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ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e
caracterização dos
anticorpos e seu uso como
ferramenta para pesquisa e
diagnóstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS
lEspecificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
lQuantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua
produção.
lIsotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são
encontrados.
lAfinidade
Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior
a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.
lAvidez: força total de ligação, nos dois sítios.
Avidez x Afinidade
INTERAÇÕES
lReações reversíveis.
reversíveis
2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
MÉTODOS
l PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial - Pesquisa
- Imunoeletroforese
- Diagnóstico
l AGLUTINAÇÃO
- Soroepidemiologia
- Aglutinação direta e indireta
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
l IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
lPrecipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.
lAglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas
de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas
adjacentes.
PRECIPITADO
É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos
mesmos. Observe abaixo:
Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +
100%--
Percentual
de
complexo
imune
precipitado
Zona de excesso Zona de Zona de excesso
de anticorpo equivalência de antígeno
IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:
Ac
IMUNODIFUSÃO
DUPLA
l As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se
encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela
formação de uma linha de precipitação:
l Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante
Utilização: muito usada em
pesquisa e diagnóstico de
algumas doenças, como
Ag Ag cisticercose
Ac
Ag Ag Ag Ag
Ac Ac
IMUNODIFUSÃO
RADIAL
l Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
l O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno
do orifício.
Utilização: dosagem
de IgG, IgA e IgM e Poços onde são
proteínas séricas. colocados padrões
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo Halo de precipitação
anticorpos IgG – anti-
anti-IgG humana IgG
IMUNOELETROFORES
E
l Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são
separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
l As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de
acordo com os seus PM e cargas elétricas.
l Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se
difunde.
l Ag e Ac formam arcos de precipitação.
Ag
canaleta
+ -
Ag
3- Difusão e precipitação
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
l Ac + Ag multivalente particulado
l Título:maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo)
l Pó-zona: excesso de Ac
l Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão)
l Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
3) Controle negativo:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
5) Leitura do resultado:
negativo positivo
+ Resultado negativo:
Urina Soro anti - hCG (ausência de hCG na
urina).
Partículas Ocorre aglutinação,
Adicionam-se
revestidas com hCG pois os anticorpos
São incubados e anti-hCG não são
colocados numa bloqueados na
placa incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Resultado positivo: Livres, podem
(presença de hCG aglutinar as partículas
na urina): não ocorre revestidas de hCG.
aglutinação.
fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado
TIPOS DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta:
lDetecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células
tumorais.
IFA indireta:
lDiagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-
imunes.
APLICAÇÕES
Tipo de linfócitos;
Quantidade, tamanho, granulosidade;
Isolamento de populações celulares;
HIV
Ensaio Imunoadsorvente
Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois
conjugados com enzimas.
Fosfatase
alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
O produto final corado surge por ação da enzima que converte
um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância
indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através
de leitura em fotocolorímetro.
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e
captura.
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
ØAplicações do ELISA:
§Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
ØVantagens:
§Teste de alta sensibilidade
§Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
§Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Ø Marcações:
l I125: emite raios gama
l H3: raios beta
Ø Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Ø Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
Ø Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
WESTERN BLOTTING
l Eletroforese de
proteínas.
l Identifica
antígenos ou
anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING