Polymerase Chain Reaction

PCR

El Genio de Jurassic Park

DNA de orgen fsil +

El Genio del PCR

Temas
Descripcin General Diseo de oligonucletidos iniciadores primers Clculo de la temperatura El estudio y uso de los productos de PCR Problemas con los errores de la polimerasa Variaciones de la PCR

Descripcin General
Para hacer copias de un gen hay que conocer las regiones que lo delimitan y contar con su secuencia. Los oligonucletidos de iniciacin determinan los lmites de la regin amplificada. Normalmente, la reaccin se lleva a cabo con una DNA polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria termoflica. Por ello, la enzima es capaz de soportar las altas temperaturas de la reaccin. El nombre del enzima es Taq. La velocidad de sntesis de las nuevas cadenas es de 1Kb por minuto aproximadamente. La sntesis es seguida de una etapa de desnaturalizacin, de 1 minuto a 93C, y anillamiento de los primers durante otro minuto, a 52C. Al finalizar la reaccin (20-35 ciclos) se observa un enriquecimiento de los fragmentos copiados entre los dos primers. El anlisis de fragmentos se hace por electroforesis en gel de agarosa, y ticin del DNA con bromuro de etidio.

Diseo de oligonucletidos iniciadores primers

Los primers tienen que ser complementarios a la secuencia a amplificar. Deben de hibridarse exactamente. Si no, no hay amplificacin, o tiene lugar una aamplificacin inespecfica. La longitud del primer determina la especificidad. Un primer de 8 nucletidos se anillar en 1/65536pb. En el genoma humano, hay 3000000 pb, luego puede anillarse en 46000 sitios distintos. Un primer de 18 nucletidos se unir en 1/17179869184pb. O sea, en un solo sitio. Los primers no pueden ser todo lo largos que se quiera, porque esto afecta a la velocidad de hibridacin y la eficiencia del proceso. En consecuencia, los primers nunca exceden 30 nucletidos.

Clculo de la temperatura
Cada ciclo de PCR implica trs saltos de temperatura: La desnaturalizacin, a 94C La hibridacin de los primers, que depende de la longitud y composicin de los mismos. La extensin, que ocurre ptimamente a 74C para Taq.

Temperatura de Hibridacin
Es el factor mas determinante en la hibridacin. A temperaturas demasiado altas, no tiene lugar. Temperaturas demasiado bajas, tienden a favorecer hibridaciones inespecficas, alterando la especificidad de la reaccin. La temperatura ptima tiene que ser lo suficientemente baja para permitir la hibridacin especfica entre el primer y su secuencia complementaria, pero lo suficintemente alta, como para impedir hibridaciones no especficas. Esta temperatura puede calcularse en base a la temperatura de fusin (melting temperature) o Tm del hbrido.

Clculo de la Tm
La Tm se puede obtener experimentalmente, pero es mas habitualmente calculada en base a la siguiente ecuacin: Tm= (4x[G+C])+(2x[A+T])C Donde G,C,A y T es el nmero de nucletidos de cada tipo en el primer.

Temperatura de Hibridacin
La temperatura de hibridacin estar, por tanto, 1-2C por debajo de la Tm Es importante tener en cuenta que la PCR requiere el uso de dos primers, y que ambos deben de tener una temperatura de hibridacin semejante. De lo contrario, la reaccin no proceder normalmente!

El estudio y uso de los productos de PCR

Anlisis por electroforesis en gel Clonaje Secuenciacin Deteccin por southern blotting

Anlisis por electroforesis en gel

Los fragmentos obtenidos por PCR se pueden cargar en un gel de agarosa y separados por electroforesis. Este anlisis permite: Determinar el tamao exacto del fragmento. Si hay muutaciones que alargan o acortan el gen, se pueden detectar. Realizar anlisis de restriccin del fragmento, determinando si hay modificaciones o diferencias con respecto a secuencias de referencia. Esta tcnica se emplea en el diagnstico y fornsica. La presencia o ausencia de fragmentos puede indicar si un gen est o no est en una genoteca. Hacer el experimento

Clonaje
En muchos casos, el producto se insertar en un vector para el anlisis funcional del fragmento. En general, Taq suele dejar una adenina extra en el extremo 3. Esto plantea problemas para la insercin del fragmento. Normalmente, los primers se disean con sitios de restriccin deseados en el extremo 5(cola), que no hibridan en el primer ciclo, pero que luego se incorporan a los fragmentos copiados en los ciclos siguientes.

Secuenciacin
El objetivo mas comn tras la obtencin de un fragmento de PCR es su secuenciacin. Hoy en da, el DNA es secuenciado de manera automatizada, y el resultado se remite en soporte digital, el cual puede incorporarse a aplicaciones boinformticas adecuadas para el anlisis de fragmentos. Ver una sntesis de una secuenciacin

Southern Blotting
Es una tcnica por la que el producto de una PCR puede usarse para determinar si existen secuencias similares en otras muestras. Es una tcnica muy importante en el anlisis de DNA. Ver animacin

Problemas con los errores de la Taq polimerasa

Todas las polimerasas cometen errores, introduciendo nucletidos erroneos. Taq tambin (1 de cada 9000 nucletidos o 1 cada 300 pb despus de 30 ciclos). Por eso, lo mas probable es que al clonar genes por PCR, el gen secuenciado y estudiado no sea idntico al gen original ! Sin embargo, existen polimerasas (Pol I) que son capaces de revisar el producto y resintetizar las zonas con errores. A esto se le denomina edicin (proofreading).Ver animacin

Variaciones del PCR

RT-PCR. Se trata de una reaccin en la que se hacen copias del RNA mensajero en versin DNA (cDNA) con una enzima que proviene de un retrovirus. Real Time PCR es otra cosa. Se trata de una reaccin en la que se puede seguir la progresin de copias a medida que ocurre.