Universidad Privada san Juan Bautista Escuela de Medicina Humana Curso Biologa celular y Molecular

MTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA

Biologa Celular y Molecular

UPSJB

MTODOS UTILIZADOS PARA EL ANLISIS INSTRUMENTAL DE LA ESTRUCTURAS BIOLOGICAS

- MICROSCOPIA - FIJACIN Y COLORACIN - MTODOS CITOQUIMICOS - CULTIVO CELULAR - FRACCIONAMIENTO CELULAR.

Cardiomiocito mus estriado , citopatologia

Clula cancerosa del pulmn

glbulos rojos con leucocito

OVOCITO HUMANO

100 Micrmetros = 1 diez milsima de metro

10-4 m

UN GLBULO ROJO

10 Micrmetros = 1 cien milsima de metro

10-5 m

VIRUS

TOMO DE HIDRGENO

1OO Nanmetros =

10-7 m

1 diez millonsima de metro

1 Angstrom = 1 billonsima de metro

10-10 m

La microscopa es la tcnica de producir imgenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeos para ser percibidos a simple vista. la microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de radiacin incidente en el sujeto de estudio.

 pticos o luminosos

- Campo Claro:

de ondas luminosas, luz

Luz

- Campo oscuro o Ultramicroscopa.

en fondo oscuro

visible, luz natural :

dispersada a nivel de interfases. Lentes de condensador estn modificadas. El objeto brillante

se producen retrasos en las radiaciones que atraviesan el objeto y aparece en tonos de gris que dependen del producto entre el espesor del objeto y las diferencias entre los ndices de refraccin del objeto y del medio efecto clulas vivientes/tejidos . M. Interferencia

- Contraste de fases e Interferencia :

notable del relieve en la estructura de la clula viviente

Microscopio Contraste de FAses

-Fluorescencia Descubierto en 1908 por Khler y

Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos Se utiliza para detectar protenas u otras molculas especficas en una clula. La utilizacin en el quirfano de un microscopio dotado de mdulo de luz fluorescente consigue la extirpacin total de los tumores cerebrales malignos en un 67% de los casos, segn los datos obtenidos de un estudio publicado en la revista cientfica americana The Lancet Oncology
Microscopa de fluorescencia. Se observa una micrografa de una clula en mitosis. Para obtener esta imagen, se emplearon tres molculas fluorescentes distintas con el fin de teir tres componentes celulares diferentes. Se us un anticuerpo acoplado a una protena fluorescente verde para detectar a los microtbulos, otro anticuerpo acoplado a una protena fluorescente roja para detectar a los centrmeros, y un colorante fluorescente azul para teir el ADN, que se encuentra condensado formando los cromosomas.

- M. Campo oscuro

- M. Fluorescencia

Tinciones Coloracines
Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante.
a) Organismos clulas vivas: - Tincin vital ( colorantes incuos)

-Tincin supravital: adicin de colorante a clulas

extirpadas de organismos (rojo neutro, verde de janus, azul de metileno)

b)Tejidos Muertos , Biopsias -Tinciones no vitales

Obtencin, Fijacin, Inclusin, Cortes, Tincin Montaje

Tipo de Colorantes
1.- Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina, Hematoxilina , Hematoxilina frrica; derivados de la anilina (metacromatica) Azul de toluidina, azul de metileno, rojo neutro, verde de janus. 2. - Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina,cido pcrico (cromo tropo) diazoico (azul de tripana, rojo de tripano 3- Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien (Negro sudn)

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos.

TIPO DE COLORACIONES

- Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina) . - Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de ZiehlNielsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante - Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes

Microscopia Electrnica
Permite la observacin de ultraestructura. Los electrones emitidos dentro de un tubo al vaci son acelerados y luego desviados a campos magnticos que actan como lentes pticas . La imagen se visualiza sobre una pantalla fluorescente y es producida por la dispersin de los electrones al chocar con los ncleos atmicos presentes en el objeto. La dispersin depende del espesor del objeto de la concentracin de los tomos y del nmero atmico. Se usan tomos pesados que actan como colorante electrnicos y aumentan el contraste. Poder resolutivo 0,3 a 0,5 nm y aumento millon de veces a ms. Las macromolculas ADN-ARN se puede estudiar por medio de la tcnica de monocapa. Caso de estructura de membrana se estudia mediante la tcnica congelacin fractura seguida o no de gravado

Microscopio Electrnico

Transmisin

Barrido

Micrografa Lser Confocal de una muestra de fango de aguas residuales

Mucosa in delg

Feto de seis dias

BARRIDO ( Scanning) permite obtener una vista de superficie del objeto utilizando los electrones secundarios emitidos ya que los electrones se reflejan en la superficie de la muestra y la imagen revela la morfologa superficial. TRASMISION (STEM) se utiliza un fino haz de electrones para efectuar el barrido del corte (seccin fina del muestra y revela la estructura interna ); los electrones dispersados son analizados con detectores especiales . Se obtiene imgenes de macromolculas sin colorear.

HIV Lt CD4 Microscopa barrido

Clulas de Lactobacillus adheridas al epitelio gstrico de un ratn

Preparacin de las muestras El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de resina. Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos para Microcopia electrnica de transmisin, pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido y su accin se centra en las protenas. La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.

Preparacin de las muestras El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de resina. Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos para Microcopia electrnica de transmisin, pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as: (COOH-protena-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO Entonces: COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteinaCOOH +H2O La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.

2. Tampones: liquido fijador que reproduzca en la mayor medida posible las condicones medioambientales del tejido vivo en lo que respecta al pH
3. Fijacin secundaria: es llevada a cabo por la accin del tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora. 4. Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y etanol absoluto. 5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.

6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos despus de la deshidratacin. La concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura. 7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura. 8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin aumentando la temperatura. Resolucin y magnificacin La tcnica de preparacin de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son vulnerables y variados al tipo de investigacin

HERRAMIENTAS DE LA NANOTECNOLOGIA
Los microscopios ven cosas a travs de lo que sienten con una punta muy afilada que est puesta en algo que parece un alfiler.

METODOS CITOQUIMICOS
Citoqumica: identificacin y localizacin de los componentes qumicos de la clula a) separacin de fracciones celulares y su anlisis por tcnicas bioqumicas b) aislamiento de tejidos y aun de clulas para su anlisis con micro y ultramtodos c) mtodos de coloracin citoqumica d) mtodos basados en parmetro fsicos. Protenas: reaccin Millon Aldehdos: reaccin Schiff es la leucobase de la fucsina bsica decolorada ADN: reaccin Fulgen despus de una dbil hidrlisis cida que elimina ARN y evidencia a aldehdos unidos a las bases pricas tie al ncleo de color morado

Polisacridos: reaccin de PAS, por oxidacin de grupos 1,2 glicoles por el cido perydico.
Enzimas: a partir de cortes congelados incubados con sustratos especficos y el producto se convierte en un precipitado o un compuesto coloreado.

CULTIVOS CELULARES
Principal mtodo para estudiar a la clula viviente Burrows (1910) uso plasma de pollo para nutrir explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio revel ser mucho mejor que los anteriormente probados, permitiendo observar crecimiento de tejido nervioso, corazn y piel. Burrows y Carrel (1912) realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de clulas de mamfero, consiguiendo mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias

 R.G. Harrison (1907), padre de los cultivos de tejidos animales, fue el primero en emplear tcnicas in vitro para el estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal de anfibios. Observo el crecimiento de axones de neuroblastos en una gota de linfa de Rana que colgaba de un cubreobjetos en una cmara sellada. Rous y Jones (1916) emplearon por primera vez extractos de tripsina para disociar clulas de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular.

 Sanford, Earle y Likely (1948) aislaron la lnea celular L mostrando que eran capaces de formar clones en el cultivo de tejidos..
Grey, Coffman y Kubicek (1952) establecen la primera lnea celular contina, las actualmente bien conocidas clulas HeLa obtenidas de carcinoma humano, L y 3T3 de embrin de ratn

Hayflick y Moorhead (1961) usaron por primera vez antibiticos para prevenir la contaminacin de los cultivos de fibroblastos, pudiendo mantenerlos durante 12 meses.
Augusti-Tocco y Sato (1969) establecen la primera lnea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecan procesos nerviosos y que eran elctricamente excitables. Kohler y Milstein (1975) establecen la primera lnea celular productora de anticuerpos monoclonales.

Aplicaciones del cultivo celular.

Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como transcripcin de DNA, sntesis de protenas, metabolismo energtico. Flujo intracelular. Movimientos de sustancias y seales asociadas a los diferentes procesos fisiolgicos, como ensamblaje y desensamblaje de componentes intracelulares, movimientos del RNA : ncleocitoplasma, movimiento de protenas.

Ecologa celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciacin, cintica de la poblacin celular. Interacciones celulares. Procesos de induccin embrionaria, cooperacin metablica, inhibicin por contacto o por adhesin, interacciones clula-clula.

 CULTIVOS EN SUSPENSION

Algunas clulas requieren de un medio fluido para poder desarrollarse e interaccionar, estos sistemas en suspensin tambin contiene macromolculas que sirven de matriz protegiendo e interaccionando con la superficie celular; stas se encuentran en el suero y proporcionan un sistema balanceado de nutrientes. Este tipo de cultivo es ideal cuando se quiere estudiar fenmenos intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de clula.

Cultivo de clulas en suspension

 CULTIVOS PRIMARIOS

Se obtienen a partir de muestras de tejido que son tomadas directamente a partir de organismos vivos, los cuales son tratados mediante enzimas proteolticas a fin de disgregar las clulas inmediatamente son cultivadas en un medio apropiado por periodos cortos de tiempo dentro de los cuales se da el anlisis.
CULTIVOS SECUNDARIOS Derivan de un cultivo primario

 LINEAS CELULARES Estos son cultivos que se establecen a partir de la seleccin de un clon especifico proveniente de un cultivo primario tripsinado. De uso mas corriente son las lneas establecidas las cuales se han adaptado a un crecimiento prolongado in vitro por transformacin cancerosa. Estas clulas son escogidas de acuerdo a caractersticas deseadas y son mantenidas por un numero indeterminado de generaciones e inclusive se les suele almacenar a temperaturas de nitrgeno liquido
Una de las primeras lneas celulares humanas, obtenida de Henrietta Lacks, quien falleci de cancer de tero a partir de cul se obtuvieron estas clulas. El cultivo de clulas HELA que se muestra en la imagen fue teido con Hoescht que se une al ADN coloreando de azul el nucleo

CONDICIONES PARA EL CULTIVO CELULAR (MICROAMBIENTE)

Medio de cultivo. Debe contener los nutrientes bsicos para la supervivencia de las clulas como y estimuladores (hormonas) que promuevan su diferenciacin y viabilidad. Gases (O2 y CO2) y pH. Debe garantizarse un 20% de O2 (atmosfricos) y un 5% de CO2 (tisular) en el sistema los cuales deben ser administrados con una adecuado sistema de ventilacin y filtros que garanticen la eliminacin de contaminantes. Osmolaridad-humedad. Debe garantizarse una ambiente hmedo, que evite la evaporacin del agua del medio de cultivo lo que incrementar lo osmolaridad del mismo. Temperatura. El estricto control de la temperatura es muy importante al tratarse de un factor crtico en la mayora de los experimentos con clulas de mamferos cuyo metabolismo ptimo es a 37 . Cuando en un experimento aparecen problemas y datos no explicables, la causa suele ser un deficiente ajuste de la temperatura.

Equipos para cultivo celular A) Cmara de flujo laminar B) Incubadora de CO2 C) Microscopio C

FRACCIONAMIENTO CELULAR

El fraccionamiento celular es un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen por objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo (mitocondrias, ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana (membrana total, plasmtica, dominio basolateral, etc. complejos) multiproteicos (citoesqueleto, poros nucleares, etc), etc.

Etapas del fraccionamiento clular

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas : Rotura de clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fraccin deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificacin. Separacin de la fraccin deseada mediante algn criterio como diferencia de densidad (centrifugacin en gradientes o diferencial), presencia de antgenos (cromatografa de inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, etc.), etc.

Rotura de clulas o tejidos

Se consigue usando procedimientos mecnicos suaves conocidos como homogenizacin. Estos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, liberando el contenido celular. Los procedimientos de homogenizacin ms comunes son : Sonicacin en la cual se aplica ultrasonidos a la suspensin celular, producindose una intensa agitacin que destruye las membranas. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa se puede destruir estructuras subcelulares e incluso complejos proteicos. Detergentes no ionicos que solubilizan la membrana celular. Homogenizadores. Los que rompen las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador.

Sonicador

Separacin de las fracciones deseadas

Centrifugacin
Se basa en hacer girar un tubo a gran velocidad, con la ayuda de un rotor (centrifugacin), de forma que se genera una fuerza centrifuga que produce la precipitacin de partculas en el fondo, ya que estas tienden a hundirse hasta alcanzar una densidad igual a la del medio en que se encuentran.

Centrifugas
Son instrumentos que generan intensas fuerzas centrifugas al girar las muestra ha altas velocidades produciendo sedimentacin. De acuerdo a la aceleracin que alcanzan se las denomina como centrfugas (de pocas g a 3000 g), supercentrfugas (de 2000 xg a 20000 xg) y ultracentrfugas (de 15000 xg a 600000xg), en estas ltimas se suele controlar la temperatura mediante refrigeracin, adems es necesario generar vaci para evitar la sobrecalentamiento debido a la friccin.

Tipos de centrifugacin
Centrifugacin diferencial Se basa en la diferencia de densidad entre las partculas en suspensin y el medio que las contiene, de modo que al aplicar un campo centrifugo estas precipiten. Una muestra en la que existen varios tipos de partculas, puede separarse por centrifugaciones sucesivas ya que las partculas mayores y/o ms densas precipitaran primero y cuando el sobrenadante de esta primera etapa es recentrifugado en condiciones de ms tiempo y aceleracin sedimentaran las nuevas partculas ms densas presentes, y as sucesivamente. obtenindose sedimentos o fracciones de partculas de diferente tamao y/o densidad.

Centrifugacin en gradiente de densidad continua

Esta tcnica se basa en la diferencia de densidad boyante (o de flotacin) que existe entre diferentes componentes de una muestra a analizar. Para esto se prepara una gradiente de densidad (generalmente de sucrosa o de cloruro de cesio), de modo que los componentes de la muestra se separaran migrando hasta aquellas en zonas en las cuales su densidad iguale a la del medio, es decir, a la de la gradiente. Para esto se usa agentes disolventes como el DMSO.

Centrifugacin en gradiente de densidad discreta

En esta tcnica tambin aprovecha la diferencia de densidad boyante de los componentes de la muestra. Ac se generan 2 zonas de diferente densidad (2 concentraciones de sucrosa o de cloruro de cesio) de tal forma que la muestra se separara en tres grupos bien definidos, el primer grupo que se ubicara en la zona de densidad baja, un segundo grupo en la de densidad alta y el tercer grupo que se ubicara en la interfase ya que su densidad es intermedia entre las 2 aplicadas.