Espectroscopia de luminescncia molecular

Fotoluminescncia
e Quimiluminescncia

Fluorescncia Molecular Absoro de ftons emisso de ftons Fosforescncia Absoro de ftons emisso de ftons
Excitao qumica emisso de ftons.

Fotoluminescncia

Quimiluminescncia

Aplicaes
Desvantagem Qualitativa Quantitativo Os estados excitados so suscetveis desativao pelas colises e outros processos, muitas molculas no apresentam fluorescncia ou fosforescncia. Espectros caractersticos Baixos valores de limites de deteco (LOD
~ ppb) esto sujeito a srios efeitos Por isso os mtodos luminescentes quantitativos Ampla linearidade de interferncia. Lquidos, slidos e gasosos

E comum utilizar esta tcnica combinada com tcnicas de separao como Alta especificidade cromatografia e eletroforese.

Fluorescncia

x Fosforescncia

Fluorescncia atmica Sdio: 3s 3p 3s Absorve 589 nm emite 589 nm Fluorescncia ressonante Fluorescncia molecular fluorescena: n * n Absorve 490 nm emite 520 nm Deslocamento de Stokes Fosforescncia antraceno: * Absorve 280 nm emite 480 nm perda de energia? Estados excitados Singleto e Tripleto

Diagrama de Nveis Energticos de Molculas Fotoluminescentes

Tambm chamado de diagrama Jablonski Velocidade de absoro ocorre em cerca de 10-14 a 10-15s. A emisso de fluorescncia ocorre em 10-5 a 10-10s. J a emisso de fosforescncia ocorre em um tempo de 10-4 a 10s. Transio singleto para tripleto e improvvel (proibida)

Processos de

A molcula excitada pode retornar ao seu estado fundamental pela combinao de varias etapas mecnicas. Duas destas formas a fluorescncia e a fosforescncia envolve a emisso de radiao.

Desativao

Relaxao vibracional Imediata (10-12 s) dissipao por vibrao Coliso com molculas do solvente Aumento mnimo de temperatura do sistema Dissipao de energia = perda de energia Deslocamento de Stokes emisso > excitao E emitida < E absorvida

As outros processos de desativao so no radioativos.

S ser possvel observar fluorescncia e fosforescncia se a trajetria para o estado fundamental seja aquela que minimiza o tempo de vida no estado excitado

Processos de

Desativao

Converso interna Processo intermolecular. Proximidade entre nveis eletrnicos excitado e nveis vibracionais de um estado eletrnico excitado de menor energia(nveis superpostos) Resultado prtico: no importa qual exc fluorescncia em

Processos de

Converso externa

Desativao

Cruzamento intersistema Ocorre com a inverso do spin de eltron excitado o que altera a multiplicidade da molcula. A probabilidade desta transio depende da proximidade entre os nveis energticos vibracionais. Fosforescncia Transio triplete singlete menos provvel que a transio singlete singlete tempo de vida mdio grande. Evento raro: observado em baixas temperaturas, solventes viscosos ou mesmo em slidos.

Envolve transferncia de energia da molcula excitada para molculas de solvente. Obviamente depende de condies intrnsecas ao solvente e fatores que aumentem ou diminuam o nmero de colises: Tipo de solvente Temperatura Viscosidade Presena de supressores

Rendimento Quntico

a razo entre o nmero de molculas luminescentes e o nmero total de molculas excitadas; ou seja:

Levando

em considerao a discusso feita sobre os processos de desativao sugere que o rendimento seja determinado pelas constantes de velocidade relativas para cada processo. =
+ + + ++

Variveis que Afetam Luminescncia

Fluorescncia e estrutura Estruturas aromticas condensadas e/ou com alto grau de conjugao apresentam alta eficincia quntica Ex: Heterocclicos: no fluorescem Heterocclicos condensados fluorescem!
Heterocclicos

Heterocclicos Condensados

Variveis que Afetam Luminescncia

Fluorescncia e estrutura A substituio em anis aromticos afetam a intensidade relativa de fluorescncia e os valores dos max de absoro/emisso

Variveis que Afetam Luminescncia

Fluorescncia e estrutura Molculas flexveis tendem a relaxar por vibrao A flexibilidade causa aumento da constante de converso interna (kci) o que leva a desativao no-radiativa.

0,2

Variveis que Afetam Luminescncia

Solvente e Temperatura Aumento de T ou diminuio de viscosidade do solvente levam a um aumento no nmero de colises e portanto aumenta a probabilidade por converso externa (supresso colisional) pH A fluorescncia de compostos aromticos com funcionalidades cidas ou bsicas apresentam forte dependncia com o pH Ex.: anilina/anilnio e fenol/fenolato Obs: pKa de substncias no estado excitado podem variar de 3 a 4 unidades em relao ao estado fundamental

Variveis que Afetam Luminescncia

Oxignio dissolvido Oxignio e outras espcies paramagnticas tendem a diminuir a fluorescncia pelo aumento do cruzamento intersistemas (fosforescncia). Tambm possvel a oxidao da espcie fluorescente Outras molculas em soluo Molculas com tomos pesados (tetrabrometo de carbono e iodeto de etila) aumentam a velocidade de inverso de spin. Ex: Acrilamida e protenas

Intensidade de Fluorescncia e concentrao

A potncia da emisso de fluorescncia (F) proporcional potncia radiante do feixe de excitao que absorvido pelo sistema.
P0 : potncia do feixe radiante P: potncia aps atravessar uma distncia b do meio K: constante dependente da eficincia quntica Relacionando com a Lei de Beer:

F= K (P0 P )

Ao considerarmos : F = Kc ....

Temos que um grfico da potncia da

fluorescncia de uma soluo em funo da concentrao das espcies emitidas deve ser linear em baixas concentraes. ( A < 0,05 ) Desvios da linearidade: Altas concentraes Auto-supresso Auto-absoro

Espectros de emisso e excitao.

Instrumentao
Componentes de um espectofluorimetro:

Instrumentao - Componentes
Fontes de Radiao
Lmpadas:

(custo) Lmpada de vapor de mercrio vrias linhas intensas para promover a excitao uso de filtros de absoro ou de interferncia. Lmpada de arco de xennio a alta presso fonte contnua ~ radiao do corpo negro. Lasers: (sensibilidade) Lasers de corantes sintonizveis bombeados por laser pulsado de N2 ou laser Nd:YAG .

Instrumentao

- Componentes
Filtros e Monocromadores Filtros so comuns em fluormetros enquanto que monocromadores so essenciais em espectrofluormetros
Transdutores (detectores)

Fotomultiplicadoras (PMT) ou contador de ftons Arranjo de diodos e dispositivos de carga acoplada (CCD)

Instrumentao - Fluormetros

Instrumentao Espectrofluorimetro

Instrumentao Instrumentos baseados em arranjos de detectores

Aplicaes e Mtodos de Fotoluminescncia

Reagentes Fluorimetricos
Essencialmente Ctions

Molculas Orgnicas:
Fluorescncia nativa Agentes derivatizantes

Mtodos Fosforimtricos
Aplicaes variadas Grande seletividade Bioqumica (cidos nuclicos, protenas, etc.) Indstria do petrleo (hidrocarbonetos poliaromticos)

Deteco da Fluorescncia por cromatografia lquida

A fluorescncia excitada por laser particularmente importante para esse tipo de aplicao porque o feixe pode ser facilmente focalizado e um tamanho adequado ao dimetro da coluna

Medidas de Tempo de Vida

Possibilita anlise qualitativa

- Permite anlise de mistura de molculas fluorescentes (com espectros similares) Instrumentao mais sofisticada Lasers PMT de resposta rpida Contadores de tempo de alta sincronizao

Mtodos de Fluorescncia por Imagem

Combinao

da espectroscopia de fluorescncia com a microscopia ptica para produzir imagens localizadas de fluorforos em matrizes complexas tais como uma nica clula.

Ex:

neurobiologia Corante Fura-2 usado para monitorar a concentrao de clcio intracelular livre de acordo com estmulos farmacolgicos ou eltricos.

Quimiluminescncia
produzida quando uma reao qumica produz uma espcie eletronicamente excitada que emite luz quando retorna ao seu estado fundamental. encontrado em sistemas biolgicos nos quais o processo denominado bioluminescncia.

Quimiluminescncia
A + B C* D C* C + h Nmero limitado de reaes maiores exemplos vm dos sistemas biolgicos bioluminescncia: vagalumes (luciferase), guas-vivas, crustceos, etc. (altas profundezas) Elevada seletividade e simplicidade instrumental Atualmente apresenta grande importncia biotecnolgica GFP protena fluorescente verde Luminol

Aplicaes Analticas da Quimiluminescncia

Altamente sensveis : baixos nveis de luz so

facilmente monitorados na ausncia de rudo. Atenuao por radiao por filtro ou monocromador no necessrio. Os limites de deteco so detectados pela pureza d o reagente. Limites de Deteco tpicos situam-se nas faixas de ppb ou at ppm. A preciso das determinaes varia dependendo da instrumentao e do cuidado tomado na analise.

Espectrofluorometria como sistema de Deteco

Acoplamento com mtodos de separao em fase lquida: HPLC cromatografia lquida de alta eficincia LC cromatografia lquida capilar CE eletroforese capilar LIF fluorescncia induzida a laser

Maiores nveis de sensibilidade 10-9 mol/L a 10-12mol/L Deteco de uma nica molcula

Sequenciamento de DNA Resoluo espectral + alta sensibilidade

Referncia Bibliogrfica:
SKOOG,

WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Qumica Analtica, Traduo da 8 Edio norteamericana,Editora Thomson, So Paulo-SP, 2006.

Obrigado!!!

Integrantes: Arthur Henrique de Castro Paula Loureiro Moura