MTODOS DIRECTOS E INDIRECTOS PARA EL ANLISIS DE VIRUS.

MTODOS DIRECTOS
Son aquellos que detectan: 1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral ). 2. La presencia de antgenos virales (tcnicas inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin. 3.La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc .). 4.El virus como partcula viral (microscopa electrnica).

1. AISLAMIENTO VIRAL - CULTIVOS CELULARES

El aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que slo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda das a semanas para la identificacin, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente. Es un proceso laborioso y caro. Requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias lneas celulares para la deteccin ptima de virus.

Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms corrientemente empleados para la propagacin de los virus. Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos Primarios:
Lneas Celulares Diploides

Lneas Celulares Continuas

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.

Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una lnea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces.
Contenedores para cultivo de clulas. a) Frasco T; b) Frasco triple; c) botellas rodantes; d) biorreactor; e) frasco con paletas; f) frascos con agitacin (Erlenmeyer).

2. DETECCIN DE ANTGENOS - TCNICAS INMUNOLGICAS

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID) Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana.

 TEST DE AGLUTINACION El test de aglutinacin es un mtodo simple, de un solo paso, que a veces se usa para la deteccin de antgenos virales en muestras clnicas. Los ensayos de aglutinacin, dependen de la fijacin inicial de anticuerpos antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente.

 RADIOINMUNOENSAYO (RIA) El fundamento es muy sencillo: Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una cantidad constante deun anticuerpo para ese antgeno Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac) se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2 anticuerpo dirigido contra el primero) se determina la radioactividad Si la muestra contiene adems antgeno fro (no marcado), ste competir con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la radioactividad Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno fro en la muestra

 ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA) Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida, en general el pocillo de una microplaca o una pequea esfera de plstico. El antgeno viral presente en la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima.

La modalidad ms frecuente del mtodo ELISA para la determinacin de antgenos es el modelo ELISA "Sandwich". En esta forma, la placa suele ya venir con un anticuerpo fijado (monoclonal policlonal) frente al antgeno problema, sobre el que se aadir el macerado del rgano sospechoso, que en caso de reaccionar con el anticuerpo de la placa, ser puesto en evidencia tras la adicin del segundo anticuerpo marcado con la enzima. Por ltimo, se aade el substrato para revelar la reaccin.

3. TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias extradas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un istopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman sondas de cidos nucleicos. Hoy en da se estn produciendo sondas de cidos nucleicos sintticas, con lo que se obtiene sondas de oligonucletidos de muy alta especificidad que estn disponibles comercialmente y son las ms usadas en los laboratorios.

TECNICA DE HIBRIDACIN

 DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA SINTETICA Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA -DNA, RNA -RNA y RNA -DNA. Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los cidos nucleicos. Posteriormente se aade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridacin. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

 Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridacin Si est marcada con un istopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma de manera que la cantidad de radiacin medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero problema.

 AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR ) La PCR es, por tanto, una amplificacin de secuencias especficas del DNA . Se basa en la utilizacin de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA ,

4. MICROSCOPA ELECTRNICA
La limitacin del mtodo adems del costo del microscopio, es que necesita de una alta concentracin de viriones (aproximadamente 109 partculas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una tcnica poco utilizada, ms an con el desarrollo de tcnicas alternativas de utilidad similar. Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrnico, se pueden utilizar tcnicas que aumenten la visualizacin, por ejemplo, la inmunoelectromicroscopa.

BIBLIOGRAFIA
Introduccin a la microbiooga, novena edicin, Escrito por Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de clulas animales) Lic. Mara Eugenia Segretn. Introduccin a la microbiologa, Volumen 2 John L. Ingraham,Catherine A . Ingraham. http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/ria.htm http://biokipedia.files.wordpress.com/2012/01/pcr.jpg