Tecnologa de ADN

Karina Orozco

ADN
Es el material gentico presente en todas las clulas y algunos virus

Cmo lo estudiamos?

Virus
Fagos: infectan bacterias (T-pares, l)
Fago virulento: ltico Fago temperado: lisgeno

Grandes cantidades en poco tiempo (1011 partculas de fago/ml de cultivo bacteriano Genomas pequeos

Pasos para estudiar el ADN

Extraccin de ADN Aislamiento de genes Seleccin de genes Amplificacin o Clonacin Estudios
Secuenciacin Mutaciones

Endonucleasas de restriccin
Enzimas que cortan al ADN en lugares especficos (secuencias palindrmicas)

Identificadas en bacterias (defensa contra virus) Puede originar fragmentos:

Pegajosos Romos

Ejemplos de Enzimas de Restriccin

Enzimaa BamHI EcoRI HaeIII HindIII HpaI HpaII MboI NotI Fuente Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus aegyptius Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Haemophilus parainfluenzae Moraxella bovis Nocardia otitidis-caviarum Sitio de reconocimientob GGATCC GAATTC GGCC AAGCTT GTTAAC CCGG GATC GCGGCCGC

SfiI
TaqI
aLa

Streptomyces fimbriatus
Thermus aquaticus

GGCCNNNNNGGCC
TCGA

enzimas tiene el nombre de acuerdo a la especie de la que se aislaron, seguida de un nmero para distinguir las diferentes enzimas aisladas del mismo organismo (ej. HpaI and HpaII). b Los sitios de reconocimiento muestran la secuencia en una sola de las hebras del DNA. N representa cualquier base

Electroforesis
Digestin con Eco RI

Separacin de los fragmentos obtenidos con endonucleasas de restriccin

Electroforesis en gel
Electrodo (-)

Migracin del DNA

Electrodo (+)

Electroforesis
Visualizacin: se tien (bromuro de etidio) y fotografan

Mapas de Restriccin
ADN se trata con diferentes endonucleasas de restriccindiferentes tipos de corte. til para genomas pequeos (virus, plsmidos)

Vectores de transferencia
Medio de transferencia para clonacin de genes Ej. Fagos, plsmidos, BACs, YACs

Caractersticas de los vectores de transferencia

Sitios de corte o de restriccin para insertar el gen Un marcador para distinguir la clula transformada

Replicacin independiente para transmitir o multiplicar el gen

Se recuperan fcilmente de la clula husped utilizando la misma enzima de restriccin usada en la insercin

Transferencia del gen

Se inserta un fragmento de DNA humano en un vector (fago l) El DNA recombinante resultante se introduce en una clula husped (E. coli)
El fago se replica dentro de la bacteria y produce nuevos fagos con el DNA recombinante (DNA de fago y DNA humano)

bacterifagos
Transbordan segmentos hasta de 15 kb Tiene un sitio de restriccin para insercin del DNA Infectan a cultivos de E. coli
Cada fago forma una calva nica y se aisla cada ADN recombinante

Plsmidos
Pequeas molculas de DNA circular que se replican independientemente dentro de una bacteria Poseen tres zonas de inters: Origen de replicacin Gen de resistencia a antibiticos (ampicilina) Donde se inserta el DNA a clonar

1. 2. 3.

Plsmido

plsmidos
Manipulacin ms fcil que con fagos Se tratan el plsmido y DNA con endonucleasa de restriccin Se unen con la ligasa Se coloca el plsmido recombinado en clula huesped Se reproducen la bacteria y el plsmido

csmidos
Contiene secuencias de fago l para ser empaquetado dentro de un fago Posee origen de replicacin y gen resistencia a antibiticos

Transporta DNA de unas 45 kb

cromosomas artificiales de levaduras

Llamados YAC (yeast artificial chromosome) Posee
Origen de replicacin Gen de resistencia a ampicilina Origen de replicacin en levaduras Centrmero Marcador Telmeros

ADN recombinante
Molcula que contiene ADN de fuentes diferentes
Molculas de ADN de fuentes diferentes se tratan con la misma endonucleasa de restriccin (digestin) Los fragmentos obtenidos se insertan en el vector de transferencaia y sellan con ADN ligasa Se obtiene el ADN recombinante y se introduce a una clula (transformacin o transfeccin) para clonarlo o amplificarlo Se seleccionan las clulas con el ADN recombinante de inters (marcador)

Se identifican los clones que contienen el ADN de inters (sonda radiactiva de ADN)

Ejemplo de clonacin con plsmidos

2. Insercin con DNA ligasa

1. Digestion con enzima de restriccin

3. Transformacin de celulas huesped

4. Replicacin de bacterias y plasmido

Manipulacin ms fcil que con fagos !

ADN complementario (cDNA)

Es una fuente alternativa para clonar ADN de inters Se utiliza ARNm (sin intrones) como molde y una transcriptasa inversa Puede obtenerse bibliotecas de ADNc (genes activos)

Ejemplo de aplicacin de estas tcnicas

Produccin de insulina humana Produccin de hormona de crecimiento humana (antes se obtena de cadveres) Vacunas (hepatitis B) Organismos genticamente modificados (GMO):
transgnicos o cisgnicos

PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa Mtodo ms rpido para aislar y clonar (amplificar) cidos nucleicos En un termociclador Reactivos:
Taq polimerasa (polimerasa termorresistente) dNTPs Primers (cebadores) para iniciar sntesis de DNA

Secuencia de pasos en PCR

95C: Desnaturalizacin de ADN

72C: Replicacin por la Tac polimerasa

60C: Unin de primers a las regiones terminales del gen de inters

Secuenciacin de ADN
Determinar el orden lineal de las bases en el ADN
Mtodo de Sanger
Utiliza dideoxinucletidos Separa fragmentos por electroforesis

Genomas
Se han secuenciado varios genomas (humano 2003) Evolucin, fisiologa y enfermedad Cuntos genes? Cundo y en qu tejidos se expresan? 1-2% genoma humano codifica protenas normalmente Qu protenas se producen, cmo funcionan e interactan con otras? Protemica

Genomas
La secuencia de bases entre individuos solo difiere un 0.3% Variaciones: SNPs o polimorfismos de un nico nucletido Utilidad: base gentica de enfermedades:
Cncer de colon y mama Diabetes Alzheimer

Microarreglos o chip de ADN

Permiten monitorear simultneamente la expresin de miles de genes (25000)

Utiliza sondas de ADN (gen individual)

Se hibrida con ADNc Patrones de expresin de genes

FISH
Sonda de ADN radiactiva se hibrida con ADN desnaturalizado Diagnstico: evidencia una mutacin puntual o delecin