Inibio enzimtica

Lus Gomes Paulo Veiga Pedro Pastor

Inibio enzimtica
Um inibidor um composto que reduz a velocidade de uma reaco enzimtica, a desnaturao de uma enzima no uma inibio, j que ocorre uma destruio da estrutura; A inibio por produto de uma reaco enzimtica, inibe por recombinao com a forma de enzima do qual se dissociou, ou seja, diminui a velocidade de reaco atravs da reduo de enzima livre. Um inibidor pontomorto aquele que no actua nem como substrato ou produto mas forma complexos com as diversas formas de enzima;

Inibio enzimtica
Em geral, a inibio classifica-se em reversvel ou irreversvel como verificado experimentalmente:
Competitivos Reversveis
Inibidores

No Competitivos Acompetitivos

Irreversveis

A actividade enzimtica recuperada com a diminuio da concentrao de inibidor; caracterizada pelo equilbrio entre o inibidor e a enzima definido por uma constante de equilbrio, ki.

Inibio reversvel competitiva

Inibidores competitivos so compostos que apresentam semelhanas com o substrato. A inibio baseia-se na competio pelo centro activo; O inibidor competitivo combina-se com uma enzima livre de tal forma que impede a ligao do substrato; A combinao do inibidor com a enzima provoca uma mudana na conformao (estrutura terciria ou quaternria) da enzima que deforma o stio do substrato e, portanto, impede o substrato de se ligar.

Inibio reversvel competitiva

Inibio reversvel competitiva

Relativamente ao esquema da inibio competitiva: A velocidade inicial da reaco proporcional concentrao no estacionrio do complexo EnzimaSubstrato, ES; Pode-se prever que em qualquer concentrao subsaturante fixa de inibidor, necessrio uma concentrao de substrato mais alta (para obter a mesma concentrao de ES); na presena de uma concentrao de substrato muito alta (saturante), toda a enzima pode ser levada forma de complexo ES. A figura abaixo ilustra o efeito de um inibidor competitivo: Grfico de V/ [S] em presena e na ausncia de uma concentrao fixa de um inibidor competitivo.

Inibio reversvel competitiva

Inibidores reversveis no competitivos

Um inibidor no competitivo clssico no tem efeito na ligao do substrato, e vice-versa; Estes inibidores podem ligar-se tanto ao complexo Enzima-Substrato como enzima livre:

Em qualquer concentrao de inibidor, uma concentrao infinitamente alta de substrato (ao contrario da inibio competitiva), no consegue levar toda a enzima sob a forma de ES que a forma produtiva;

Inibidores reversveis no competitivos

O efeito final de um inibidor no competitivo diminuir a aco da enzima presente.

Inibidores reversveis acompetitivos

Na inibio acompetitiva, o inibidor no se pode ligar enzima no estado livre, mas somente ao complexo ES. O complexo E-I-S assim formado, enzimaticamente inactivo; Neste tipo de inibio o valor da Vmax diminui e o Km tambm; quanto maior Km menor ser a afinidade da enzima.

Resultados
1 PNPP (4,5 mM) 0 H2O 2,5 Inibidor 0,5 Tampo acetato 0,5 de sdio (ml) MgCl2 0,5
PNPP concentrao final 0

2 0,03 2,47 0,5

0,5 0,5

3 0,13 2,37 0,5

0,5 0,5

4 0,27 2,23 0,5

0,5 0,5

5 0,67 1,87 0,5

0,5 0,5

6 1,33 1,17 0,5

0,5 0,5

7 2,22 0,28 0,5

0,5 0,5 2,5

0,03 0,15 0,3

0,75 1,5

Clculos
Converso dos valores de absorvncia em concentraes molares de PNP:
A=xlxC

= 1.88x104 litro.mole-1.cm-1
C = A / x l C = A / 1 x 1.88x104

Clculo da Vi:
Vi = C(M) 10

Inibidor NaF
Abs [PNPP]
8.08x10-6 4.84x10 2.30x10 3.92x10
-5

Vi
8.08x10-7 4.84x10 2.30x10 3.92x10
-6

1/Vi
1.24x106 2.07x10 4.35x10
5

[PNPP]fin al
--3,00E-03 1,50E-04 3,00E-04 7,50E-04 1,50E-03 2,50E-03

1/[PNPP]final
--3,33E+04 6,67E+03 3,33E+03 1,33E+03 6,67E+02 4,00E+02

1 2 3 4 5 6 7

0.152 0.910 0.433 0.737 0.860 0.916 1.039

-5

-6

-5

-6

2.55x10

4.57x10-5 4.87x10-5 5.53x10-5

4.57x10-6 4.87x10-6 5.53x10-6

2.19x105 2.05x105 1.81x105

Inibidor NaF
5,00E+05 4,00E+05

1/Vi

3,00E+05 2,00E+05 1,00E+05 0,00E+00 0,00E+00

y = 38,222x + 164233 R2 = 0,9559

2,00E+03 4,00E+03 6,00E+03 8,00E+03

1/[PNPP]final

inibidor NaF
6,00E-06 5,00E-06 4,00E-06

Vi

3,00E-06 2,00E-06 1,00E-06 0,00E+00 1,50E-04 3,00E-04 7,50E-04 1,50E-03 2,50E-03

[PNPP]final

Inibidor NaF
Clculo do km e Vmax:
V = Vmx [S]_ [S] + KM

1 Vi

[S] + KM_ Vmx . [S]

1 Vi

[S] + _ KM___ Vmx . [S] Vmx . [S]

1 = 1 + KM_ . 1_ Vi Vmx Vmx [S]

y = b + mx

m = 38.222 b = 164233 r2 = 0.9559 b = 1/Vmx Vmx = 1/164233 Vmx = 6.09x10-6M/min

y = 38.222x + 164233

m = Km/Vmx Km = 6.09x10-6 x 38.222 Km = 2.3277x10-4M

Inibidor Na2AsO4
Abs [PNP]
8.14x10
-6

Vi
8.14x10
-7

1/Vi
1228501.229 529100.529 1005025.126 862068.966 500000 381679.389 293255.132

[PNPP]fin al
--3,00E-03 1,50E-04 3,00E-04 7,50E-04 1,50E-03 2,50E-03

1/[PNPP]fin al
--3,33E+04 6,67E+03 3,33E+03 1,33E+03 6,67E+02 4,00E+02

1 2 3 4 5 6 7

0.153 0.356 0.187 0.218 0.376 0.493 0.642

1.89x10-5 9.95x10
-6

1.89x10-6 9.95x10
-7

1.16x10-5 2.00x10-5 2.62x10 3.41x10

-5

1.16x10-6 2.00x10-6 2.62x10 3.41x10

-6

-5

-6

Inibidor Na2AsO4
inibidor Na2AsO4
1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0,00E+00

1/Vi

y = 59,471x + 357491 R2 = 0,9977

2,00E+03 4,00E+03 6,00E+03 8,00E+03

1/[PNPP]final

4,00E-06 3,50E-06 3,00E-06 2,50E-06 2,00E-06 1,50E-06 1,00E-06 5,00E-07 0,00E+00 1,50E04 3,00E04 7,50E04 1,50E03 2,50E03

Vi

[PNPP]final

Inibidor Na2AsO4
Clculo do km e Vmax:
1 = 1 + KM_ . 1_ Vi Vmx Vmx [S]

y = b + mx

m = 59.471 b = 357491 r2 = 0.9977

y = 59.471x + 357491

b = 1/Vmx Vmx = 1/ 357491 Vmx = 2.7973x10-6M/min

m = Km/Vmx Km = 2.7973x10-6 x 59.471 Km = 1.664x10-4M

Enzima normal sem inibidor

350000,00 300000,00 250000,00 200000,00 150000,00 100000,00 50000,00 0,00 0,00E+00

1/Vi

y = 31,675x + 73763 R2 = 0,8563

2,00E+03 4,00E+03 6,00E+03 8,00E+03

1/[PNPP]final

Sem Inibidor
1,20E-05 1,00E-05 8,00E-06

Vi

6,00E-06 4,00E-06 2,00E-06 0,00E+00 1,50E-04 3,00E-04 7,50E-04 1,50E-03 2,50E-03

[PNPP]final

Concluso
Esta aula prtica teve como objectivo a observao dos efeitos dos inibidores enzimticos; Os inibidores utilizados foram o NaF e o Na2AsO4; Os inibidores adicionados so reversveis, pois no se verificou a inactivao do enzima; Finalizada a experincia prtica determinamos o valor do Km e Vmax atravs das seguintes frmulas: b = 1/Vmax m = Km/Vmax Consoante os valores obtidos do km e Vmax podemos identificar qual o tipo de inibio presente;

 Com os dois inibidores obtivemos os seguintes resultados: Inibidor NaF Vmx = 2.08x10-6M/min Km = 1,6778x10-4M Inibidor Na2AsO4 Vmx = 2,7973x10-6 M/min Km = 1,664x10-4M Depois da observao destes dados obtidos podemos concluir que os nossos valores de Km e Vmax aumentaram e diminuiram respectivamente com o aumento do inibidor, coincidindo com os parmetros tericos estabelecidos para inibies reversveis competitivas.