Estudio de la produccin de acetato isoamlico (aroma a pltano) por levaduras aisladas de las fermentaciones espontneas de Agave duranguensis

M. C. Gerardo Rafael Hernndez Carbajal

Noviembre 2008

Comit de Tesis
Director: Dr. Nicols Oscar Soto Cruz. Asesor: Dra. Olga Miriam Rutiaga Quiones. Asesor externo: Dra. Araceli Prez Silva IT-Tuxtepec Asesor externo: Dr. Gerardo Saucedo Castaeda UAM-I.

Contenido
Introduccin.
Justificacin.

Objetivo general.
Objetivos especficos.

Materiales y Mtodos. Resultados Esperados. Cronograma de actividades.

Introduccin.
Los aromas son productos muy importantes en la industria.
A qu se debe esto?

Los consumidores tienen una idea precisa de las caractersticas de un producto. Es uno de los primeros contactos del consumidor

Dijksterhuis P. et al., 2001; Bufe B. et al., 2003

Introduccin
Sabor y olor estn estrechamente relacionados.
Compuestos que son voltiles a temperatura ambiente y que se detectan por medio de las fosas nasales. Se utilizan aditivos que devuelven o mejoran caractersticas que se han perdido durante el proceso. las

Dijksterhuis P. et al., 2001; Bufe B. et al., 2003

Introduccin.
El capital alrededor de estos representa el 25% del total de las finanzas de los aditivos de la industria alimentaria. Del 2002 al 2004 creci 5.4% llegando a 18.40 billones de dlares

Actualmente IFF tiene ventas de 1900 millones de dlares.

La gran parte de los compuestos aromticos que se comercializan se producen por mtodos qumicos.
Reyes-Gonzales G. et al., 2006; Royal Society of Chemistry 2000- 2002

Introduccin.
Las compaas dedicadas a la produccin de aromas se han visto interesadas en los mtodos biolgicos, por la llamada quimiofobia Se ha considerado volver a las plantas como origen de compuestos aromticos.
Qumico
Vanilla planifolia

12 dlares/kg
4,000 dlares/kg

Rakotoarisoa S. et al., 2001; Yilmaztekin M. et al., 2008.

Introduccin.
De las posibles alternativas biolgicas para la produccin de aromas, la ms prometedora es la que se lleva a cabo por procesos microbiolgicos.

Se pueden usar fuentes de carbono y nitrgeno baratas. Los problemas de una reaccin lenta, se superan con frecuencia por una alta concentracin celular.

Yilmaztekin M. et al., 2008; Vadali R.V. et al., 2003.

Introduccin.
Gran parte de los trabajos de produccin de aromas por microorganismos tienen su origen en los estudios de produccin de bebidas alcohlicas.
La actividad fermentativa de las levaduras ha sido explotada por los humanos desde hace miles de aos para produccin de pan y vino. La ms estudiada es la Saccharomyces cerevisiae.

Plata C. et al., 2004; The Desk Encyclopedia of Microbiology, 2003

Introduccin.
Durante la fermentacin las levaduras sintetizan numerosos y cuantiosos grupos de compuestos aromticos como alcoholes superiores, cidos grasos y sus steres. cido decanico.. Madera Eugenol..... Clavo Fenil-etil acetato... Florales Acetato isoamlico.. Pltano

Plata C. et al., 2004; Rojas et al., 2003.

Introduccin.
Tabla 1. Ejemplo de produccin de compuestos aromticos por levaduras Autor Levadura Compuesto Aroma

Fujii, 1996
Quilter, 2003 Buzzini, 2003 Yilmaztekin, 2008 Hernndez-Orte, 2008 Mdaini, 2006 Medeiros, 2001 Rojas, 2001 Hecquet, 1996

Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae Pichia membranaefaciens Williopsis saturnus Brettanomyces bruxellensis Geotrichum candidum Kluyveromyces marxianus Hanseniaspora guilliermondii Zygosaccharomyces rouxii

Acetato isoamlico
Acetato isoamlico Acetato isoamlico Acetato isoamlico Vainillina Acetato etlico 2-feniletanol Acetato de 2-Pentanol 2,5-dimetil-4-hidroxi3(2H)-furanona

Pltano
Pltano Pltano Pltano Vainilla Pia Rosas Flores Fresa

Introduccin.
Los steres son de especial inters ya que contribuyen al bouquet de los vinos con su caracterstico aroma frutal. Un ster de especial inters industrial es el Acetato isoamlico. Este compuesto se ha encontrado en bebidas alcohlicas como mezcal duranguense, sake, tequila y cerveza por mencionar algunas.

Es cotizado en la industria de los alimentos por su agradable olor a pltano.

Su produccin anual mundial es de 74,000 toneladas.

Yilmaztekin M. et al., 2009; Fehr E. et al., 2008; Paez-Lerma J. et al., 2008.

Introduccin.
Tabla 2. Propiedades Fsicas del acetato isoamlico a 25C y 100 kPa. Formula molecular C7H14O2
Peso molecular Densidad 130.19 g/mol 0.876 g/cm3

Punto de Fusin
Punto de Ebullicin Presin de Vapor Aroma Color Umbral de olor NFPA 704

-78 C
142 C 5 mmHg Dulce, Pltano Transparente 0.022 ppm
3 1 0

Sigma aldrich, 2008; U.S. Department of Labor, 1996

Introduccin.
El Acetato Isoamlico es producido por una reaccin entre alcohol isoamlico y acetil coenzima A

Es catalizada por la enzima alcohol acetil transferasa (AATaseA; EC 2.3.1.84)

Los niveles de acetato isoamlico en bebidas alcohlicas varia de 0.8 a 6.6ppm La concentracin depende de las condiciones de fermentacin
Quilter M.G. et al., 2003; Kobayashi P. et al., 2007.

Swiegers J. et al., 2003

Introduccin.
Saerens G. et al., 2007 - Saccharomyces cerevisiae
A B

ppm

ppm

% de maltosa

mg de FAN

Fig 3. Produccin de acetato etlico y acetato isoamlico por Saccharomyces cerevisiae despus de la fermentacin (A) concentracin de fuente de carbono variable y concentracin de fuente de nitrgeno constante. (B) concentracin de fuente de carbono constante y concentracin de fuente de nitrgeno variable

Introduccin.

ppm

Temperatura C

Fig 4. Produccin de acetato etlico y acetato isoamlico por Saccharomyces cerevisiae despus de la fermentacin a diferentes temperaturas desde 14 hasta 26C Saerens G. et al., 2007.

Introduccin.
Quilter, M.G. et al.,(2003) - Saccharomyces cerevisiae

ppm

Acetato etlico (melaza) Acetato etlico (mosto)

Acetato isoamlico (melaza) Acetato isoamlico (mosto)

Fig 5. Efecto del pH en la produccin de acetato etlico y acetato isoamlico.

Introduccin.
Plata C. et al.,2004 - Saccharomyces cerevisiae.

ppm

Tiempo (h)

Introduccin.
Algunos de los microorganismos usados para la obtencin de acetato isoamiico son: Pichia membranaefaciens Candida guilliermondii Hansenula subpelliculosa Kluyveromyces marxianus Torulaspora delbrueckii Kloeckera apiculata Saccharomyces cerevisiae

CH3COOC5H11

Verstrepen J. et al., 2003.

Justificacin.
Durante los trabajos realizados en el Instituto Tecnolgico de Durango en la produccin de Mezcal a partir de Agave duranguensis, se observ que haba cepas de levaduras capaces de producir aromas frutales agradables. En este trabajo se pretende encontrar una cepa de levadura capaz de producir acetato isoamlico, un compuesto con aroma a pltano de inters en la industria de los alimentos. Aprovechamiento de la biodiversidad microbiana como fuentes naturales de aromas.

Objetivo General.
Producir acetato isoamlico (aroma a pltano) por una cepa nativa seleccionada de la fermentacin espontnea de Agave duranguensis.

Objetivos especficos.
Seleccionar una cepa de levadura nativa de la fermentacin espontnea de Agave duranguensis productora de acetato isoamlico. Identificar de las variables (composicin del medio de cultivo, aireacin, pH, temperatura) que ms influyen en la produccin de acetato isoamlico. Optimizacin de las condiciones de sobreproduccin de acetato isoamlico. cultivo que permitan la

Materiales y Mtodos

Fase 1: Seleccin de la cepa

150 cepas

Sistema doble acoplado

Anlisis Cuantitativo

Cepa Seleccionada

Fase 2: Identificacin de las variables.

Cepa seleccionada 10 mL de 100 mL Medio de GYMP Medio 24 horas Melaza 28C 10 horas 28C

2 mL de muestra cada 12, 24, 48, 72, 240 horas

Microextraccin en fase slida por espacio de cabeza

Plata C. et al., 2004.

Fase 3: Optimizacin de las condiciones de cultivo.

Tabla 5. Diseo de Box-Behnken para la optimizacin del proceso

Teng Y. et al., 2008 W.-Q. Guo et al., 2009

Resultados esperados

Encontrar una cepa de levadura capaz de producir acetato isoamlico y las condiciones de cultivo para producirlo en altas concentraciones.

Cronograma de actividades
ACTIVIDADES
ENE FEB 2008 FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT DIC ENE FEB 2009 MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB 2010 MAR ABR MAY JUL JUN AGO SEP SEP NOV DIC

Revisin de Literatura Conservacin de cepas Seleccin de cepas Identificacin y cuantificacin Produccin de acetato isoamlico Anlisis de datos

X
X

X
X

X
X

X
X

X
X X X X X X X

X X

X X

Estancia en el extranjero. Presentacin de examen predoctoral Desarrollo de 2 artculos de investigacin. Redaccin y defensa de tesis

Introduccin.
Muchos pescadores de la inmensa isla de Maraj, al norte de Brasil, pasaban hambre en los lluviosos meses de "aguas grandes" La poblacin riberea de Maraj dej de talar los arboles para usar su madera, al ver que vive mejor si aprovecha sus frutos. As se fund Brasmazon. Con un crecimiento anual del 20% y sus ventas al exterior al exterior son de 224,3 millones de dlares. El aroma de la biodiversidad.

Agitacin 0 rpm Concentracin de Carbono fija, concentracin de nitrgeno variable (mg de peptona) 150 200 250 Concentracin de nitrgeno fija, concentracin de fructosa variable 100 rpm Concentracin de Carbono fija, concentracin de nitrgeno variable (mg de peptona) 150 200 250 Concentracin de nitrgeno fija, concentracin de fructosa variable

10 %

15 %

20 %

10 %

15 %

20 %

Agitacin 150 rpm

Sin Agitacin

Agitacin

Concentracin de Carbono fija, concentracin de nitrgeno variable (mg de peptona) 150 200 250

Concentracin de nitrgeno fija, concentracin de fructosa variable

10 % 15%

20%

0 rpm 100 rpm

Reaccin de esterificacin: Es la reaccin qumica que se produce entre un cido orgnico y un alcohol para dar un ster ms agua.

R1-COOH + HOCH2-R2
cido orgnico alcohol

R1-COO-CH2-R2 + H2O
ster agua

O R1-C-O -H =
cido orgnico

H-O-CH2-R2
alcohol

ster

agua

Anlisis Cualitativo.
El anlisis se llevara a cabo en un cromatgrafo de gases Agilent Technologies Network System Mod. 6890N Columna INNOWAX marca J&W Scientifics 30 m de longitud, 0.25 mm de dimetro interno, 0.5 m de espesor de fase estacionaria de polietilenglicol y fase mvil Helio 99.9 a un flujo de 1 mL/min. Temperatura inicial del horno de 40C por 8 min, con una primer rampa de 5C/min hasta 200C durante 26 min., segunda rampa de 5C/min hasta 220C durante 10 min con un tiempo total de 80 min. La deteccin del compuesto se llevar a cabo en un equipo CLARUS 500 marca Perkin Elmer con una energa de impacto de electrones de 70eV haciendo escaneo para m/Z 10 a 400 E+ y de 40 a 400E+. La interpretacin e Identificacin de los espectros se llevar a cabo por comparacin con la base de datos Wiley NBS de espectros de masas.

Anlisis Cuantitativo.
Para la cuantificacin de acetato isoamlico se utilizar un estndar interno. El anlisis se llevara a cabo en un cromatgrafo de gases Agilent Technologies Network System Mod. 6890N equipado con un detector de ionizacin de flama (FID) provisto de una columna INNOWAX marca J&W Scientifics de 30 m de longitud, 0.25 mm de dimetro interno y 0.5 m de espesor de fase estacionaria de polietilenglicol. Como gas acarreador se utilizar nitrgeno a un flujo de 1 mL/min. Las temperaturas de trabajo propuestas son: para el inyector y del detector 220 C y 300 C respectivamente. En el caso del horno se propone mantener la temperatura durante 10 min e incrementar a razn de 1,5 C/min hasta 150 C, 4 C/min hasta 170C y a 20 C/min hasta 250 C y mantener en 2 min.

Seleccin de Cepas

Figura 2. Cintica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae Semianaerobicas y 250g/L de glucosa; semianaerobicas y 100g/L de glucosa; semianaerobicas y 50g/L de glucosa; semiaerobicas y 250g/L de glucosa; semiaerobicas y 100g/L de glucosa; semiaerobicas y 50g/L de glucosa;

X1
Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X1 Cdigo X2 2 3 4

X2
Cdigo -1 0 +1 X3

X5
Cdigo