Evaluacin de actividad antibacterial de extracto de ajo frente a Clostridium perfringes y E.

Coli

Segn la organizacin Mundial de la Salud ms del 30% de las personas en pases industrializados sufren de enfermedades asociadas con los alimentos; Esta misma organizacin est impulsando una poltica del no uso de sal como conservante de alimentos para tratar de disminuir los casos de enfermedad cardiovascular en el mundo; El inters por cambiar los conservantes tradicionales como los nitritos en los productos crnicos, ha despertado la inquietud en los procesos para la obtencin de aceites esenciales y extractos vegetales de diversas plantas.

En el proceso de los crnicos el nitrito juega un papel importante como agente de curado y conservante, ya que aporta caractersticas de color y textura y como agente inhibidor de microorganismos como Clostridium

perfringens.

Ms de la mitad de todos los brotes epidmicos de enfermedades transmitidas por los alimentos son causados por carne y productos crnicos que son los que ms se asocian con la txico infeccin producida por C. perfringens y E.Coli, pues ofrecen condiciones ideales para su desarrollo.

Escherichia coli
Halladas en el intestino de los seres humanos y animales. Es una bacteria en forma de bacilo gram negativo, anaerobio facultativo, la temperatura ptima de crecimiento es de 37C a un pH casi neutro aunque puede crecer a un pH inferior a 4 y a una actividad acuosa mnima de 0,95.Su presencia en los alimentos sirve como indicador de contaminacin por manipuladores. Alimentos asociados: Carnes picadas de vaca y aves sin coccin completa (ej.: hamburguesas), salame, arrollados de carne, leche y jugos sin pasteurizar, productos lcteos elaborados a partir de leche sin pasteurizar, aguas contaminadas, lechuga, repollo y otros vegetales que se consumen crudos

Clostridium perfringes
El Clostridium Perfringes es un bacilo gram positivo esporulado, la temperatura ptima de crecimiento vara entre 43 y 47C con un pH mnimo de 5 y un ideal entre de 6 a 7,5.La aw est entre 0,95 y 0,97, no crece en presencia de sal de mas de 6% de concentracin. La espora puede resistir temperaturas de 100C durante 38 minutos. Cuando las clulas vegetativas de Clostridium perfringens llegan al intestino y esporulan, producen la enterotoxina que es la responsable del cuadro clnico, una toxico infeccin. Alimentos asociados: Las carnes y derivados y los caldos de carne son los ms peligrosos. La preparacin de alimentos para colectividades (como escuelas, cafeteras, hospitales, alojamientos, penitenciaras, etc.) es la causa ms comn de intoxicacin por Cl. perfringens, y ocurre cuando una gran cantidad de alimentos se preparan con mucha anticipacin.

El ajo (Allium sativum), del cual se realiza la extraccin del disulfuro de alilo (C6H10S2),trisulfuro de alilo y tetrasulfuro de alilo, tiene un efecto bactericida, accin que se ha atribuido a los componentes sulfurosos y fenlicos. Dado la presencia de estos componentes activos en el aceite esencial de ajo es importante estudiar su efecto frente a microorganismos patgenos transmitidos por alimentos como Clostridium perfringens y E.coli. que se encuentran entre los patgenos mas importantes.

Ajo deshidratado

.Su manipulacin origina una prdida casi total pulverizado y encapsulado de alina. .Se obtiene por destilacin y carece de alicina y de compuestos hidrosolubles, pero contiene compuestos solubles en medio oleoso (disulfuro de dialilo y trisulfuro de dialilo) Es el producto obtenido por maceracin de ajo machacado en aceite vegetal Se presenta encapsulado Contiene alina y alicina La alicina se descompone instantneamente en numerosos compuestos organosulfurados (sulfuros, ajoenos y ditinas) Es el extracto obtenido por maceracin (AGE) de lminas de bulbo de ajo en solucin hidroalcohlica (15-20%) durante 20 meses o ms, a temperatura ambiente (posteriormente se filtra y concentra a baja temperatura y presin reducida) Este extracto es rico en derivados azufrados solubles en agua, especialmente S-alil-mercapto-cistena Tambin contiene alil-sulfuros liposolubles estables, flavonoides, compuestos fenlicos, saponinas y otros nutrientes esenciales Carece de compuestos liposolubles inestables(alicina)

Aceite de ajo (esencia de ajo)

Macerado oleoso de ajo

Extracto envejecido de ajo

Beneficios y propiedades del aceite de ajo

El aceite de ajo es antisptico y antibacteriano, actuando de gran forma sobre el intestino y los pulmones, principalmente. A su vez, es antiespasmdico, colagogo y diurtico. El aceite de ajo puede resultar bueno para limpiar la sangre, ayudando con sus propiedades a todo el sistema cardiovascular, adems de resultar antioxidante. El aceite de ajo puede emplearse para adelgazar. De hecho, suele consumirse en formas de cpsulas para perder peso.

Este trabajo de investigacin est basado en cuanto al mtodo de evaluacin de actividad antibacterial y concentracin inhibitoria mnima en el ensayo preliminar de la actividad antibacteriana de extractos de allium sativum, coriandrum sativum, eugenia caryophyllata, origanum vulgare, rosmarinus officinalis y thymus vulgaris frente a clostridium perfringens de Biosalud, Volumen 8, pero con modificaciones en cuanto al mtodo de extraccin del aceite voltil y que adems en este proyecto se investigar el efecto antibactericida no solo frente al clostridium perfringens sino tambin frente a E.coli.

Objetivo
Objetivo General: * Estudiar la posibilidad de obtener mtodos alternativos, que sean orgnicos para la conservacin de alimentos crnicos. Objetivos especficos: * Estudiar el efecto inhibitorio del aceite esencial obtenido de los bulbos de Allium sativum (ajo) frente a Clostridium perfringens (gram positivo) y Escherichia Coli (gram negativo). * Determinar la Concentracin Mnima Inhibitorio (CMI) del aceite esencial obtenido de los bulbos de Allium sativum (ajo) al crecimiento de Clostridium perfringens y Escherichia Coli.

Ventajas de Extractos

1- Permiten disponer de un producto homogneo; 2- Desde el punto de vista microbiolgico, los extractos ofrecen la ventaja de hallarse prcticamente libres de grmenes; 3- Son especialmente tiles para la preparacin de conservas a partir de productos muy sensibles al calor, como por ejemplo el pescado; 4- La mezcla de extractos y sacarosa o glucosa son muy convenientes para el curado de la carne y pueden emplearse con la sal de cocina y los aceites vegetales.

Hiptesis

El aceite esencial de ajo posee propiedades antibacteriales contra Clostridium Perfringes y Escherichia coli.

De ser demostrada esta hiptesis el extracto puede ser considerado como posible conservante alternativo en alimentos crnicos. Sin embargo tambin hay que considerar y realizar estudios acerca de la efectividad, inocuidad y poca capacidad de modificacin de las condiciones organolpticas de los alimentos para poder establecer este extracto como alternativa viable de conservacin

Identificacin de variables

Variable independiente El uso del aceite esencial de ajo Variable dependiente El efecto en el crecimiento de colonias de Clostridium Perfringes y Escherichia Coli. Variables intervinientes Cambio de pH Cambio de temperatura Tiempo de incubacin Composicin y concentracin del extracto (componentes activos)

Paradigma y Sistema de investigacin

Un paradigma es el marco a travs del cual una persona percibe (y filtra) la realidad y acta en consecuencia. El paradigma a seguir ser el Positivista el cual se fundamenta en la cuantificacin y est soportado por el sistema de investigacin Hipottico-Deductivo ya que el mtodo de difusin en disco a utilizar nos permitir determinar el % de inhibicin del extracto con respecto a un antibitico (control +) y la concentracin mnima inhibitoria del aceite esencial de ajo, lo que requiere de observacin, descripcin medicin, interpretacin de resultado etapas que principales de este sistema de investigacin. La estrategia a utilizar ser de tipo experimental. A partir de la informacin que se recopil, se analiz y expuso en el marco terico, se plantea la hiptesis que da cuenta de una causa y efecto, en nuestro caso, el aceite esencial de ajo y su efecto antibactericida frente a Clostridium perfringes y E.coli.,esto se pretende comprobar mediante la experimentacin controlada, la cual se detallar en la siguiente seccin. Finalmente, a partir de la experiencia se podr demostrar o refutar la hiptesis que se plante previamente.

Muestra y experimentacin Equipamiento

Extracto de ajo de laboratorio Medios de cultivo Cepas de clostridium perfringens y E.coli Antibitico

LABORATORIO MICROBILOGICO

Reactivos

Material descartable

Evaluacin de actividad antibacterial y concentracin mnima inhibitoria de aceite esencial de ajo frente a clostridium perfringens y E.coli.

Hipoteca de emisiones:

Proveedor de material descartable: Residuos

plsticos, contaminacin atmosfrica, uso de recursos no renovable, ocupacin de espacio. Proveedor de equipamiento: equipos de acero (autoclave, estufa, esptulaetc), material elctrico, ocupacin y contaminacin ambiental. Proveedor de reactivos: Desechos de produccin, contaminacin, ocupacin. Proveedor de de antibitico: Desgaste de energa, residuos microbiolgico. Laboratorio microbiolgico: Residuos bacteriolgicos, contaminacin del ambiente, gasto de energa.

Etapas de Experimentacin
1) Obtencin del aceite esencial de ajo 2) Evaluacin de actividad antibacterial 3) Evaluacin de concentracin mnima inhibitoria

Muestra de ajo

Residuos orgnicos

Limpieza, pelado picado

Agua, molino de cuchilla

Agua Residuo qumico y orgnicos

Extraccin de aceite

Vapor de agua Producto qumico

Energa Material de Vidrio Material de acero

Residuos biolgicos

%Efecto inhibitorio

Concentracin Mnima inhibitoria

Productos para cultivo

1)PREPARACIN DEL ACEITE ESENCIAL

Limpieza: retirado de impurezas, pelado y lavado con abundante agua y se desdenta manualmente. Retirado de piel. Picado utilizando molino de cuchillas.

Mtodo de extraccin
Expresin

Solventes voltiles

Extraccin de aceite esencial

Arrastre con vapor de agua

Destilacin por arrastre de vapor

Extraccin por arrastre Con vapor de agua

Mtodo directo

Hidrodestilacin

Hidrodestilacin

Enfoque sistmico Equipo de

hidrodestilacin
vapor de agua, calor, Na2SO4(anhidro)

Extraccin por vapor de agua

Muestra de ajo

Hidrodestilacin
Aceite esencial puro agua, calor desprendido, Na2SO4(hidratado),residuo orgnico.

2) EVALUACIN DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIAL

Mtodo de difusin en disco(Bauer, Kirby ): El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibiticos. Tan pronto el disco impregnado de antibitico se pone en contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibitico difunde al agar. El antibitico difunde radialmente a travs del espesor del agar a partir del disco formndose un gradiente de concentracin. Transcurridas 18-24 horas de incubacin los discos aparecen rodeados por una zona de inhibicin.

Cepas de microorganismo. Las cepas utilizadas en el ensayo de

actividad antimicrobiana estn depositadas en el American Type Culture Collection (ATCC), son de referencia internacional y forman parte de una batera mnima de cepas que se emplean para este tipo de estudio: Escherichia coli (ATCC 25922), Clostridium perfringens (ATCC 13124). Medios de cultivo. Los medios de cultivo a utilizar son medios ricos que permiten el crecimiento del microorganismo sin dificultad. Para Escherichia coli se utiliza agar eosina azul de metileno (EMB), y para Clostridium Perfringens agar SPS, esterilizados en autoclave a 121 C y una atmsfera durante 20 min. Controles. Como control negativo se utiliz una solucin de etanol al 40 %. En el caso de los controles positivos se emple vancomicina para C.perfringes y estreptomicina para E.coli.

Etapas de mtodo de difusin de disco

a) Preparacin de inculo b) Inoculacin de placas c) Lectura de placas e interpretacin de resultados

a) Preparacin de inculo
Seleccin de 3-5 colonias
Incubacin a 35C y comparacin con estndar de 0,5 McFarland

Colonias de la cepa en agar

Caldo de cultivo

Suspensin de 1-2 x 108 UFC/ml

Enfoque sistmico
Estndar de McFarland
-Caldo de cultivo -Solucin salina estril -tubos de ensayo -asa Cepas de E.coli y Clostridium perfringes
Esterilizacin,lavado y secado de material de vidrio, conservacin (refrigeracin) de caldos, solucin salina, cepas y almacenamiento de estndar de McFarland.

Procedimiento para preparacin de cepas

Incubacin (ajuste de turbidez)

-tubos de ensayos,

Inoculo 108UFC /ml

material sucio material no utilizado Incineracin de residuo bacteriolgico

b) Inoculacin de placas
1ml de inoculo (108 UFC/ml

20ml de medio(agar)

Aceite esencial

Control +

Nitrito de sodio

LECTURA DE PLACAS

INCUBACIN A 37C, 18-24 Hs.

Enfoque sistmico
Inoculo de 108UFC/m Mtodo de difusin en disco (Kirby Bauer)

-Medio agar -Antibitico -NaNO2 -Placas -Estufa -pipeta Aceite esencial de ajo

Incubacin %Inhibicin de microorgan ismos

Esterilizacin, lavado y secado de material de vidrio y plstico, conservacin de antibitico y NaNO2.

-Material

sucio o no utilizado, residuo microbiolgico

Incineracin de residuo microbiolgico

c) Lectura de placas e interpretacin de resultados

Despus de 18 horas de incubacin, cada placa es examinada. Los dimetros de la zona de inhibicin completa son medidos en mm pasando por el centro del disco. Se compara el dimetro con el obtenido en el antibitico (control positivo); se consider que un determinado extracto tena accin antibacteriana cuando produjo una inhibicin igual o mayor al 50% de inhibicin con respecto al antibitico.

Clculo de efecto inhibitorio

dimetro de halo inhibitorio del extracto 100 dimetro de halo inhibitorio del control positivo

%efecto inhibitorio

3) Evaluacin de concentracin mnima inhibitoria

La Concentracin mnima inhibitoria (CMI), en microbiologa, es la concentracin ms baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo despus de su incubacin. Mtodo a utilizar de Kirby Bauer

Diluciones de aceite esencial

Control +
INCUBACION 24Hs-37C

Control (etanol)

Repique, Incubacin

La inhibicin se corrobora mediante repiques de la zona de inhibicin en medio SPS en tubo y EC(para E.coli), confirmndose de esta manera la inhibicin obtenida en aquellas diluciones que as la presentaron en el ensayo inicial.
Microorganismo Medio para confirmacin Tiempo y temperatura de incubacin Ausencia de crecimiento

E.coli

Caldo EC con campanita de Durhan

48hs,44-45C

Ausencia de gas. Sin viraje de indicador.

Clostridium perfringes

SPS en tubo

24hs, 37C En condiciones anaerbicas

Ausencia de turbidez. Ausencia de gas. Ausencia de color oscuro.

Enfoque sistmico
Inoculo de 108UFC/m -Medio agar -Antibitico -Placas -Estufa -pipeta Diluciones de Extracto de ajo Incubacin CMI no utilizado, residuo microbiolgico
-Material

Mtodo de difusin en disco (Kirby Bauer)

Lavado y secado de material de vidrio y plstico, conservacin de antibitico en ambiente adecuado(refrigeracin).

Incineracin de residuo microbiolgico

ndice Analtico tentativo

1. Investigacin previa del problema 2. Determinacin de recursos humanos y materiales 5. Determinacin de costos 6. Recoleccin de datos 7-Financiamiento 8-Anlisis e Interpretacin de resultados

Cronograma
Actividades 1-Investigacin de problema 2-Asesora metodolgica 3-Diseo del proyecto Tiempo

4-Observaciones
5-Proyecto 6-Observaciones

7-Tratamiento de Informacin
8-Anlisis e interpretacin Semanas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 0