UNIDAD N 3: Tema 2: REPLICACIN DEL ADN

Blgo. Ms. Pablo Chuna Mogolln

Profesor Auxilar T.C. Area Biologa Departamento Acadmico de Ciencias - UPAO

REPLICACION DEL DNA

La replicacin es el proceso mediante el cual, a partir de una molcula de DNA doble hlice, se sintetizan dos molculas idnticas. Tiene lugar cada vez que se divide una clula, ya que las dos clulas hijas han de tener exactamente, la misma dotacin gentica que la progenitora.
CARACTERISTICAS Semiconservativa Bidireccional Semidiscontnua Asimtrica Asincrnica Es multifocal en eucariotas Requiere de Cebadores Ocurre en el perodo S.

Es semiconservativa
A partir de la doble hlice de una molcula de DNA se originan dos molculas de DNA, ambas compuestas por una cadena original (preexistente) y una cadena nueva (recin sintetizada). Es decir, que las dos cadenas de la molcula progenitora se separan y sirven cada una de molde para la sntesis de una nueva cadena hija complementaria, siguiendo la regla normal de apareamiento.

Nucletidos

Molcula parental de DNA

Ambas cadenas parentales Sirven como molde

Dos molculas de DNA hijas idnticas

Es Bidireccional
Origen de replicacin Origen de replicacin

Al abrirse la doble hlice se forma una estructura llamada burbuja de replicacin, cuyo tamao aumenta a medida que avanza la separacin de las dos cadenas de DNA, evento que se produce en forma simultnea en los 2 extremos de la burbuja. Cada burbuja, tiene dos horquillas de replicacin que a partir de ese punto de origen comn avanzan en ambas direcciones opuestas

Origen de replicacin

Cadena parental

Cadena hija

Burbuja de replicacin

Dos molculas de DNA hijas

Es Semidiscontnua
La cadena hija que adopta como molde a la cadena progenitora que corre en direccin 35 se sintetiza en forma continua, al crecer en direccin 53, y se denomina cadena adelantada (leading strand).

La otra cadena hija, cuyo molde es la cadena del DNA progenitora que corre en direccin 53 es sintetizada de un modo singular, ya que para poder crecer en esa direccin debe sintetizarse en direccin opuesta al avance de la horquilla de replicacin. El problema se supera haciendo de que la sntesis sea discontinua, lo cual significa que la nueva cadena se sintetiza de a pequeos fragmentos y se le llama cadena retrasada (lagging strand).

La sntesis de la cadena retrasada se lleva a cabo en la direccin opuesta a la del movimiento de la horquilla de crecimiento, a partir de una serie de iniciadores de RNA cortos formados por la primasa en mltiples sitios de la segunda cadena molde. Los segmentos resultantes de RNA ms DNA se conocen como fragmentos de Okasaki.

La Replicacin es Multifocal en Eucariotas

En eucariotas, para poder llevar a cabo la replicacin en un tiempo razonable, ha de ser multifocal, es decir, empezar por muchos puntos a la vez. Se ha comprobado que en el DNA de clulas de mamferos existen cerca de 50 000 a 100 000 replicones. En cambio la replicacin del DNA bacteriano es monofocal, es decir, existe un slo origen de replicacin.

Requiere de Cebadores
Para empezar la sntesis de DNA se requiere una cadena de nucletidos para agregarle un nuevo nucletido. Cada fragmento de Okazaki se inicia con un RNA cebador primer (~10 bases de largo).

Ocurre en Fase S del ciclo celular. La replicacin del DNA

ocurre con alta fidelidad dentro de un perodo de tiempo determinado en forma precisa dentro del ciclo celular. Sntesis de DNA = replicacin

REQUERIMIENTOS DE LA REPLICACION
EN PROCARIOTAS DNA Helicasa. Protenas SSB (Single- Strand binding). Topoisomerasas I y II (girasa) RNA primasa. DNA Polimerasas (DNA Pol) I, II y III Pirofosfatasa. DNA Ligasa DNA molde o template Cebadores Los 4 desoxirribonucletidos trifosfato: (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Mg++ Abrazadera RNAH asa EN EUCARIOTAS DNA Helicasa. Protenas RFA y RFC Topoisomerasas I y II RNA primasa. DNA Polimerasas (DNA Pol) ,, , , Pirofosfatasa. DNA Ligasa DNA molde o template Cebadores Los 4 desoxirribonucletidos trifosfato: (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Mg++ PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) ORC (origin recognition complex) Nucleasa reparadora

DNA POLIMERASAS (DNA Pol)

La DNA Polimerasa, agrega un nucletido al extremo 3 de la cadena de DNA en crecimiento y forma un enlace fosfodister entre este extremo y el grupo 5-fosfato de nucletido entrante. El nucletido trifosfato entrante provee la energa necesaria para esta reaccin por la hidrlisis de los dos fosfatos terminales (PPi). Este pirofosfato es luego hidrolizado a fosfato inorgnico (Pi), lo cual permite que la reaccin de polimerizacin sea irreversible.

DNA HELICASAS y PROTENAS SSB.

Una helicasa y las protenas de unin a las monocadenas (SSB) trabajan para desenrollar y mantener las cadenas de DNA separadas antes del avance de la horquilla de replicacin Las helicasas son enzimas capaces de desplazarse a lo largo del DNA utilizando la energa de la hidrlisis del ATP, para separar las cadenas. Las protenas SSB mantienen las cadenas separadas

Topoiso merasas
Las Topoisomerasas tipo I relajan el DNA, por corte y cierre de una cadena del DNA.
Las Topoisomerasas tipo II cambian la topologa del DNA mediante el corte y la reparacin del DNA bicantenario.

ETAPAS DE LA REPLICACION

INICIACION
Reconocimiento de orgenes de replicacin Separacin de hebra Posicionamiento de maquinaria de replicacin

ELONGACION
Crecimiento bidireccional de la horquilla de replicacin Replicacin semiconservativa, semidoscontinua, coordinada.

TERMINACION
Reconocimiento de seales de terminacin
Desensamble de replisomas

1) INICIACION
La sntesis del DNA se inicia en regiones especiales llamadas orgenes de replicacin. Los orgenes de replicacin tpicamente contienen mltiples secuencias repetidas cortas. Estos segmentos de DNA singulares son reconocidos por protenas multimricas que se unen al origen y, a su vez, reclutan hacia ste otras enzimas de la replicacin.

1) INICIACION
La sntesis del DNA se inicia en regiones especiales llamadas orgenes de replicacin. Los orgenes de replicacin tpicamente contienen mltiples secuencias repetidas cortas. Estos segmentos de DNA singulares son reconocidos por protenas multimricas que se unen al origen y, a su vez, reclutan hacia ste otras enzimas de la replicacin.

La iniciacin de la replicacin del DNA en E. coli, se produce por la unin de la protena dnaA al nico origen de replicacin (oriC), seguida por la fijacin de la DnaB, una helicasa que disocia el DNA a la altura de la horquilla. La asociacin de la primasa (dnaG) a este complejo forma un primosoma. Tras la sntesis del iniciador la primasa se separa.

2) ALARGAMIENTO DE LAS CADENAS:

Una vez que el origen de replicacin se ha formado, el alargamiento para formar la cadena adelantada progresa sin mayor dificultad. Una primasa se une a un sitio adyacente a la helicasa en el segmento monocatenario del molde de la cadena retrasada e inicia la sntesis de otro iniciador de RNA, el mismo que la polimerasa procede a alargar para formar otro fragmento de Okasaki. El ncleo polimersico que sintetiza la cadena adelantada se desplaza, junto con su abrazadera de subunidad , a lo largo de su molde en la direccin del movimiento de la horquilla, y as alarga la cadena.

Una vez que los cebadores de la cadena retrasada han sido elongados por la DNAP III, ellos son removidos Por la RNAHasa + DNA polimerasa I y sta ltima rellena dichos espacios. La enzima tiene actividad polimerasa 53, 3 5 exonucleasa (proofreading) en una sola cadena polipeptdica. La exonucleasa 53 remueve los cebadores, mientras que la polimerasa funciona simultneamente llenando los espacios con DNA por elongacin del extremo 3 del fragmento de Okasaki adyacente. El enlace fosfodister final entre los fragmentos es catalizado por la DNA ligasa

3) TERMINACIN
La replicacin finaliza cuando una horquilla de replicacin se encuentra con el otro lado del cromosoma circular en el lugar de terminacin, la regin ter ( ). La regin ter est formada por un par de secuencias ter de repeticiones invertidas. Cada secuencia ter evita una progresin posterior de una de las horquillas de replicacin cuando se une una protena de unin ter (TBP) de 26 KDa. Las dos molculas hijas de DNA se separan porque acta una topoisomerasa de tipo II.

(T1)

(T2)

LA DNA POLIMERASA HACE UNA LECTURA DE PRUEBA (PROOFREADING)

Muchos errores de copiado que se producen durante la replicacin del DNA son corregidos por la funcin de lectura de prueba de la DNA Polimerasa, que pueden reconocer bases errneas (mal apareadas) en el extremo 3 de la cadena en crecimiento y luego extraerlas por medio de una actividad inherente de exonucleasa 3 5.

DNA POLIMERASAS EUCARIOTICAS: , , , y .

Las enzimas son similares a aquellas involucradas en la replicacin del DNA bacteriano. La DNA topoisomerasa II est involucrada en aliviar superenrollamientos positivos en el DNA, mientras que la helicasa desenrolla las dos cadenas. LA DNA Pol- tiene baja procesividad y una primasa asociada y carece de actividad exonucleasa. Est involucrada en la sntesis de la cadena retrasada. Es fuertmente inhibida por afidicolina (fuerte tambin para y ) DNA Pol tiene alta procesividad en presencia de PCNA (tiene una funcin homloga a la subunidad de Pol III de E. coli ) y no tiene asociada una primasa, sugiriendo que replica la cadena lder eucaritica. DNA Pol es encontrada en la mitocondria y replica su DNA. DNA Pol y tienen buena procesividad y estn involucradas en la reparacin del DNA.

INICIO DE REPLICACION EN EUCARIOTAS

Los origenes de replicacin contienen contienen tramos de ADN especiales, compuestos por cientos de nucletidos. Todos poseen una secuencia comn denominada ARS (autonomous replication sequence).
El ADN de los orgenes de freplicacin se halla asociado aun complejo de protenas llamadas ORC (origin recognition complex). El ORC es requerido durante la activacin de los orgenes de replicacin. En G1, Factores de replicacin defosforilados se unen al ORC para formar complejo de prereplicacin.

Al comienzo de la fase S, ORC recluta a otras protenas por ejemplo la denominada MCM (minichromosome maintenance proteins) y cdc6 (cell division cycle)con las cuales integra un cimplejo mayor llamado pre-RC (pre replication complex). Este cataliza el inicio de la replicacin despues de ser inducido por el factor SPF (S-phase promoting factor), este tambin es llamado FPR (factor promotor de la replicacin).

La unin de cdc45 activa el MCM helicasa y facilita la unin de RPA, una protena de unin a cadena simple (SSB).

Adems de participar en la activacin de los orgenes de replicacin, el ORC impide que el ADN se reduplique dos veces durante la fase G2, por lo que evita que la clula comience la mitosis teniendo un nmero de molculas de ADN mayor que el normal.

La DNA Polimerasa , que posee actividad de primasa, inicia la sntesis del DNA a travs de la formacin de un RNA cebador seguido por una cadena corta de nucletidos de DNA. Una vez que la DNA polimerasa coloc entre 30 y 40 nucletidos, la DNA polimerasa completa la replicacin sobre las cadenas lder y retrasada. La DNA polimerasa tambin parece participar en la replicacin nuclear. Estudios recientes muestra que la DNA Pol replica la cadena lder. Los cebadores son eliminados por una nucleasa reparadora y su lugar lo ocupa una pieza equivalente de DNA, sintetizada por la DNAP- . El proceso culmina al actuar la DNA ligasa.

REMOCIN DE CEBADORES
RNase R1 remueve RNA primer Endonuclease: remueve ribonucletidos y la DNA Pol sintetiza los deoxiribonucleotidos

DNA LIGASA
Cataliza formacin del enlace fosfodiester entre dos fragmentos de Okazaki

INHIBIDORES DE SINTESIS DE DNA

Quinolonas, cido nalidxico: se unen a la DNA girasa. La unin del antibitico al complejo DNA-girasa inhibe la replicacin del DNA. Las quinolonas y las nuevas fluoroquinolonas, como ciprofloxacina y norfloxacina son antibiticos de amplio espectro y especialmente utilizados en infecciones urinarias y en infecciones por Escherichia coli y Salmonella.