AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE CAMPYLOBACTER Y HELICOBACTER PYLORI

REALIZADO POR: ALVAREZ OVIEDO. Gabriela MAMANI COTA, William MARROQUIN ESCALANTE, Nadia TARMEO TORRES, Angel

Hasta hace poco tiempo solo era posible conocer la etiologa de las enfermedades diarreicas en un porcentaje relativamente bajo. En los ltimos aos, se incluy dentro del espectro de agentes microbianos a nuevos enteropatgenos como son los Rotavirus, Criptosporidium, Aeromonas y las especies termfilas de Campylobacter.

INTRODUCCIN

Los miembros de este gnero son tpicamente bacterias Gram negativas, que no forman esporas, con forma de S o espiral Con flagelos polares en uno o a ambos extremos, lo que le da una movilidad caracterstica (sacacorchos) Son microaerfilas (requiere oxgeno pero a ms bajas concentraciones de las encontradas en la atmsfera) Algunas pueden crecer tambin aerbicamente o anaerbicamente. No fermentan ni oxidan los carbohidratos. Son causa principal de enfermedades intestinales bacterianas en humanos

CAMPYLOBACTER

Algunas especies, particularmente C. jejuni, C. coli y C. lari, son termfilas, y crecen ptimamente a 42C. La fuente de infeccin por C.jejuni/coli en humanos es la manipulacin y/o el consumo de carne contaminada, especialmente carne de aves de corral. Sin embargo, el contacto con animales domsticos y con ganado, el consumo de agua contaminada o de leche cruda

Se recolectan muestras fecales o intestinales (ciego) de aves de corral, de mamferos productores de carne y animales domsticos. En el matadero, se recogen muestras de piel o de carne. Los campilobacters son organismos bastante difciles de cultivar.

IDENTIFICACIN DEL AGENTE

Aves de corral: C. jejuni (65-95%). Ganado vacuno y ovejas: El ganado vacuno y las ovejas son colonizados fundamentalmente por C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis y C. fetus. Cerdos: C. coli. Perros y gatos: Los perros y los gatos se encuentran colonizados frecuentemente por C. upsaliensis (perros) y C. helveticus (gatos). rganos internos (corazn, bazo, hgado o contenidos estomacales): Los rganos se extraen post-mortem en condiciones aspticas y se envan al laboratorio el mismo da.

RECOGIDA DE MUESTRAS

Son muy sensibles a la deshidratacin, oxgeno atmosfrico, luz solar y temperatura elevada. no deben transportarse como frotis secos, ya que los campilobacters se secaran y moriran rpidamente. Se deben evitar temperaturas altas (>20C), temperaturas bajas (<0C) El Amies, un agar simple o un medio con base de carbn vegetal sirve como medio de transporte ya que su funcin no es el crecimiento de Campylobacter sino proteger a las muestras de la sequedad y de los efectos txicos del oxgeno.

TRANSPORTE Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS

Medios selectivos para aislamiento

Se utilizan cefalosporinas (generalmente cefoperazona), a veces en combinacin con otros antibiticos (por ejemplo vancomicina, trimetroprim). Se utiliza cicloheximida (actidiona) y ms a menudo anfotericina B para inhibir a las levaduras y a los hongos. Los medios selectivos se pueden dividir en dos grupos fundamentales: medios que contienen sangre y medios que contienen carbn que sirven para eliminar los derivados txicos del oxgeno.

AISLAMIENTO DE CAMPYLOBACTER

Ejemplos de caldos de enriquecimiento selectivos:

Caldo Bolton Caldo Preston Caldo Exeter

Ejemplos de medios slidos selectivos con sangre:

Agar Preston Agar Skirrow Agar Butzler Campy-cefex

Ejemplos de medios slidos con base de carbn

mCCDA (agar modificado con deoxicolate, cefoperazona y carbn), versin ligeramente modificada de la CCDA descrita originalmente). Agar Karmali o CSM (medio de carbn selectivo) Agar CAT (cefoperazona, anfotericina y teicoplanina), facilitador del crecimiento de C. upsaliensis.

El mtodo se basa en la separacin de Campylobacter del resto de la flora microbiana presente en las heces, de esta manera se obtiene un cultivo selectivo, situacin que reemplaza a la adicin de antibiticos.

Filtracin pasiva

Se puede confirmar con prueba de catalasa y oxidasa (positivas). Tincin GRAM de las colonias sirve de ayuda. 24 a 48 horas en A. sangre: espiraladas curvas, en alas de gaviota, en S, alargadas. Cultivos viejos: formas cocoides.

Identificacin:

Entre las especies de Campylobacter spp. que crecen a 42C, las que se encuentran ms frecuentemente en muestras de origen animal son C. jejuni y C. coli. C. jejuni se puede diferenciar de otras especies de Campylobacter sobre la base de la hidrlisis de hipurato (es un compuesto orgnico aromtico que puede ser hidrolizado enzimticamente originando benzoato y glicina) ya que es la nica especie que da positiva a hipurato.

IDENTIFICACIN DE CAMPYLOBACTER A NIVEL DE ESPECIE

Colocar una colonia sospechosa sobre un porta de vidrio. Poner una gota de H202 al 3% sobre el material bacteriano. Examinar inmediatamente la produccin de gas, lo que indica actividad catalasa. La prueba es positiva si aparecen burbujas de gas en 30 segundos.

Deteccin de actividad catalasa:

DETECCIN MOLECULAR DE CAMPYLOBACTER

Se han presentado previamente en la literatura mtodos basados en PCR para la deteccin de Campylobacter en muestras de heces animales y en muestras de carne enriquecida.

PRUEBAS BASADAS EN LA CAPTURA DEL ANTGENO

Existen varios enzimoinmunoensayos disponibles comercialmente para la deteccin de Campylobacter en muestras de deposiciones animales.

OTRAS DETECCIONES

H. pylori es un microorganismo Gram negativo, curvo, mide aproximadamente 3.5 x 0.5 mm, Posee mltiples flagelos en uno de sus polos y es activamente mvil, es microaeroflico y coloniza la capa de moco que cubre el epitelio gstrico.

HELICOBACTER PYLORI

Modo de infeccin de H. pylori:

H. pylori penetra la capa mucosa del estmago y se adhiere a la superficie de la capa mucosa epitelial gstrica. Produce amonaco a partir de la urea, para neutralizar el cido gstrico. Migracin y proliferacin de H. pylori al foco de infeccin. Se desarrolla la ulceracin gstrica con destruccin de la mucosa, inflamacin y muerte de las clulas mucosas.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HELYCBACTER PILORY

Se produce hidrlisis de la urea provocando liberacin de CO2 y NH4, por lo tanto aumento del pH, lo que manifiesta por un cambio en el color de un indicador cido-base. pruebas comerciales : CLOtest, PyloriTek y Hpfast, tienen alta sensibilidad y especificidad y un tiempo de lectura corto, que puede ser desde un minuto a 24 horas .

Ureasa rpida:

CULTIVO

La muestra para el estudio bacteriolgico es una biopsia que debe ser macerada. Agar sangre sin antimicrobianos y las placas se incuban en microaerobiosis por 5 das a 35C. A los cinco das de incubacin en una muestra positiva se obtienen colonias de aproximadamente 1mm de dimetro, claras, transparentes, brillantes y convexas, que a la tincin de Gram muestran bacilos curvos Gram negativos, que son ureasa, catalasa y oxidasa positivos.

Puede realizarse en biopsia o en cortes histolgicos, en ambos casos con tinciones como Gram, HE, impregnaciones argnticas y recientemente se ha utilizado con mucho xito la coloracin con azul de toluidina.

Deteccin microscpica de la bacteria

Mtodos no invasivos:

Metodos De Diagnostico Serologico

GRACIAS