Mtodos de sequenciamento de DNA

Mtodo de Sanger

Frederick Sanger
Bioqumico Ingls Ganhou 2 Prmio Nobel em qumica 1958 ele foi premiado por seu trabalho sobre a estrutura das protenas, especialmente o de insulina

1980, Walter Gilbert e Sanger compartilharam metade do prmio "por suas contribuies relativas determinao de seqncias de bases em cidos nuclicos"

 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturebiotec

City, CA, US thePolonator (Dover/Harvard) and theHeliS A), copeS ingle

by random fragmenta

DNA fragmentation

DNA fragmentation

In vivo cloning and amplification

In vitro adaptor ligation

Cycle sequencing
3'- GACTAGATACGAGCGTGA-5' (template) (primer) 5'-... CTGAT CTGATC CTGATCT CTGATCTA CTGATCTAT CTGATCTATG CTGATCTATGC Polymerase CTGATCTATGCT dNTPs CTGATCTATGCTC Labeled ddNTPs CTGATCTATGCTCG

Generation of polony array

Electrophorsesis (1 read/capillary)
G C T C G T A T C
A A

Cyclic array sequencing (>106 reads/array)

Cycle 1
G G G C G C T T T A T A A A C C

Cycle 2
G G T T A A A A G G G G C C A A C C

Cycle 3
T T A C C C G T G

What is base 1? What is base 2? What is base 3? Jay Shendure & Hanlee Ji. 2008. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26(10).

Metodo de trmino da cadeia (chain termination method)

Permite determinar a sequncia exata de uma cadeia de DNA com at 500 nucleotdeos.

O mtodo consiste na sntese de cadeias a partir do fragmento de DNA a ser sequenciado - cadeias estas que so marcadas radioativamente numa extremidade e diferem entre si por um nucleotdeo.
Por separao das cadeias clivadas atravs da eletroforese, pode estabelecer-se a sequncia de nucleotdeos do fragmento de DNA original. So necessrios primers para que se inicie a reao pela DNA polimerase. O primer que define qual a cadeia que usada como molde.

Sintese da cadeia com nucleotdeos modificados

dATP dGTP dCTP dTTP dNTPs

(desoxirribonucleosdeos trifosfatados)

ddATP ddGTP ddCTP ddTTP ddNTPs

(didesoxirribonucleosdeos trifosfatados)

no permitem a formao de uma ligao fosfodister com outro nucleotdeo trifosfato, pelo qual a sua incorporao na cadeia resulta numa cadeia clivada, nesse ponto.

DNA polimerase inespecfica para ambos

Altas Concentraes

Baixas Concentraes

Em cada reao, um ddNTP incorporado aleatoriamente na posio do dNTP correspondente, provocando a terminao da polimerizao

Sanger et al., 1977

A incluso de marcadores fluorescentes com diferentes cores para cada tipo de ddNTP permite a distino das cadeias marcadas pela respectiva fluorescncia. Por exemplo, todas as sequncias clivadas que terminem com um ddGTP podem ter fluorescncia de cor amarela, as terminadas com ddATP com cor verde, etc., independentemente dos seus tamanhos.

Por electroforese das sequncias de nucleotdeos em gel de poliacrilamida, separam-se as diferentes cadeias simples de DNA (as quais diferem entre si apenas por um nucleotdeo).

Mtodo de Sanger
1985- Leroy Hood e colaboradores desenvolveram marcadores de ddNTPs fluorescentes - automao da tcnica para o seqenciamento de DNA, com alto rendimento.

Simplificou o sequenciamento de DNA kits disponveis comercialmente

As limitaes: ligao no especfica do primer com o DNA, afetando a preciso da leitura e estruturas secundrias de DNA que afetam a fidelidade da sequncia.

Clonagem das sequencias, nem sempre so as desejadas e tambm demandam tempo

Depois de trs dcadas de melhoria gradual, a bioqumica Sanger pode ser aplicada para conseguir ler os comprimentos de at ~ 1.000 pb e precises to elevadas como 99,999%. No contexto de alto rendimento no sequenciamento genmico por shotgun, os custos de sequenciar pelo mtodo de Sanger chega a $ 0,50 por quilobases.

Jay Shendure & Hanlee Ji. 2008. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26(10).