Integrantes : * Bazan Rodriguez Victor ** Rivera Vilchez Dennis

La deteccin de los agentes biolgicos se dan en tren etapas: 1. Extraccin y purificacin de los cidos nucleicos [ de la muestra] 2. Amplificacin del segmento del genoma 3. Identificacin del segmento amplificado .::Desventaja que este proceso puede durar hasta 24 horas::.

.::Usos del PCR en el campo microbiolgico::.

.::Diagnostico Etiologico::. * Cuando hay falta de un mtodo de diagnostico ** Para cuando hay un mtodo complejo de diagnostico ***Para mejorar la eficacia de algn diagnostico **** Cuando se requiere un mtodo de diagnostico rpido o precoz

.::Control del tratamiento microbiano::. *Se utiliza para la seleccin de los pacientes que deben ser tratados ** Una vez iniciado el tratamiento se verifica la eficacia del tratamiento [a travs de mtodos cuantitativos]

.:: Caracterizacin gentica de agentes infecciosos ::. * Determinacin de mutaciones en resistencias a frmacos o de virulencia.

PCR

Se ha consolidado como apoyo en la rama de VIROLOGIA (aislamiento por cultivo celular)

actualmente el uso de este mtodo se ah reducido a aquellos agentes infecciosos con inters econmico (VIH , Hepatitis B&C)

en la MICROBIOLOGIA CLINICA su uso ha sido limitado ( para microorganismos que NO crecen o crecen MAL en un medio de cultivo)

para agentes infecciosos de menor inters econmico , no hay kits o mtodos NO mtodos estandarizados : Cada Laboratorio optimiza los mtodos

el empleo de usos no convencionales No son recomendables ya que no se puede evaluar por los siguientes motivos : *Deficiencia de reproducibilidad* **Sensibilidad** *** Especificad ***

Problemas del PCR

La presencia de algunas muestras , inhiben el PCR En MICROBIOLOGIA afecta a la especificad

originando falsos negativos

debido a la elevada deficiencia sensibilidad del mtodo

Riesgo de contaminacin cruzada Hbitos en el rea de trabajo fragmentos de ADN amplificados en el laboratorio (Ampliaciones)

Cuantificacion del Adn

La eficacia de la amplificacion del ADN la cual va disminuyendo con el tiempo hasta que la reaccin llega a una fase de saturacin , en la cual YA NO HAY INCREMENTO DE ADN

por eso los fragmentos amplificados se detectan al final , cuando ya se llego a la fase de saturacin

Caractersticas
*Estos procesos de amplificacin y deteccin se producen de manera simultanea en un mismo sistema cerrado. **Se puede detectar mediante fluorescencia

La emision de la fluorescencia es proporcional al ADN amplificado

*** Los termocicladores incorporan un lector de fluorescencia y pueden medir en cualquier momento del proceso . **** Se cuenta con 2 sistemas para la deteccin de la fluorescencia : AGENTES INTERCALANTES y SONDAS ESPECIFICAS

::AGENTES INTERECALANTES ::
Son fluorocromos que aumentan la emision de la fluorecencia
que se une a un ADN de doble helice

El mas empleado es el SYBR GREEN

VENTAJA

DESVENTAJA

Es mas barato optimizar las Tiene baja especifidad [por que condiciones y la complejidad de se une de manera inespecifica al la reaccion. producto genetico O a los dimeros de cebadores ]

Elevar la temperatura en el momento de la sntesis del ADN , para lo cual se puede utilizar polimerasa recombinantes modificadas

Se puede utilizar anticuerpos que bloquean el sitio activo de la enzima hasta que se llega a una temperatura alta

disminuye el riesgo de formacin de dmeros

donde se desnaturaliza el anticuerpo y libera a la enzima polimerasa permitiendo su accin

** La mayora de los equipos presentan

la posibilidad de determinar la temperatura de fusin de los fragmentos amplificados (Tm= es la temperatura cuando el 50% del ADN se ha desnaturalizado)

***Cada fragmento tiene un Tm diferente que depende de : Longitud y

composicin de sus bases.

****Esto permite comprobar la especificad de los fragmentos

por el PCR ; aunque no siempre es confiable

detectados

*.
**** No permiten la identificacin de polimorfismo en la secuencia diana

**Son dos tipos de fluorocromos un donador y un aceptor. **El proceso se basa en la transferencias de Energa Fluorescente
[mediante resonancia]

*::Sondas de hidrolisis (Taqman) *::Sondas molecular (beacons)

::Sondas FRET

** Los mas utilizados son :

Son Oligonucletidos con un fluorocromo [donador en el extremo 5 que emite fluorescencia y un aceptor en el extremo 3]

en la molcula los extremos deben estar prximas

al alejarse la fluorescencia emitida es captada por el LECTOR

el espectro de emisin del extremo 5se ha de solapar con el espectro de absorcin del extremo 3

se produce la liberacin del fluorocromo [donador]

la sonda se hibrida con su cadena complementaria , en su accin de sntesis , la ADN Polimerasa [Hidroliza] el extremo 5 de la Sonda

*
Tienen una molcula donadora en el extremo 5 de florescencia y una aceptara en el extremo 3 presentan una estructura secundaria en forma de asa ; en la que reside la secuencia de union con el ADN diana la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el receptor y no es captada por el equipo, cuando La sonda no esta Hibridada

al hibridarse con el ADN diana , la sonda se abre alejndose los extremos pudiendo ser captada la fluorescencia emitida.

Loop

Tallo

5 'fluorforo 3 'extintor (no fluorescente)

13/02/14

*
El sistema se compone en dos sondas , adyacentes del adn diana una de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la un aceptor en el extremo 5 cuando las sondas estn hibridadas los dos fluorocromos estn prximos

al ser excitado el donador transfiere su energa al aceptor que emite florescencia, que detecta el equipo

Estos equipos cuentan con un termociclador y un lector de fluorescencia , la cual nos

permite una lectura en cada vial utilizado y en

cualquier momento deben disponer de diferentes marcos de lecturas para detectar distintos fluorocromos a la vez ( PCR los equipos mas utilizados Biosystems y Roche Diagnostic MULTIPLE)

la diferencia mas significativa se e en la rapidez y el numero de la muestra que se pueden procesar

Instrumento

Fabricante

Sistema Trmico

Tiempo de reaccin

Capacidad

Serie GeneAMP Serie AbiPrims

Applied Biosystems

Convencional

2h

96

I Cycler iQ LightCycler

BioRad Roche Diagnostics

Convencional Aire

2h 20 60 min

96 384 32

SmartCycler MX 4000 Rotor Gene

Cepheid Stratagene Corbett Research

Placa ceramica 40 60 min Convencional Aire 90 min 50 min

16 - 96 96 32

LightCycler GeneAMP I Cycler iQ

SmartCycler

MX 4000

Rotor Gene

Opciones de los equipos de PCR en tiempo real

PCR mltiple

Analisis de curvas de disociacion Amplificacin y deteccin de ADN o ARN diana en la muestra Cuantificacion del ADN o ARN

Cuantificacion del ADN o ARN

El incremento es registrado por un Software que mide el aumento de la Fluorescencia que es proporcional al aumento del ADN en cada ciclo .

Se aaden controles externos en concentraciones conocidas y crecientes de ADN diana

Se puede controlar : *Fases iniciales **Cuando la concentracin de los reactivos aun no es limitante.

Por cada muestra el Software calcula el ciclo en el cual se comienza a detectar el aumento significativo de la fluorescencia ; esto se llama PUNTO DE CORTE o CICLO UMBRAL y es inversamente proporcional a la concentracion inicial del ADN diana

Anlisis de la curva de disociacin

Se basa en una gradiente de temperatura creciente despus de la PCR para monitorizar la cintica de disociacin de los fragmentos que se amplificaron Con este aumento de la temperatura se puede determinar la TM para comprobar su especificad. Se usa para analizar si hay mutaciones puntuales

*Se usa una sonda complementaria con el ADN diana de tipo [NATIVO] , la cual abarca la posicin polimorfismo **Se forma un hibrido entre la sonda y el ADN la cual tendr mayor estabilidad que el ADN mutado ***La estabilidad se reflejara en un Tm superior

Ventaja de PCR en tiempo real

*La rapidez es uno de sus ventajas ya que no necesita de otros procesos adicionales . Si se cuenta con un equipo Ligth cycler aumenta la ventaja ya que completa los siguientes procesos : Amplificacin y Deteccin en 30 a 40 minutos

Este Pcr en tiempo real , es rentable ya que es realizado en un sistema cerrado .

La cuantificacin es mucho mas precisa , tanto as como el reconocimiento prematuro de mutaciones , que puede ser relacionado a resistencia a medicamentos,