Curso: Biologa Celular y Molecular Oscar Nolasco Crdenas MSc. oscarnol@hotmail.

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Octubre 20 !

%&' Se(ero Ochoa descubri) la *olinucle)tido +os+orilasa, ca*a- de sinteti-ar in vitro #N" a *artir de ribonucleotidotri+os+atos: #N" *olimerasa.

"#N $historia

.se mismo a/o 0eorge 0amo1 +unda el 2#N" tie club3Se reunan 2 (eces al a/o *ara discutir sobre la estructura del #N" y como esta contribuye a la +ormaci)n de *rotenas %&& 4 Cric5 *ro*uso su 6"da*ter 7y*othesis2 re+erida a la +alta de una mol8cula 9ue *orte el aminocido

#euni)n del RNA tie club, Cambridge, :nglaterra. 4rancis Cric5 ;+ondo, i-9uierda<, =eslie Orgel ;+ondo, derecha<, "le>ander #ich ;+rente, i-9uierda<, y ?ames @atson ;+rente, derecha<. %&&

"#N $historia
Marshall Nirenberg y 7einrich Matthaei.

%A Marshall Nirenberg inicia sus trabaBos *ara desci+rar el c)digo genetico ; %A $ %A2 Che coding race: entre el laboratorio de Ochoa y Nirenberg, el *rimero desisti) al (er 9ue tan a(an-ado estaban los trabaBos de Nirenberg< %A& #obert 7olley descubre el "#Nt la mol8cula +altante de Cric5 %AD 4rancis Cric5 y =eslie Orgel *ro*usieron al "#N como la *rimera mol8cula in+ormati(a %DA Chomas Cech y Sidney "ltman descubrieron el "#N catalitico ;sel+$s*licing< *rimera e(idencia s)lida de *rimera mol8cula in+ormati(a %%! el laboratorio de 7arry Noller e(idencio la *artici*aci)n del "#Nr en la sntesis de *rotenas

Se(ero Ochoa

A Esquema de la estructura cristalogrfica de una ribozima martillo B Modelo en cinta de ribozima martillo

"#N ti*os:
Principales ARN involucrados en los procesos de transcripcin y traduccin: - ARNm - ARNt - ARNr - Otros ARN en eucariotes ARNsn (ARN pequeo nuclear, ARN de edicin , ARNsc (ARN pequeo citoplasmatico, micro ARN ARNs en E. coli
!ipo "ed# $oe%# m#N" t#N" r#N" A 2! A $ 2& F' & &ol# 't# Residuos ( del total ARN F2 A

2&,000 $ ,000,000 E& $!000 2!,000 $ !0,000 !&,000 20 ,&'2 2,%0' D2 E! $ %'

&&0,000 , 00,000

rRNA es el *rinci*al com*onente de los ribosomas

mRNA procariote

mRNA eucariote

tRNA
tRNA estructura primaria Secuencia lineal de 60 a 95 nucletidos de longitud ( Comnmente 76). tRNA estructura secundaria a estructura de !o"a de tr#$ol muestra los $ra%os & los $ucles o loops. tRNA estructura terciaria Nue'e enlaces de !idrogeno entre las $ases en los $ucles de simple cadena & el plegamiento de la estructura secundaria en una estructura en (orma de con el anticodon & el $ra%o aceptor del Caracteristicas del tRNA amino)cido en los e*tremos opuestos de la mol#cula. +. ,ra%o o tallo aceptor 7-$p apareadas del 5.-terminal

con /.-terminal.

0uede contener apareamientos no tipo 1atson-Cric2. 3. CCA cola Secuencia /. terminal. 4n procariotes el CCA es transcrita5 & en eucariotes CCA es adicionada post transcripcional. /. 4l $ra%o 6 tallo de 7 $p 8ue termina en un $ucle o loop 8ue contiene di!idrouridina. 7. 4l ,ra%o del anticodon tallo de 5 $p apareadas & contiene el loop del anticodon. 5. 4l ,ra%o 9:C tallo de 5 $p apareadas 8ue contiene la secuencia 9:C donde : es una pseudouridina. 6. ;n $ra%o 'aria$le5 tRNAs de clase 1 contiene / a 5 $ases & tRNA de clase 2 contiene +/ a 3+ $ases (ormando un tallo de 5 $ases apareadas

Aminoacil-tRNA sintetasas
Catali%an la unin amino)cido - tRNA.
Nomenclatura de tRNA-sintetasas and charged tRNAs

Aminoacido= serine tRNA = tRNAser aminoac&l-tRNA sintetasa= ser&l-tRNA sintetasa Aminoac&l-tRNA= ser&l-tRNAser Tipos de tRNA-sintetasas .>isten dos ti*os de "minoacil t#N" sintetasas clasi+icadas en la +orma inicial de la uni)n del aminoacido a la adenina del CC" terminal del t#N": C="S. :. "minoacila inicialmente el 2 O7 de la adenina, luego *or una transesteri+icacion esta uni)n se traslada al ! O7. Com*rende las sintetasas *ara los t#N" de los aminoacidos: =eu,:le,Gal,Cys,Met,0lu,0ln,"rg,Cyr,Cr*. C="S. ::. "minoacila el ! O7 de la adenina. Com*rende las sintetasas *ara los t#N" de los aminoacidos: 7is,Hro,Ser,Chr,"s*,"sn,=ys,0ly,"la,Hhe

.ta*a de acti(aci)n

.ta*a de trans+erencia

a aminoacil tRNA sintetasa une una adenosina mono(os(ato A>05 al grupo IC??@ para crear un aminoacil adenilato intermediario. uego el apropiado tRNA despla%a el A>0. a aminoacil tRNA sintetasa puede reali%ar el proceso de relectura o proo(reading 'aliendose de los determinantes de identidad del tRNA

=a in+ormaci)n gen8tica almacenada en el JN" es transcrita a una co*ia de #N" com*lementario. =a hebra de "JN 9ue ha ser(ido como molde se denomina hebra antisentido y la otra hebra de "JN es denominada hebra codante o con sentido y la secuencia es id8ntica a la del #N" sinteti-ado ; .>ce*to en las *osici)n de C 9ue son cambiadas *or K< (5')ATGCGCTATAGCTGTTT(3') )ebra de *NA no molde (+
codante

Cranscri*ci)n

Joble hebra de JN"

(3')TACGCGATATCGACAAA(5') )ebra de *NA molde (,

antisentido

(5')AUGCGCUAUAGCUGUUU(3') !ranscrito de RNA

=ocali-aci)n de transcritos

0enoma de adeno(irus, ambas hebras contienen codi+icaci)n de *rotenas. Muchos de los mensaBeros se sinteti-an inicialmente en +orma de un transcrito largo 9ue *ro(iene de dos tercios de la longitud del JN". .ste transcrito es modi+icado *osteriormente .

Cranscri*ci)n
.l *roducto transcri*to *uede ser :
#N" mensaBero o m#N"L #N" ribosomal o r#N"L #N" de trans+erencia o t#N"L u
Otros #N" como ribo-imas ;act. .n-imatica<,#N" de inter+erencia o i#N" ;acti(idades de regulaci)n de la e>*resi)n gen8tica<, o *artici*ar en acti(idades *ostranscri*cionales de edici)n de m#N" ;g#N"<.

RNA PO-.&/RA"A"

Cranscri*ci)n eta*as: .niciacin: =a misma hebra es siem*re transcrita de un *romotor dado. =a *olimerasa se une al *romotor en una orientaci)n de+inida, +ormando un com*leBo cerrado, *aso seguido la hebra se abre a ! b* alrededor del inicio de transcri*ci)n ;com*leBo abierto<. =as *rimeras transcri*ciones son ine+icientes y a menudo se liberan *e9ue/os transcri*tos y se inicia nue(amente la transcri*ci)n. =a sntesis no re9uiere de cebador o *rimer, la *olimerasa inicia los transcri*tos con una ",

/lon0acin: =a sntesis se reali-a en un corto es*acio a*ro> 0bases. .l JN" se desenrrolla en +rente y se rehibrida *or detrs. =a cadena de #N" se elonga a tra(8s del molde y *ermite las +unciones de *roo+reading. !erminacin : .n algunas celulas e>iste una secuencia se/al 9ue desencadena la terminacion, en otras el *roceso no es claro

!ranscripcin procariotes Promotor .l *romotor reconocido *or la *olimerasa conteniendo el +actor sigma tiene dos secuencias conser(adas, cada una de seis nucleotidos, se*aradas *or E$ % nucleotidos, en la *osicion menos 0 y menos !& .lementos adicionales KH element *romotores de genes r#N" aumentan la interaccion en-ima JN" .>tended 0 element carece de la region $!& ;genes gal< .lemento discriminador hebra baBo del elemento $ 0

:nicio de la transcri*ci)n en *rocariotes

4actor si0ma mantiene estable la unin de la RNA polimerasa al promotor en el *NA# /ste %actor de iniciaci)n es es*eci+ico *ara la transcri*cion de di+erentes gru*os de genes en .. coli. .l +actor M E0 *uede di(idirse en ' regiones. =a region 2 se une a una hebra del elemento $ 0. =a subunidad sigma es *osicionada dentro de la estructura holoen-ima *ara hacer +actible el reconocimiento de (arios elementos *romotor

.dicion *iro+os+orolitica *or reincor*oracion de un HHi , l en-ima *uede incor*orar otro nucleotido y continuar con l sintesis. .dicion hidrolitica la *olimerasa retrocede uno a ma nucleotidos y corta el *roducto y remue(e el error

Cerminaci)n de la transcri*ci)n *rocariote Cerminaci)n #ho de*endiente

.n la terminaci)n de*endiente de no se *resenta el tramo de *oli", aun9ue s se +orma una hor9uilla en la 9ue la #N" *olimerasa hace una *ausa y si se encuentra la *rotena *resente se detiene la transcri*ci)n. No se conoce a detalle el mecanismo de disociaci)n, *ero en este se *roduce la hidr)lisis de "CH *or e+ecto de .

Cerminaci)n de la transcri*ci)n Hrocariote #ho inde*endiente

Cerminaci)n inde*endiente de rho ;<, contiene una secuencia 9ue induce a la +ormaci)n de una hor9uilla en el transcrito de #N" de 0 a & nucle)tidos antes del +inal, seguida *or un tramo de *oli" en la cadena molde 9ue +acilita la disociaci)n de los elementos de la transcri*ci)n.

 Cranscri*ci)n en eucariotes
3 RNA Polimerasas en Eucariotes, en plantas pueden encontrarse hasta 5.

RNA polimerasa : transcribe la mayoria de los genes de r#N" RNA polimerasa .. transcribe todos los genes 9ue codi+ican *roteinas y algunos #N" *e9ue/os nucleares RNA polimerasa ... transcribe los genes de t#N" y genes de &S r#N" y #N" *e9ue/os nucleares
" di+erencia de la *olimerasa *rocariote 9ue solo re9uiere un +actor de inicicacion , en eucariotes se re9uiere de (arios +actores llamados +actores generales de transcri*cion

 Cranscri*ci)n eucariote: Hromotor '0$A0 nucle)tidos:

.l com*onente de C4::J 9ue se une y distorsiona la caBa C"C" es CBH Cata binding *rotein, las otras subunidades son llamadas C"4s +actores asociados a CBH. C4::J es un +actor critico en el reconocimiento del *romotor y establecimiento del com*leBo de *reiniciacion

C4::", C4::B, C4::4 Bunto con *olimerasa y C4::. y C4::7 +orman el com*leBo de *reiniciaci)n, +ormado este com*leBo se *roduce la denaturacion del *romotor. .sta hidrolisis re9uiere de "CH y es mediada *or C4::7 .l carbo>iterminal de la *olimerasa debe ser +os+orilado: distino numero de re*eticiones he*ta*e*tido de tyr$ser$*ro$ the$ser$*ro$ser .l inicio de la transcri*ci)n re9uiere de *rotenas adicionales, *rotenas regulatorias, del com*leBo mediador, en-imas modi+icadores del nucleosoma .l com*leBo mediador com*rende mas de 20 subunidades

 =a regi)n CCJ de la *olimerasa recluta las di(ersas en-imas del *rocesamiento del #N"

=a terminaci)n de la transcri*ci)n en eucariotes

Modelo Cor*edo : esta ligada a una #N"sa #at y otros +actores 9ue actuaran al igual 9ue #ho iniciando la terminaci)n Modelo alosterico: Cambio de *rocesi(idad de la en-ima *asada la se/al la *rocesi(idad disminuye y el cambio con+ormacional iniciara la terminaci)n

.= C#"NSC#:HCO J. m#N" .N .KC"#:OC. SK4#. J:G.#SOS H#OC.SOS HOSC#"NSC#:HC:ON"=.S: Adicin de metil 0uanosina en 12 ( 12cappin0 o Adicin del capuc3on 12 Corte y em*alme ; #N" s*licing< "dici)n de cola de *oli"

$orte y empalme ( RNA splicin0

Mecanismo de s*licing mediado *or el s*licesoma

 S*licing alternati(o

Proceso de Poliadenilacin

Com*uestos 9ue inhiben el *roceso de transcri*ci)n

Se une al surco menor del JN"

Se intercala entre 0 y C

Traduccin

=os m#N" al menos contienen un O#4

Com*onentes re9ueridos *ara las & eta*as *rinci*ales de la sntesis de *rotenas en E. coli 4ase Com*onente esencial "cti(aci)n de aminocidos 20 aa 20 aa$t#N" sintetasa 20 o mas t#N" "CH MgNN :niciaci)n m#N" N$+ormilmetionina$t#N" Codon de inicio "K0 !0S y &0S subunidad ribosomal 4actores de iniciaci)n :4 ,:42, :4! 0CH MgNN .longaci)n 4uncional E0S ribosoma aa$t#N"s es*eci+icos *or codones 4actores de elongacion .4$Cu, .4$Cs, .4$0 0CH MgNN Cerminaci)n y liberaci)n Codon de terminacion en m#N" 4actores de liberacion *oli*e*tidica #4 ,#42,#4! "CH Hlegamiento de *rotena y .n-imas es*eci+icas, co+actores y otros com*onentes *rocesos *ostraduccionales *ara la remosion de residuos de iniciacion, secuencias se/al *rocesaciento *roteolitico, modi+icacion de residuos terminal, uni)n de +os+atos,metilos, carbonilos, carbohidratos, o gru*os *rosteticos

.l inicio de la traduccion in(olucra el a*areamiento del m#N" y el r#N" Shine$Jelgarno ;SJ< es una secuencia 9ue se *resenta en muchos transcri*tos de *rocariotes 9ue consta de !$% bases del m#N" los 9ue se com*lementan con el !Oterminal del AS r#N" .n transcri*tos m#N" de eucariotes la secuencia 9ue +acilita la union inicial del m#N" a la subunidad *e9ue/a ribosomal es la secuencia Po-a5 "CC"C00 o ;0CC<#CC"C00

=a subunidad menor inicia la bus9ueda del sitio de iniciacion: .n Hrocariotes :4 *re(iene el enlace *rematuro del aat#N" al sitio " :42 +acilita la uni)n del +ormilmetionina a la *osici)n H de la subunidad menor ribosomal :4! *re(iene el enlace *rematuro de la subunidad mayor

Eucariotes usan un complejo de multiples factores de iniciacion

subunidades funcion

eIF1 1 eIF1A eIF2 3 eIF2B eIF3 11

Reconocimiento de codon AUG codon, destabiliza complejos aberrantes 1 Promueve union del Met-tRNA al40S;

GTPasa, 5 guanine nucleotide exchange factor for eIF2

estabiliza la union 40S y Met-tRNA y previene

la asociacin con 60S eIF4A 1 RNA dependiente de ATPasa; esencial para

enlazar los ribosomas al mRNA eIF4B 1 protena de enlace al RNA; promueve la

actividad eIF4A eIF4E eIF4F eIF4G eIF4H eIF5 1 1 3 1 1 Se enlaza al m7G cap cap complejo de enlace eIFs 4A, 4E, and 4G enlaza mRNA, PABP, eIF4E, eIF4A, and eIF3 similar a eIF4B

AUG reconoce y promueve actividad de

eIF2 GTPasa eIF5B 1 GTPasa, ensambla el ribosoma

"cti(aci)n del aminoacil$ t#N"

.longaci)n

.longaci)n

Cerminaci)n

Cranscri*ci)n y traducci)n ocurren simultaneamente en *rocariotes

&O

!O

!O

&O

#N" Hol.
#ibosome

m#N"
&O

#ibosome

.n .ucariotes los *rocesos de transcri*cion y traducci)n ocurren en di(ersos com*artimientos

Horos del Nucleo

JN"

Cito*lasma

Cranscri*ci)n
#N"

Hrocesamiento de #N"
m#N" 0
""""""

""""""

Nucleo

.>*ortaci)n

Kn gen de eucariote
Sitio de inicio &O KC# de transcri*ci)n #egi)n no traducida :ntrones !O KC# #egi)n no traducida

&O
HromotorQ #egi)n de Control

.>on

:nt.

.>on 2 :nt. 2 .>on !

!O
Secuencia Cerminador

.>ones
#N" Cranscri*to

&O

.>on

:nt.

.>on 2 :nt. 2 .>on !

!O

Hrocesamiento del m#N"

&O

.>on

.>on 2 .>on !

!O

$di0o 0en4tico#

.l Codigo es un tri*lete. Kn codon son ! nucleotidos consecuti(os de m#N" es*eci+ico *ara aminoacido. Hresenta un codon de inicio y otro de termino. "C0 *ara Met como codon de inicio. C"", C"0, y C0" como codones sto* de la traduccion del *oli*e*tido.

.l c)digo es uni(ersal. .n la e(oluci)n el c)digo gen8tico *arece haberse congelado. =a mayora de codones tiene el mismo signi+icado en distintos organismos. ;Ji+erencia del c)digo de mitocondria en animales<
Gariaci)n de codones en mitocondria Codones "0" K0""K" "00CKNC00 NO#M"= Sto* :le "rg =eu "rg "nimales Gertebrados Cr* Met Sto* N N Jroso+ila Cr* Met Ser N N =e(aduras Saccharomyces cerevisiae Cr* Met N Chr Torulopsis glabrata Cr* Met N Chr R Schizosaccharomyces pombe Cr* N N N 7ongos +ilamentosos Cr* N N N N Cri*anosomas Cr* N N N N Hlantas su*eriores N N N N Cr* Chlamydomonas reinhardtii R N N N R No ha sido obser(ado N es cual9uier nucleotido N mantiene el mismo signi+icado

N N

Numero de codones *or aminocido .l c)digo es degenerado. Muchos aminocidos tiene mas de un codon a e>ce*ci)n de Met y Cr*.

$odon,anticodon interacciones
Jegeneracion de la tercera base

Y la hipotesis del titubeo

.l a*areamiento codon$anticodon es crucial en la lectura del codigo genetico el a*areamiento de bases es anti*aralelo =a hi*otesis de Cric5 esta re+erida a la tercera *osicion del codon, o *rimera *osicion del anticodon ;*osicion de bamboleo< .n la tercera *osicion del codon *ueden ocurrir a*areamientos no canonicos, ocurre el bamboleo o alternacion del nucleotido sin alterar la secuencia del *oli*e*tido GentaBa del bamboleo: disociaci)n del t#N" del m#N" mas ra*ida

#egla del bamboleo: #econocimiento de un codon "nticodon Codon 2 #econocimiento de 2 codones "nticodon Codon ! #econocimiento de ! codones "nticodon Codon
:nosina S "denosina :nosina S Citidina

0uanosina S Kridina :nosina S Kridina

"KC

&O

m#N"

!O !O &O t#N"leu 0"K CK" 0

Base del bamboleo

Kn t#N"leu *uede leer dos de =os codones de leucina

&O

m#N"

!O

.l codigo esta escrito en el sentido &O a !O del m#N" .l codigo no se sobrela*a cada nucleotido es leido una sola (e-, de manera continua en un M"#CO J. =.CCK#" ;O#4<

Marco de lectura O#4

.sta determinado *or el codon de inicio "K0 siem*re el tri*lete siguiente es ledo como un codon hasta el sto*

:N:C:O TTTTTTTTTTTT..

4:N

...AGAGCGGA.AUG.GCA.GAG.UGG.CUA.AGC.AUG.UCG.UGA.UCGAAUAAA... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER

:nicio de un marco de lectura in *rocariotes and eucariotes

Huede ocurrir en codones internos "K0 en m#N" *rocariote .n eucariotes solo *uede ocurrir en el *rimer codon "K0 .l o*eron lac en .. coli se transcribe como un m#N" *olicistronico con multi*le codones "K0 lac : H O
"K0

lac U
"K0

lac V
"K0

lac "
"K0

&O

SJ

"K0

"K0 Codon interno de Met sin sitio Shine$Jalgarno

SJ

"K0

Codon de inicio antecedido del sitio Shine$Jalgarno

Codon de inicio antecedido del sitio Shine$Jalgarno

m#N" de eucariote &O ca*

"K0 "K0

.l codon de inicio "K0 es unico *osterior al &O ca*

 !.PO" */ &5!A$.ON/" 67N.$A"

/n el A*N
"ustitucion de bases !ransiciones HuWHu o HiWHi !ransversiones HuWHi o HiWHu :nserciones Jeleciones Ju*licaciones, :n(ersiones, Crans*osiciones

 !.PO" */ &5!A$.ON/" 67N.$A"

/n la prote8na &utaciones conservativas &utacin silenciosa:Cri*letes 9ue codi+ican *ara el mismo aminocido: ""0;arg<WC00;arg< &utacin con sentido o neutra:Cri*letes 9ue codi+ican *ara aminocidos e9ui(alentes distintos. """;lys<W"0";arg<. "mbos son aminocidos bsicos &utaciones no conservativas &utacin cambio de sentido: a*arece un nue(o tri*lete 9ue codi+ica *ara un aminocido de distinto ti*o. =a *rotena *ierde su +unci)n si a+ecta su sitio catalitico &utacin sin sentido: "*arece un tri*lete de terminaci)n o sto*: C"0;gln<WK"0;sto*< &utacin con cambio de marco de lectura inserciones y deleciones cambian el marco de lectura y la *osici)n del codon sto*<

Silenciosa

Con Sentido

Sin Sentido

#eadthrough