EPIFLUORESCENCIA

EL EQUIPO

EL EQUIPO LED EPI

MONTAJE DE LA LAMPARA

DESCRIPCION DEL MICROSCOPIO

EL MICROSCOPIO

El microscopio Primo Star iLED ya est disponible con tres accesorios de fluorescencia adicionales que permiten el uso de distintos fluorocromos, tales como los FITC, Dapi y Rhodamine/Cy 3. De este modo puede emplearse un microscopio de LED para aplicaciones de fluorescencia simple en la formacin, en procedimientos habituales y en investigacin bsica. Este dispositivo es especialmente robusto y fcil de usar, y ofrece una sobresaliente relacin precio/rendimiento, gracias en gran medida a la fuente lumnica econmica, duradera y de gran ahorro energtico que ofrecen los El microscopio LED. Especialmente en el caso de la formacin, la excitacin de fluorescencia mediante la iluminacin ya est por LED resulta muy til al no ser necesario contar con perodos de calentamiento o refrigeracin, a diferencia de lo que ocurre con la excitacin producida mediante lmparas de vapor de disponible con mercurio. Adems, ya no es necesario reajustar las lmparas de excitacin, por lo que el usuario tres accesorios puede comenzar a trabajar en el mismo momento en que se enciende la fuente de iluminacin. El accesorio de fluorescencia del iLED cuenta de unos prcticos adaptadores oculares que con fluorescencia permiten efectuar labores de microscopia de fluorescencia aunque no se est en un cuarto oscuro (por ejemplo, en un auditorio). El microscopioque adicionales dispone de una palanca que permite pasar de un uso de campo claro a uno de fluorescencia.

Primo Star iLED

permiten el uso de distintos fluorocromos, tales como los FITC, Dapi y

FILTROS

CIRCUITO DE LA LUZ

La fluorescencia es

La fluorescencia es el fenmeno ptico que ocurre cuando la luz es absorbida por una sustancia cuando se encuentra expuesta a radiaciones ultravioletas, rayos catdicos o rayos x-, creando as una excitacin molecular que hace que dicho material re-emita la luz en una longitud de onda mayor a la longitud incidente. As, las molculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs de un filtro que slo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad caracterstica de la molcula fluorescente utilizada. La tincin molecular se basa en la utilizacin de colorantes fluorescentes, los cuales son detectados gracias al microscopio de fluorescencia. Este tipo de microscopa se fundamenta en el uso de filtros. El primer filtro selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo. El microscopio fluorescente para epifluorescencia. La tcnica de fluorescencia para microscopia con epiiluminadores (iluminador episcpico) est basada en la adaptacin del iluminador vertical. La luz incide sobre la muestra a travs de las lentes del objetivo, que permiten el paso de la luz ultravioleta exentos de tensin molecular.

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.

Estudios sobre naranja

Fazii y col. (9) idearon un mtodo de coloracin de fluorescencia para la diferenciacin entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, basada en el uso de naranja de acridina que interacta con componentes de la pared celular, alcohol etlico-acetona para decolorar y fluorescena de sodio que origina el sistema rojo/verde. Segn los autores, el decolorante, tal vez, desestabiliza la membrana externa de las bacterias Gram negativas, removiendo parcialmente el naranja de acridina; de tal forma que al incorporar la fluorescena, se produce un efecto de coloracin diferencial, donde las bacterias Gram positivas se tien de amarillo fluorescente y las Gram negativas de verde fluorescente. Fazii y col. (9) y Ciancaglini y col. (10) emplearon la coloracin diferencial de fluorescencia en hemocultivos y muestras de orina, obteniendo elevada sensibilidad en la deteccin de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

NARANJA DE ACRIDINA

Naranja de acridina (o N,N,N',N'-tetrametilacridina segn IUPAC) es un colorante catinico selectivo para los cidos nuclicos y til para realizar determinaciones sobre el ciclo celular. Interacciona con el ADN y el ARN por intercalacin dentro de la molcula o por atraccin electrosttica, respectivamente. Cuando asociado al ADN, el naranja de acridina es espectralmente similar a la fluorescena, presentado un mximo de excitacin a 502 nm y una emisin a 525 nm (en el verde). Cuando est asociado al ARN, la excitacin mxima deriva a 460 nm (en el azul) y la emisin mxima a 650 nm (en el rojo). Por lo tanto, este colorante tie de verde a las clulas en fase de divisin activa (mucho ADN), y de naranja a las que estn en reposo multiplicativo (mucho ARN y protenas).

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.

FOTOGRAFIAS CON NARANJA

FOTOS DE LEVADURAS Y HONGOS

Mtodo para vinos con naranja de acridina

Preparacin del reactivo: Pesar 0,05 g de naranja de acridina y llevar a 50 ml., con agua destilada que estuvo en ebullicin 10 minutos, y se filtra por 0,45 micrones y se mantiene estril. Tcnica: Tomar 40 ml de vino si es de lnea y 10 ml de vino si es de vasija e instalar en el extremo de la jeringa un portafiltro de 13 mm con una membrana de poro de 0,6 micrones de poliamida, filtra la muestra Con otra jeringa de 5 ml tomar 3 ml del naranja de acridina e instalar un filtro de 13 mm con una membrana de 0,22 micrones de poro estril. En la salida de este filtro instalamos el filtro donde filtramos el vino y ejercemos presin en la jeringa para que pase el colorante a travs de los dos filtros con sumo cuidado. Luego hacemos pasar 1-2 ml de isopropanol para arrastrar el exceso de colorante. Retirar la membrana del vino con una pinza, secarla con sumo cuidado y rpido y una vez ocurrido esto colocar sobre un portaobjetos. Agregar sobre la membrana aceite de inmersin de alta calidad, veremos que la membrana se transparenta, colocar un portaobjetos sobre la misma y volver a colocar otra gota de aceite de inmersin.
Asegurar una correcta inmersin de la lente del objetivo. La lectura se realiza en zigzag tomando la lectura de 10 campos, comenzando por el extremo inferior y luego observar el centro.

RESULTADOS INTERPRETACION

Resultados: En vasija < 400 levaduras y < 600 bacterias por litros y en botella es de < 100 levaduras y < 200 bacterias Las levaduras verdes y bacterias se tien de color naranja brillante sobre un fondo negro

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION

ALEJANDRO CANGI

MAG SRL