Tinciones Hematolgicas

Sal F. Hernndez Domnguez

 En las coloraciones de Romanowsky (Wright, Giemsa, Leishman), son 2 colorantes bsicos diferentes: La Eosina que es un colorante de color naranja que se une a estructuras cidas.

 En el esquema la eosina est representada como pirmides de color naranja (1) y los sitios cidos como zonas de contorno cuadrangular; ejemplos de sustancias eosinfilas: hemoglobina, protenas catinicas de las grnulos de los eosinfilos.

 Y el azur de metileno, derivado del azul de metileno: es un colorante de color bsico de color azul brillante que tie estructuras cidas. Aqu se representan como zonas de contorno circular y el azur de metileno como cilindros.

A diferencia de la eosina, el azur de metileno tie diferentes colores dependiendo de su estado de agregacin. Si las molculas de colorante se unen a un componente de manera desordenada ( como se ve en la parte superior izquierda) conservan su color azul (2); los cidos que tpicamente se tien de esta manera, son los cidos ribonucleicos, y los ms abundantes son los ribosomales; por eso el citoplasma de las clulas con abundantes ribosomas se tien de color y se dice que es un citoplasma basfilo

 Por eso , si los componentes celulares tienen sitios de unin cercanos unos a otros y distribuidos de tal manera que las molculas de colorante se unan de forma ordenada, el azur de metileno cambia su color a rojo (3) (metacromasia), con todos los tonos intermedios entre el azul y el rojo; dependiendo del nivel de ordenamiento de las molculas del colorante en el espacio.

 Los cidos que tpicamente fijan de manera ordenada o metacromtica al azur de metileno son el DNA y los mucopolisacridos cidos.

 Por esta razn los ncleos celulares que tienen DNA- se tien de color rojo-violeta, y los grnulos de los promielocitos o de las clulas citotxicas que contienen mucopolisacridos cidos- se tien tambin de color rojo y se denominan grnulos azurfilos.

 Diferentes colores observados con la tcnica de Wright (y en general con las tinciones de Romanowsky), en eritrocitos y en un mielocito eosinfilo.

 A. Azul (basfilo). Indica la presencia de cidos no metacromticos (generalmente ribosomas).

 B. Naranja (eosinfilo). Indica la presencia de protenas bsicas, como la hemoglobina en el eritrocito y protenas catinicas en los grnulos de eosinfilos maduros.

 C. Gris (neutrfilo o policromatfilo). Indica una mezcla de sustancias cidas y bsicas como en los grnulos maduros de los neutrfilos, los grnulos intermedios de los eosinfilos y el citoplasma de los eritroblastos policromatfilos

 D. Rojo-violeta (azurfilo). Indica la presencia de cidos metacromticos como DNA o mucopolisacridos cidos; como en los grnulos de los promielocitos, los grnulos de los eosinfilos inmaduros o los ncleos celulares.

 La tcnica del cido perydico de Schiff (PASchiff) tie molculas de glucosa siempre y cuando sean abundantes, como sucede en clulas que tienen polmeros de glucosa (glucgeno o almidn) o glucoprotenas ricas en glucosa.

 En la primera etapa de la tcnica, las clulas se fijan, por lo general con formol alcohlico que conserva y precipita las molculas antes mencionadas. En el esquema se muestra una molcula de glucgeno.

 Las clulas o tejidos se tratan con cido perydico, con el que se obtienen radicales aldehdo a partir de las molculas de glucosa.

 Los radicales aldehdo, obtenidos despus del tratamiento con cido perydico (esteriscos).

 Las muestras se tratan ahora con fucsina decolorada (A), llamada tambin reactivo de Schiff, que al ponerse en contacto con los radicales aldehdo recobra su color magenta original (B).

 El resultado es que el glucgeno o glucoprotenas celulares se tien de color magenta, con una intensidad que depende de la concentracin de molculas de glucosa.

 Los mucopolisacridos, que contienen pocas molculas de glucosa, son dbilmente positivos Generalmente estas preparaciones se contratien con hematoxilina para poder observar el ncleo.

Granulocitos neutrfilos teidos con: A. Tincin de Wright.

Granulocitos neutrfilos teidos con: B. Tcnica de PASchiff. Los neutrfilos tienen una gran cantidad de glucgeno citoplasmtico.

 C. Tcnica citoqumica enzimtica para mieloperoxidasa. Estas tcnicas aprovechan la actividad de una enzima para producir una reaccin controlada que tiene como producto final una sustancia coloreada que se precipita en el sitio de la reaccin.

 C. En esta fotomicrografa, la mieloperoxidasa de los neutrfilos, se ha puesto de manifiesto con una tcnica de citoqumica enzimtica cuyo producto final es de color azul.

 D. Inmunocitoqumica para CD15. En las tcnicas de inmunocitoquimica (en frotis celulares) o en inmunohistoqumica (en cortes de tejidos) se utiliza un anticuerpo dirigido contra una sustancia particular a la cual se le una.

 Posteriormente el anticuerpo adherido se revela con tcnicas que se vern a continuacin.

 En la primera etapa de la tcnica de inmunofluorescencia, marcados con fluorescencia, dirigidos contra una sustancia que se quiere mostrar en el tejido o clula.

 El anticuerpo se une a la sustancia (antgeno) hacia la que est dirigido.

 Varios anticuerpos fluorescinados unidos a sus respectivos antgenos en una superficie celular.

En un microscopio de fluorescencia, la excitacin con luz de cierta longitud de onda (en el caso de la fluorescena con luz azul) hace que la sustancia fluorescente unida a los anticuerpos emita fotones con una longitud de onda mayor (en este caso verde) que pueden ser captados pticamente a travs de sensores apropiados.

 Las zonas luminosas corresponden a las zonas donde se encuentra la sustancia buscada.

 Fibroblasto en cultivo teido con anticuerpos antitubulina y fotografiado con un microscopio de fluorescencia.

 En la primera etapa de la tcnica de inmunohistoqumica, se utilizan anticuerpos primarios dirigidos contra una sustancia que se quiere demostrar en una clula o en un tejido.

 Los anticuerpos son productos en una especie diferente a aquella que se quiere demostrar el antgeno, por ejemplo, anticuerpos de ratn contra una protena humana.

 Anticuerpos primarios unindose a su antgeno especfico.

 En la segunda etapa se aaden anticuerpos secundarios biotinilados (en color amarillo, biotina en color azul).

 Estos anticuerpos estn dirigidos contra los anticuerpos primarios y son producidos en una especie diferente, por ejemplo anticuerpos de conejo contra anticuerpos de ratn (que a su vez estn dirigidos contra una protena humana).

 En la ltima etapa la enzima unida a la avidina (generalmente peroxidasa o fosfatasa alcalina) se revela por medio de una tcnica de citoqumica o de histoqumica enzimtica.

 El producto final coloreado muestra las zonas donde se encuentra el antgeno buscado.

 A. Tcnica de citoqumica no enzimtica para hierro no hmico, que se observa de color azul dentro de un macrfago (tcnica de Perls).

B. Tcnica de citoqumica enzimtica doble para el alfa-naftilacetato (caf rojizo), que es positiva en un monocito y para cloro acetato esterasa (azul) que es positiva para un neutrfilo segmentado.

 C. Tcnica de inmunocitoqumica con un anticuerpo monoclonal contra CD41 que marca varios monocitos en color rojo. Inmunofosfatasa alcalina

 D. Tcnica de inmunohistoqumica doble en un corte de bazo; las clulas endoteliales de los sinusoides venosos estn marcadas en color amarillo, con anticuerpos anti bcl12; las fibras reticulares estn marcadas en color verde, con anticuerpos anti colgena tipo IV.

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