AGLUTINAO,PRECIPITAO, DIFUSO E RADIOIMUNOENSAIO

Denise dos Anjos Jessica Marques Jessica Oyie

INTRODUO
O diagnstico de certeza de um processo infeccioso a demonstrao do patgeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biolgicos do hospedeiro. O conhecimento da aplicao dos testes sorolgicos e a interpretao correta dos resultados obtidos so fundamentais para clnicos, patologistas e laboratoristas orientarem seu trabalho visando o diagnstico correto, associando sempre os resultados obtidos s investigaes clnicas e epidemiolgicas. Na pesquisa de anticorpos, os testes sorolgicos tm sido utilizados com sucesso como auxiliares importantes no diagnstico individual ou em inquritos soroepidemiolgicos, devido s suas mltiplas possibilidades de emprego

TCNICAS IMUNOLGICAS UTILIZADAS NO DIAGNSTICO DAS INFECES

Aglutinao

Preciptao

Difuso

Radioimun oensaio

 As reaes de aglutinao decorrem da ligao entre o Ac e Ag particulado.

o agrupamento de partculas, usualmente por molculas de Ac, que se ligam a Ag na superfcie de partculas adjacentes.

Agregao visvel de partculas

Eritrcitos Bactrias Fungos Ltex

o Fatores que influenciam a formao dos agregados

Classe do anticorpo envolvido. Concentrao inica e pH do meio.

Presena de macromolculas, ons, enzimas e conservantes.

Tempo e temperatura. Padronizao adequada da suspenso de micropartculas ou clulas. Concentrao tima de antgeno ou Ac a ser fixado nas micropartculas ou clulas.

Estabilidade da ligao do Ag/Ac e acessibilidade dessa molcula nas micropartculas ou clulas.

o Vantagens:
Baixo custo. Boa especificidade. Leitura visual. Facilidade de execuo.

o Desvantagens:
Baixa sensibilidade. Reprodutibilidade dos lotes de reagentes. Acessibilidade molecular para interao Ag-Ac. Estabilidade da ligao do Ag/Ac no suporte.

 Neste teste, o antgeno faz parte naturalmente da clula, e haver aglutinao dessas clulas promovida por anticorpo contra esses antgenos (antgeno naturalmente insolvel).

Anticorpo

Antgeno

Complexo precipitado

Ex: Identificao de antgenos eritrocitrios na tipagem sangunea, reao de Widal (febre tifide).

 Na reao de aglutinao direta utilizam-se partculas antignicas insolveis em sua forma ntegra ou fragmentada. Hemcias, bactrias, fungos, protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos especficos so realizados empregando-se diluies em srie do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antgeno. Aps um perodo de incubao, a aglutinao se completa e o resultado geralmente expresso como o ttulo do anti-soro, isto , a mxima diluio em que ocorre a aglutinao.

Tipagem ABO Testes confirmatrios para sfilis Aglutinao bacteriana Presena de infeco Diferenciao de espcies

Salmonelose aviria Coriza infecciosa das galinhas Micoplasmose Brucelose

 TIPAGEM ABO

 Esse mtodo emprega a adsoro de anticorpos ou antgenos proticos solveis na superfcie de micropartculas inertes (suporte). Para o teste, as hemcias e as partculas inertes (ltex, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsoro passiva, devida ao contato direto com os antgenos solveis, por adsoro via agentes qumicos, como cido tnico, cloreto de cromo e por conjugao do antgeno, por meio de ligaes qumicas covalentes, fornecendo reagentes estveis. Devido grande diversidade de antgenos que podem se ligar s clulas ou partculas, a aplicao dos testes de aglutinao passiva muito variada.

 Teste de gravidez
POSITIVO
Soro anti hCG

NEGATIVO
Soro anti hCG Particulas revestidas com hCG

Urina
Ac

+ Urina
Ac

Incubados e colocados em placa

+
hCG

Incubados e colocados em placa

Positivo no aglutina, pois os Ac se ligaram ao hCG da urina na incubao

Negativo aglutina

PRECIPITAO

 Teste utilizado para detectar a presena de anticorpo (ac) especficos em

fluidos corporais
Possui boa especificidade, porm apresenta falhas de sensibilidade

A formao do complexo ag/ac e sua precipitao permite a visualizao

do teste Facilidade de confeco do teste Antgeno e anticorpo so colocados em meio slido ou lquido, interagem e precipitam formando uma linha de precipitao, que indica a presena do anticorpo no soro.

 Utiliza-se, em geral, uma placa de Petri, lmina de microscopia ou

placa de poliestireno onde se adiciona o gel contendo ou no

antgeno, O gel geralmente composto de agarose ou gar nobre (a depender do teste e o tipo de malha e afinidade eletrnica que o mesmo exige). Depois de preparado e colocado na placa o gel perfurado e nestes poos anticorpo e/ou antgeno so colocados, de onde se difundiro.

Na regio onde o antgeno e o anticorpo se encontrarem (zona de

precipitao) formar-se- uma linha de precipitao que indica a positividade da amostra e/ou controle, um mtodo qualitativo (na medida em que indica um resultado atravs da presena ou no das zonas de precipitao).

o Elementos necessrios para a realizao:

Gel de Agarose ou gar (o gel pode ser impregnado com Ac ou no a

depender do tipo de imunodifuso),

Antgeno purificado (imunodifuso dupla), Anticorpo purificado (controle positivo), Amostras a serem testadas, Placa de poliestireno, Petri, ou lmina de microscopia, Cuba de eletroforese horizontal.

o Elementos necessrios para a realizao:

http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg

http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg

Placas Imunodifuso

http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4% 7D_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG Acervo pessoal.

Placa de Petri

Cuba de eletroforese horizontal

o Vantagens
um mtodo de fcil execuo,

No necessita de aparato sofisticado, Teste com boa especificidade (caracterstica que indica que o teste em questo identificar somente o ag ou ac desejado) menor risco de falsos-positivos, Permite que vrias amostras sejam testadas ao mesmo tempo, Realizao relativamente rpida, simples e de custo baixo em

comparao com outras tcnicas.

oDesvantagens
Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos

negativos, um teste que apresenta alguns problemas com a reprodutibilidade, Apesar de ser um texte de rpida execuo, o tempo de incubao

muito grande, de 24 at 72 horas em alguns casos.

Difcil peservao do gel No aplicvel a alguns isotipos de imunoglobulinas.

EM MEIO SEMI-SLIDO IMUNODIFUSO RADIAL: dosagem de ac ou ag IMUNODIFUSO DUPLA: deteco de ac

IMUNOELETROFORESE:
avaliao de imunoglobulinas

Anticorpo livre Antgeno livre

+ -

Precipita o de anticorpo

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalncia

Zona de excesso de antgeno

Quantidade de antgeno adicionado

1) A placa se encontra cheia de gel impregnado com um anticorpo especfico, 2) Coloca-se os controles positivos e as amostras a serem testadas nos poos perfurados no gel,
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAO, Laboratrio de Apoio Didtico UCG Go.

3) Incuba-se a placa por 48 horas, 4) Os halos (zona de equivalncia) formados em tono dos poos so medidos,

Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAO, Laboratrio de Apoio Didtico UCG Go.

o Interpretao

dos resultados:

Durante a incubao ocorre a difuso do antgeno na agarose e a formao de complexos ag-ac.,

Os complexos precipitam e formam um halo ao redor do orifcio, Existe uma relao linear entre o quadrado do dimetro do halo (d2) e a concentrao do
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAO, Laboratrio de Apoio Didtico UCG Go.

antgeno,
Utilizando antgeno de concentraes

conhecidas pode-se fazer uma curva padro, permitindo determinar a concentrao em amostras desconhecidas.
http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAO, Laboratrio de Apoio Didtico UCG Go.

1) O gel de agarose ou agar preparado e colocado na placa, 2) Aps a solidificao do gel, poos so perfurados com um molde (perfurador ou roseta),
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAO, Laboratrio de Apoio Didtico UCG Go.

3) adiciona-se antgeno , controle positivo e a amostra a ser testada nos poos perfurados,

4) Incuba-se a placa por 48 horas. 5) Os complexos ac-ag se formam e precipitam formando linhas de precipitao que indicam o resultado.

Acervo Porf. Cruvinel, W.M..Pessoal. PRECIPITAO, Laboratrio de Apoio Didtico UCG Go

o Interpretao

dos

resultados:
A formao e localizao da banda de precipitao indicam a presena de ac bem como sua concentrao em relao ao ag, Quanto mais perto do ag maior a

concentrao de ac na amostra .

Acervo pessoal.

o Aplicaes

na medicina humana e veterinria:

Muito usado no diagnstico de doenas infecto-contagiosas, Exemplos na Medicina Humana: Candidsase, Histoplasmose e Aspergilose Exemplos na Medicina Veterinria: Brucella ovis. Doena de Maedi-visna,

RADIOIMUNOENSAIO

 1959 Berson e Yalow primeiro RIA para quantificao de insulina. O RIA foi a primeira tcnica imunolgica padronizada capaz de detectar e quantificar substncias da ordem de nano a picogramas.
Torna-se ento possvel determinar qualquer tipo de molcula biolgica, desde que haja um receptor especfico e que a molcula biolgica possa ser marcada.

o DEFINIO
O termo radioimunoensaio (RIA) mais empregado em ensaios com antgenos marcados.

O termo imunorradiomtrico (IRMA) utilizado em ensaios com anticorpos marcados.

 Apresenta alta sensibilidade que conferida pela deteco radioativa. O RIA tambm apresenta elevada especificidade. Graas sua especificidade, os ensaios podem acontecer diretamente no lquido biolgico. Por causa da sua sensibilidade, o volume de amostra pode ser menor.

o Vantagens
Mtodo muito sensvel, especfico e de alta afinidade. Baixo custo.

o Desvantagens
Instabilidade dos radioistopos.
Risco operacional. Necessidades de medidas especiais. Elevado custo de biossegurana

Requer pouca amostra.

Rpido.

e problemas com o descarte de

material.

o Alta sensibilidade permite dosagem de substncias no encontradas em concentraes suficientes para serem percebidas por outras tcnicas. polipeptdios, catecolaminas, esterides, antibiticos, hormnios tireoidianos, protenas, vitaminas, drogas e outras. vrus da hepatite B. marcador tumoral.

Reao de competio por um receptor comum entre uma substncia a ser determinada e a mesma substncia marcada radioisotopicamente.

Anticorpo radioativo Antgeno radioativo Amostra a ser testada Leitor radiomtrico

Leitor radiomtrico

125 I

o radioistopo mais comumente empregado.

Meia vida de 57,5 dias.

Liga-se facilmente aos resduos de tirosina das protenas. Produz radiao . Estabilidade menor que 3H. Dosagem de hormnios proticos.

o Trtio (3H)
Produz radiao . Dosagem de esterides.

o De competio com Ag marcado.

o De competio com Ac marcado.

o Sanduche ou captura de Ag.

o Para deteco de IgE:

Paper Radioimmunosorbent Test (PRIST).

Radioallergosorbent Test (RAST).

Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos especficos colocada na fase slida. Em seguida, adiciona-se o antgeno marcado com 125 I. Uma amostra de soro de um paciente suspeito ento acrescentada. O antgeno, se presente no soro, compete com o antgeno radioativo pelos stios de ligao nos anticorpos. A quantificao feita em aparelho especfico para a leitura de radioatividade. A concentrao das molculas antignicas presentes na amostra inversamente proporcional leitura de radioatividade.

Y
Antgeno marcado

Inicialmente, antgenos so fixados na fase slida. A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente.

Os anticorpos especficos e marcados com o radioistopo so acrescentados. Se a amostra for positiva, haver a formao do complexo Ag/Ac com o Ag do soro. Quanto maior a quantidade de antgeno na amostra, maior ser a ligao destes aos anticorpos, formando imunocomplexos, que sero retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade.

Antgeno marcado

Teste realizado em duas etapas:

Primeira etapa:
1) Fixao de Acs no marcados na fase slida. 2) Adio da amostra (que contm Ag especficos contra o Ac fixado e outros componentes no especficos). 3) Os Ac capturam os Ag especficos da amostra. 4) Dever ocorrer uma primeira lavagem para eliminao de componentes no especficos.

Segunda etapa:
1) Acrescenta-se um segundo anticorpo especfico e marcado, que formar o sanduche. 2) A formao do imunocomplexo ser revelada por este segundo anticorpo.

Antgeno do soro marcado

Y Ac