BIOTECNOLOGA

INGENIERA GENTICA

Biotecnologa: Conjunto de tcnicas que utilizan las potencialidades de

los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas, hormonas, antibiticos .), para la obtencin de productos, bienes y servicios Biotecnologa tradicional: procesos de fermentacin de bacterias y levaduras desde hace miles de aos

Biotecnologa moderna: en los ltimos 30 aos, avances en microbiologa, inmunologa e ingeniera gentica, con manipulacin selectiva y programada de material gentico

Biotecnologa contempornea Clonacin, nanotecnologa, biomateriales, reprogramacin

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA

ROJA - Aplicaciones mdicas

Obtencin de nuevos productos y frmacos por organismos Produccin de Ac monoclonales Desarrollo de terapias gnicas y celulares

VERDE Aplicaciones agrcolas y ganaderas

Desarrollo de cereales resistentes a plagas Desarrollo de animales resistentes a enfermedades Desarrollo de plantas que expresen pesticidas

AZUL Aplicaciones acuticas y marinas

Uso de plantas y productos marinos para obtener nuevos frmacos Restauracin y preservacin de especies acuticas Uso de genes de organismos acuticos para obtener resistencias

BLANCA Aplicaciones a procesos industriales

Produccin de nuevos compuestos Desarrollo de combustibles nuevos Uso de bacterias para eliminar vertidos de petrleo

ORGANISMOS TRANSGNICOS

Organismo transgnico: es aqul que ha sufrido la alteracin de su material hereditario (genoma) por la introduccin artificial (manipulacin gentica) de un gen exgeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente.
Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y descomponer al DNA, intercambiando as fragmentos especficos de ADN de distintas especies e incluso transferirlos a bacterias.

Se descubri posteriormente que esta prctica se vena haciendo en la naturaleza de forma espontnea desde hace millones de aos en los vegetales a travs de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens.
Las bacterias producen hoy en da, protenas humanas por ingeniera gentica como el interfern, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran importancia en la medicina.

ORGANISMOS TRANSGNICOS Microorganismos transgnicos Produccin de alimentos Eliminacin de basuras Obtencin de materias primas para la industria Descontaminar lo que las industrias han contaminado

Animales de granja (cerdos, ovejas, borregos) "biorreactores de protenas teraputicas humanas en su leche (antitripsina, factor VIII de coagulacin)

Plantas transgnicas "nueva revolucin verde Resistentes a sequas, a herbicidas o a plagas de insectos, Maduracin tarda o con caractersticas para mantener el color y sabor despus de congelacin Ejemplos : algodn, la soja, la papa, el tomate y al maz

INGENIERA GENTICA

La Ingeniera Gentica
Conjunto de tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo que carece de ellos
Se realiza por Incluye

Enzimas de restriccin
Capaces de cortar el ADN por puntos concretos

Tcnicas biotecnolgicas
Se obtiene Recombinacin de ADN Secuenciacin del ADN Reaccin en cadena de la polimerasa Aplicaciones diversas

ADN Recombinante
Segmento de ADN extrao intercalado en un ADN receptor

Tcnicas de ADN recombinante: la manipulacin gentica

Entre los aos 70 y 80 se desarrollaron herramientas de la biologa molecular y la ingeniera gentica, lo que se conoce como tcnicas del ADN recombinante

La tcnica se fundamenta en: Doble cadena del ADN Complementareidad de bases Siempre que se encuentren secuencias complementarias se unen Orden de las bases determina informacin de protenas Cdigo de transcripcin universal

Tcnicas de ADN recombinante: la manipulacin gentica

La tecnologa del ADN recombinante incluye diferentes tcnicas de las que destacan:
La rotura especfica del ADN mediante endonucleasas de restriccin, que facilita el aislamiento y la manipulacin de los genes individuales. La secuenciacin rpida de todos los nucletidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los lmites de un gen y la secuencia de aminocidos que codifica. La hibridacin de los cidos nuclicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas molculas de unirse a secuencias complementarias de otros cidos nuclicos. La clonacin del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento gnico autorreplicante (plsmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molcula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idnticas. La ingeniera gentica mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a clulas u organismos.

Enzimas: Endonucleasas de restriccin

Endonucleasas de Restriccin:
Enzimas que pueden cortar el ADN y lo hacen en secuencias concretas

Enzimas que las bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacterifagos

Enzimas: Endonucleasas de restriccin

Se conocen mas de 1200 enzimas de restriccin

Eco RI (E. coli) reconoce

secuencias GAATTC y corta entre G y A

Construccin de ADN recombinante

1 ADN plsmido

2 ADN extrao
3 Corte del plsmido y ADN extrao con Eco RI (endonucleasa de restriccin)

4 Formacin de extremos cohesivos 5 Formacin de ADN recombinantes

6 Accin de ADN ligasa que sella los extremos

Construccin de ADN recombinante

Clonacin del ADN

La clonacin de un gen consiste en introducirlo en una clula de modo que se copie y se mantenga
El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonacin (plsmidos), capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una clula husped Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen insertado en la clula hospedadora adecuada apropiada Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un organismo Un plsmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plsmido

Clonacin del ADN Proceso de clonacin de un gen en bacterias

1. Obtencin de plsmido
recombinante

2. Transformacin de bacterias

3. Seleccin de bacterias transformadas

4. Crecimiento de bacterias transformadas 5. Aislamiento de los plsmidos recombinantes

Clonacin del ADN Prcticas de ejercicios similares en la pgina indicada

Ejercicios: http://personales.ya.com/geopal/biologia_2b /unidades/ejercicios/act8abiointema6.htm

Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es una tcnica que permite amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de ADN.
Es un mtodo alternativo a la clonacin muy rpido y eficaz Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna Aplicaciones mdicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnstico: Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recin nacidos de madres seropositivas. Diagnstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis qustica, o reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncolg icas

Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

El mtodo se basa, en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalizacin". Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de oligonucletidos (inicidores o primers) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Los primers son sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea replicar

Tercer paso: la ADN polimerasa produce la extensin de los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde (la T la condiciona la polimerasa

Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

ADN polimerasa de E. coli se desactiva a la alta temperatura de la desnaturalizacin del ADN, por lo cual deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" Thermus aquaticus
http://www.youtube.com/watch?v=N6 kBo_pTOA8

Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

APLICACIN: amplificar ADN Fragmentos de ADN antiguos (momias, fsiles..) ADN de la escena de un crimen ADN de clulas embrionarias para diagnstico prenatal ADN de genes virales

SECUENCIACIN DEL ADN: Mtodo Sanger Mtodos y tcnicas para determinar el orden de los nucletidos de un determinado fragmento de ADN Utilidad importante en biologa bsica y aplicada (forense) Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonacin) Mtodo Sanger o didesoxi: Fragmento de ADN (cantidad) Cebador en el extremo 3 (20 bases) ADN polimerasa Desoxiribonucletidos (A,T,C,G) Didesoxiribonucletidos marcados radiactivamente (paran la sntesis) Cuatro tubos diferentes con: Polimerasa dATP, dCTP, dTTP y dGTP Un solo didesoxi marcado (ddATP) Se forman fragmentos de distinto tamao terminados en A

SECUENCIACIN DEL ADN

Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaos con electroforesis Cada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gel Terminada la electroforesis se ponen en contacto con una pelcula fotogrfica

SECUENCIACIN DEL ADN: Mtodo Automtico Marcaje de ddNTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo tiempo losADNs de las cuatro mezclas

Comparativa de los dos mtodos

INGENIERA GENTICA: Agricultura y medio ambiente Tradicionalmente se han mejorado los cultivos por seleccin de ejemplares Actualmente se mejoran caractersticas con tcnicas de ADN recombinante: -Plantas transgnicas-

El plsmido Ti o T-ADN de Agrobacterium contiene genes (onc) que provocan una mayor produccin de hormonas de crecimiento con la formacin del tumor o agalla.

Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habr obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la planta, evitando la aparicin de la enfermedad

INGENIERA GENTICA: Agricultura y medio ambiente Actualmente se consiguen mejorar diferentes caractersticas con tcnicas de ADN recombinante -Plantas transgnicasResistencia a herbicidas (mejora vegetal)
Resistencia al glifosfato herbicida no selectivo, con gen de E. coli resistente, clonado e incorporado Resistencia a plagas, con toxina de Bacillus turingiensis Resistencia a virus, con protenas de la cpsida de dicho virus

FASES:
1. Transferencia de genes 2. Regeneracin de plantas completas

INGENIERA GENTICA: Agricultura y medio ambiente Mejora del producto (alimentos)

Arroz transgnico arroz dorado- con caroteno (vit A)

Plantas farmaceticas (biofarmacetica)

Produccin de protenas humanas, vacunas, anticuerpos, mas econmicas y contienen mecanismos de modificacin postraduccional de las protenas, a diferencia de las bacterias

INGENIERA GENTICA: Agricultura y medio ambiente Medio Ambiente:Utilizacin de organismos genticamente modificados para eliminar contaminantes Biorremedacin: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos

Bioadsorcin: Bacterias modificadas que adsorben en su superficie metales pesados

INGENIERA GENTICA: Agricultura y medio ambiente Fitorremedacin: Plantas transgnicas que transforman contaminantes peligrosos en sustancias inocuas

chopos modificados para acumular metales, actualmente en condiciones controladas en invernadero

La fitoestabilizacin :plantas que inmovilizan los metales en el suelo por absorcin o adsorcin en las races. Los contaminantes permanecen retenidos bajo la superficie del suelo La fitoextraccin : plantas tolerantes capaces de absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su biomasa area. Posteriormente, esta biomasa es cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso

INGENIERA GENTICA y GANADERA Insercin de genes en vulos o clulas madre embrionarias:

Quimeras transgnicas slo sobre algunas clulas del embrin

Clulas modificadas Clulas no modificadas

Organismos transgnicos todas las clulas modificadas

Transmisin a la descendencia, rganos y tejidos para trasplantes

1.Secuencia hibrida de gen de inters y secuencia promotora de una protena de la leche 2. Introducir el transgn en vulo fecundado
3.Implantacin en la hembra que lo expresar junto con la leche

Ejs.: 1-antitripsina, factor VIII,

INGENIERA GENTICA y MEDICINA APLICACIONES

Obtencin de productos farmacuticos Insulina Interfern H. De crecimiento Factor VIII

Medicina forense
Marcadores genticos Huella gentica

Terapia gnica Diagnstico de enfermedades Deteccin en personas o fetos enfermedades hereditarias por tcnicas de ADN recombinante Insercin de genes funcionales para corregir un defecto gentico En clulas germinales En clulas somticas

Produccin de insulina humana

La forma activa de la insulina consta de dos polipptidos (A y B), que estn codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados. Promotor Protena de fusin con subunidad A del gen de la insulina

Subunidad A del gen de la insulina

Transformacin en E. coli

Promotor

Extraccin de Separacin de las protenas de los polipptidos fusin AyB

Subunidad B del gen de la insulina

Protena de fusin con subunidad B del gen de la insulina

Formacin de insulina activa

CONSTRUCCIN DE ADN RECOMBINANTE