerdos como una especie nueva: Brucella suis
1966 Leland Carmichael descubre una nueva especie a la que denomina Brucella canis por aislarse de casos de abortos en perros. Esta especie se demuestra capaz de infectar a las personas

BRUCELOSIS
Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

AISLAMIENTO DE LAS ESPECIES DE Brucella

1886 - Bruce - Br. melitensis del hombre 1897 - Bang - Br. abortus de bovinos 1914 - Traum - Br. suis de porcinos 1953 - Buddle y Boyes - Br. ovis de ovinos

1957 - Stoenner y Lackman - Br. neotomae de ratas

1966 - Carmichael - Br. canis de caninos 1994 Ross et al Br. cetaceae de delfines 1994 Ross et al Br. pinnipediae de focas
Laboratorio de Inmunologia

2000.- Skol Br. microti

Clasificaciones filogenticas
La informacin gentica de los seres vivos se encuentra codificada en la secuencia de bases del ADN.

La clasificacin filogentica se fundamenta en las relaciones genticas generales que tienen las bacterias sobre la base de antepasados comunes

El estudio del genoma demuestra que la composicin de bases es constante y caracterstica para cada microorganismo.

Para su realizacin se emplean tcnicas de biologa molecular con el fin de conocer el ADN (cromosmico o extracromosmico) y el ARN.

Actualmente se utilizan varios parmetros combinados para determinar las relaciones ADN, como son: tamao del genoma, contenido de guanina ms citosina, estabilidad trmica de las secuencias afines de ADN relaciones del ADN mediante hibridacin.

Por otro lado, el ARN ribosmico (ARNr), por su carcter ancestral en la biosntesis de protenas, presenta ms homologa entre microorganismos diferentes que el ADN, y parece ser un buen candidato para la medida de la distancia evolutiva.

A medida que los organismos sufren procesos de mutacin, recombinacin, o transduccin sus genomas cambian de tamao, composicin y secuencia de bases, cumplindose la teora de Darwin de la seleccin de las especies que mejor se adaptan al medio, es decir, la evolucin.

Divisin BXII. Proteobacteria Clase I Alphaproteobacteria

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Orden I Rhodospirillales
Familia II Acetobacteraceae Gnero I Acetobacter Gnero IX Gluconobacter Orden II Rickettsiales FamiliaI Rickettsiaceae Gnero I Rickettsia Orden VI Rhizobiales Familia I Rhizobiaceae Gnero I Rhizobium Gnero II Agrobacterium Family III Brucellaceae Gnero I Brucella

Pertenecen al grupo de las alfaproteobacterias y mas especficamente a la clase Rhizobiales.

Br.maris

B suis Cepa B. ovis

B.suis

B.suis B.canis B.suis

B.suis

B.suis B.canis

B.suis

Br.maris

Hoy se plantea el genero como mono especie: Brucella melitensis El resto se las considera biovariedades y se las denomina

Brucella melitensis variedad melitensis B. Brucella melitensis variedad suis (porcinos, liebres,ciervos, bisontes,etc ) Brucella melitensis variedad abortus (bovinos)
Brucella melitensis variedad neotomae (roedores: meriones ) Brucella melitensis variedad ovis (ovejas) Brucella melitensis variedad canis (caninos) Brucella melitensis variedad maris (delfines, marsopas, ballenas, focas), Brucella melitensis variedad microti (zorros rojos, roedores de campo), Brucella melitensis variedad inopinata, recientemente descrita (2009), aislada de una infeccin en implante mamario de una paciente de 71 aos.

Brucelosis

Genero
Caractersticas Microscpicas Gram negativos

Inmviles No Poseen cpsula No poseen plasmidos

Son bacilos pequeos de 0.6-1.5 micras de longitud y 0.5-0.7 de dimetro

Coloracin de Gram

Laboratorio de Inmunologia
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 Vida endocelular

Principales caractersticas del Genero

cocobacilo, aerbico

Gram negativo
No poseen capsulas Son inmviles No son esporulados Parsitos intracelulares facultativos Particular perfil metablico Producen una infeccin de por vida en los animales
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Caractersticas Macroscpicas

Colonias regulares, brillantes, traslucidas, pequeas, convexas. gotas de roco Crecimiento lento

Repique de 72hs. B abortus

Relacin con el Husped

Genero fuertemente adaptado al husped Crece y se reproduce dentro de una gran variedad de clulas.

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Los cultivos lisos de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento, especialmente con subcultivos, y aparecen formas rugosas (R). Las colonias son entonces mucho menos transparentes, presentan una superficie mate ms granular y el color vara de blanco mate a marrn con luz reflejada o trasmitida.

Laboratorio de Inmunologia. Dra La comprobacin de esta transicin se realiza Lorenzo Cecilia Di fcilmente por tincin con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo plido.

Por lo general, los cambios de morfologa colonial se asocian con cambios en la virulencia, en las propiedades serolgicas y/o en la sensibilidad a los fagos. La aglutinacin positiva con un antisuero anti-Brucella es una identificacin preliminar de que el aislado corresponde a Brucella.

La identificacin posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia.

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Si las colonias son lisas deben probarse con antisuero contra B. abortus lisa, o preferiblemente con antisueros monoespecficos contra los antgenos de superficie A y M. En el caso de colonias rugosas, las colonias deben probarse con antisuero contra el antgeno R de Brucella.

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La mayora de las especies son Catalasa positivas y Oxidasa positivo , solo son negativos a la oxidasa: B. ovis B. neotomae
Son aerobios estrictos a excepcin B. ovis y B. abortus, son microaerobias (5-10% de CO2)

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Requerimientos de Cultivo
Necesita medios enriquecidos complejos, por requerir de ciertos animocidos , tiamina, biotina, nicotinamida, pantotenato de calcio y trazas de magnesio. Se usan medios con suero Medio enriquecido Albimi Medio Selectivo Farrel ( ac nalidixico)

Cultivos de 72 hs

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Brucella canis Lab de Inmunologia. FCV. UNLP

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Genero Brucella

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BRUCELFAGOS 6 grupos de fagos :

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Tipo 1:: Tbilisi B.abortus en fase S SI o I Tipo 2: cepa Firenze75/13 . B.abortus S SI I y B.suis(4) Tipo 3:: cepa Weybridge B.abortus S SI I y B.suis

Tbilisi Tipo 4: Berkeley BK0 BK1 Y BK2 Formas S abortus,neotomae,suis Tipo 5: R/O ,R/C Formas R de Brucella Tipo 6: Tzatnagar Iz Cultivos S,SI,I de abortus,melitensis,neotomae y suis.
El patrn de sensibilidad a los fagos muestra una gran vinculacin con la actividad de oxidacin metablica, definen : especie
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B abortus inhibida por Thionina

B suis inhibida por Fucsina Cecilia Di Lorenzo

Laboratorio de Inmunologia. Dra

Aglutinacin con sueros monoespecficos.Laboratorio de Inmunologia. Prof Cecilia Di Lorenzo

Se emplean el suero monovalente A y en monovalente M. El R se utiliza solo cuando se sospecha de B. canis o de otra especie rugosa natural.

Procedimiento : Una ansada del cultivo en 0,5 ml de suero en poratojetos

Genoma de Brucella: 2 replicones

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Chr I 2,1 mega bases Tpico bacteriano

Chr II 1,1, megabases Tpico plasmido

Funcionalmente absolutamente complemetarios Laboratorio de Inmunologia 98% de correspondencia entre especies

 Genero Brucella Especie : Brucella melitensis Biovares: melitensis abortus suis canis ovis neotomae maris

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RESERVORIOS COMUNES DE LA ESPECIE DE BRUCELLA

ESPECIE

BIOVAR.

HOSPEDERO

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PATOGENICIDAD EN HUMANOS

Br. melitensis Todas

Br. abortus Br. suis Todas 1, 3

Caprinos/ovinos
Bovinos Porcinos

+
+ +

2
4 Br. canis

Porcinos, liebres
Caribus, renos Caninos

+ +

Br. ovis
Br. neotomae Br. maris

Ovinos
Ratas de campo

+ Ballenas, delfines, bufeos

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Focas, leones marinos

Constitucin del Lipopolisacarido

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Brucella : aminoglycose y acidos grasos

Glucose,mannose and quinovosamina

Homopolymer 100 residues of 4 dideoxymannose

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Brucella lisas
B.abortus B.melitensis

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B.suis

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Brucella ovis y Brucella canis

Son cepas naturalmente RUGOSAS

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LPS : Brucella

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Cepas Lisas o S

Cepas Rugosas

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LPS Rugoso
Cadena O de tipo R

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Mtodo para identificacin de fase

Mtodo de Henry : iluminacin a 45

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Mtodo para identificacin de fase

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Mtodo de Wilson
(Coloracin con Cristal Violeta)

CV

Cultivo de 48 hs + Sol de Cristal Violeta por 30

Se vuelca el colorante y se observa en Lupa

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Cambios en la morfologa de las colonias son generalmente asociados con cambios en la virulencia.

Diagnostico Directo
Coloraciones especificas : Coloracin de Stamp Aislamiento: sangre - hemocultivo fetos placenta semen Poner en evidencia el agente: Tcnicas de biologa molecular

PCR

Coloraciones especificas: Coloracin de Stamp

Coloracin de Stamp
15m Volcar Y Lavar con agua corriente

1/10

20-30

Volcar Y Lavar con agua corriente

0,5% Volcar Y Lavar con agua corriente

10

Coloracin de Stamp

Puntillado o cadenas cortas rojas sobre fondo azul

HEMOCULTIVO
Puncin venosa (2-5 ml ) Colocar en medio para hemocultivo y homogeneizar Mantener a Temp ambiente hasta llevar al Laboratorio

Marcha Bacteriolgica
Stamp +

Siembra ATS con 10% de suero estril

Gram -

Colonias pequeas como gotas de roco

24 48 - 72 hs 37C

Aisalmiento en Leche y derivados

Leche: centrifugar a 10000 rpm 15 minutos Sembrar en medios selectivos por separado grasa y sedimento Por 15 das Queso: porciones de 1 grs en medio liquido selectivo, durante 15 das . Repicar a medios solidos selectivos.

Con y sin 10 % CO2

PCR en leche y queso

T1: Hidrogeno Sulfurado

T2: Movilidad (agar semisolido) T3: Ureasa ( Medio Bauer) Oxidasa Catalasa
Coloracin de Stamp Oxidasa Catalasa Urea Hidrgeno Sulfurado Movilidad Positiva Positiva, Positva dbil Positiva Positiva, indicar tiempo Negativo durante 4 dias Inmvil

T1
Negativo

Bacterias compatibles con el genero Brucella T2

Negativo

T3
Positivo

Enviamos a Laboratorio de Referencia para confirmacin por fagolisotipia Oxidacin metablica , biologa molecular y determinacin de especie

Ureasa

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rea Urea de Christensen (Rojo de Fenol)

Buenos Aires Modificado Indicador de Andrade y Azul de Timol

Cronometrar tiempo de reaccin

Pos
Laboratorio de Inmunologia

Neg

Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

Urea Rpida

Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

Prueba de Catalasa positiva (Ansada en H2O2 )

Prueba de Oxidasa positiva / positiva dbil (Parafenilendiamina)

Laboratorio de Inmunologia

Movilidad

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Agar semislido

Laboratorio de Inmunologia

Hidrogeno sulfurado

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ATS en pico de flauta

Con papel con acetato de plomo por 4 das ( cambio diario)

Laboratorio de Inmunologia

T1: Hidrogeno Sulfurado

T2: Movilidad (agar semisolido) Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia T3: Ureasa Di Lorenzo Oxidasa Catalasa
Coloracin de Stamp Oxidasa Catalasa Urea Hidrgeno Sulfurado Positiva

Positiva, Positva dbil Positiva Positiva, indicar tiempo Negativo durante 4 dias Inmvil

T1
Negativo

Bacterias compatibles con el genero Negativo Positivo Brucella Enviamos a Laboratorio de Referencia para confirmacin por fagolisotipia Oxidacin metablica , biologa molecular y determinacin de especie
Laboratorio de Inmunologia

T2

T3

Movilidad

Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

Diagnostico Indirecto

Laboratorio de Inmunologia

MUESTRAS

Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

VIA DE EXTRACCIN - VOLUMEN (4 -5 ml.) - INSTRUMENTAL A UTILIZAR CALIDAD : - HEMOLISIS - CONTAMINACIN TIPO : - SANGRE ENTERA : refrigerada - SUERO: frizado EMBALAJE
Laboratorio IDENTIFICACIN de Inmunologia

BRUCELFAGOS
6 grupos de fagos :

Tbilisi

Tipo 1:: Tbilisi B.abortus en fase S SI o I Tipo 2: cepa Firenze75/13 . B.abortus S SI I y B.suis(4) Tipo 3:: cepa Weybridge B.abortus S SI I y B.suis

Tipo 4: Berkeley BK0 BK1 Y BK2 Formas S B.abortus,B.neotomae,B.suis Tipo 5: R/O ,R/C Formas R de Brucella Tipo 6: Tzatnagar Iz Cultivos S,SI,I de B.abortus,B.melitensis,B.neotomae y B.suis. El patrn de sensibilidad a los fagos muestra una gran vinculacin con la actividad de oxidacin metablica, definen :

ESPECIE

Genero Brucella

Brucella lisas
B.abortus B.melitensis B.suis

Brucella ovis Brucella canis Brucellla maris

RUGOSAS

Genoma de Brucella: 2 replicones

Chr I 2,1 mega bases Tpico bacteriano

Chr II 1,1, megabases Tpico plasmido

Funcionalmente absolutamente complemetarios 98% de correspondencia entre especies

Estudio de genoma de Brucella

No posee plasmidos como factor de virulencia Vas metablicas oxidativas Identificado vas metablicas bsicas faltantes Relacin husped Imposibilidad de ciclo libre 98% de correspondencia entre especies

Pruebas Moleculares: PCR

M-

B. suis

B. abortus RB51 B. abortus S19 B. Abortus campo

B. canis

1682

794 587 450

272 152

M-

B. suis

B. abortus RB51 B. abortus S19 B. Abortus campo

B. canis

1682

794 587 450

272 152

M-

B. suis

abortus RB51

. abortus S19

. Abortus campo

B. canis

1682

587

794

272 450

152