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Espectrometra de fluorescencia

La espectrometra de fluorescencia es un tipo de espectroscopia electromagntica que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las molculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energa, generalmente luz visible.

Molcula en estado fundamental

e- en nivel energtico superior con espines opuestos SINGLETE

h
SINGLETE e- en nivel energtico superior con espines paralelos TRIPLETE

Transicin PERMITIDA FLUORESCENCIA Estado excitado SINGLETE


Rpido retorno al estado fundamental Tiempo de vida 10ns

Transicin PROHIBIDA FOSFORESCENCIA


Estado excitado TRIPLETE Velocidad de emisin lenta Tiempo de vida minutos a horas

So la energa en estado fundamental Lneas gruesas superiores son los niveles de energa de los estados vibracionales fundamentales de tres estados excitados. S1 y S2 estados electrnicos sencillos o singletes T1 la energa del primer estado electrnico triple (de energa menor que la energa correspondiente al estado singlete) Las transiciones de absorcin ocurren del estado fundamental sencillo (So ) hacia varios niveles vibracionales DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980) sencillos excitados (S1 y S2 ) No se muestra la transicin al estado excitado triple porque hay cambio de multiplicidad, tiene una baja probabilidad de suceder (transicin prohibida)

Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un tomo o una molcula excitada liberan su exceso de energa y se relajan a su estado fundamental. Dos de las ms importantes de estos mecanismos son la relajacin (desactivacin) no radiante y la relajacin fluorescente.

Relajacin vibracional Relajacin no radiante Conversin interna

La relajacin vibracional , sealada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energa vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre molculas excitadas y las molculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energa vibracional se transfiere a las molculas del disolvente La ganancia de energa vibracional del disolvente se refleja en un ligero incremento de la temperatura del medio.

Tambin puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado electrnico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrnico. Este tipo de relajacin corresponde a la conversin interna, se ilustra por las flechas onduladas largas. El fenmeno de fluorescencia se produce cuando las molculas electrnicamente excitadas se pueden relajar a cualquiera de los estados vibracionales del estado electrnico fundamental. El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por fluorescencia es rpida con respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal emisin. Es decir, si un camino sin radiacin tiene una constante de velocidad favorable, la fluorescencia no tiene lugar.

Relajacin vibracional 10-10 - 10-13 s Fluorescencia 10-9 - 10-4 s

Se observa que las bandas de fluorescencia molecular estn formadas principalmente por bandas que tienen longitudes de onda mayores y, por tanto, energas menores que la banda de radiacin responsable de su excitacin. Este fenmeno se conoce como desplazamiento de Stokes. En aquellos casos en los que la radiacin absorbida sea emitida sin cambio en la longitud de onda (misma energa) se conoce como radiacin de resonancia o resonancia fluorescente.

l excitacin / nm 400 350 300

(a)

Espectro de fluorescencia de antraceno en etanol. a) Espectro de excitacin b) espectro emisin

(b)

300

350 l emisin / nm

400

Fluorescencia de la quinina

Fluorescencia

emisin excitacin

Longitud de onda (nm)

RENDIMIENTO CUNTICO

F =

Nmero de fotones emitidos como fluorescencia Nmero de fotones absorbidos 0 < F > 1

Funcin de la velocidad del proceso de desactivacin por emisin/ velocidad de otros procesos de desactivacin

KF F K F K CI K CS

Los rendimientos cunticos de fluorescencia y de fosforescencia de una sustancia pueden medirse fcilmente comparando su emisin con la de una sustancia patrn de rendimiento cuntico conocido.

FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA DEL COMPUESTO

1. 2.

Rendimiento Cuntico Estructura molecular


DEL ENTORNO QUMICO

1. 2. 3.

Disolvente Temperatura pH

FACTORES DEL COMPUESTO

Extensin del sistema de electrones p Rigidez estructural Efecto de tomo pesado interno Formacin de complejos organometlicos Efectos de los sustituyentes

Extensin del sistema de electrones p

Transiciones pp* de grupos funcionales. Grupos carbonilo en estructuras alifticas. Estructuras con dobles enlaces conjugados En este tipo de sistemas la KF es mayor con respecto a las constantes de relajacin no radiante

Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y -OR aumentan la eficacia de la fluorescencia, desplazndola a mayores l.

Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y NO2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transicin n-p *.
Los grupos sulfnicos no modifican significativamente la fluorescencia

Rigidez estructural

Entre menor sea la rigidez de una molcula provoca el aumento en KIC (la constante de conversin interna) y el correspondiente aumento en la relajacin no radiante

Efecto del sustituyente heterotomo


F

FLUORESCENCIA RELATIVA 100%

Cl

7%
Br

0.2%
I

Las interacciones espn orbital aumenta con estos tomos Provocando el cambio de espn y favoreciendo la fosforescencia

<0.05%

Viscosidad

Solvente

FACTORES DEL ENTORNO QUMICO

pH

Temperatura

EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y DEL DISOLVENTE 1. Al aumentar la temperatura, la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura se eleva incrementa la probabilidad de desactivacin por conversin externa (interaccin y la transferencia de energa entre la molcula excitada y el solvente). 2. Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta la probabilidad de la conversin externa y conduce al mismo resultado. 3. La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia de disolventes que contienen tomos pesados o de solutos con dichos tomos en su estructura; como por ejemplo, el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo.

EFECTO DEL pH Compuestos aromticos con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo dependen del pH. Este fenmeno se asocia por el nmero de especies resonantes.

La potencia de la radiacin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitacin que es absorbido por el sistema. F = K' (P0 - P)

donde P0 es la potencia del haz incidente sobre la disolucin y P es su potencia despus de atravesar la longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuntica del proceso de fluorescencia. Con objeto de relacionar F con la concentracin (c)

sustituyendo nos queda:

F = K' P0 (1 10-ebc)

Si desarrollamos el trmino exponencial como una serie de Maclaurin

Siempre que 2.303ebc =A < 0. 05 podemos despreciar los trminos posteriores

F = K' P0 2.303ebc
y si P0 se mantiene constante

F = Kc

Cuando c es suficientemente elevada como para que la absorbancia multiplicada por 2.303 sea mayor que 0.05, los trminos de mayor orden de la expresin anterior no son despreciables y la linealidad se pierde.

Filtro o
Monocromador

Radiacin dispersada Muestra

de excitacin Fuente

Atenuador del haz

Filtro o
Monocromador

de emisin

Fotomultiplicador de referencia Amplificador diferencial

Fotomultiplicador de la muestra

Dispositivo de lectura

Los componentes bsicos de estos aparatos son:


1. Fuente de luz de excitacin (energa radiante): Se pueden emplear lmparas de arco de xenn o lmparas de mercurio 2. Rendijas de excitacin y emisin: Son iguales a las del espectrofotmetro(orientan el haz de luz) 3. Monocromadores (de excitacin y de emisin): 4. Monocromadores de excitacin: para seleccionar la longitud de onda de excitacin deseada. 5. Monocromadores de emisin: para eliminar las longitudes de onda emitidas no deseadas 6. Celdas: De slice o cuarzo. Las de plstico pueden causar fluorescencia adicional con prdida de sensibilidad. 7. Detector: Fotomultiplicadores.

La mayor ventaja => su enorme sensibilidad y selectividad por el aumento de la intensidad de la radiacin de excitacin. La seal depender => del solvente, pH, temperatura, de la absorbancia de luz por la solucin, de interferentes que aporten fluorescencia no deseada Aplicaciones En bioqumica: - anlisis de alimentos y frmacos. En bioqumica clnica: - muestras biolgicas de iones, enzimas, coenzimas, vitaminas, algunos medicamentos, etc. Su gran aplicacin es el fluoroinmunoanlisis que utiliza Ac marcados con una sustancia fluorescente, especficos de la sustancia a estudiar.