UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NAYARIT

PRUEBAS FEBRILES
Inmunologa Diagnstica
Elaborado por: Gabriela Nohem Espinoza de Len Lucia Rodrguez Pacheco

Fiebre es un proceso patolgico que refleja un proceso inflamatorio. Los macrfagos, liberan algunas citosinas, las cuales..

Fiebre

Alteran el centro termorregulador.

La infeccin por estos microorganismos induce a una respuesta inmune de tipo humoral con la produccin de anticuerpos que pueden ser detectados con el antgeno especfico.

Que son las pruebas febriles?

Son

un conjunto de pruebas que sirven para diagnosticar enfermedades que cursan con fiebre, como fiebre tifoidea (Salmonella), Brucelosis (fiebre ondulante, fiebre de Malta) y Rickettsiosis (fiebre Q, fiebre manchada de las montaas rocallosas).

Fundamento
La prueba se basa en una reaccin inmunolgica entre los anticuerpos sricos y el antgeno correspondiente produciendo una reaccin de aglutinacin macroscpica.

Se utilizan antgenos febriles para detectar anticuerpos en el suero del paciente contra Salmonella, Brucella y Rickettsias.
Las suspensiones de antgenos son bacterias muertas, coloreadas y estandarizadas para permitir una lectura ms fcil.

Los test deben ser ledos despus de los tiempos de incubacin recomendados para evitar los falsos-positivos.

REACTIVOS: Un equipo para Reacciones Febriles que contiene los siguientes antgenos: 1. Tfico O (antgeno somtico)

2. Tfico H (antgeno flagelar)

3. Paratfico A (antgeno flagelar) 4. Paratfico B (antgeno flagelar)

5. Brucella abortus
6. Proteus OX-19 7. Suero control positivo

8. Suero control negativo

Toma y preparacin de la muestra

Suero reciente. Rechazar las muestras hemolizadas o fuertemente lipmicas. Los anticuerpos son estables en el suero al menos 48h a 2-8C

REACCIN DE WIDAL

La reaccin de Widal es un test basado en el principio de aglutinacin antgeno-anticuerpo, donde se determina la presencia de anticuerpos contra el antgeno O de la salmonella paratyphi A y B, el antgeno O y H de la Salmonella typhi para el serodiagnstico de fiebre paratifoidea y tifoidea respectivamente.. Fue desarrollada por Georges Fernand Isadore Widal en junio de 1896.

Estructura antignica de la Salmonella typhi.

El gnero Salmonella tiene una estructura antignica similar al resto de enterobacterias, con tres tipos de antgenos (figura 2): 1. Antgeno somtico (O) 2. Antgeno flagelar (H) o (d) 3. Antgeno capsular o de envoltura (Vi) o (K) (especfico para Salmonella typhi, dublin, y paratyphi C)

Fiebre tifoidea

La fiebre tifoidea es una enfermedad infectocontagiosa de alta prevalencia a nivel mundial, deriva su nombre del latn tyvphos, que significa oscurecimiento de los sentidos o mente turbia; es causada por la bacteria Salmonella typhi, nombrada as en honor del bacterilogo estadounidense David Salmon. La enfermedad consta de 4 fases.

Fundamento
La

reaccin de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antgenos H (flagelar) u O (somtico) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea. Sntomas: aparecen a los 6-8 das y desaparecen de 3 a 6 meses.

Procedimiento de la Tcnica
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Se obtiene el suero del paciente a partir de sangre total. Se colocan distintas cantidades de suero en una placa transparente para cada una de las 4 reacciones (antgeno O, H, A y B) en la primer parte se ponen 80L, en la segunda 40L, tercera 20L, cuarta 10L y quinta 5L. A cadacirculo se le aade 1 gota (50L aproximadamente) del antgeno correspondiente. Al final quedan diluciones 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320 respectivamente para cada antgeno.

Interpretacin de resultados

Un diagnstico de fiebre tifoidea puede considerarse si los ttulos iniciales se cuadruplican entre una y cuatro semanas.

Se toma en consideracin la fiebre tifoidea con ttulos Anti-O1:160-200 y/o H 160-200 en zonas endmicas (ej. Colombia); en zonas no endmicas se debe pensar con ttulos mas bajos Anti-O 1:40-80

Limitaciones de la tcnica

Puede haber reacciones antignicas cruzadas con otras bacterias (principalmente enterobacterias, incluyendo Salmonellas no typhi), parsitos, virus y hongos, llevando con frecuencia al clnico a sobrediagnosticar sndromes febriles como fiebre tifoidea. Como ejemplo de estos falsos positivos, se ha descrito en fiebre paratifoidea por Paratyphi A, ttulos Anti-O y Anti-H 100 en un 53 y 22% de los pacientes, respectivamente.

Continuacion
Falsos positivos: Puede haber reaccin cruzada en pacientes con enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide, lupus LES, etc. Falsos negativos: 1. Antibioterapia temprana 2. Utilizacin de corticosteroides 3. Medicin temprana de anticuerpos (primera semana) 4. Inmunodeficiencias adquiridas y congnitas. 5. Portadores crnicos de Salmonella typhi. 6. Relacionadas a estandarizacin de la prueba

Tabla 3. Reacciones cruzadas del test de Widal Falsos Positivos de la Reaccin de Widal Bacterianas Salmonelosis no typhi (Serogrupos A-B-D) Infecciones por Enterobacterias+ Pseudomonas aeruginosa Klebsiella sp. Escherichia coli Citrobacter sp.- Yersinia enterocolitica Neumonas-infecciones urinarias-Meningitis Tuberculosis pulmonar y miliar (36) Brucelosis Endocarditis bacteriana Rickettsiosis Infecciones por Staphylococcus aureus Infecciones por Burkholderia pseudomallei Ttanos Parasitarias Malaria Amebiasis Virales Dengue Infeccin por VIH Hepatitis viral aguda y crnica Hongos Cryptococosis (Meningitis) No infecciosas Hepatopatias crnicas Enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide-lupus eritematoso sistmico)* Inmunizacin con antgeno de Salmonella Relacionadas a la estandarizacin de la prueba

Introduccin
Es un mtodo para el diagnostico de tifos y otras rickettsiasis. La Rickettsiosis se puede dividir en 3 grandes grupos: 1. Grupo Tifus: tifo epidmico, por Rickettsia prowazekii, transmitido por piojos y tifo clsico endmico, por Rickettsia typha por la pulga. 2. Grupo de Fiebre manchada: Rickettsia rickettsii, que implica ms de 30 especies, transmitido principalmente por caros y pulgas 3. Tifus Scrub: Orientia tsutsugamushi,, transmitido por caros. Otras Rickettsiosis como la Fiebre Q.

Rickettsiosis (Proteus 0X-19)

Las Rickettsias son bacterias cocobacilares, muchas de ellas son transmitidas por vectores como pulgas, garrapatas y piojos. En general la Rickettsiosis se considera una zoonosis, siendo el humano un husped accidental excepto por el tifo epidmico (transmitido por piojos) Son parsitos intracelulares estrictos, por eso existieron dudas mucho tiempo sobre si pertenecan a los virus o a las bacterias.

Fundamento
Se

basa en la capacidad del suero del paciente infectado (que presenta Ac) por Rickettsias para aglutinar ciertas cepas de Proteus (Reaccin cruzada) por lo que es poco sensible y especfica y siempre deber seguirse de pruebas confirmatorias (fijacin del complemento, etc.).
Esta prueba siempre es negativa para la fiebre Q.

Nota:

Suspensin de Antgeno
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Se realizan cultivos de el antgeno y se incuban a 37C por 1824 horas. Se hace la suspensin del cultivo en cloruro de sodio al .85% Se filtra la suspensin con papel filtro en forma de embudo. Se ajusta la turbidez de la suspensin. Para la prueba se utilizan suspensiones frescas de grmenes vivos. (se realizan pruebas cada 3 meses para comprobar que aun reaccionan).

Tcnica de la reaccin en tubo (weil-felix)

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5. 6.

Numerar siete tubos ( 13x75mm) del uno al seis y un testigo (T) para cada antgeno. Adicionar 0.9 ml de solucin salina al primero y 0.5 ml a los restantates. Agregar 0.1ml del suero problema al tubo uno. Mezclar y pasar 0.5 ml al tubo dos y as sucesivamente hasta el seis eliminando 0.5 ml de esta ltima dilucin. Obtenindose diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320. Adicionar 0.3 ml de antgeno diluido previamente 1:20 con solucin salina en cada uno de los tubos. Incubar el testigo y las pruebas por 2 horas a 37C. Observar la aglutinacin producida en cada tubo en comparacin con el testigo y la muestra positiva.

Otra tcnica
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Se obtiene el suero del paciente a partir de sangre total. Se colocan distintas cantidades de suero en una placa transparente en la primer parte se ponen 80L, en la segunda 40L, tercera 20L, cuarta 10L y quinta 5L. A cada circulo se le aade 1 gota (50L aproximadamente) del antgeno correspondiente, proteus OX-16 Al final quedan diluciones 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320 respectivamente para cada una.

Lectura de los resultados

Se

toma en cuenta el titulo del ltimo tubo que aglutino, en el caso de la reaccin en placa el resultado es el titulo de la ltima dilucin en donde se observo la aglutinacin.

 En

esta tcnica en ocasiones se detectan ttulos muy altos en pacientes que no han manifestado la enfermedad, por ello, es necesario realizar otras tcnicas en conjunto para un mejor diagnstico.

Brucelosis
La brucelosis es una enfermedad zoontica causada por bacterias pertenecientes al gnero Brucella: B. canis, B. abortus y B. melitensis, que ocasiona problemas de salud importantes entre los individuos que ingieren alimentos contaminados o mantienen un estrecho contacto con el ganado.

Brucelosis (continuacin)
La brucelosis en el hombre se transmite por la ingesta de leche, sus productos y derivados contaminados, no pasteurizados, por contacto con productos, subproductos y desechos como tejidos o excreciones de animales enfermos, y por inoculacin de Brucella o inhalacin de polco de corrales o mataderos, donde estas se encuentran.

Cuadro clnico
La

brucelosis se caracteriza por fiebre que en la mayora de los casos es alta e intermitente (ondulante). La Brucelosis se presenta en la mayora de los casos con anorexia, fiebre, decaimiento y escalofros, pudiendo aparecer luego complicaciones importantes como son las seas y neuropsquicas.

Aglutinacin lenta en tubo de Wright (SAT)

Es la ms antigua (1897) y la ms utilizada an para el diagnstico de brucelosis animal y humana. Bases metodolgicas: se realizan diluciones crecientes del suero a investigar que se enfrentan con cantidades constantes de antgeno observndose la presencia de aglutinacin luego de un perodo de incubacin. De esa forma se determina el ttulo como la mxima dilucin aglutinante. Antgeno: suspensin de B. abortus 1119-3 al 4,5%. Anticuerpos: IgM, IgG1 e IgG2. Ttulo significativo: no existe consenso en cuanto al ttulo que indica una infeccin activa, por lo que debe establecerse regionalmente.

Prueba de aglutinacin con y sin 2-mercaptuetanol (2-ME)

Es una variante de la anterior que emplea el tratamiento previo con 2-mercaptoetanol como agente reductor que inactiva los anticuerpos de clase IgM perdiendo stas su capacidad aglutinante, sin interferir con las de clase IgG, que son las que se cuantifican. Se usa solucin salina al 0,85% con 0,1M de 2-mercaptoetanol. Bases metodolgicas: se realizan simultneamente las pruebas de aglutinacin en tubo con y sin tratamiento del suero con 2-ME. La diferencia de ttulo obtenida entre ambas pruebas corresponde a los anticuerpos IgM. Antgeno: suspensin de B. abortus 1119-3 al 4,5%. Anticuerpos: IgG e IgM. Ttulo significativo: mayor de 1:20.

Reaccin de Huddleson
Es una reaccin de aglutinacin rpida en placa. La reaccin de Huddleson es un mtodo serolgico que detecta anticuerpos contra B. abortus, B. melitensis y B. Suis , agentes causales de la brucelosis Bases metodolgicas: se enfrentan cantidades decrecientes del suero a investigar con cantidades constantes de antgeno y se observa la presencia o no de aglutinacin. Existe una escala de ttulos, establecida por convencin, que permite la expresin de resultados.

Se utiliza una suspensin Antgenos de B. abortus al 3-10% de grmenes en fenol, con verde brillante y cristal violeta para la bsqueda de anticuerpos. Anticuerpos: IgM, IgG1, IgG2 e IgA.

Ttulo significativo: mayor de 1:40. En ocasiones se observa el fenmeno de prozona, donde puede estar ausente la aglutinacin en los ttulos ms altos a causa de un exceso de anticuerpos. Este hecho debe tenerse en cuenta para evitar falsos resultados negativos por esa causa

Interpretacin
En

la interpretacion de estos resultados, se deben tomar en consideracin los aspectos clnico-epidemiolgicos de cada caso, hay que considerar los falsos positivos y falsos negativos.

Rosa de Bengala
Se utiliza un antgeno de Brucella abortus biotipo 1 (cepa 99S o cepa 1119-3) acidificado regulado y teido con Rosa de Bengala a un pH de 3.65 +/- 0.05 para la deteccin de aglutininas especficas de Brucella. La suspensin del antigeno se enfrenta al suero sin diluir del enfermo. Proporciona una aproximacin diagnstica en pocos minutos con una sensibilidad y especificidad muy altas. Presenta elevado grado de correlacin con la seroaglutinacin y, por su simplicidad, es muy til como prueba de despistaje inicial o screening.
Sus falsos negativos se limitan a enfermos con procesos de pocos das de evolucin y a algunos casos de enfermedad de curso muy prolongado.

Procedimiento
1) Llevar a temperatura ambiente el reactivo, controles y muestras de suero. 2) Utilizando la pipeta automtica adicione 30 L de la muestra del paciente en un crculo de la placa. 3)Mezcle suavemente el Antgeno Rosa de Bengala hasta que se encuentre totalmente homogneo, despus coloque 30 L en la placa de prueba, en el mismo circulo donde se coloco la muestra del paciente, mezcle ambas con un aplicador. (usar un aplicador diferente para cada muestra). Repita este paso para cada muestra de paciente y controles. 4) Agitar la placa con movimientos rotatorios por 4 minutos. 5) Con la ayuda de una fuente de luz directa lea el resultado. Importante: Despus de este tiempo la lectura ya no es vlida.

Resultados
* No Aglutinacin - Suero Negativo *Cualquier cantidad de Aglutinacin Presencia de anticuerpos especficos. Suero Positivo Si resulta positiva debe ser confirmada mediante otra prueba cuantitativa para brucelosis como: Aglutinacin Lenta Estndar o Aglutinacin Lenta en Presencia de 2-Mercaptoetanol. SENSIBILIDAD 25 UI/mL.

Bibliografa

William. Medicina interna. Segunda edicin. Editorial mdica panamericana. Madrid, Espaa.1992. Pag. 1539-1540. Rojas,Espinoza. Inmunologa (de memoria). 3 edicin. Editorial. Mdica Panamericana. Mxico, DF. 2006. Pag. 226-227. Welch, H; Bengtson A. Tcnicas para el diagnostico del laboratorio del tifo y otras rickettsiasis. Instituto nacional de sanidad de la agencia federal de seguridad, Washington, DC. New York. 1980. Katime, A. articulo de revisin Reaccin de WidalInterpretacin clnica. Revista Panam infectol. Colombia. 2006. Pag: 40-44.