As prximas oito aulas tratam de mtodos que se baseiam na ligao do anticorpo com o antgeno.

Tais ligaes, como voc j sabe, podem ser do tipo primria, secundria e terciria. Veja os mtodos que sero apresentados, com base na ligao:

primria Imunofluorescncia, ELISA, Western Blotting, Fluorometria, Luminescncia, Radioimunoensaio e Citometria de Fluxo. secundria Precipitao e Aglutinao

Aula 6

Trabalho realizado pelos acadmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientao dos professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cludia BrodsKyn, Songel Freire e Denise Lemaire, do Laboratrio de Imunologia do Instituto de Cincias da Sade da UFBA. Atualizado em junho de 2003

 Complexos moleculares gerados a partir da interao de Ag solveis com Ac especficos tendem a precipitar em um determinado meio.
Este fenmeno permitiu o desenvolvimento de tcnicas em que se observa a formao do precipitado, o que s possvel se o Ac e o Ag interagirem. Tcnicas utilizando a precipitao em meio lquido so raramente utilizadas (e somente em pesquisa), para verificao da resposta de um animal a um dado antgeno solvel. Algumas tcnicas foram desenvolvidas a partir da observao de que Ag - Ac precipitam em meio semi-slido, tipo gel (em geral de agarose). Ex: - Imunodifuso dupla - Imunodifuso radial - Imunoeletroforese

Curva de precipitao
importante levar-se em conta como ocorre a ligao Ag-Ac em diferentes concentraes dos mesmos. Observe abaixo:
Anticorpo livre Antgeno livre 100%-Percentual de complexo imune precipitado

+ -

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalncia

Zona de excesso de antgeno

Quantidade de antgeno adicionado

Veja os detalhes no prximo slide

 medida que concentraes crescentes de Ag so adicionados a uma quantidade constante de Ac, a quantidade de complexos imunes precipitados inicialmente aumenta, caindo a seguir. De modo sequenciado, observa-se a:
* zona de excesso de Ac: quantidade de Ag insuficiente para reagir com e precipitar todo o Ac presente. O Ac livre pode ser detectado no sobrenadante. * zona de equivalncia: o Ag adicionado suficiente para se combinar com e precipitar todo o Ac presente. Nem Ag nem Ac livre podem ser detectados no sobrenadante. * zona de excesso do Ag: a quantidade de Ag excede aquela necessria para ligar todo o Ac, havendo reduo da quantidade de Ac precipitado. Esta diminuio resultante da solubilizao dos complexos Ag-Ac pelo excesso de Ag.
A seguir, as principais tcnicas de precipitao em gel:

IMUNODIFUSO
Imunodifuso dupla:
Coloca-se agarose sobre uma lmina, por exemplo de vidro tipo de microscopia, deixando-a solidificar:

. Faz-se em seguida pequenos orifcios no gel e so adicionadas as solues testes de Ag e Ac, como por exemplo mostrado abaixo:
Ag Ag

Ac

* As solues sofrem difuso e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalncia, se observa a reao pela formao de uma linha de precipitao:
Ag Ag

Ac

* Pode ser visualizada aps lavagem do gel , para remoo das protenas solveis, por colorao dos arcos de precipitao com corante.

Ag

Ag Lavagem + colorao

Ag

Ag

Ac

Ac

Observe a seguir os principais padres de reao que podem ser gerados:

* So trs os padres possveis:

A: identidade

1) Os arcos de precipitao formados entre o Ac e os dois antgenos se fundem, indicando que o Ac est precipitando eptopos idnticos. 2) O Ac preparado distingue os trs Ag diferentes que formam arcos independentes de precipitao. 3) Os antgenos compartilham o eptopo 1, mas um deles tambm possui um eptopo 3. A linha de precipitao indica, ento, uma identidade parcial e no total, entre as preparaes de Ag.

Ag
Ac

Anti -1 B: no identidade 1
Ac

2,4

Anti 1, 2 e 4 C: identidade parcial esporo

1/3

Utilizao: muito usada em pesquisa. Na rotina: diagnstico de algumas doenas, como a cistecercose

Ac Anti 1 e 3

IMUNODIFUSO RADIAL
* Permite a quantificao do antgeno ou do anticorpo. *O Ac adicionado a uma soluo de agarose (~1%), que em seguida dispensada em lminas e deixada gelificar. *Orifcios so feitos no gel para adio do Ag teste. *Incubao por 24h. Durante este perodo o Ag adicionado difunde-se no gel de agarose, formando complexos solveis com o Ac. *O processo continua at ser atingida a zona de equivalncia, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifcio. *Colocando-se pelo menos em tres dos orifcios concentraes conhecidas do Ag, possvel construir uma curva com os dimetros dos halos obtidos. Assim, medindo-se o halo gerado por uma concentrao desconhecida do Ag e lanando-se o valor na curva, a concentrao determinada.
Concentraes conhecidas Grfico padro
2

Imunodifuso radial simples

Gel contendo Ac Anel de precipitao Ag

Ag Ag colocado no orifcio

Teste

Dimetro do anel

10

25

50

100

Concentrao do antgeno

Utilizao da tcnica:

dosagem de imunoglobulinas (A,G,M)

e outras protenas sricas

Imunodifuso radial
Um exemplo de sua utilizao: dosagem de imunoglobulinas numa placa disponvel no mercado.
Poos onde so colocados padres e amostras a serem dosados

Halo de precipitao IgG anti-IgG

Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana

PLACA PARA DOSAGEM DE IgG HUMANA

IMUNOELETROFORESE
1- Separao de antgenos
Ag

2- Anti-soro na canaleta coluna

canaleta

+
Ag

3- Difuso e precipitao

Veja a explicao no prximo slide

NA IMUNOELETROFORESE: * Pode-se fazer comparao de misturas complexas de Ag. * Os Ag so separados em gel de agarose, pela aplicao de uma corrente eltrica. * O pH do gel escolhido de modo que as molculas carregadas positivamente migrem para o eletrodo negativo. Um fluxo de gua gerado por ao das cargas residuais (negativas) da agarose (eletroendosmose), empurra tais molculas para o plo negativo. Assim, aps um tempo determinado, essas molculas apresentam-se distribudas no gel, de acordo com os seus PM e cargas eltricas. * Uma canaleta recortada entre os poos e preenchida com Ac, que se difunde.

* O Ag e Ac formam arcos de precipitao.

Utilizao: avaliao de atipias das imunoglobulinas G, M e A

FIM