UTILIDAD DE LAS BANDAS OLIGOCLONALES (INMUNOELECTROFORESIS)

COLLACHAGUA DELGADO JEFFERSON MR3 NEUROLOGIA

PROTEINAS PLASMATICAS

Funciones:

Transporte de compuestos endgenos/exgenos poco solubles en agua (medicamentos, hormonas, calcio, ) Regulacin de la presin onctica y el balance intra/extravasal de agua. Respuesta inflamatoria y control de la infeccin (PCR, Fibringeno, Ferritina, ...)

PROTEINAS PLASMATICAS

Sntesis proteica

Sntesis: la mayor parte de las protenas plasmticas se sintetizan en el hgado Los linfocitos B son los responsables de la sntesis de las inmunoglobulinas Degradacin/Prdidas.
El catabolismo tiene lugar en muchas y distintas clulas (endoteliales, fagocitos mononucleares, fibroblastos cutneos) Prdidas por filtracin glomerular Prdidas a travs de la pared intestinal

PROTEINAS PLASMATICAS

Estructura: Los aminocidos -> Unidad estructural de las protenas (secuencia de aa)
La disposicin espacial de esta secuencia de aa condiciona su carcter intrnseco y las diferencia de otras Los aa, debido su composicin (grupos cidos y bsicos), al disociarse en agua confieren a la molcula cargas + y => La molcula proteica presenta una carga neta suma de las cargas positiva y negativa La carga elctrica de la protena depende del grado de disociacin de sus grupos funcionales cidos y bsicos, lo cual depende del pH.

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Metodologa (electroforesis)

Las protenas son capaces de moverse en funcin de su carga y tamao cuando son sometidas a un campo elctrico La movilidad electrofortica es proporcional al cociente: Carga/Masa

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Fracciones proteicas

Albmina srica
Banda mayoritaria (53-66%) del total del proteinograma Valores normales:

Recin nacidos: 2.9-5.5 g/100ml Nios: 3.8-5.5 Adultos (V): 3.3-6.1; (H): 2.7-5.6

Pre-albmina (retinol binding protein)

Mayor movilidad electrofortica. Rpido recambio (18-45 mg/100ml) Indicador de estado nutricional

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Fracciones proteicas

Fraccin 1 globulinas

Aumenta durante los procesos inflamatorios agudos, neoplasias, infartos y necrosis (1.9-4.1% del total del proteinograma)

1- glicoprotena cida 1- antitripsina 1- antiquimiotripsina 1- fetoprotena (<2 mg/100 ml)

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Fracciones proteicas

Fraccin 2 globulinas

Aumenta en el sndrome nefrtico, ictericia obstructiva, tuberculosis, inflamacin crnica (7.7-12.3%)

2 macroglobulina (150-420 mg/100ml; Sndrome nefrtico) Ceruloplasmina (20-40 mg/100ml; transporte Cu2+; enf. Wilson) Haptoglobina (60-270 mg/100ml), transporte Hb; aumenta en inflamacin, neoplasias; disminuye hemlisis intravascular, anemia perniciosa Protena C reactiva (<0.5 mg/100 ml). Inflamaciones e infecciones

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Fracciones proteicas

Fraccin globulinas

Aumento moderado en sndrome nefrtico, ictericia obstructiva, cirrosis, tuberculosis, inflamacin crnica (7.6-13.0%)

-Lipoproteina (colesterol) Fibronectina (25-40 mg/100ml; aumenta en sndrome nefrtico, colestasis, neoplasias. Disminuye en politraumatismos, quemaduras extensas, sepsis) Transferrina (200-400 mg/100ml; transporte Fe; aumenta en anemias) Transcobalamina (900 pmol/L; transporte de B12). Complemento (C3, C4) (85-190; 12-36 mg/100 ml). Aumentan en procesos inflamatorios agudos. Disminuyen en reacciones autoinmunes.

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Fracciones proteicas

Fraccin globulinas

La fraccin de las gammaglobulinas supone entre 10.3 y 20.8% del total de protenas del suero. Se pueden detectar IgG, IgM, IgA, IgD e IgE

IgM aparece aumentada tras procesos agudos virales IgA aumenta en enfermedades intestinales autoinmunes (Crohn) IgG aumenta en enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso, hepatitis crnica activa, infecciones bacterianas crnicas) IgE est aumentada en enfermedades con un componente alrgico (eczema, asma, infeccin parasitaria)

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Principales alteraciones (Albmina)

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Principales alteraciones (Deficiencias)

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Principales alteraciones

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Principales alteraciones

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Principales alteraciones (Fraccin -globulinas)

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Inmunofijacin

Permite el estudio de protenas en sangre y orina, especficamente la identificacin de componentes monoclonales u oligoclonales Se investigan bandas anormales que aparecen en el perfil electrofortico de protenas de sueros u orinas, principalmente situadas en las fracciones globulinas y -globulinas que son siempre sospechosas de ser protenas monoclonales, y por lo tanto son un indicio de gammapatas monoclonales.

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Inmunofijacin

Es una electroforesis de protenas seguida de una inmovilizacin de las mismas al enfrentarse a un antisuero especfico (Anti-IgG, IgA, IgM, IgD, , ) formando un complejo insoluble que luego se revela por coloracin. Se realiza en cuatro etapas:
1. 2.

3.

4.

Separacin de protenas mediante electroforesis en gel de agarosa Inmunofijacin (inmunoprecipitacin) de las protenas separadas : los carriles de migracin electrofortica apropiados son recubiertos con los antisueros individuales, los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antgenos correspondientes cuando estn presentes. Las protenas del carril de referencia son fijadas con una solucin fijadora. Las protenas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado. La precipitacin del complejo antgeno-anticuerpo queda fijada en la matriz del gel Los precipitados y las protenas fijadas son visualizadas mediante tincin

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Electroforesis de alta resolucin (HRE)

La HRE usa como medio un gel de agarosa acoplada a alto voltaje y un soporte de enfriamiento. Para obtener los patrones de HRE, las muestras son aplicadas en el gel, que a la vez es sometido a un campo elctrico para permitir la migracin de las protenas, luego los geles son teidos, secados y analizados.

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Electroforesis de alta resolucin (HRE)

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Electroforesis capilar

La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta (sopote: capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin . La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de poliamina para darle mayor rigidez y resistencia, permite el paso de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.

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Electroforesis capilar

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Inmunoglogulinas (LCR)

IgG < 40 mg/L Otras Ig muy inferior [Igs]:

Aumento Ig en suero Alteracin de la BHE Aumento de sntesis local

Procendencia :

Razn de IgG y diversos ndices

Permiten conocer si existe un ss.Intratecal de las Ig. IgG: presencia y actividad de LB locales (E. desmielinizantes). IgM: aparicin ms precoz en la RI: diagnstico y seguimiento de procesos infecciosos e inflamatorios del SNC. IgA: ofrece poco valor clnico en enfermedades neurolgicas.

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LCR

La medicin debe realizarse de manera inmediata despus de la recepcin de la muestra.

Si se emplea electroforesis convencional para el estudio cualitativo, el LCR debe concentrarse entre 50 y 100 veces (ultrafiltracin) hasta C2540 g/L. Conservacin: hasta 3 das a 2 8 C Obtencin de muestras simultneas de suero y LCR :

Investigar la presencia de bandas oligoclonales Para calcular los distintos ndices

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LCR

Deteccin de bandas oligoclonales

Imprescindible para confirmar la sntesis intratecal de Ig que se producen en la EM (mtodo separacin proteica) La EEF convencional del LCR concentrado: deteccin de b. oligoclonales. Inmunofijacin: confirmacin de bandas oligoclonales e identificacin de Ig.

Para confirmar la sntesis intratecal de Ig:

Estudio electrofortico Anlisis cuantitativos de Ig :

especficos

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LCR

Mtodos de separacin proteica

Finalidad: deteccin de bandas oligoclonales.

Procedimientos ms utilizados para su fraccionamiento:

Electroforesis en acetato de celulosa o el gel de agarosa seguida de inmunofijacin en gel de poliacrilamida. Isoelectroenfoque en gel de agarosa o en gel de poliacrilamida. Electoctroforesis capilar

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LCR (Electroforesis)

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LCR (Utilidad)

Esclerosis mltiple: (Inmunofijacin)

El patrn de B. Oligoclonales en el LCR, es caracterstico de cada

paciente y permanece inalterable en el tiempo. La concentracin de Ig en el LCR, puede afectarse por efectos del tratamiento. Demostrar presencia de transferrina- : m.separacin proteica. Procesamiento en paralelo del LCR y del suero del paciente. Pptidos (LCR) cuadros neuropsiquitricos.

Prdida de LCR en rinorreas u otorreas:

Electroforesis bidimensional:

Etiologa Mejoran diagnstico y seguimiento.

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Limitaciones

Visualizacin a ojo

Bandas monoclonales dbiles Bandas monoclonales enmascaradas dentro de otra fraccin distinta a la esperada (IgA)-> , 2 Integracin (densitometra): Revisar fracciones y picos de la curva Inmunofijacin: Determinar Igs -> Referencia para ajustar diluciones => Sensibilidad