Conservacin de cepas microbianas por el mtodo de liofilizacin para el control microbiolgico en Laboratorios Liorad

Integrantes del equipo: Caballero Espadas Liliana Crdenas Bates Ilse Ileana Ferrez Canul Luis Manuel

Introduccin

Necesidad de conservar la fuente microbiana

Reducen al mnimo la posibildad de contaminacin Introduccin de mtodos de conservacin de microorganismos

Garantizan al menos la supervivencia del 70% de las clulas por un perodo de tiempo
La liofilizacin es el mtodo de eleccin debido a su posibilidad de minimizar al mximo el riesgo de cambio gentico en las clulas y las mantienen viables por 10 aos o ms.

Justificacin
Laboratorios Liorad dispona de una coleccin de cepas procedentes de subcultivos de cepas de la ATCC. El mtodo empleado no resulta la ms conveniente para la conservacin por largos perodos de tiempo, por tal motivo surgi la necesidad de evaluar otra estrategia de conservacin.

MATERIALES Y MTODOS
Acervo Microbiano
elaborado a partir de un subcultivo primario de cepas ATCC. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, conservadas por liofilizacin 5 aos

Recuperacin de los microorganismos

Conservacin de los microorganismos

Liofilizacin

1 mL de CTS,

c/u de las mpulas liofilizadas

sustancias lioprotectoras: leche descremada y glicerol al 20 %.18,19

comprobar la pureza; 0,1 mL de las suspensiones bacterianas se inocul en una placa de Agar Triptona Soya (TSA)

tincin de Gram.

Preparacin de la suspensin
20 L de la suspensin de m.o. a liofilizar en una placa TSA

Condiciones de liofilizacin
Temp. de de congelacin 70 oC, de condensacin 50 oC y de secado 35 - 37oC.

incub de 18 a 24 h a (35 2) C,

Presin 10 Pa.

se colect 1/4 del crecimiento los bulbos se sellaron al vaco inocularon erlenmeyers que contenan 100 mL de medio CTS se almacenaron entre 2 y 8C Las clulas fueron colectadas por centrifugacin LARGO PLAZO

La biomasa se resuspendi en 50 mL de las diferentes disoluciones lioprotectoras Se tomaron 100 L de cada suspensin para determinar el (UFC/mL) antes de la liofilizacin.

Eficacia del mtodo de conservacin

Se restituyeron dos con 2 mL de CTS

Pureza

Viabilidad

Comprobacin de las caractersticas bioqumicas

prueba de diagnstico e identificacin Liofilchem de Italia (sistema colorimtrico).

se transfiri el contenido de los bulbos de cada cepa a un tubo con 20 mL de CTS.

recuento de UFC/mL por diluciones seriadas hasta 10-8 siembra en superficie en TSA. satisfactoria una concentracin celular igual o superior a 105 UFC/mL

se determin agitacin 2 h a una temperatura de 35 oC 2 oC.

pureza, viabilidad y caractersticas bioqumicas.

inocular 0,2 mL de la suspensin bacteriana

verificacin de la pureza

IMPORTANCIA: Debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las clulas por un perodo considerable de tiempo. Conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genticos. reducir el riesgo de contaminacin

Resultados
Se seleccion un buen mtodo de conservacin. Buena apariencia de la pastilla liofilizada y rehidratacin instantnea. Presencia, de cultivos puros, en cada una de las especies estudiadas.

El efecto protector de la leche descremada fue observado en las cepas Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa

Valores de 10^6 UFC/mL, el procedimiento evaluado, mantuvo la viabilidad de los cultivos liofilizados .
Se recomienda como sustancia lioprotectora de excelencia la leche descremada (sustancia proteica) por sus buenos resultados en la preservacin de la viabilidad en el proceso de liofilizacin.

La adicin de polioles (glicerol) previene el dao del material liofilizado. Los resultados de este trabajo confirman que en la variante glicerol 20 % la viabilidad en las cepas S. aureus, B. subtilis, E. coli no se afect significativamente durante el tiempo objeto de estudio. Pero no se obtuvo buen resultado con la P. Aeruginosa. Los ensayos de identidad de todas las cepas mostraron que el comportamiento de las caracterstica s e mantuvieron de acuerdo con la descripcin de las especies.

Conclusiones
Concluimos que el mtodo de liofilizacin propuesto es apropiado para la conservacin de cepas microbianas al igual que las sustancias lipoprotectoras con las que se realizaron el anlisis.