AISLAMIENTO DE ARN DE ALTA CALIDAD DE PAPAS FRITAS DEL POLISACRIDO POLYPORUS UMBELLATUS (PERSONAS)

INTEGRANTES: LaRosa Valverde, Dennis Jess Caldern Ramos, Anderson F. Contreras Soto, Omar Franchescoli

INTRODUCCIN
Chuling (Polyporus umbellatus (Pers.) Fries), un hongo medicinal que pertenece a Polyporaceae, Basidiomycetes, se distribuye ampliamente en China, incluyendo Shaanxi, Yunnan, etc. (Zhang et al.2010). Su esclerocio seco se ha utilizado como diurtico en la medicina china desde hace ms de 2500 aos (Yuan et al 2004.; Comit Nacional de la Farmacopea de 2010). Recientemente, el esclerocio se ha informado que presenta otras funciones farmacolgicas tales como in vivo actividad anticancergena (Zhao et al. 2010). Estas propiedades farmacolgicas potentes han suscitado inters mundial en el desarrollo de este hongo medicinal, mientras que sobre- excavacin de materiales silvestres ha hecho sus recursos silvestres disminuir drsticamente en China (Zhang et al. 2010).

Sin embargo, las investigaciones moleculares de este hongo son muy limitadas, y su aislamiento de ARN es insuficiente. Esto se puede atribuir al mayor contenido de polisacrido contenida en esta especie que severamente puede interferir con el ADN, el ARN y purificacin de protenas (lonneborg y Jensen, 2000; Snchez- Rodrguez et al 2008.; Zhu et al 2012

OBJETIVOS:
Identificar

a partir de diversos protocolos de muestras de cepas, la extraccin de mayor calidad y cantidad de ARN. que mtodo es el mas adecuado para el aislamiento del ARN.

Diferenciar,

Antecedentes

El esclerocio seco de medicamento hongo Polyporus umbellatus (pers.) Fries tiene muchas funciones farmacolgicas tales como actividad diurtica y contra el cncer, en el que de alto contenido polisacridos pueden desempear un papel importante. Sin embargo, el aislamiento de ARN es difcil en hongos filamentosos y carente de P. umbellatus.

POLYPORUS UMBELLATUS
Caractersticas macroscpicas: Carpforo que en su conjunto puede alcanzar muy notables dimensiones, incluso medio metro en algunas ocasiones. Est formado por un tronco central de color blanco sucio o beige del que, de manera similar a como lo hacen las ramarias, parten en diversas direcciones unas ramificaciones de las que se erigen un montn de setas completas, con pleo, sombrero, e himenio.

Sombrero de unos 4 o 5 cm de dimetro, de color beige, liso o ligeramente fibriloso, plano y circular, o si acaso dbilmente deprimido, con el margen muy fino.
Pie ms largo que el dimetro del sombrero, de color similar o incluso blanco, delgado y frgil.

Himenio formado por una serie de poros sin tubos, su tamao aproximado es de 1 a 3 poros por mm, son de color blanco. Carne escasa y delicada, muy frgil y de color blanco, tiene olor fngico suave y sabor un poco amargo tras un rato de masticacin.

MATERIALES Y METODOS

Materiales Sclerotium

Cinco cepas esclerocios de P. umbellatus se obtuvieron de Shaanxi, Henan, Sichuan y Heilongjiang (Zhang et al 2010). Ellos fueron identificados y conservados en el laboratorio local del instituto regional despus de la recoleccin. El protocolo del cultivo de activacin para cada esclerocio fue descrito por Zhang et al (2010) y cada micelio se almacen a -20C para su uso.

Extraccin de ARN

ARN fue aislado del micelio despus del cultivo de activacin, usando cinco mtodos de aislamiento, a saber, CTABLiCl, Trizol Plus + RNAiso- mate para tejido de la planta (Takara, Dalian), el mtodo de Trizol (Qiagen, Beijing), Plus Trizol y reactivo Trizol, respectivamente. Los tres ltimos mtodos de aislamiento fueron seguidos por instrucciones de sus correspondientes kits comerciales.

El mtodo CTABcontinuacin:

CiCl

se

describen

En un mortero previamente enfriado y mano de mortero; 0,1g de micelio fue molido finamente utilizando nitrgeno lquido, y transfieren rpidamente a 1 ml de tampn de extraccin precalentado por 65 C durante 5 min.

El Tampn de extraccin de ARN contena 2% (w/v) de CTAB, 2% (w/v) de PVP, 100 mM Tris- HCl (pH 8,0), 25 mM EDTA (pH 8,0), 2,0 M NaCl, 0,5 g/L y espermidina 2% mercaptoetanol.

 La

mezcla se agit vigorosamente durante 15 segundos cada 1 min para 5-6 veces y luego se enfri a temperatura ambiente. 1 ml de cloroformo se aadi a la misma y se mezcl bien por la mezcla invertido. contenido se contrifug a 12.000 xg durante 20 min a 4C. recoger cuidadosamente la fase acuosa superior, volumen igual de cloroformo y se mezclaron bien, seguido de centrifugacin a 12.000 xg durante 20 min a 4C.

El

El

Para

Exactamente 0,25 volmenes de 12 M de LiCl se aadi en la fase acuosa superior y se almacen a -20C durante una noche, despus ligeramente mixto.

La mezcla se centrifug a 14.000 xg durante 20 min a 4C y el pellet de ARN se re suspendi en 500 I de agua tratada con DEPC por 5 min y cloroformo adicional 500 I, seguido por centrifugacin 14.000 xg durante 10 min.
Los dos volmenes de etanol se aadieron en la fase de recogida superior. El precipitado se recogi por centrifugacin (12.000 xg durante 20 min a 4C) despus de incubar los tubos a -80C durante dos horas y despus se lav dos veces con etanol al 75%, y se centrifugo a 12.000 xg durante 10min a 4C. El sedimento se volvi a suspender en 30 I de agua tratada con DEPC despus de la evaporacin de etanol.

Los paso de Trizol combinado Plus + RNAiso- mate para el mtodo de Tejidos son:

0,1 g de micelio se aadi en un mortero previamente enfriado y mano de mortero y se moli a polvo fino usando nitrgeno lquido y se transfieren rpidamente a 2 ml RNAiso- mate para Tejidos Vegetales tampn para eliminar polisacrido. La mezcla se moli de nuevo hasta que la solucin se volvi transparente despus de que el polvo completamente disuelto en el tampn del kit.

Anlisis de ARN total

La calidad y la cantidad de RNA total se determina monitorizando tanto A260/ A280 y A260/ A230 razn de absorbancia utilizando el espectrofotmetro UV- 2802H (Unico, Shanghai) y ejecutando 1,2% de electroforesis en gel de agarosa.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Las muestras de micelio de cinco P. umbellatus cepas, colectadas en cuatro provincias de China fueron utilizadas para aislar el ARN y comparar su calidad y cantidad, por emplear cinco mtodos. El mtodo comnmente utilizado Trizol aislado RNA de buena calidad, pero ligeramente menor que la de Trizol Plus + RNAiso- mate de tejido vegetal en la pureza y rendimiento (tabla 1). Los otros dos kits comerciales y CTAB mejorado no era eficiente, que tambin se observ en otras especies de hongos, es decir, Rhodosporidium toruloides (Yang et al 2010). La mejora de CTAB- LiCl descrito aqu eficazmente eliminado la mayora de los metabolitos secundarios en loto (Nelumbo nucifera Gaertn. Ssp. nucifera) y producida blanco y solubles en agua ARN precipitados con un rendimiento considerable (entre 59,87 a 163,75 mg g-1 peso fresco)(datos no publicados).

Resultados
Cinco mtodos para la extraccin de ARN a partir de cinco cepas recolectadas de cuatro provincias fueron evaluados por su capacidad para recuperar un ARN de alta calidad aplicables para la secuencia relacionada con el polimorfismo de amplificacin (PAS) PCR y el PIB-D-manosa gen pirofosforilasa (GMP) perfiles de expresin. Nuestros resultados muestran que el mtodo combinado de Trizol Plus + RNAiso- mate para el tejido de la planta exhibi una alta eficiencia para el aislamiento de ARN mediante el uso de dos kits comerciales.

conclusin

Todos estos resultados demostraron que el ARN total aislado por este protocolo es de suficiente calidad para las subsiguientes aplicaciones moleculares.
Una de esas aplicaciones moleculares es el uso de la presentacin diferencial de ARNm (DDRT-PCR) para identificar los genes expresados diferencialmente en las clulas vasculares normales y enfermos