ENZIMAS

Morillo R. Jos G.
2
ENZIMAS - Historia
Los Catalizadores Biolgicos. Siglo XIX.
Digestin de carne: Estomago.
Digestin de almidn: Saliva.
En la Dcada de 50
Louis Pasteur - Concluy que la fermentacin
del azcar hasta alcohol por la levadura era
catalizada por fermentos = enzimas.
Eduard Buchner (1897)
Los extractos de levadura podan fermentar el
azcar hasta alcohol.
Las enzimas funcionaban igual cuando eran
removidas de la clula viva.
3
James Sumner (1926) Siglo. XX
Aslo y cristaliz a la ureasa.
Obtuvo cristales que eran protenas.
Postulo que todas las enzimas son protenas.
John Northrop (Dcada 30)
Se cristaliz la pepsina y la tripsina de
bovinos;
Dcada de 50
Se aislaron y cristalizaron ms de 75 enzimas.
Quedando evidenciado el carcter proteico.
Actualmente son conocidas ms 2000 enzimas.
ENZIMAS - Historia
4
ENZIMAS
Definicin:
Catalizadores biolgicos;
Formadas por largas cadenas de pequeas
molculas llamadas aminocidos.
Funcin:
Controlar la actividad de las clulas,
separando o uniendo molculas para formar
nuevos compuestos.
Con excepcin de un pequeo grupo de molculas
de RNA con propiedades catalticas, llamadas de
RIBOZIMAS, todas las enzimas son PROTENAS.
Aminocidos:
H

R C* COOH

NH2
5
ENZIMAS PROTENA
Protenas con alto peso molecular,
la mayora entre 15 a 1000 Kilo
Daltons Unit (KD).

OBS: 1 Dalton = 1 unidad de peso
molecular (AMU)

ENZIMAS

Protenas globulares

Estructura terciara
Clasificacin de las protenas
Protenas globulares Protenas fibrosas
Estructura de las protenas
Primaria Secundaria Terciaria Cuaternaria
6
ENZIMAS ESTRUTURA
RNA
Estructura
Enzimtica
Ribozimas
Enlace covalente
Apoenzima o
Apoprotena
Grupo Prosttico
Holoenzima
Cofactor
Coenzima
Puede ser:
Un in inorgnico
Una molcula orgnica
Protena
7
ENZIMAS
CARACTERSTICAS GENERALES
Presentan un alto grado de especificidad.
Son productos de naturaleza biolgica.
Son catalizadores con poco gasto energtico y
seguros (no txicas).
Son altamente eficientes, acelerando las
velocidades de reaccin (10
8
a 10
11
+ rpida).
Actan reduciendo la energa de activacin.
Trabajan en condiciones favorables de pH,
temperatura, polaridad del solvente y fuerza
inica.
8
ENZIMAS
Comparacin de las enzimas con catalizadores qumicos.
Caracterstica Enzimas Catalizadores Qumicos
Especificidad por el substrato alta baja
Naturaleza de la estructura compleja simples
Sensibilidad a T y pH alta baja
Condiciones de reaccin (T, P y pH) suaves drstica (generalmente)
Costo de obtencin (aislamiento y purificacin) alto moderado
Naturaleza de proceso controlado continu
Consumo de energa bajo alto
Formacin de subproductos baja alta
Separacin catalizador/ productos difcil/cara simples
Actividad Cataltica (temperatura ambiente) alta baja
Presencia de cofactores si no
Estabilidad de preparado baja alta
Energa de Activacin baja alta
Velocidad de reaccin alta baja
9
ENZIMAS NOMENCLATURA
En el Siglo XIX - Pocas enzimas se
identificaron
Se nombraban aadiendo el sufijo ASA
al nombre del substrato:
Grasas (Lipo - Griego) LIPASA
Almidn (Amylon-Griego) AMILASA
Nombres arbitrarios:
Tripsina e pepsina Proteasas
10
ENZIMAS NOMENCLATURA
1955 - Comisin de Enzimas (EC) La Unin
Internacional de Bioqumica (IUB).
Propusieron una forma de nombrar y clasificar
las enzimas.

Donde cada enzima tendra:
Un cdigo con 4 dgitos que caracteriza el tipo
de reaccin catalizada:
1 Dgito - Clase
2 Dgito - Subclase
3 Dgito - Sub-subclase
4 Dgito - Indica el substrato
11
1. Oxido-redutasas (reacciones de oxidacin-reduccin y transferencia de electrones)
1.1. Actuando en CH-OH
1.2. Actuando en C=O
1.3. Actuando en C=O-
1.4. Actuando en CH-NH
2
1.5. Actuando en CH-NH- n
1.6. Actuando en NADH, NADPH
2. Transferasas (transferencias de grupos funcionales entre molculas)
2.1. Grupos con un carbono
2.2. Grupos aldehido o cetona
2.3. Grupos acil
2.4. Grupos glicosil
2.7. Grupos fosfatos
2.8. Grupos contenido enxofre
3. Hidrolasas (reacciones de hidrlisis)
3.1. Esteres
3.2. Enlaces glucosdicos
3.4. Enlaces peptdicos
3.5. Otras Enlaces C-N
3.6. Anhidridos cidos
Clasificacin de las enzimas segn la Comisin de
Enzimas.
ENZIMAS Clasificacin
12
ENZIMAS Clasificacin
4. Liasas (catalizan la ruptura de enlaces covalentes, remocin de molculas de agua,
amonio y gas carbnico)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-
5. Isomerasas (transferencia de grupos dentro de la misma molcula para formar
isomeros)
5.1. Racemasas
6. Ligasas (catalizan reacciones de formacin de nuevas molculas a partir de enlaces
entre dos molculas pre-existentes, siempre con gasto de energa)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
Clasificacin de las enzimas segn la Comisin de
Enzimas.
13
ENZIMAS Clasificacin
Subclases
Ejemplos de
Subclases
Tipo de Reaccin
Catalizada
Clases
Hidratasas Adicionan agua a dobles
enlaces
Liasas
Quinasas Transfieren desde el ATP
fsforos
Transferasas
Mutasas Mueven fsforos en la
misma molcula
Isomerasas
Sinteasas Sntesis independiente
de ATP
Transferasas
Sintetasas Sntesis dependiente de
ATP
Ligasas
14
ENZIMAS NOMENCLATURA



ADP + D-Glucosa-6-fosfato ATP + D-Glucosa
IUB - ATP:Glucosa fosfotransferasa
E.C. 2.7.1.1
2-Clase - Transferasa
7-Subclase - Fosfotransferasa
1-Sub-subclase - Fosfotransferasa que utiliza un grupo
hidroxilo como receptor
1-Indica que la D-glucosa es un receptor de grupo
fosfato
Nombre trivial: Hexoquinasa
15
Condicin de reaccin
Energa libre de Activacin
KJ/mol Kcal/mol
Velocidad
Relativa
Sin catalizador

Platino

Enzima Catalasa
75,2 18,0

48,9 11,7

23,0 5,5
1

2,77 x 10
4


6,51 x 10
8

ENZIMAS CATALIZADORES
Aceleran las reacciones qumicas


Ejemplo: Descomposicin de H
2
O
2

H
2
O
2
H
2
O

O
2
+
Catalasa
16
ENZIMAS Catalizadores




No son consumidas en las reacciones
H
2
O
2
H
2
O

O
2
+
Catalasa
E + S E + P
17
ENZIMAS CATALISADORES



Actan en pequeas concentraciones
1 molcula de Catalasa
Descompone
5 000 000 molculas
de H
2
O
2
pH = 6,8 en 1 min
Nmero de renovacin = n de molculas de
substrato convertidas en producto por cada molcula
de enzima en unidad de tiempo.
18
ENZIMAS CATALISADORES

No alteran el estado de equilibrio de las reacciones.
Disminuyen la energa de activacin.
La K
eq
no es afectada por la enzima.
No tienen efecto sobre la termodinmica global.
AG no es afectado por la enzima.
Diferencia entre
la energa libre
de S e P
Curso de una Reaccin
Energa de activacin
con enzima
Energa de activacin
sin enzima
S
P
19
Mecanismos de catlisis enzimtica
Catlisis por proximidad: Para que las molculas
reaccionen deben aproximarse la distancia de
formacin de enlace.
Catlisis acido base: Los grupos ionizables de las
cadenas laterales de los aminocidos y grupo
prostticos contribuyen a la catlisis al actuar
como cidos o bases.
Catlisis por deformacin: Se unen a los
sustratos con una conformacin desfavorable.
Catlisis covalente: Se forman un enlaces
covalentes entre la enzima y el sustrato
estabilizando compuestos intermedios.
20
ENZIMAS
COMPONENTES de una reaccin



E + S E S P + E
Substrato se une al
SITIO ATIVO
De la enzima
21
ENZIMAS SITIO ACTIVO
Regin de la molcula enzimtica que participa en la
reaccin con el substrato.
Puede poseer componentes no proteicos: cofactores.
Poseen aminocidos auxiliares de contacto.
HOLOENZIMA
Grupo prosttico
Activador: Iones inorgnicos
que condicionan la accin
cataltica de la enzimas. Fe
+
Porcin proteica
APOENZIMA
Cofactor
Coenzima: molcula orgnica
compleja. NAD+
22
ENZIMAS COFACTOR



Algunas enzimas que contienen o necesitan de
elementos inorgnicos como cofactores
ENZIMA COFACTOR
PEROXIDASA Fe
+2
o Fe
+3


CATALASA
CITOCROMO OXIDASA Cu
+2

ALCOHOL DESIDROGENASA Zn
+2

HEXOQUINASA Mg
+2

UREASA Ni
+2
23
ENZIMAS COENZIMAS



La mayora deriva de vitaminas hidrosolubles
Se Clasifican en:
Transportadoras de hidrogeniones.
Transportadoras de grupos qumicos.
Transportadoras de hidrogeniones
Coenzima Abreviatura Reaccin
catalizada
Origen
Nicotinamida adenina
dinucletido
NAD
+
Oxi-reduccin Niacina o
Vitamina B
3
Nicotinamida adenina
dinucletido fosfato
NADP
+
Oxi-reduccin Niacina o
Vitamina B
3
Flavina adenina
dinucletido
FAD Oxi-deduccin Riboflavina o
Vitamina B
2
24
ENZIMAS COENZIMAS
Transportadoras de grupos qumicos
Coenzima Abrev. Reaccin catalizada Origen
Coenzima A CoA - SH
Transferencia de
grupo acil
Pantotenato o
Vitamina B
3
Biotina
Transferencia de
CO
2
Biotina o
Vitamina H
Piridoxal fosfato PyF
Transferencia de
grupo amino
Piridoxina o
Vitamina B 6
Metilco balamina
Transferencia de
unidades de carbono
Cobalamina o
Vitamina B 12

Tetrahidrofolato THF
Transferencia de
unidades de carbono
cido flico
Tiamina
pirofosfato

TPP
Transferencia de
grupo aldehdo
Tiamina o
Vitamina B 1

25
ENZIMAS
Enlace ENZIMA - SUBSTRATO
Emil Fischer (1894): El alto grado de especificidad de
las enzimas permiti la creacin de un modelo
explicativo Llave-Cerradura , que considera que
la enzima posee sitio activo complementario al
substrato.
26
ENZIMAS
Enlace ENZIMA - SUBSTRATO



Koshland (1958): Ajuste Inducido , la enzima y/o
substrato sufren cambios de conformacin para que
encaje. El substrato se distorsiona durante cambio de
conformacin exactamente en el estado de
transicin.
27
Enzyme Commission: La unidad (U) de actividad
es la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de 1 micro mol de substrato o la
formacin de 1 micro mol de producto por minuto.

Expresa: U = micro moles producto/minuto
Actividad especfica = U/mg de protena

Las enzima bajo condiciones, de pureza, pH,
temperatura ptimos pueden alcanzar una
velocidad de reaccin mxima con una [S]|
substrato que permite que toda la enzima se
encuentre [E] [ES].
V = K[E] = K[ES]
ENZIMAS
ATIVIDADE ENZIMTICA



28
ENZIMAS
ATIVIDADE ENZIMTICA



Factores que alteran la velocidad de reacciones
enzimticas:
pH.
Temperatura.
Concentracin de enzimas;
Concentracin de substratos;
Presencia de inhibidores.
29
ENZIMAS
Influencia Del pH



El pH acta sobre la reaccin enzimtica causando
variaciones en el sistema los estado de ionizacin
de los componentes.
Enzimas grupos ionizables, existe en estados
de ionizacin.
30
La estabilidad de una enzima depende del:
pH
Temperatura.
Fuerzas inicas.
Naturaleza qumica de el tampn.
Concentracin de iones metlicos.
Concentracin de substratos, cofactores y
enzimas.
ENZIMA pH PTIMO
Pepsina 1,5
Tripsina 7,7
Catalasa 7,6
Arginasa 9,7
Fumarasa 7,8
ENZIMAS
Influencia Del pH
31
ENZIMAS
INFLUENCIA De la TEMPERATURA



El | Temperatura tiene dos efectos:
Aumenta la tasa de reaccin, como se observa en
mayora de las reacciones qumicas.
La estabilidad de la protena decrece debido a la
desactivacin trmica.
Las enzimas temperatura
ptima para su actividad
mxima, y una temperatura
mxima a la cual la enzima
posee una actividad cte. por
un largo perodo de tiempo.
32
El efecto de la temperatura depende:
pH y la fuerza inica del medio.
La presencia o ausencia de enlaces.

Temperaturas por encima de ptima, bajan la velocidad de
reaccin debido a la perdida de actividad cataltica
producto de la desnaturalizacin.
ENZIMAS
Influencia De la TEMPERATURA



ENZIMA TEMPERATURA TIMA (C)
Pepsina 31,6
Tripsina 25,5
Urease 20,8
33
ENZIMAS
INFLUENCIA De la [E]



La velocidad de transformacin de S en P es
proporcional a la cantidad de E.
Los desvos de la linealidad ocurre por:
Presencia de inhibidores de la enzima.
Presencia de substancias txicas.
Presencia de activadores que disocian la enzima.
Limitaciones impuestas por los mtodos de
anlisis.
Recomendaciones:
Enzimas con alto grado de pureza.
Substratos puros.
Mtodos de anlisis confiabilidad.
34
ENZIMAS
INFLUENCIA De lA [S]
[S] varia durante el curso de la reaccin a medida que S
es convertido en P.
Medir V
o
= velocidad inicial de la reaccin.


vo

[S]
Vmax
[E] = cte.
[S] pequeas | Vo linealmente.
[S] mayores |Vo por incrementos
cada vez menores.
V
max
|[S] |Vo insignificantes.
V
max
es alcanzada E Estn en la forma
ES y la [E] libre es insignificante,
entonces, E esta saturada con su S la V
no | con | de [S].
35
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA



Victor Henri (1903): E + S ES
1913
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
E + S
K1
K-1
ES
Kp
E + P
Etapa rpida Etapa lenta
36
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Cintica Enzimtica
Determinar las constantes de afinidad de
substratos e inhibidores.
Conocer las condiciones ptimas de catlisis.
Ayudar a descubrir los mecanismos de la
reaccin.
Determinar a funcin de una determinada
enzima en una va metablica.
37
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA


v =
Vmax [S]
Km + [S]
[S]
v
Vmax
2
v = Vmax
v = Vmax [S]
Km
Km
1
2
3
1- [S]+ Km>>[S]
2- [S]| [S]>>Km
3- v = Vmax
2
38
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Afinidad de la enzima por su substrato.
Km depende:
Aspectos especficos de los mecanismo de
reaccin.
N de pasos de la reaccin.
Velocidades relativas de los pasos individuales.
ENZIMA SUBSTRATO Km (mM)
Catalasa H
2
O
2
25
Hexoquinasa ATP 0,4
D-Glucosa 0,05
D-Frutosa 1,5
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108
N-benzoiltirosinamida 2,5
39
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Vmax:
E + S
K
1
K
-1
ES
K
p
E + P Vmax = K
p
[E
t
]
E + P
E + S
K
1
K
-1
ES
K
2
EP
K
3
K
-2
Vmax = K
3
[E
t
]
Vmax [E]
Vmax [2E]
V
[S]
40
Enzimas
orden de la reaccin
La formacin de P es
proporcional a la [S] y la
velocidad de la reaccin
es de:
1
a
ORDEN
La velocidad de la reaccin
es independe de la [S] y
la reaccin es de:
ORDEN CERO
V
[S]
[S]+ [S] <<Km
v = Vmax
v = Vmax [S]
Km
v = K[S]
[S]| [S]>>Km
41
ENZIMAS
MTODOS GRFICOS
max
V
1
[S]
max
V
m
K
v
1
+ =
Grfico doble Recprocos de Lineweaver-Burk
1
[S]
1
Vo
-1
Km
1
Vmax
Km
Vmax
Pendiente =
42
ENZIMAS
INHIBICIN ENZIMTICA
Cualquier sustancia que reduzca la velocidad de una
reaccin enzimtica.
INHIBIDORES


REVERSIBLES IRREVERSIBLES


COMPETITIVOS NO COMPETITIVOS ACOMPETITIVOS
43
[substrato] necesaria para
obtener la misma [ES]
afinidad de la enzima por el
substrato
I compuestos con estructura
molecular similar al S
Km aparente
da enzima
ENZIMAS
INHIBICIN COMPETITIVA
Inhibidor competitivo lucha con S por el sitio activo de la
E libre.
I anlogo no metabolzable, derivado de un S
verdadero, S substituto de la E en un P de la reaccin.
44
ENZIMAS
Inhibicin COMPETITIVA
E + S
ES E + P
EI
I

+


K
1
K
I
K
2
] [
1
)
] [
1 (
1 1
] [ )
] [
1 (
] [
] [
] ][ [
max max
max
S K
I
V
K
V v
S
K
I
K
S V
v
EI
I E
K
I
m
I
m
I
+ + =
+ +
=
=
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
45
ENZIMAS
INHIBICIN COMPETITIVA
1- Sin inhibidor
2- Con inhibidor en concentracin [I1]
3- con inhibidor en concentracin [I2] > [I1]
46

I no tiene semejanza
estructural con el S

[substrato] no diminuye la
inhibicin

Km de la enzima NO se altera

Vmax en presencia del
inhibidor
ENZIMAS
Inhibicin No-COMPETITIVA
Inhibidor no-competitivo se une reversiblemente,
aleatoria e independientemente en un sitio que le es
propio.
47
ENZIMAS
Inhibicin No-COMPETITIVA
E + S
ES E + P
EI + S
EIS
+
I
+
I
K
S
K
I
K
2
K
I
K
S
(
)
] [
1 (
1
] [
1
)
] [
1 (
1
)
] [
1 ]( [ )
] [
1
] [
] [
] ][ [
] [
] ][ [
max max
max
I I
m
I I
m
I
K
I
V S K
I
V
K
v
K
I
S
K
I
K
S V
v
EIS
I ES
EI
I E
K
+ + + =
+ + +
=
= =
Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten
48
ENZIMAS
Inhibicin NO-COMPETITIVA
1- Sin inhibidor
2- Con inhibidor en concentracin [I1]
3- Con inhibidor en concentracin [I2] > [I1]
49
ENZIMAS
Inhibicin aCOMPETITIVA
Inhibidor acompetitivo se une reversiblemente, en un sitio
propio, al complejo ES.

I no tienen semejanza
estructural con el S

I favorece a formacin do ES

Km y Vmax de la enzima

50
E + S
ES E + P
EIS
+
I
K
S
K
2
K
I
)
] [
1 (
1
] [
1 1
] [
] [
1
] [
] [
1
] [
] ][ [
max max
max
I
m
I
m
i
I
K
I
V S V
K
v
S
K
I
K
S
K
I
V
v
EIS
I ES
K
+ + =
+
+
+
=
=
Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten
ENZIMAS
Inhibicin aCOMPETITIVA
51
1- Sin inhibidor.
2- Con inhibidor en concentracin [I1]
3- Con inhibidor en concentracin [I2] > [I1]
ENZIMAS
Inhibicin aCOMPETITIVA
52
ENZIMAS
Inhibicin Irreversible
I se combina con un grupo funcional, en molcula de la
E, que es esencial para su actividad.
Pueden promover la destruccin del grupo funcional
Forma un enlace COVALENTE entre el I y la E.
Vmax + parte de la E es completamente removida de
el sistema y el Km permanece igual.
K
2
E + P
E + S
ES
K
1
EI
+
I
53
Graficando V
max
vs la cantidad total de E adicionada a
mayor de reaccin en presencia de I.
ENZIMAS
Inhibicin Irreversible
54
ENZIMAS
ENZIMAS REGULATRIAS
No obedecen a cintica de Michaelis-Menten.
Controlan a etapa limitante en una cadena de
reacciones enzimticas.
Tienen su actividad cataltica aumentada o
disminuida en respuesta a determinados iniciadores,
molculas finalizadoras (pequeos metablicos y/o
cofactores).
Clases de enzimas reguladoras:
Enzimas alostricas;
Enzimas reguladas por modificacin covalente
reversible.
55
ENZIMAS
ENZIMAS REGULATRIAS
Enzimas alostricas
Funcionan a travs de la unin no-covalente y
reversible de un metabolito regulador llamado
modulador.
Moduladores pueden ser inhibidores o activadores.
Son mayores y mas complejas, poseen dos o mas
cadenas polipeptdicas.

Enzimas reguladas por modificacin covalente reversible
Grupos qumicos son unidos covalentemente y
removidos de la enzima reguladora por enzimas ,
pueden ser: fosfato, adenosina monofosfato,
grupos metil, etc.
56
ENZIMAS
ENZIMAS REGULATRIAS
1- Comportamento tipo Michaelis-Menten.
2- Comportamento Alostrico.