Universidad de Concepcin Facultad de Farmacia Departamento de Anlisis Instrumental

CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL

I: PRINCIPIOS Y PARAMETROS

CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR

Mikhail Tswett: 1906: separ pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar ter de petrleo sobre ella
Pigmentos naturales

CROMATOGRAFIA

Columna de Carbonato de Calcio

D. von Baer/C. Mardones 2008

CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR

Mikhail Tswett: 1906: separ pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar ter de petrleo sobre ella

CROMATOGRAFIA

Eter de petrleo

Pigmentos naturales

Columna de Carbonato de Calcio

D. von Baer/C. Mardones 2008

CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR

Mikhail Tswett: 1906: separ pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar ter de petrleo sobre ella

CROMATOGRAFIA

Eter de petrleo

Martin y James (1952): Inventan Cromatografa de Gas (1er mtodo instrumental) Martin y Synge (1952): Obtienen Premio Nbel de Qumica por la invencin de la Cromatografa de Particin en Papel: Clave para la separacin de aminocidos y diversos otros compuestos de inters biolgico en mezcla.

Columna de Carbonato de Calcio

Pigmentos naturales

D. von Baer/C. Mardones 2008

CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR

Mikhail Tswett (1906): separ pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar ter de petrleo sobre ella

CROMATOGRAFIA

Eter de petrleo

Martin y James (1952): Inventan Cromatografa de Gas (1er mtodo instrumental) Martin y Synge (1952): Reciben Premio Nbel de Qumica por la invencin de la Cromatografa de Particin en Papel: Clave para la separacin de aminocidos y diversos otros compuestos de inters biolgico en mezcla.

Columna de Carbonato de Calcio

Pigmentos naturales

HOY:
Conjunto de mtodos de anlisis qumico instrumental que permiten separar los componentes de una mezcla, los cuales se distribuyen SELECTIVAMENTE entre:

FASE ESTACIONARIA
(en reposo)

FASE MOVIL
(se hace pasar a travs de o en torno a FASE ESTACIONARIA )

D. von Baer/C. Mardones 2008

CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS

Segn ESTADO FISICO de las FASES:

FASE MOVIL:
Lquido Lquido
Crom. LIQLIQUIDO Crom. LIQ SOLIDO Cromatgrafo de Lquidos

Gas
Crom. GASLIQUIDO Crom. GAS SOLIDO Cromatgrafo de Gases

FASE ESTACIONARIA:

Slido

INSTRUMENTO

CROMATOGRAFO DE LIQUIDOS

CROMATOGRAFO DE GASES

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CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS

Segn el OBJETIVO:
Analtica Identificar y cuantificar componentes de una mezcla Preparativa
Compuesto A B C D % 12,5 25,0 50,0 12,5

Aislar componentes de una mezcla

D. von Baer/C. Mardones 2008

 Segn la FORMA de hacerla:

En COLUMNA

COLUMNAS DE HPLC

COLUMNA DE GC

PLANAR Fase estacionaria

Fase mvil

p1 p2 p3 m1 m2

D. von Baer/C. Mardones 2003

 Segn la FORMA de hacerla:

En COLUMNA

COLUMNAS DE HPLC

COLUMNA DE GC

PLANAR Fase estacionaria

Fase mvil

p1 p2 p3 m1 m2

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 Segn el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:

PARTICION O REPARTO ADSORCION INTERCAMBIO IONICO EXCLUSION

PARTICION O REPARTO:
Solubilidad selectiva entre dos fases. Lo SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILAR Fase Estacionaria: LIQUIDO Fase Mvil: LIQUIDO o GAS

Para retener la fase estacionaria lquida, en la mayora de los casos esta se une fsica- o qumica-mente a un soporte slido EN CROMATOGRAFIA LIQUIDO/LIQUIDO: Para evitar que se mezclen las fases, se usan dos lquidos no miscibles como fase estacionaria y mvil, uno polar y uno apolar. F. est. polar /F. mvil apolar: Fase Normal F. est. apolar/ F. mvil polar: Fase Inversa Casos particulares Crom. Reparto: - Crom. en Papel y Crom. Liquida en Fase Inversa
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 Segn el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:

PARTICION O REPARTO ADSORCION INTERCAMBIO IONICO EXCLUSION ADSORCION: Fenmeno de SUPERFICIE Los solutos se concentran sobre la superficie de un slido Fase Estacionaria: SOLIDO ADSORBENTE

Centros activos en la superficie del slido interaccionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase mvil. Retencin depende de rea superficial, la cual depende del tamao de partcula y de la superficie interna ido interaccionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase mvil.
D. von Baer/C. Mardones 2008

 Segn el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:

PARTICION O REPARTO ADSORCION INTERCAMBIO IONICO EXCLUSION INTERCAMBIO IONICO: Intercambio estequiomtrico de IONES de Muestra y Fase Mvil, que compiten unirse a Fase Estacionaria IONICA.

Fase estacionaria: Matriz rgida en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva- o negativamente y contraiones de carga opuesta, susceptibles de intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en en la Fase Mvil, la cual suele ser una solucin tamponada, SEPARACION se produce por competencia entre iones analito y de la Fase Mvil por los grupos ionizados de la Fase Estacionaria.
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+ +

++

+ + +

 Segn el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:

PARTICION O REPARTO ADSORCION INTERCAMBIO IONICO EXCLUSION EXCLUSION: Separacin en funcin de tamao molecular. Solutos ms pequeos penetran ms en poros de Fase Estacionaria POROSA (tamiz molecular)

Fase estacionaria: Matriz inerte que contiene pequeos poros en los cuales pueden penetran ms las molculas ms pequeas y menos las ms grandes. La retencin depende del tamao de las molculas solvatadas y del tamao de los poros.

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FASE MOVIL

COLUMNA

FASE ESTACIONARIA

DETECTOR < retardo tm > retardo

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FASE MOVIL

COLUMNA

FASE ESTACIONARIA

DETECTOR tm
D. von Baer/C. Mardones 2008

FASE MOVIL

COLUMNA

FASE ESTACIONARIA

DETECTOR < retardo tm > retardo

D. von Baer/C. Mardones 2008

FASE MOVIL

COLUMNA

FASE ESTACIONARIA

DETECTOR < retardo tm > retardo

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CROMATOGRAMA

Seal

INFORMACIN CUANTITATIVA

tM

3 t

INFORMACIN CUALITATIVA

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CROMATOGRAMA

Seal

INFORMACIN CUANTITATIVA

tM

tR 1

3 t

INFORMACIN CUALITATIVA

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CROMATOGRAMA

Seal

INFORMACIN CUANTITATIVA

tM

tR 1

tR 2

INFORMACIN CUALITATIVA

D. von Baer/C. Mardones 2003

CROMATOGRAMA

Seal

tR2 t R1

INFORMACIN CUANTITATIVA

tM

2 3 INFORMACIN CUALITATIVA

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CROMATOGRAMA
tR = tR- tM
Seal

tR2 tR1 t R1

INFORMACIN CUANTITATIVA

tR2

tM

2 3 INFORMACIN CUALITATIVA

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PARAMETROS CROMATOGRAFICOS I. Factor de Retencin (Factor de Capacidad) tR tM k = t M Como tR = tR- tM tR k = t M

tiempo del soluto en Fase Estacionaria tiempo del soluto no retardado en Fase Mvil

tR = tiempo de retencin tM = tiempo muerto (to )

Fase mvil

Fase estacionaria

Idealmente, k debe estar entre 2 y 10. En la prctica 1< k < 20 es satisfactorio.

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Para modificar k: En HPLC modificando la proporcin de modificador orgnico de la fase mvil

EN GC: Variando T

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II. Factor de Separacin (Factor de Selectividad) tR2 a= t R1

para tR2 > tR1

o bien

a=

k2 k1

para k2 > k1

El factor de separacin a describe la migracin de un pico presente en la mezcla en relacin al otro que sufre menos retardo a > 1

a recomendable que 1.1 < a < 1.5

D. von Baer/C. Mardones 2008

II. Factor de Separacin (Factor de Selectividad) tR2 a= t R1

para tR2 > tR1

o bien

a=

k2 k1

para k2 > k1

Columna C-1

a (2,1) = 1.6

Columna C-8

a (2,1) = 2.1
D. von Baer/C. Mardones 2008

II. Factor de Separacin (Factor de Selectividad) tR2 a= t R1

para tR2 > tR1

o bien

a=

k2 k1

para k2 > k1

Es igual la calidad de la separacin en casos A y B ?

tR2 ( cte) tR1 (cte)

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tR 1 tR2
Seal

t
M

Si

tM, tR1 , tR2 = constantes

k y a = constantes, pero calidad separacin no es constante

III. Eficiencia
N = Nmero de Platos Tericos
< ancho > eficiencia: deseable > ancho < eficiencia: NO deseable

h
w w

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Eficiencia N

N = Nmero de Platos Tericos

N = 16 tR wb

[ ]

wb = ancho de pico en la base =4s

tR 2
Seal

t
D. von Baer/C. Mardones 2008

Eficiencia N

N = Nmero de Platos Tericos

N = 16 tR wb

[ ]

wb = ancho de pico en la base

tR N = 5,545 w h

[ ]

wh = ancho de pico a mitad de altura

tR 2
Seal

t
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Altura Equivalente de Plato Terico (HETP)

Seccin eficaz responsable de un equilibrio de intercambio

Fase mvil L

HETP = L N
L = largo columna N = nmero de platos tericos

Fase estacionaria

N=7
HETP HETP

N = 14
HETP

N = 28

HETP = 2

HETP = 1

HETP = 4

< N, > HEPT = Menor eficiencia

> N,< HEPT = Mayor eficiencia

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Ecuacin de van Deemter

lineal HETP = A + B/ m + C . m m= velocidad media de la fase mvil

A: Efecto de camino mltiple o de laberinto

M M M M M

A = 2 l. dp

l = factor de empaque dp = dimetro de partcula

A depende de forma y tamao de partculas en el lecho de separacin > Eficiencia con partculas pequeas de tamao uniforme A NO depende del flujo de fase mvil
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Ecuacin de van Deemter

lineal HETP = A + B/ m + C . m m= velocidad media de la fase mvil

A:Efecto de camino mltiple

M M M

A depende de forma y tamao de partculas en el lecho de separacin > Eficiencia con partculas pequeas de tamao uniforme

Incidencia Tamao partcula

Forma partcula Partculas irregulares > A < eficiencia

D. von Baer/C. Mardones 2008

Partculas esfricas < A > eficiencia

Ecuacin de van Deemter

lineal HETP = A + B/ m + C . m m= velocidad media de la fase mvil

B: Difusin longitudinal o axial

t1

D. von Baer/C. Mardones 2008

Ecuacin de van Deemter

lineal HETP = A + B/ m + C . m m= velocidad media de la fase mvil

B: Difusin longitudinal o axial

Difusin longitudinal aumenta a medida que analitos permanecen ms tiempo en la columna B/m depende del flujo a >m < contribucin de B/m a la HETP

t1

t2

> Eficiencia

B depende de: DM= Coeficiente difusin soluto en Fse Mvil: mucho > en un GAS que en un lquido + importante en GC que en HPLC Factor de obstruccin o tortuosidad empacadas, 0 en columnas capilares)

(slo en columnas

D. von Baer/C. Mardones 2008

Ecuacin de van Deemter

lineal HETP = A + B/ m + C . m m= velocidad media de la fase mvil

C: Resistencia a la transferencia de masa

Trmino C Ec. van Deemter se refiere a la transferencia de masa del analito hacia y desde la Fase Estacionaria.

C * m: aumenta directamente con el flujo a >m > C m y < Eficiencia

Distribucin del analito en situacin de:

Equilibrio

No equilibrio

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Efecto del flujo sobre el ensanchamiento del peak cromatografico

Crom. de Gas

HETP

HETP= A + B/m + C*m

C*m A B/m
Flujo ptimo

Crom. Lquida

HETP

m
Incidencia B mucho menor en Cromatografa Liquida que Gaseosa, pues DM es < en un lquido que en gas, pero Transf. Masa en Fase Mvil (Cm) adquiere > importancia.
D. von Baer/C. Mardones 2008

PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO: RESOLUCION:

Medida cuantitativa de las separacin entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos

de los peaks en sus bases.

tR 2- t R 1
Seal

D. von Baer/C. Mardones 2008

PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO: RESOLUCION:

Medida cuantitativa de las separacin entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos

de los peaks en sus bases.

tR 2- t R 1
Seal

Rs = Resolucin tR2 tR1 Rs= 2 w b1+ wb2

Wb1 y Wb2 = ancho en la base de dos picos vecinos

D. von Baer/C. Mardones 2008

PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO: Rs = Resolucin tR2 tR1 Rs= 2 w b1+ wb2
Wb1 y Wb2 = ancho en la base de dos picos vecinos

Si dos picos vecinos tienen tamao similar Rs = 1,0 > 97,9 % separacin = 1,25 > 99,4 % separacin = 1,5 > 99,7 % separacin > 2,0 > separacin TOTAL Ecuacin Maestra de la Cromatografa
Si Wb1 Wb2

Rs =

( )(

a-1 a

k k+1

)( 4 )
D. von Baer/C. Mardones 2008

Influencia de la eficiencia sobre la resolucin cromatogrfica

N = 712 Rs=1.0 N= 1.600 Rs=1.5 N = 2.844 Rs=2.0 N = 11.344 Rs=4.0

98 % 99,7 % Total

Total

Resolucin vs. proporciones de rea de 2 picos vecinos

1:1 1:1 2:1 4:1 1:4 8:1 16:1 1:16 32:1

Rs=0.6

Rs=0.8
Rs=1.0 Rs=1.25
D. von Baer/C. Mardones 2008

Influencia de a ( factor de separacin) sobre la resolucin cromatogrfica

C8
a = 1.15
Rs (3,4) = 1.2

C18
a = 1.25 Rs (3,4) = 2.0

D. von Baer 2002

Factor de Asimetra (Tailing)

T = b0,1 / a0.1
(definicin IUPAC)

T idealmente = 1, en la prctica T > 1

D. von Baer/C. Mardones 2008

Nunca la primera separacin es la mejor

D. von Baer/C. Mardones 2008

Nunca la primera separacin es la mejor

D. von Baer/C. Mardones 2008

Nunca la primera separacin es la mejor

D. von Baer/C. Mardones 2008

Nunca la primera separacin es la mejor

Separaciones DEBEN OPTIMIZARSE

D. von Baer/C. Mardones 2008