INMOVILIZACIN

Gonzlez Medrano Stephanie Prez Pimienta Yerandi Citlali Calva Zaldivar Vctor Manuel Rosas Huerta Uriel Alejandro

INMOVILIZACIN

"Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas o clulas confinadas o localizadas en cierta regin definida del espacio, con retencin de su actividad cataltica, y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetitivo y continuo." [European Federation of Biotechnology, 1983].

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

Aporta un considerable ahorro en su consumo. Es posible inmovilizar enzima y coenzima (cofactor). Permite realizar reacciones en fase heterognea, ampliando el uso analtico de las enzimas en nuevos dispositivos analticos de reconocimiento molecular del analto(sensores).

Perspectiva histrica
Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos. La inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea econmicamente rentable.

VENTAJAS DE LA INMOVILIZACIN

En muchas circunstancias la enzima se estabiliza. La actividad enzimtica se integra en el instrumento analtico(sensor). La enzima inmovilizada sobre un soporte se puede separar fcilmente de la muestra y utilizar repetidas veces (ausencia de contaminacin). Capacidad para detener rpidamente la reaccin, removiendo la enzima de la solucin de la reaccin (o viceversa).

DESVENTAJAS DE LA INMOVILIZACION
Costo adicional del soporte, reactivos y operacin de la inmovilizacin. Prdida de actividad. Influencia del soporte sobre la enzima que modifica su comportamiento. Poco adecuado a sustratos insolubles o de elevado peso molecular. Mayor riesgo de contaminacin en la operacin de reactores en continuo.

CUANDO INMOVILIZAR
Cuando el proceso de inters sea catalizado por enzimas intracelulares. Las enzimas de inters son inestables. Los cofactores requeridos son inestables. El uso de solventes inmiscibles en agua puede favorecer la solubilidad del sustrato.

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

La utilizacin de enzimas inmovilizadas o no, depender de una evaluacin econmica de las alternativas, donde se considerarn datos de cintica y estabilidad, costo, propiedades fisicoqumicas, eficiencia de inmovilizacin y carga del soporte.

MTODOS DE INMOVILIZACIN
1. RETENCIN QUMICA a) Enlaces no covalentes (adsorcin). b) Enlaces covalentes. c) Reticulado (cross-linking) y auto inmovilizacin. 2. RETENCIN FSICA=ATRAPAMIENTO a) Atrapamiento en matrices. (geles o polmeros, micelas reversas). b) Atrapamiento en membranas. (en fibras huecas, reactores de membrana).

RETENCIN QUMICA
A) Enlaces no covalentes (adsorcin) B) Enlaces covalentes. C) Reticulado (crosslinking) y auto inmovilizacin

INMOVILIZACIN POR ADSORCIN

Es el sistemas mas antiguos de inmovilizacin Se trata de la adsorcin fsica de la enzima a un soporte tcnico. La cantidad de enzima inmovilizada y su actividad dependen del tipo o naturaleza del soporte.

El fenmeno de adsorcin se basa en interacciones electrostticas, fuerzas de Van der Waals y de carga inica entre el soporte cargado y las clulas.

Es un mtodo de inmovilizacin: Suave (no afecta la actividad enzimtica ni viabilidad celular) Reversible (pH, fuerza inica o temperatura)

Seleccin del soporte

Depender de su capacidad de: Retener la enzima, sin dejar de desorber al seno del liquido. Tipo de enzima Tamao de la partcula Costo Composicin qumica del soporte Los mas empleados son: matrices de intercambio inico, vidrios, arena, carbon activado, plsticos, etc.

Inmovilizacin por enlace covalente

El mtodo de inmovilizacin mas utilizado es la formacin de un enlace covalente entre la enzima y un soporte o matriz. La tcnica se basa en la formacin de uniones covalentes entre el soporte insoluble y el biocatalizador.

Seleccin del tipo de reaccin

Para seleccionar el tipo de reaccin por la cual la protena ser inmovilizada, hay que tener en cuenta: 1. La reaccin de enlace debe ser llevada a cabo bajo condiciones en que no se cause perdida de actividad enzimtica. 2. El sitio activo de la enzima no deber ser afectado por los reactivos utilizados.

Grupos funcionales
Los grupos funcionales que forman parte en la formacin de enlace covalente son: Grupos amino Carboxil Hidroxil Fenol treonina

Soportes utilizados
Los soportes utilizados pueden ser: De origen natural (celulosa, agarosa, etc) Sinttico (derivados de poliestireno, poliacrilamida, etc); tambin se usan cermicas y vidrio. Regularmente se inicia con la activacin del soporte (por bromuro de ciangeno, formacin de complejos de diazonio, etc).

La mayora de las enzimas inmovilizadas por enlace covalente presentan una actividad cataltica alta, sin embargo dicha actividad puede perderse por:

Modificacin del centro activo de la enzima, si uno de sus grupos funcionales participa en los enlaces de inmovilizacin. Impedimentos estricos, si la ubicacin del sitio activo despus de la inmovilizacin impide el acceso del

Reticulado (cross-linking) y autoinmovilizacin

En estos mtodos se generan partculas solidas del biocatalizador sin el uso de un soporte, sino mediante la interaccin directa entre enzimas y clulas. Se pueden adicionar materiales inertes.

Entrecruzamiento

Las clulas microbianas y las enzimas pueden inmovilizarse por enlaces cruzados entre ellas mismas, empleando reactivos bi o multifuncionales (glutaraldehido, tolueno, etc.) que se entrelazan covalentemente a los grupos funcionales de las enzimas o de las paredes de las clulas.

RETENCIN FSICA=ATRAPAMIENTO
Atrapamiento en matrices En geles o polmeros Micelas reversas b) Atrapamiento en membranas Micro encapsulacin Membranas preformadas
a)

Atrapamiento en matrices
La inmovilizacin por inclusin se fundamenta en la formacin de una matriz tridimensional en presencia de un biocatalizador que queda atrapad dentro de su estructura. En este mtodo, ala enzima es contenida entre las cadenas de una red polimrica, lo suficientemente compacta para retener la enzima, pero capaz de permitir el libre flujo de reptantes.

Se ha utilizado con mas frecuencia para clulas, pues en el caso de las enzimas se obtiene normalmente una baja retencin del biocatalizador. Un inconveniente de estos mtodos es el crecimiento celular dentro de las partculas, que pueden llegar a densidades elevadas con una distribucin no uniforme debido a posibles limitaciones por difusin en las partculas.

Desventajas
No son regenerables. Baja estabilidad. Pobres propiedades mecnicas Severas restricciones difusinales.

MICROENCAPSULAMIENTO

Consiste en un doble proceso de atrapamiento. Se manufacturan esferas de gel contenido en enzimas, se recubren en una segunda capa y se licua el interior de la capsula por un mtodo especifico (intercambio de iones, temperatura, etc.).

Produciendo una reaccin de polimerizacin en la superficie de gotas de solucin enzimtica, dispersas en un solvente inmiscible con agua, que produce una delgada pelcula (nylon), casi sin restricciones di fusinales.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS METODOS DE INMOVIIZACION DE ENZIMAS.

METODO ADSORCION VENTAJA Los centros activos permanecen inalterados. INCONVENIENTE Posible desorcin de enzimas por cambio de pH, temperatura, etc.

No se requieren reactivos y Mtodos no especficos las etapas de activacin son para cada reaccin/enzima sencillas.

ENLACE COVALENTE

Mtodo sencillo y econmico Estabilidad de la enzima. No desliga Mtodo muy flexible, segn se elija el agente portador y mtodo de enlace

Mtodo caro y complicado La actividad puede reducirse si los reactivos usados son txicos para la enzima Los centros activos pueden modificarse o daarse

ENTRECRUZAMIENTO

Enzima ms entable, fuertemente enlazado. Puede usarse en combinacin con la adsorcin para prevenir perdidas de catalizador

Puede daar los centros activos Puede haber problemas difuncionales que limiten el rendimiento. Perdidas de enzimas durante la preparacin Problemas de difuncionales debido a la membrana Posible inactivacin de enzimas, sometidas a fuerzas de cizalla elevadas.

Simplicidad Posibilidad de uso simultaneo de varias enzimas.

MEMBRANAS

Uso de membrana selectiva: Mal funcionamiento a bajas control de sustrato/productos de concentraciones de mezclas sustrato(adsorcin de este en la membrana) Proteccin ante inhibicin, envenenamiento, No hay prdidas Adecuado para sustrato de alto peso molecular, buen contacto enzima-sustrato: altas concentraciones Estricto control del tiempo de residencia para sustratos de bajo peso molecular.

ELECCIN DEL MTODO DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

Caractersticas Preparacin Fuerzas de unin Actividad enzimtica Regeneracin del soporte Coste Estabilidad Aplicabilidad Proteccin frente a ataque microbiano Adsorcin Simple Dbil Intermedia Posible Baja Baja Si No Enlace covalente Difcil Fuerte Alta Rara Alta Alta No No Entrecruzamiento Membranas Intermedia Fuerte Baja Imposible Intermedia Alta No Posible Difcil Intermedia Baja Imposible Intermedia Alta Si Si

Efectos de la inmovilizacin sobre las propiedades cinticas y de difusin de las enzimas

En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. 1. Una estabilizacin conformacional 2. Una proteccin frente a las proteasas 3. Se evita la agregacin intermolecular 4. Existe una alteracin del microentorno del enzima

En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interface.

Efectos en la actividad enzimtica Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones.

El co-reticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina).

Catlisis de las enzimas inmovilizadas

La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar.

Problemas de difusin con enzimas inmovilizadas

Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno.

a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte.

b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.