TEMA 2

PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS ANIMALES PLANTAS MICROORGANISMOS

CULTIVOS CELULARES

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Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de aplicacin industrial. Presentan numerosas ventajas
Los microorganismos son muy verstiles y tericamente se puede encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto. Los microorganismos pueden ser modificados genticamente para producir mayor cantidad de enzima. La recuperacin de las enzimas microbianas suele ser fcil, puesto que, generalmente, son extracelulares. La produccin de enzimas microbianas requiere materias primas fciles de conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos. Los microorganismos son fciles de cultivar, tienen velocidades crecimiento y de produccin de enzimas muy alta (baratas, abundantes) de

La tecnologa a gran escala para su produccin se encuentra hoy bien establecida. Fcil escalado Las enzimas microbianas son ms estables que sus homlogas de plantas y animales.

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ENZIMAS INTRACELULARES: permanecen en el interior de la clula.

Actan sobre sustratos de bajo peso molecular. Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acilasa, a-galactosidasa pullulanasa y lactasa.
Es necesaria la integridad de la clula para que se sintetice el enzima y preservar su estabilidad. Para obtener el producto es necesario romper las clulas y separar el producto de los restos celulares. Operacin difcil y costosa Las enzimas aparecen contaminadas con otras protenas intracelulares.

la separacin de las clulas del medio de cultivo permite obtener preparados muy concentrados que facilitan la purificacin

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ENZIMAS EXTRACELULARES: actan sobre sustratos de alto

peso molecular. Se sintetizan en grandes cantidades. Muy reguladas.

Hidrolasas

Dado que la molcula es segregada fuera de la clula, no se requieren tcnicas de ruptura celular que a veces son difciles de aplicar a gran escala. El nmero de protenas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fcil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura ms compacta y menos susceptibles a la desnaturalizacin que las correspondientes intracelulares.

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ETAPAS EN LA OBTENCIN DE ENZIMAS INDUSTRIALES

Seleccin de la fuente Produccin de clulas con un alto nivel de la enzima Rotura celular y eliminacin de los restos celulares (enzimas intracelulares) Concentracin y enriquecimiento Purificacin con alta resolucin (dependiendo de su uso final)

Concentracin y formulacin del preparado

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Maximizar la velocidad de sntesis concentracin para reducir costos. de enzima y su

Experimentacin previa en el laboratorio:

Ciclo celular. Requerimientos nutricionales. Constitutiva o inducible. Intracelular o extracelular. Mecanismos de control de su sntesis.

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN

Seleccin de una cepa, a partir del medio natural o de colecciones de cultivo. Factores a considerar:
criterios de seguridad:

daos sobre el producto (propio organismo o por un metabolito)

contaminacin con toxinas debe crecer en medios simples y baratos estable en sus propiedades genticas producir alta cantidad de producto en poco tiempo fcil de separar

ORGANISMOS TERMFILOS

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN

Mejora de estirpes
Incrementar la productividad de la enzima

Reducir o eliminar enzimas contaminantes

Conseguir su sntesis sin necesidad de inductores Permitir su sntesis en condiciones inadecuadas

1. Mutacin y seleccin
2. Hibridacin 3. Tecnologa de ADN recombinante

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Formulacin y preparacin del medio de cultivo: baratos y fciles de reproducir. Consideraciones:
Requerimientos nutricionales (C, N, P,S,O, Mg, Ca, etc) Propiedades de la enzima: Induccin Represin por catabolitos Inhibicin por producto Mecanismos de liberacin

ESTERILIZACIN EXTRACCIN DE LA BIOMASA Y RECUPERACIN DE ENZIMA

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Diseo del equipo y del proceso de fermentacin
FERMENTACIN EN SUSTRATO SLIDO: sustrato insoluble sin fase lquida libre El proceso est limitado a hongos Difcil medida de los parmetros del proceso Difcil control del pH, T, transferencia de oxgeno

La mayora de los sustratos requieren un pretratamiento

Medios de cultivo muy simples No suele haber contaminacin bacteriana- ESTERILIZACIN Enzima se recoge muy concentrado No es necesario mantener inculos FERMENTACIN SUMERGIDA

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PURIFICACIN
Consideraciones Generales

Necesidad de purificacin Prdida del enzima: prdida fsica inactivacin

pH y temperatura formacin de espuma Proteasas agentes quelantes.

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FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

Factor inactivante Fuente de enzima frecuencia Modo de contrarrestarlo

Calor Frio Proteasa Productos oxidacin de fenoles oxidacin Dilucin protena Prdida de estabilidad Inhibidores especficos Metales pesados Cambios de fase

cualquiera cualquiera mayora Plantas y hongos

universal raro Comn Bastante comn

Enfriamiento Calentamiento Inhibidores de proteasas o fro Agentes reductores

cualquiera cualquiera cualquiera Plantas y bacterias cualquiera cualquiera

comn Bastante comn Bastante comn Raro Raro comn

Agentes reductores Concentracin rpida Restauracin de ese factor Separacin del inhibidor Agentes quelantes Mnima agitacin

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EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

MATERIAL DE PARTIDA

ROTURA CELULAR

Detergente

Tratamiento con lcali

Tamizacin lquida

Agitacin con abrasivos

Tratamiento enzimtico

Choque osmtico

Tamizacin slida

ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

SEPARACIN SLIDO-LQUIDO

Centrifugacin CONCENTRACIN

Filtracin

Precipitacin

Adsorcin

Secado

Liofilizacin PURIFICACIN

Ultrafiltracin

Cromatografa

Sistemas en dos fases

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EXTRACCIN
CONSIDERACIONES PARTICULARES: SEGN LA NATURALEZA INTRACELULAR O EXTRACELULAR necesidad o no de rotura celular

SEGN LA FUENTE DE ENZIMA: Microorganismos Animales Vegetales

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ELECCIN DEL MTODO DE ROTURA

Susceptibilidad de la clula Caractersticas de estabilidad del enzima Velocidad del mtodo

Facilidad de separacin de los restos celulares

COSTE del proceso

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MTODOS DE ROTURA
1. Mtodos qumicos de lisis celular:
1.1 lcali 1.2 lisozima y EDTA 1.3 detergentes: inicos no inicos

2. Mtodos fsicos de lisis celular:

2.1 sonicacin 2.2 shock por enfriamiento 2.3 choque osmtico 2.4 congelacin y descongelacin 2.5 tamizacin slida 2.6 homogeneizacin con abrasivos 2.7 tamizacin lquida

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EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

MATERIAL DE PARTIDA

ROTURA CELULAR

Detergente

Tratamiento con lcali

Tamizacin lquida

Agitacin con abrasivos

Tratamiento enzimtico

Choque osmtico

Tamizacin slida

ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

SEPARACIN SLIDO-LQUIDO

Centrifugacin CONCENTRACIN

Filtracin

Precipitacin

Adsorcin

Secado

Liofilizacin PURIFICACIN

Ultrafiltracin

Cromatografa

Sistemas en dos fases

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CONCENTRACIN Y ENRIQUECIMIENTO
1er paso: Eliminacin de cidos nucleicos: pH alto, fuerza inica baja, nucleasas 2 paso: Eliminacin de restos celulares: Centrifugacin Filtracin

3er paso: Concentracin: Precipitacin Adsorcin Ultrafiltracin Secado Liofilizacin

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: CENTRIFUGACIN Centrfugas discontinuas

Centrfugas de flujo continuo:

De disco De rotor tubular De cestillo

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: FILTRACIN

Ultrafiltracin:
Opera a temperatura y presin baja Suave y no destructiva No hay inactivacin del enzima Econmica

Filtracin de flujo tangencial. Fcil escalado

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: CONCENTRACIN

Precipitacin
Sulfato amnico Solventes orgnicos Polmeros de alto peso molecular

Adsorcin
polisacridos aninicos polisacridos catinicos Cromatografa de afinidad Otros

Ultrafiltracin Secado
Evaporacin rotatoria Secado en spray liofilizacin

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TCNICAS DE PURIFICACIN: CROMATOGRAFA

Cromatografa a gran escala:

Se pueden aplicar los mismos mtodos que en cromatografa analtica. El objetivo principal es purificar grandes cantidades en el menor tiempo
posible (flujos elevados).

Fcilmente escalable (aumento del dimetro de la columna) Optimizacin previa en el laboratorio.

Saltos de escala progresivos.

Destino final del producto (posible presencia de contaminantes) Seleccin del tipo de matriz. Eliminacin material particulado, evitar la
adsorcin inespecfica y contaminacin bacteriana.

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TCNICAS DE PURIFICACIN: Cromatografa

Tipo de matriz
Dextrano con enlaces entrecruzados Poliacrilamida entrecruzados Agarosa Agarosa con enlaces entrecruzados Compuesto poliacrilamida/dextrano Compuesto poliacrilamida/agarosa Polmero acrlico hidroxilado Copolmero etilenglicol-metacrilato Celulosa Slice porosa Polmero orgnico rgido con enlaces

Porosidad
Baja Baja Alta Alta Alta Media Media Baja/media Media/alta Baja/media Media/alta

Adsorcin noespecfica
Baja Baja Baja Baja Media Baja Media Media Alta Alta Baja

Rigidez
Baja Baja Baja Media Media Media Media Media Baja Alta Alta

Estabilidad
Buena Buena Deficiente Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena

Facilidad de modificacin
buena buena buena buena buena buena buena buena buena deficiente buena

Coste relativo
Bajo/medio Medio Medio Medio Medio Medio/alto Medio Medio Bajo Alto Alto

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TCNICAS DE PURIFICACIN
Cromatografa
Intercambio inico Cromatoenfoque Afinidad Interaccin hidrofbica Filtracin en gel HPLC

Sistemas acuosos en dos fases

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TCNICAS DE PURIFICACIN: Cromatografa

Caracterstica molecular aprovechada Tamao

Tipo de cromatografa
Filtracin en gel

Caractersticas Resolucin moderada para el fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores. Capacidad limitada por el volumen de la muestra La resolucin puede ser alta. Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra. La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz. La resolucin puede ser alta. La capacidad puede ser alta. La velocidad puede ser alta Resolucin buena Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de muestra. Velocidad alta La resolucin puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja, dependiendo del ligando y no limitada por el volumen de la muestra. Velocidad alta.

Aplicacin El fraccionamiento es mejor en las ltimas etapas de la purificacin. En cualquier momento se pueden usar tampones intercambiadores y podr existir una limitacin respecto al volumen de muestra Es ms efectiva en las primeras fases del fraccionamiento cuando se van a manipular grandes volmenes.

Carga

Intercambio inico

Cromatoenfoque

Es mejor usarla en una purificacin posterior, ya que las matrices son caras. Puede ser utilizada en cualquier fase, pero es mejor aplicarla cuando la fuerza inica es alta tras la precipitacin con sales o despus de un inter-cambio inico Puede emplearse en cualquier etapa, aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases

Polaridad

Interaccin hidrofbica

Afinidad biolgica

Afinidad

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TCNICAS DE PURIFICACIN
Solucin acuosa de dos polmeros
PEG y dextrano

Sistemas acuosos en dos fases:

Solucin acuosa de un polmero y una sal
PEG y fosfato potsico Protenas hidrofbicas Protenas hidroflicas fase superior (rica en PEG) fase inferior

- Aplicaciones: separacin de restos celulares enriquecimiento para posteriores pasos de purificacin concentracin y purificacin de protenas en baja concentracin - Operacin:
- Mezcla y equilibrado - separacin

Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology, 3:6 (139-144) 1985

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TCNICAS DE PURIFICACIN
Diseo de enzimas:
La fusin de un gen de inters a secuencias promotoras eficientes hace que una protena se sobreexprese. Dirigir la protena sintetizada de novo al periplasma de la clula. Adicin de colas de afinidad.